CN208140718U - 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有DON半抗原‑载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫前与偶联有DON抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理；本实用新型所述检测卡无需含金标抗体的释放垫，用于与检测样本溶液混合的偶联有DON抗体的乳胶微球，颜色鲜艳易判别，且偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；另外，本实用新型所述检测卡的检测方法操作简易，适于批量化生产和应用。

Description

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡

技术领域

本实用新型是涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，属于生物检测技术领域，特别适用于粮油和谷物类的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的定量快速检测。

背景技术

呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，化学名为3 α,7α,15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名，对人体也有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，家禽次之，反刍动物由于瘤胃微生物的作用，耐受力最强。呕吐毒素属于霉菌毒素的一种，目前粮油和谷物领域流行的霉菌毒素试纸条主要为胶体金定性产品，胶体金定量产品由于准确度、精密度和稳定性很难达到要求，一直难以占市场主导，客户只能靠酶联免疫试剂盒和仪器法如高效液相等，检测样品的具体含量，酶联免疫试剂盒和仪器法对人员和环境的要求较高，检测时间较长。我国国家标准 GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素国家限量呕吐毒素限量1000μg/kg。

现有脱氧雪腐镰刀菌烯醇试纸条主要采用胶体金标技术，将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果；如李培真等人采用胶体金测试条法快速定量测定粮食中的呕吐毒素(胶体金测试条法对粮食中玉米赤霉烯酮快速定量测定的应用研究，王桂芳、李培真、曹阳、郭健、刘美辰，《粮食科技与经济》2014 年2月第39卷第1期)，以验证此方法在检测粮食中呕吐毒素的适用性。

然上述方法存在如下问题：

(1)胶体金本身为暗紫红色，颜色较浅，不易判别检测结果的阴阳性；

(2)胶体金一批制金量最多约10L左右，粒径偏差较难精准控制，大量生产定量产品，不同批容易造成大的批间差，进而影响检测结果的精度和结果稳定性；

(3)胶体金标记技术为物理吸附，较化学键偶联，产品稳定性较差；

(4)目前市场胶体金试纸条主要为定性产品，不能满足人们对操作快速、简单、人员要求低、成本低、肉眼可视的定量产品的应用需求，且现有定性筛选，假阴性和假阳性较高；

(5)烧金、标记抗体工作量较大，工艺繁琐，产出少，浪费人力物力。

实用新型内容

针对现有技术存在的上述问题和需求，本实用新型的目的是提供一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，将待检测样液提前与乳胶微球混合制得含DON抗体的反应液后再滴加到检测卡上进行检测，提高了检测结果的准确度和稳定性，无需再利用胶体金将DON抗体标记在检测卡上，操作和制作简单，成本低廉，适于大批量产出和应用。

为实现上述目的，本实用新型采用的技术方案如下：

一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有DON抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。

作为优选方案，所述检测线和所述质控线的包被量分别为0.1mg/mL和0.4mg/mL。

作为进一步优选方案，所述硝酸纤维素膜在完成所述检测线和所述质控线的包被后，在37℃条件先进行烘干过夜处理。

作为优选方案，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜搭接。

作为进一步优选方案，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水垫、所述检测线和所述质控线沿所述底板长度方向的的长度依次为25mm、21mm、20mm、3-4mm和3-4mm，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm。

作为优选方案，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂的通过下述方法制备获得：先将脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原溶解于DMF中，再加入EDC，然后将制得的溶液在室温下搅拌24小时后，逐滴缓慢滴加到溶解有OVA的CB溶液中，并于室温下搅拌24小时，最后将得到的溶液用PBS透析3天。

作为进一步优选方案，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂通过下述方法制备获得：先取8mg脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原溶解于0.8mL的DMF中，再将加入用0.2mL 的水充分溶解的20mg的EDC后，在室温下搅拌24小时，即可得到反应液A，称取36mg的OVA并充分溶解在3mL浓度为0.1mol/L、pH为9.6的CB中，即可得到蛋白溶液A，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液A中，并于室温下搅拌24小时，最后，用浓度为0.01mol/L 的PBS在4℃条件下透析3天并且每天更换3次透析液，即得到所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂。

