CN109406784A - 一种检测微囊藻毒素mc-lr时间分辨荧光免疫定量poct试纸条 - Google Patents

一种检测微囊藻毒素mc-lr时间分辨荧光免疫定量poct试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明属于时间分辨免疫检测领域，根据时间分辨荧光免疫层析技术和POCT理念开发了一种检测微囊藻毒素MC‑LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条。本发明试纸条先用铕(Eu)荧光微球标记抗体，然后将其固定于结合垫上，再将抗原固定于NC膜上，37℃烘干，最后将样品垫、荧光微球结合物垫、NC膜和吸水垫依次搭接于PVC板上，切成4mm宽的试纸条，转入PVC卡壳，卡壳上设有与样品垫相配合的加样孔，和与检测T线和质控C线相配合的读数窗口。本发明试纸条采用竞争免疫反应的检测原理，将试纸条插入时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪，可实现方便快捷、低成本、高灵敏的定量检测水体及水产品中微囊藻毒素(MC‑LR)的含量，整个检测过程仅需5min，检测限0.05ppb，定量线性范围为 0‑10ppb。

Description

一种检测微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试 纸条
技术领域
本发明属于时间分辨免疫检测领域，尤其是一种水体及水产品中快速定量检测微囊藻毒素技术领域。
背景技术
随着全球水体富营养化程度加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加，由此产生的代谢产物微囊藻毒素（Microcystins, MCs），对水体环境和人类健康的危害己成为全球关注的重大环境问题之一。微囊藻毒素(MC)是一种细胞内毒素，当藻类死亡后其细胞破裂释放出毒素，结构为环状七肽化合物，相对分子质量在1000 左右，至今发现的MC异构体中，毒性最大的是MC-LR，对动物和人有强烈的肝毒性。微囊藻水华在全球淡水水体中发生频率最高、范围最广、持续时间长且危害最大，浮游动物和鱼类对微囊藻毒素有较大的耐受性,毒素常可在其体内富集和存留，并达到相当高的浓度，由于微囊藻毒素具热稳定性和水溶性，普通的食物烹调过程不能除去，因此微囊藻毒素还可通过食物链对人类造成潜在的健康威胁。1998年，世界卫生组织（WHO）出版的《用水卫生基准》中建议饮用水中 MC-LR安全标准为1.0µ g/L，我国2006年在颁布的《用水卫生标准》（GB5749-2006 ）中增加了微囊藻毒素MC-LR 的检测指标和限量标准，规定其限量值为1.0 μg/L。
目前MC-LR的检测方法有生物毒理检测法、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱分析(LC-MS)等。生物毒理检测由于费用高、动物保护等限制己很少使用；蛋白磷酸酶抑制法选择性较差，结果不够准确，实际应用受到了很大限制；免疫分析法是基于抗原-抗体特异性反应的分析方法，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、费用低廉等特点，是目前比较常用的检测方法，包括酶联免疫吸附法 (ELISA）、胶体金快速检测法等，但也均存在各自的优缺点，酶联免疫吸附法虽然结果准确，但操作简便性欠佳，需要多次孵育和洗涤，操作繁琐，耗时长，至少1.5小时才能检测出结果；胶体金法检测快速，但灵敏度较低，且只能实现定性或半定量检测，无法给出定量的检测结果；高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱分析(LC-MS)，可以对微囊藻毒素进行定量的分析测定，结果可靠，但色谱法所使用的仪器价格昂贵，需要专业人员进行操作，前处理复杂，分析周期长，成本高，也无法满足大量样品的筛选和实时检测的需要。
发明内容
为了克服上述检测缺点，本发明根据时间分辨荧光免疫层析技术和POCT的理念开发了一种检测微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条。POCT ( point-of-care testing)是医学检验的一种新模式，2004年POCT概念引入中国，开始在医学检验上使用，2013年国家标准化委员会将POCT正式命名为即时检验，即可以不受样品多少，场地限制实时检测。本发明使用镧系元素铕(Eu)荧光微球标记抗体，根据其发光特点和光谱特性，用时间分辨技术测量发射荧光，通过时间延迟和波长分辨，有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。本发明试纸条采用竞争免疫反应的原理，仅配合一台时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪，可实现方便快捷、低成本、高灵敏的定量检测水体及水产品中微囊藻毒素(MC-LR)的含量，检测时间仅需 5分钟，可满足当前实时快速监测现场饮用水的安全和大规模的水体及水产品中微囊藻毒素(MC-LR)的检测，具有重要的经济价值和社会效益。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1.微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条包括：PVC塑料卡壳、样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)反应膜（T线、C线）、吸水垫。
2.所述试纸条组装工艺为：先用时间分辨铕(Eu)荧光微球标记抗体，然后将其干燥固定于结合垫上，再将抗原固定于NC膜上，37℃烘干，最后将样品垫、荧光微球结合物垫、NC膜和吸水垫依次搭接于PVC板上，再切成4mm宽的试纸条。
