CN106248894A - 一种检测牛奶中抗生素残留的纸芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种检测牛奶中抗生素残留的纸芯片：牛奶中四环素、氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类5种抗生素残留的纸芯片检测方法。目的在于提供一种多通道检测纸芯片，本发明在检测数量、检测指标、检测时间方面做了改进，而且提供一种开放式的平台，在纸芯片上的检测指标可以根据实际需求调整。结果发现，该纸芯片具有成本低，灵敏度高，平台开放，结果准确等优点，给食品安全检测领域开发纸芯片提供了一定的指导意义。

Description

一种检测牛奶中抗生素残留的纸芯片

技术领域

本发明涉及食品安全快速检测领域，尤其涉及牛奶中抗生素残留快速检测领域。

背景技术

抗生素在畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中残留抗生素。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。我国过去对牛奶中抗生素残留卫生指标无明文规定，直到2001年10月，农业部发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，对新鲜牛乳的卫生指标明确了“抗生素不得检出”。但对这一行业标准，我国目前并未能严格执行，致使我国牛奶及奶制品中抗生素残留问题一直未能得到解决，以至引起了人们对牛奶安全问题的担忧，并成为越来越受关注的热点。 1988年，周树南对江苏省8市10个牧场的鲜奶、消毒牛奶和奶粉中抗生素残留情况进行调查，结果发现鲜奶阳性率3.6％，消毒牛奶11.4％，奶粉39.58％。李权超(1991)、王晓光(1992)测得长春市市售鲜牛奶中抗生素残留阳性率3.3％，可疑率18.3％和2.5％。张利琴(1999)、常建军(2000)测得西宁市市售鲜奶中抗生素阳性率分别为2％、11.7％和5.3％。 葛华等（1996）对西宁市各类奶样进行调查，共采集奶样187份（奶牛场生奶110份、牛奶公司袋装消毒奶35份、私人沿街售奶42份），检出有抗生素残留奶8份，阳性率4.3％。王春奕等(1996)检测的5批25份市售消毒鲜牛奶中抗生素残留质量分数在1.5×l0－9以上，超过了世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)规定的奶中青霉素含量为0的标准。并认为这可能与饲料中添加的抗生素过量和兽医临床大剂量长期使用抗生素有关。马群飞等(2002)对福建省生牛乳抗生素残留情况进行调查，结果86件鲜乳样中共检出抗生素残留阳性样品17件，检出率19.8％。据此提出福建省乳牛散养农户生产的生牛乳抗生素残留阳性率较高，应通过改善饲养条件和加强监测予以控制。以上情况可以看出，我国牛奶中抗生素残留现状并不令人乐观，有关部门应加强对牛奶生产的管理，并对牛奶中的抗生素等药物残留进行有效检测和监控，以保证人们饮用牛奶的卫生和安全。

目前，主要采用的检测方法有：微生物检测法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等；理化检测法，理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高；免疫法，目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(immunoassays，IAs)，如RIA、ELISA、固相免疫传感器(soindphase immunosensor )等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(immunoaffinity chromatogrphy,IAC)。

本发明主要利用免疫学原理，跟理化技术相结合，采用纸芯片的检测形式，具有成本低，灵敏度高，平台开放，多通道，结果准确等优点。

鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，应重视和加强检测工作，并努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选多残留分析技术；实现分析过程自动化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保证消费者的健康 。

发明内容

为解决上述中存在的问题与缺陷，本发明一种检测牛奶中抗生素残留的纸芯片，能同时检测牛奶中四环素、氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类5种抗生素残留。

本发明提供的技术方案的有益效果是：

本发明提供的同时检测牛奶中四环素、氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类5种抗生素残留，而且根据实际情况可以将别的项目接入此种芯片，采用的技术原理是竞争免疫胶体金层析法，大大提高检测效率，缩短检测时间，为企业质控，监管部门现场执法、日常监督的快速检测提供有力技术支撑，对促进我国食品安全事业具有重要意义。

附图说明

图1是牛奶中四环素、氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类5种抗生素残留的胶体金纸芯片结构图。

其中，图1：1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为底板，4为检测点（左上为四环素检测点、左中为氯霉素检测点、左下为磺胺类检测点、右上为质控点、右中为喹诺酮类检测点、右下为β-内酰胺类检测点），5为硝酸素纤维膜，6为吸水纸。

具体实施方式

实施例1

1、测制胶体金：在冷凝回流装置中的圆底烧瓶中加入100mL超纯水和1mL1%的氯金酸溶液，加热至沸腾后加入1mL1%浓度的柠檬酸三钠溶液，观察颜色变化，待颜色稳定时继续反应10min，冷却静置一天，利用粒度仪检测制得粒径为40nm胶体金，其最大吸收峰在526nm。

2、制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH8.2，分别标记抗体，方法如下：取最佳用量单克隆抗体（TC、CAP、SAS、QNS、β-lactams抗体标记量分别是：6μg/mL、8μg/mL、11μg/mL、9μg/mL、9μg/mL）、终质量浓度为1%的海藻糖同时加入100mL胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，得到四种金标抗体各100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

