CN112462053A - 一种能同时检测三种真菌毒素的荧光定量试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能同时检测真菌毒素（DON/ZEN/AFB1)的荧光定量试纸条及其制备方法和应用，首先用荧光微球标记三种真菌毒素的特异性抗体和兔IgG，然后将其干燥于荧光结合垫上；在NC膜上依次划上三种真菌毒素与小牛血清白蛋白偶联物的检测线T1、T2、T3和羊抗兔的质控线C线；最后组装试纸条：在PVC硬板纸上依次搭接并粘贴样品垫、荧光标记物结合垫、划有三根检测线（T1/T2/T3线）和一根质控线（C线）的硝酸纤维素膜、吸水纸，组装完毕后剪切成试纸条，然后装入塑料卡壳中。本发明的试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可在8min内实现对粮食谷物中三种常见真菌毒素的快速定量检测，其结果准确性及操作简易性远超过市场上大多数免疫层析快速检测产品。
Description
技术领域
本发明属于真菌毒素检测技术领域，特别涉及一种可同时对粮食谷物中真菌毒素（DON/ZEN/AFB1)进行快速定量检测的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
全球谷物饲料中霉菌毒素污染都十分普遍和严重。各类原料和饲料、各个地区、各个季节均有霉菌毒素污染，检出率可高达70%～100%，按照饲料卫生标准判定的毒素超标率可达20%～80%。污染饲料的检出毒素少者2～3种，多者7～8种，呈现多种霉菌毒素复合污染的特征，其中几种主要毒素德结构式如下：
根据联合国粮农组织的调查，全球每年約有25%的粮食受到真菌毒素污染，约有2%的农作物因污染严重而失去利用价值。然而，并不是所有受真菌毒素污染的粮食都能被消费者辨识，如果种植、存储、加工等环节控制不当，粮食的加工产品就有可能真菌毒素超标，长期食用或对人体健康造成危害。2017年9月17日，新修订的国标《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）正式实施，其中规定了人们常吃的食物中对人体危害较大的真菌毒素（呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮）的限量值，见表一、二、三；同时要求食品生产和加工者采取控制措施，使食品中真菌毒素的含量达到最低水平。
表一 食品中呕吐毒素（DON）的限量标准
表二 食品中黄曲霉毒素B1（AFB1）的限量标准
表三 食品中玉米赤霉烯酮（ZEN）的限量标准
目前真菌毒素的检测技术主要有色谱法、蛋白磷酸酶抑制法和免疫分析法等。色谱法可以真菌毒素类物质进行定性和定量的分析测定，结果可靠，但色谱法所使用的仪器价格昂贵，需要专业的人员进行操作，前处理繁复，分析周期长，成本高，一般只适用于确证检测。蛋白磷酸酶抑制法目前还不够成熟，酶反应体系中许多变量尚未进行量化和建立统一的标准，且选择性较差，环境中的许多物质可对测定造成干扰，结果不够准确，因此实际应用受到了很大限制。免疫分析法是基于抗原-抗体特异性反应的分析方法，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快，费用低廉等特点，是目前比较常用的常规检测方法，包括酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金快速检测法等，但也均存在各自的优缺点，酶联免疫吸附法虽然检测灵敏度高、结果准确，但是操作相对复杂，时间较长，且一次只能检测一种毒素；胶体金法无需对样品进行前处理，检测快速，但灵敏度相对较低，且只能实现定性或半定量检测，无法给出定量的检测结果。
发明内容
本发明目的在于提供一种时间分辨荧光免疫层析试纸条，它可同时对粮食谷物中三种常见真菌毒素（DON/ZEN/AFB1)进行快速定量检测，样品只需简单的前处理，检测时间仅需8min，三种真菌毒素中DON的检测灵敏度达到25ug/kg，定量线性范围100～5000ug/kg，ZEN的检测灵敏度达到2ug/kg，定量线性范围5～500ug/kg，AFB1的检测灵敏度达到0.5ug/kg，定量线性范围1～75ug/kg，满足世界卫生组织（WHO）和我国有关粮食谷物中真菌毒素的残留限量标准，适应大规模样品的快速筛查和预警监测，满足当前的检测需要。本发明的目的还在于提供上述试纸条的制备方法和在检测真菌毒素中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，包括：衬板和衬板上依次粘贴吸附的样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上划有三根检测线T1/T2/T3线和一根质控线C线。
所述检测线T1/T2/T3线分别包被的抗原为真菌毒素DON与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素ZEN与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素AFB1与牛血清白蛋白的偶联物。
所述质控线C线包被的抗原为羊抗兔二抗。
所述荧光标记物结合垫上用喷金仪分别喷有真菌毒素DON的鼠单抗时间分辨荧光微球标记物、真菌毒素ZEN的鼠单抗时间分辨荧光微球标记物、真菌毒素AFB1的鼠单抗时间分辨荧光微球标记物、兔IgG时间分辨荧光微球标记物。
所述衬板为PVC硬板纸，所述样品垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜或海绵。