作为优选方案，所述偶联有DON抗体的乳胶微球通过下述方法制备获得：

S1：在乳胶微球中加入25mM、pH6.0的MES缓冲溶液，混匀后利用MES缓冲溶液进行离心洗涤；

S2：以1L乳胶微球对应40μL的NHS和40μL的EDC的比例分别加入25mM的NHS和EDC反应液，混匀后进行孵育10min处理；

S3：利用MES缓冲溶液进行离心洗涤、去上清液处理；

S4：加入DON抗体至其终浓度为0.6mg/mL后混匀；反应2h；

S5：进行离心去除上清处理，并加入2％的BSA进行封闭,再次混匀；在反应1h后进行离心去除上清处理，之后，加入2％的BSA进行清洗、混匀；

S6：进行离心去除上清处理，乳胶微球悬浮于储存10mMpH7.0PBS缓冲溶液中，混匀并保存于储存温度为2-8℃的冰箱中备用，即得到偶联抗体；

S7：取上述制得的偶联抗体用冻干稀释液稀释后，进行冻干处理，将偶联抗体冻干于乳胶微球的微孔中形成反应微孔，即完成所述偶联抗体的冻干与包被，得到偶联有DON抗体的乳胶微球。

作为进一步优选方案，所述25mM、pH6.0的MES缓冲溶液的的制备方法为：将0.53g的MES溶于90mL纯水中，调节pH为6.0，并用纯水定容于100mL。

作为进一步优选方案，所述DON抗体通过下述方法制备获得：

(1)免疫原的制作

先取8mg脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原溶解于0.8mL的DMF中，再加入用0.2mL的水充分溶解的20mg的EDC，然后在室温下搅拌24小时，即可得到反应液A；称取36mg的OVA 并充分溶解在3mL浓度为0.1mol/L、pH为9.6的CB中，即可得到蛋白溶液A；将反应液A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液A中，并于室温下搅拌24小时，用浓度为0.01mol/L的PBS在4℃条件下透析3天并且每天更换3次透析液，即得到免疫原；

(2)免疫

用步骤(1)中得到的免疫原免疫Balb/c小鼠，免疫计量为100μg/只，使其产生抗血清；

(3)细胞融合和克隆化

取步骤(2)中的免疫Balb/C小鼠脾细胞，按数量配比为8:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争法ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(4)细胞冻存和复苏

将步骤(3)中得到的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存；复苏时取出液氮中长期保存的冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶培养；

(5)腹水的制备与纯化抗体

采用体内法，在小鼠腹腔内打细胞，7天后抽小鼠腹水，用饱和硫酸铵法纯化得到抗体。

本实用新型所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡的检测方法，包括如下步骤：

(1)预热：打开孵育器开关并于检测前升温至45±1℃；

(2)加液：用移液器吸取待检样本溶液120ul，垂直滴加入经过冻干与包被处理的偶联有DON抗体的乳胶微球中，反复吸打10次以上至混合均匀；

(3)孵育：将检测卡和步骤(2)得到的溶液放置在孵育器上，在45±1℃的条件下孵育2min；

(4)反应：取出孵育后的溶液，反复吸打4次以上，小心吸取反应后的液体120ul ±10ul，根据样品顺序逐滴加入检测卡的样品垫上(图1中S处加样孔)，反应5min；

(5)读取结果：根据检测卡的显示直接获得检测结果，或者，将从孵育器上取出的所述检测卡在1min内插入读数仪进行批量的定量检测，读取或/并打印检测结果。

作为优选方案，步骤(1)之后还包括以下步骤：标记样品：根据待检样本数量，取出相应数量的经过冻干与包被处理的偶联有DON抗体的乳胶微球和检测卡，并在检测卡上标记以区分待检样本溶液。

上述待检样本溶液适用检测范围为125μg/kg-2500μg/kg，其制备方法包括如下步骤：

(1)粉碎：将粮谷类样品进行粉碎；

(2)称量：称取5g粉碎好的粮谷类样品于50ml离心管中；

(3)混匀：在离心管中加入25mL去离子水，密封高速剧烈震荡混合3min后，于室温下静置2min；

(4)离心：静置或4000rpm离心5min；

(5)稀释：取100μL上层液体，加入900μL样品稀释液，混匀备用。

与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：

本实用新型所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，无需含有金标抗体的释放垫，检测卡制作简单，用于与检测样本溶液混合的偶联有DON抗体的乳胶微球，颜色鲜艳饱满，极易判别，且乳胶微球偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度、精密度和稳定性高；每批乳胶微球产量至少50L-100L，同批量是胶体金的5-10倍，批次间的差异性小且成本低廉；乳胶微球偶联过程操作简单，实验用品每次无需泡酸，受环境、人员和试剂影响较小，大大节省人力物力；另外，本实用新型所述检测卡的检测方法操作简易、成功率高，还可采用读数仪进行批量的读取、打印检测结果，相对于现有技术具有显著性进步和突出的有益效果。