3、首先将金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液于4℃再8000 r/min离心30min。溶液分为三层:透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬液：终质量浓度为0.1%吐温20、1%海藻糖、0.5% BSA、0.01mol/L PBS pH7.4溶液。重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0.1%的叠氮钠4℃保存备用。

4、将样品垫和金标抗体结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后37℃、2小时烘干，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3%%吐温20、2%海藻糖、10%蔗糖及pH值为7.4浓度为0.01mol/L的PBS溶液。

5、将金标抗体点样在金标抗体结合垫上：金标抗体调浓度至OD₅₂₆为5，将五种金标抗体等体积混匀，点样机将金标抗体在结合垫上均匀点样，点样量在30μL/cm²，37℃真空干燥。

6、检测点抗原和控制点二抗的包被：分别将包被抗原稀释到0.9mg/mL，二抗稀释度为商品化稀释0.2 mg/mL倍，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，37℃干燥。

7、试纸条的组装：将2.4cm×0.8cmNC膜、1.8cm×0.8cm吸水纸、0.6cm×0.8cm胶体金结合垫、1.5cm×0.8cm样品垫按图1方式依次粘贴在PVC胶板上，即成纸芯片。

实施例2

1、根据实施例1中1所述。

2、制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH8.2，分别标记抗体，方法如下：取最佳用量单克隆抗体（TC、CAP、SAS、QNS、β-lactams抗体标记量分别是：5μg/mL、7μg/mL、9μg/mL、8μg/mL、8μg/mL）、终质量浓度为1%的海藻糖同时加入100mL胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，得到四种金标抗体各100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

3、根据实施例1中3所述。

4、根据实施例1中4所述。

5、根据实施例1中5所述。

6、检测线抗原和控制线二抗的包被：TC-BSA、CAP-BSA、SAS-BSA、QNS-BSA、β-lactams-BSA分别稀释到0.5、0.6、0.8、0.5、0.5mg/mL，二抗稀释度为商品化稀释0.1 mg/mL倍，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，37℃干燥。

7、根据实施例1中7所述。

实施例3

1、根据实施例1中1所述。

2、制备胶体金标记抗体：最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体金用0.1mol/L的HCl和K₂CO₃调至pH8.2，分别标记抗体，方法如下：取最佳用量单克隆抗体（TC、CAP、SAS、QNS、β-lactams抗体标记量分别是：6μg/mL、8μg/mL、11μg/mL、9μg/mL、9μg/mL）、终质量浓度为1%的海藻糖同时加入100mL胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合10min后，加入终质量浓度为0.5%的BSA，得到四种金标抗体各100mL，4℃保存过夜后冷冻超速离心纯化。

3、根据实施例1中3所述。

4、根据实施例1中4所述。

5、根据实施例1中5所述。

6、检测线抗原和控制线二抗的包被：TC-BSA、CAP-BSA、SAS-BSA、QNS-BSA、β-lactams-BSA五个检测点浓度分别是1.2、1.3、1.2、1.4、1.4mg/mL，二抗稀释度为商品化稀释0.1mg/mL倍，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，37℃干燥。

7、根据实施例1中7所述。

Claims (3)

1.一种检测牛奶中抗生素残留的纸芯片，包括：胶体金制备，胶体金标记五种单克隆抗体制备金标抗体，金标抗体纯化，金标抗体结合垫以及样品垫的制备，纸芯片点样，纸芯片组装，其特征在于：分别标记每种单克隆抗体、浓缩纯化每种金标抗体，将五种浓缩液混合在一起，然后用重悬液稀释到合适的喷金浓度，将该金标抗体喷涂在胶体金结合垫；在同一块硝硝酸素纤维膜上同时阵列点样包被抗原，分别是：四环素偶联牛血清白蛋白全抗原（TC-BSA），氯霉素偶联牛血清白蛋白全抗原（CAP-BSA）、磺胺类偶联牛血清白蛋白全抗原（SAS-BSA）、喹诺酮类偶联牛血清白蛋白全抗原（QNS-BSA）、β-内酰胺类偶联牛血清白蛋白全抗原（β-lactams-BSA）、 羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述一种同时检测四种硝基呋喃代谢物胶体金试纸条及其制备方法，其特征是：采用单独标记单克隆抗体法，在每种抗体自身合适的条件下进行胶体金标记抗体的反应，TC、CAP、SAS、QNS、β-lactams抗体标记量分别是：3~6μg/mL、4~8μg/mL、5~11μg/mL、4~9μg/mL、4~9μg/mL。

3.根据权利要求1所述一种同时检测四种硝基呋喃代谢物胶体金试纸条及其制备方法，其特征是：一次同时阵列点样6个点，五个检测点，一个质控点，TC-BSA、CAP-BSA、SAS-BSA、QNS-BSA、β-lactams-BSA五个检测点浓度分别是：0.5~1.2mg/mL、0.6~1.3mg/mL、0.8~1.2mg/mL、0.5~1.4mg/mL、0.5~1.4mg/mL；质控点羊抗鼠IgG的浓度为0.1~0.2mg/mL。