一种真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备抗体的荧光微球标记物：先将荧光微球用EDC和NHS进行活化，然后离心除去多余的EDC和NHS，用偶联缓冲液复溶后加入抗体进行偶联，偶联2～4小时后，加入牛血清白蛋白BSA和乙醇胺封闭过夜，最后离心洗涤2～3次后，用储存缓冲液复溶置于4℃保存；
（2）制备硝酸纤维素膜T线和C线：将真菌毒素DON与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素ZEN与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素AFB1与牛血清白蛋白的偶联物用喷膜机由左至右依次喷涂在硝酸纤维素膜表面形成检测线T1、T2和T3线，将羊抗兔二抗用喷膜机喷涂在T3线右边形成质控线C线，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用；
（3）荧光标记物结合垫的制备：先用海藻糖、牛血清白蛋白、PVP的磷酸缓冲液浸泡Fusion5，然后置于37℃烘箱中烘干2小时，再将三种真菌毒素抗体荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物用磷酸缓冲液分别稀释后，用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用；
（4）样品垫的处理：用含有EDTA、tween-20、PVP、BSA的PBS缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用；
（5）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理过的样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有三条检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜以及吸水纸，组装完毕后剪切成4 mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可。
所述荧光微球粒径范围为100～1000nm，优选粒径为200～400nm；荧光发光物为铕、钐、铽或镝等稀有元素，优选为铕元素；荧光微球表面基团为氨基、羧基、巯基或羟基等基团，优选为羧基。
所述荧光微球表面基团密度（Parking Area）为20～250 sq·A/grp，优选为25 ～50 sq·A/grp。
所述三条检测线T线和质控线C线之间的间距为3～10mm，优选4mm间距。
一种真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条在检测真菌毒素的应用，包括以下步骤：取100μL样品，滴加在试纸条卡壳的加样孔中，计时8分钟，然后将试纸条卡壳插入荧光读数仪的卡槽中，读数仪将分别激发扫描和读取T1/T2/T3/C线的荧光强度，根据荧光强度的大小和荧光读数仪中内置的标准曲线即可自动计算出样品的三种真菌毒素的准确浓度。
本发明将时间分辨荧光技术和免疫层析技术结合，开发了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条 (Time-Resolved Fluorescence Immunoassay Lateral FlowStrip，TRF-LFS)，通过免疫竞争法原理可同时对粮食谷物中三种常见真菌毒素（DON/ZEN/AFB1)进行高灵敏的快速准确定量检测。实验证实，本发明的真菌毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可在8min内实现对粮食谷物中三种常见真菌毒素的快速定量检测，无需任何样品前处理操作，其结果准确性及操作简易性远超过市场上大多数免疫层析快速检测产品；能适应大规模样品的快速筛查和预警监测，满足当前的检测需要，具有重要的经济价值和社会效益。
附图说明
图1是本申请实施例试纸条的结构示意图。
图中：1、样品垫；2、荧光标记物结合垫；3、硝酸纤维素膜；4、检测线T1；5、检测线T2；6、检测线T3；7、质控线C；8、吸水纸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1、真菌毒素抗体荧光微球标记物的制备
取固含量为1%的Eu荧光微球（南京微测生物科技有限公司）100μL稀释于400μL0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺（EDC）(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)和60μL 10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，室温置于旋转摇床上50转/分钟活化15min，然后40000g离心10分钟，去除上清溶液，用0.05 mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，然后80W超声处理30s，加入50μg的真菌毒素鼠单抗（三种真菌毒素鼠单抗均为江南大学食品学院提供），室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10%的BSA（购自上海西宝生物科技有限公司）溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10分钟，用0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