3.所述试纸条中关键为结合垫和NC反应膜的制备，其中结合垫上是喷有时间分辨Eu荧光微球标记的微囊藻毒素 (MC-LR) 鼠单抗和时间分辨Eu荧光微球标记的兔IgG抗体，NC反应膜检测 T线上包被的是微囊藻毒素MC-LR抗原，质控C线包被的是羊抗兔二抗。
4.样品垫的处理：所述样品垫材料为玻璃纤维素膜，用含有EDTA、tween-20、牛血清白蛋白的磷酸缓冲液浸泡样品垫，然后在37℃干燥2小时，置于密封干燥袋中保存备用。
5. 所述吸水垫为吸水滤纸，层析中吸收反应后多余的样本溶液。
附图说明
下面结合附图对发明做进一步说明
附图1为本发明微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条的构造图
1-样品垫；2-荧光标记物结合垫；3-检测线T；4-控制线C；5-吸水垫；6-硝酸纤维素膜(NC膜)；7-PVC板
具体实施方式
1、时间分辨Eu荧光微球的活化：优选1%(W/V)包埋镧系元素Eu，粒径180-360nm羧基化的荧光微球，取200µ L荧光微球，100W超声处理 1min,稀释到500µL 0.1 mol/L pH8.0的硼酸缓冲液，加入50µL碳二亚胺（EDC )试剂（购自上海伯奥生物科技股份有限公司）和100µL的 N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）试剂（购自上海伯奥生物科技股份有限公司），25℃置于震荡摇床上140转／分钟混匀活化15min，然后20000转／分钟高速离心10分钟，除去上清溶液，用0.1mol/L硼酸缓冲液反复洗涤2-3次，备用。
2、制备微囊藻毒素(MC-LR)鼠单抗时间分辨铕(Eu)荧光微球标记物：取上述活化后的时间分辨Eu荧光微球,使用时100W超声分散2min, 加入200µg的微囊藻毒素(MC-LR)鼠单抗（MC-LR鼠单抗由上海雄图生物科技有限公司提供），25℃置于震荡摇床上140转／分钟偶联反应2小时，加入1% 的牛血清白蛋白BSA溶液50µL 封闭过夜，最后20000转／分钟高速离心10分钟，用0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤2-3次，置于4-8℃冰箱中保存备用。同理标记兔IgG，制成兔IgG时间分辨铕(Eu)的荧光微球标记物。
3、制备时间分辨Eu荧光微球标记物结合垫：首先用含2.5% ( m/v）蔗糖、1% (m/v）牛血清白蛋白、1% ( v/v )tween-20的 0.1 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲液浸泡荧光结合垫玻璃纤维素膜，然后置于37℃烘箱中烘干2小时。再将0.05 mg/mL微囊藻毒素MC-LR鼠单抗时间分辨铕(Eu)荧光微球标记物和0.1 mg/mL兔IgG时间分辨铕(Eu)的荧光微球标记物，用喷金仪喷于处理烘干后的结合垫上，在37℃烘箱中干燥过夜，置于密封干燥包装袋中保存备用。
4、制备硝酸纤维素膜T线和C线：用含有0.5% ( m/v）牛血清白蛋白、2.5%( m/v）蔗糖溶液的 0.01 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲溶液，将微囊藻毒素 MC-LR抗原配制成浓度0.05mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜表面，包被成检测线 T线，同样用含有1% ( m/v）牛血清白蛋白、2.5%( m/v）蔗糖溶液的 0.01 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲溶液，将羊抗兔二抗配制成0.1mg/mL，用喷膜机喷涂在距离T线右边4mm处，包被成质控线C线，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干过夜，置于室温干燥环境中保存备用。
5、微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条的制备：在底衬依次相互搭接地粘贴以上处理好的样品垫、时间分辨Eu荧光标记物结合垫、带有T线和C线的硝酸纤维素反应膜和吸水垫得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条。转入PVC卡壳，卡壳上设有与所述样品垫相配合的加样孔，和与所述反应膜检测T线和质控C线相配合的读数窗口。
6、定量标准曲线的确定：将微囊藻毒素MC-LR标准品分别用0.01mol/L pH7.4的PBS溶液稀释成0ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL。按照标准操作方法每个浓度检测10次，以相对荧光强度为纵坐标，微囊藻毒素MC-LR的浓度为横坐标，获得标准曲线，将标准曲线的参数、产品批号等信息储存入ID卡中。
7、样品检测过程：先将时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪（上海雄图生物科技有限公司提供）开机预热5分钟，插入本批次产品所对应的ID卡，将本发明的试纸条平放于桌面上，取100µL待测水样或水产品的提取液，滴加到试纸条的加样孔中，37℃孵育，计时 5分钟，插入时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪卡槽中，按检测键即可进行自动检测计算和读数。整个检测过程仅需5min，检测限0.05ppb，定量线性范围为 0-10ppb，满足世界卫生组织（ WHO）和我国有关水体中藻毒素的残留限量标准，适应大规模样品的快速定量检测，满足当前需要。