附图说明

图1为本实用新型实施例1提供的一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡的结构示意图；

图2为本实用新型实施例3提供的所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡的检测方法的流程示意图。

图中标号示意如下：1、底板；2、样品垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本实用新型的技术方案做进一步详细描述。

实施例1

结合图1所示，本实施例提供的一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，包括依次设置于底板1上的样品垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，且不包括含有胶体金标记的抗体或单克隆抗体的释放垫，所述硝酸纤维素膜3上具有包被有脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂(DON-BSA)的检测线(T线)5和包被有羊抗鼠抗体的质控线(C线)6，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有DON抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。

在本实施例中，所述检测线5和所述质控线6的包被量分别为0.1mg/mL和0.4mg/mL，所述硝酸纤维素膜3在完成所述检测线5和所述质控线6的包被后，在37℃条件先进行烘干过夜处理。

在本实施例中，所述样品垫2、所述硝酸纤维素膜3和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板1上，所述样品垫2和所述吸水垫4分别与所述硝酸纤维素膜3搭接；所述样品垫2、所述硝酸纤维素膜3、所述吸水垫4、所述检测线5和所述质控线6沿所述底板1长度方向的的长度依次为25mm、21mm、20mm、3-4mm和3-4mm，所述样品垫2和所述吸水垫4分别与所述硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1-2mm。

所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂的通过下述方法制备获得：所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂通过下述方法制备获得：先取8mg脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原溶解于0.8mL的DMF中，再将加入用0.2mL的水充分溶解的20mg的EDC后，在室温下搅拌24小时，即可得到反应液A，称取36mg的OVA并充分溶解在3mL浓度为0.1mol/L、 pH为9.6的CB中，即可得到蛋白溶液A，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液A中，并于室温下搅拌24小时，最后，用浓度为0.01mol/L的PBS在4℃条件下透析3天并且每天更换3次透析液，即得到所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂。

所述偶联有DON抗体的乳胶微球通过下述方法制备获得：

S1：在乳胶微球中加入25mM、pH6.0的MES缓冲溶液，混匀后利用MES缓冲溶液进行离心洗涤；

S2：以1L乳胶微球对应40μL的NHS和40μL的EDC的比例分别加入25mM的NHS和EDC反应液，混匀后进行孵育10min处理；

S3：利用MES缓冲溶液进行离心洗涤、去上清液处理；

S4：加入DON抗体至其终浓度为0.6mg/mL后混匀；反应2h；

S5：进行离心去除上清处理，并加入2％的BSA进行封闭,再次混匀；在反应1h后进行离心去除上清处理，之后，加入2％的BSA进行清洗、混匀；

S6：进行离心去除上清处理，乳胶微球悬浮于储存10mMpH7.0PBS缓冲溶液中，混匀并保存于储存温度为2-8℃的冰箱中备用，即得到偶联抗体；

S7：取上述制得的偶联抗体用冻干稀释液稀释后，进行冻干处理，将偶联抗体冻干于乳胶微球的微孔中形成反应微孔，即完成所述偶联抗体的冻干与包被，得到偶联有DON抗体的乳胶微球。

作为优选，所述25mM、pH6.0的MES缓冲溶液的的制备方法为：0.53gMES溶于90mL纯水中，调节pH为6.0，并用纯水定容于100mL。

实施例2

本实施例中所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡同实施例1，不同之处仅在于，所述DON抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体通过下述方法制备获得：

(1)免疫原的制作

先取8mg脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原溶解于0.8mL的DMF中，再加入用0.2mL的水充分溶解的20mg的EDC，然后在室温下搅拌24小时，即可得到反应液A；称取36mg的OVA 并充分溶解在3mL浓度为0.1mol/L、pH为9.6的CB中，即可得到蛋白溶液A；将反应液A 逐滴缓慢滴加到蛋白溶液A中，并于室温下搅拌24小时，用浓度为0.01mol/L的PBS在4℃条件下透析3天并且每天更换3次透析液，即得到免疫原；

(2)免疫

用步骤(1)得到的免疫原免疫Balb/c小鼠，免疫计量为100μg/只，使其产生抗血清；

(3)细胞融合和克隆化

取步骤(2)中的免疫Balb/C小鼠脾细胞，按数量配比为8:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争法ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔；利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(4)细胞冻存和复苏

将步骤(3)中得到的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存；复苏时取出液氮中长期保存的冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶培养；

(5)腹水的制备与纯化抗体

采用体内法，在小鼠腹腔内打细胞，7天后抽小鼠腹水，用饱和硫酸铵法纯化得到抗体。

实施例3

结合图2所示，本实施例提供一种实施例1中所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡的检测方法，包括如下步骤：