2、兔IgG荧光微球标记物的制备
取固含量为1%的Eu荧光微球（南京微测生物科技有限公司）100μL稀释于400μL0.05 mol/L pH8.0的硼酸缓冲液中，加入30μL 10mg/mL的碳二亚胺（EDC）(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)，再加入100μg兔IgG（购自长沙博优生物科技有限公司），室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50m mol/L的乙醇胺(购自上海晶纯生化科技股份有限公司)、10%的BSA（购自上海西宝生物科技有限公司）溶液50μL封闭过夜，最后40000g离心10分钟，用0.05 mol/L pH8.0的硼酸缓冲液复溶，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，置于4～8℃冰箱中保存备用。
3、试纸条的制备
1)硝酸纤维素膜T线和C线的制备
将真菌毒素DON与牛血清白蛋白偶联物、真菌毒素ZEN与牛血清白蛋白偶联物、真菌毒素AFB1与牛血清白蛋白偶联物（三种真菌毒素与牛血清白蛋白的偶联物均为江南大学食品学院提供）分别用含1.5%（m/v）海藻糖、0.5%（m/v）牛血清白蛋白、0.05%（v/v）SDS的0.01 mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.025 mg/mL，用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端依次为10mm处、14mm处、18mm处形成检测线T1、T2和T3；将羊抗兔IgG单克隆抗体用含1.5%（m/v）海藻糖、0.5%（m/v）牛血清白蛋白、0.05%（v/v）SDS的0.01 mol/L pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端22mm处形成质控线C线。将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用。
2）荧光标记物结合垫的制备
首先用含2.5%（m/v）海藻糖、1%（m/v）牛血清白蛋白、1%（v/v）tween-20、0.5%（m/v）的PVP的0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液浸泡荧光结合垫Fusion5（购自GE公司），然后置于37℃烘箱中烘干2小时。再将三种真菌毒素抗体荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物用0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液分别稀释500倍、500倍、600倍、1200倍，用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
3）样品垫的处理
用含有10m mol/L EDTA、1%（v/v）的tween-20、0.5%（m/v）PVP、0.5%（m/v）的BSA的PBS缓冲液（0.2 mol/L，pH8.0）浸泡玻璃纤维素膜样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
4）试纸条的组装
参看图1，在PVC背衬上依次搭接并粘贴：处理过的样品垫、喷有荧光标记物探针的荧光标记物结合垫、喷涂有三条检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜以及吸水纸，组装完毕后剪切成4 mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可，保质期可达两年以上。
4、定量标准曲线的确定
将真菌毒素DON标准品用0.05 mol/L pH7.4的PBS稀释到0ug/kg、100ug/kg、250ug/kg、500ug/kg、1000ug/kg、2500ug/kg、5000ug/kg，真菌毒素ZEN标准品用0.05 mol/LpH7.4的PBS稀释到0ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、25ug/kg、50ug/kg、100ug/kg、250ug/kg、500ug/kg，真菌毒素AFB1标准品用0.05 mol/L pH7.4的PBS稀释到0ug/kg、1ug/kg、2.5ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、25ug/kg、50ug/kg、75ug/kg，按照标准操作流程每种毒素每个浓度检测10次，然后将所测得的数值输入Microdetection食品安全管理软件（南京微测生物科技有限公司）中，即可获得标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入ID卡中即可。
5、样品检测过程
将Microdetection荧光读数仪开机预热5分钟，然后插入本批次产品所对应的标准曲线ID卡，读数仪将自动读取标准曲线参数。打开检测卡的包装袋，平放于桌面上，取100μL待测水样，滴加至检测卡的加样孔中，计时8分钟，插入荧光读数仪中，按读数键即可进行读数和自动计算，三种真菌毒素的最终浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪器上GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结果的实时监控。
整个检测过程仅需8 min，三种真菌毒素中DON的检测灵敏度达到25ug/kg，定量线性范围100～5000ug/kg，ZEN的检测灵敏度达到2ug/kg，定量线性范围5～500ug/kg，AFB1的检测灵敏度达到0.5ug/kg，定量线性范围1～75ug/kg，满足世界卫生组织（WHO）和我国有关粮食谷物中真菌毒素的残留限量标准，适应大规模样品的快速筛查和预警监测，满足当前的检测需要。
本领域技术人员应当理解，以上举例仅仅是本发明的典型实施例，但并不限于上述的实施方式，在不超出或不偏离本发明保护范围的情况下，本发明的技术方案及其实施方式有多种修饰、改进或等价变化，这些均应落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于包括：衬板和衬板上依次粘贴吸附的样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上划有三根检测线T1/T2/T3线和一根质控线C线。
2.根据权利要求1所述的真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述检测线T1/T2/T3线分别包被的抗原为真菌毒素DON与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素ZEN与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素AFB1与牛血清白蛋白的偶联物。
3.根据权利要求1所述的真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述质控线C线包被的抗原为羊抗兔二抗。
4.根据权利要求1所述的真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述荧光标记物结合垫上用划膜喷膜仪分别喷有真菌毒素DON的鼠单抗荧光微球标记物、真菌毒素ZEN的鼠单抗荧光微球标记物、真菌毒素AFB1的鼠单抗荧光微球标记物、兔IgG荧光微球标记物。
5.根据权利要求1所述的真菌毒素荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：所述衬板为PVC硬板纸，所述样品垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜或海绵。
6.权利要求1至5任一所述试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备抗体的荧光微球标记物：先将荧光微球用EDC和NHS进行活化，然后离心除去多余的EDC和NHS，用偶联缓冲液复溶后加入抗体进行偶联，偶联2～4小时后，加入牛血清白蛋白BSA和乙醇胺封闭过夜，最后离心洗涤2～3次后，用储存缓冲液复溶置于4℃保存；
（2）制备硝酸纤维素膜T线和C线：将真菌毒素DON与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素ZEN与牛血清白蛋白的偶联物、真菌毒素AFB1与牛血清白蛋白的偶联物用划膜喷膜仪由左至右依次喷涂在硝酸纤维素膜表面形成检测线T1、T2和T3线，将羊抗兔二抗用喷膜机喷涂在T3线右边形成质控线C线，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2小时，置于室温干燥环境中保存备用；
（3）荧光标记物结合垫的制备：先用含海藻糖、牛血清白蛋白、PVP的磷酸缓冲液浸泡Fusion5，然后置于37℃烘箱中烘干2小时，再将三种真菌毒素抗体荧光微球标记物和兔IgG荧光微球标记物用磷酸缓冲液分别稀释后，用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用；
（4）样品垫的处理：用含有EDTA、tween-20、PVP、BSA的PBS缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用；
（5） 试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理过的样品垫、喷有荧光标记物的荧光标记物结合垫、喷涂有三条检测线T线和质控线C线的硝酸纤维素膜以及吸水纸，组装完毕后剪切成4 mm宽的试纸条，装入塑料卡壳中，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可。
7.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述荧光微球粒径范围为100～1000nm，荧光发光物为铕、钐、铽或镝，荧光微球表面基团为氨基、羧基、巯基或羟基。
8.根据权利要求7所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述荧光微球表面基团密度为20～250 sq·A/grp。
9.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述三条检测线T线和质控线C线之间的间距为3～10mm。
10.权利要求1至5任一所述试纸条在检测真菌毒素中的应用，其特征在于包括以下步骤：取80μL样品，滴加在试纸条卡壳的加样孔中，计时6分钟，然后将试纸条卡壳插入荧光读数仪的卡槽中，读数仪将分别激发扫描和读取T1/T2/T3/C线的荧光强度，根据荧光强度的大小和荧光读数仪中内置的标准曲线即可自动计算出样品的三种真菌毒素的准确浓度。
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