Claims (5)

1.一种检测微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条，其特征在于其组装工艺为：先用时间分辨铕(Eu)荧光微球标记抗体，然后将其干燥固定于结合垫上，再将抗原固定于NC膜上，37℃烘干，最后将样品垫、荧光微球结合物垫、NC膜和吸水垫依次搭接于PVC板上，再切成4mm宽的试纸条，转入PVC卡壳，卡壳上设有与所述样品垫相配合的加样孔，和与所述反应膜检测T线和质控C线相配合的读数窗口。
2.根据权利要求1所述试纸条中微囊藻毒素(MC-LR)鼠单抗时间分辨铕(Eu)荧光微球标记物的制备：取活化后的时间分辨Eu荧光微球,使用时100W超声分散2min, 加入200µg的微囊藻毒素(MC-LR)鼠单抗（MC-LR鼠单抗由上海雄图生物科技有限公司提供），25℃置于震荡摇床上140转／分钟偶联反应2小时，加入1% 的牛血清白蛋白BSA溶液50µL 封闭过夜，最后20000转／分钟高速离心10分钟，用0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤2-3次，置于4-8℃冰箱中保存备用，同理标记兔IgG，制成兔IgG时间分辨铕(Eu)的荧光微球标记物。
3.根据权利要求1所述试纸条中关键为结合垫制备，其特征在于：首先用含2.5% ( m/v）海藻糖、1% (m/v）牛血清白蛋白、1% ( v/v )tween-20的 0.1 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲液浸泡荧光结合垫玻璃纤维素膜，然后置于37℃烘箱中烘干2小时，再将0.05 mg/mL微囊藻毒素MC-LR鼠单抗时间分辨铕(Eu)荧光微球标记物和0.1 mg/mL兔IgG时间分辨铕(Eu)的荧光微球标记物，用喷金仪喷于处理烘干后的结合垫上，在37℃烘箱中干燥过夜，置于密封干燥包装袋中保存备用。
4.根据权利要求1所述试纸条中关键技术NC反应膜的制备：用含有0.5% ( m/v）牛血清白蛋白、2.5%蔗糖溶液的 0.01 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲溶液，将微囊藻毒素 MC-LR抗原配制成浓度0.05 mg/mL，用喷膜机喷涂在硝酸纤维素膜表面，包被成检测线 T线，同样用含有1% ( m/v）牛血清白蛋白、2.5%蔗糖溶液的 0.01 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲溶液，将羊抗兔二抗配制成0.1 mg/mL，用喷膜机喷涂在距离T线右边4mm处，包被成质控线C线，将喷涂好的硝酸纤维素膜 37℃烘干过夜，置于室温干燥环境中保存备用。
5.用微囊藻毒素MC-LR时间分辨荧光免疫定量POCT试纸条检测样品的过程，其特征在于先将时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪（上海雄图生物科技有限公司提供）开机预热5分钟，插入本批次产品所对应的ID卡，将本发明的试纸条平放于桌面上，取100µL待测水样或水产品的提取液，滴加到试纸条的加样孔中，37℃孵育，计时 5分钟，插入时间分辨荧光免疫定量POCT分析仪卡槽中 ，按检测键即可进行自动检测计算和读数，整个检测过程仅需5min，检测限0.05ppb，定量线性范围为 0-10ppb。
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