(1)预热：打开孵育器开关并于检测前升温至45±1℃；

(2)标记样品：根据待检样本数量，取出相应数量的经过冻干与包被处理的偶联有DON 抗体的乳胶微球和检测卡，并在检测卡上标记以区分待检样本溶液

(3)加液：用移液器吸取待检样本溶液120ul，垂直滴加入经过冻干与包被处理的偶联有DON抗体的乳胶微球中，反复吸打10次以上至混合均匀；

(4)孵育：将检测卡和步骤(2)得到的溶液放置在孵育器上，在45±1℃的条件下孵育2min；

(5)反应：取出孵育后的溶液，反复吸打4次以上，小心吸取反应后的液体120ul ±10ul，根据样品顺序逐滴加入检测卡的样品垫2上(如图2中S处)，反应5min；

(6)读取结果：根据检测卡的显示直接获得检测结果，或者，将从孵育器上取出的所述检测卡在1min内插入读数仪进行批量的定量检测，读取或/并打印检测结果。

本实施例还提供所述待检样本溶液的制备方法，适用于检测范围为 125μg/kg-2500μg/kg，具体包括如下步骤：

(1)粉碎：将粮谷类样品进行粉碎；

(2)称量：称取5g粉碎好的粮谷类样品于50ml离心管中；

(3)混匀：在离心管中加入25mL去离子水，密封高速剧烈震荡混合3min后，于室温下静置2min；

(4)离心：静置或4000rpm离心5min；

(5)稀释：取100μL上层液体，加入900μL样品稀释液，混匀备用。

本实用新型所述检测卡的检测反应原理为：

在所述检测卡上滴加处理后的，若样品中含有等于或高于检测限脱氧雪腐镰刀菌烯醇, 脱氧雪腐镰刀菌烯醇首先与乳胶微球偶联的抗体结合形成复合物，此复合物连同乳胶微球向前涌动到检测线位置，偶联抗体表面位点由于被抗原占据，而使其不能与检测线5的脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂结合，此检测线5由于不能拦截乳胶微球而不显色或显色弱，将此检测结果视为阳性，而当样品中含有低于检测限脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，乳胶微球涌动到检测线5时将被脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂捕获，乳胶微球聚集于检测线5上呈现出肉眼可见的红色条带，此检测结果视为阴性，当检测线5与质控线6均为无色或质控线不显色时，表明不正确的操作过程或检测卡已变质失效。

样本检测1

取谷物样本玉米，终浓度705μg/kg、1000μg/kg、1410μg/kg，分别经上述方法制得待检样本溶液后采用上述检测卡检测，每个浓度检测21个平行样分于3个评价人进行评价检测，读取结果如表1所示。

表1.DON检测卡评价结果(玉米)

样本检测2

取谷物样本小麦，终浓度500μg/kg、1000μg/kg、1870μg/kg。分别经上述方法制得待检样本溶液后采用上述检测卡检测，每个浓度检测21个平行样分于3个评价人进行评价检测，读取结果如表2所示。

表2.DON检测卡评价结果(小麦)

由表1、表2可见，采用本实用新型所述检测卡及检测方法分别测定玉米、小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其回收率分别均在102％-106％之间和99％-106％之间，RSD分别均在 2.3％-6.1％之间和2.9％-5.7％之间，说明本发明实用新型所述检测卡及检测方法的回收率良好、变异系数较小、准确度高。

本实用新型提供的检测卡具有以下优点：

1、红色乳胶微球颜色鲜艳饱满，颜色极好判别；

2、每批乳胶微球产量至少50L-100L，同批量是胶体金的5-10倍；

3、乳胶微球偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，准确度和精密度高；

4、乳胶微球偶联过程操作简单，实验用品每次无需泡酸，受环境、人员和试剂影响较小，大大节省人力物力；非专业人士按照说明书操作也可完成检测。

最后有必要在此指出的是：以上所述仅为本实用新型较佳的具体实施方案，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有脱氧雪腐镰刀菌烯醇半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有DON抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述检测线和所述质控线的包被量分别为0.1mg/mL和0.4mg/mL。

3.根据权利要求2所述的检测卡，其特征在于：所述硝酸纤维素膜在完成所述检测线和所述质控线的包被后，在37℃条件先进行烘干过夜处理。

4.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜搭接。

5.根据权利要求4所述的检测卡，其特征在于：所述样品垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水垫、所述检测线和所述质控线沿所述底板长度方向的长度依次为25mm、21mm、20mm、3-4mm和3-4mm，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm。