JP4426103B2 - 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを用いて、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための新規、迅速かつセンシティブな方法に関する。本発明は、これらの方法を行うためのキットにも関する。
【０００２】
現在、抗生物質は、細菌によって引きおこされる感染性の疾患の治療における治療剤としてばかりでなく、食物を保存するための剤として及び成長を刺激するための動物飼料中の添加物としても極めて広範囲に用いられている。従って、複合生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出物、発酵液又は緩衝化水性媒体中で極めて低い濃度でさえ抗生物質の存在を検出することができる必要性が次第に感じられている。
【０００３】
ミルク生産の場合はこの一例である。なぜなら乳牛の特定の感染性疾患を治療するために抗生物質を用いることは公知であるからである。
しかしながら、明らかな医学的理由のため、ヒトの消費を意図したミルクは原則として、いずれの微量の抗生物質も含んではならない。更に、０．００５I.V.／ml又はそれ未満のペニシリン濃度は、チーズ、ヨーグルト等のようなミルクベースの製品の製造の間に有害な効果を有し得る。
【０００４】
いくつかの状況を心に描くことができる。第１の場合、例えばワゴンに移す前に農場で抗生物質の存在を検出するために、極めて迅速（５分未満）かつ簡単なテストが優先される。例えば処理のために用いられている抗生物質が既知である場合、及び更にこのテストが法的基準で問題の抗生物質の検出を許容する場合、このような迅速なテストを用いることを考えることもできる。第２の場合、速度が強調されない場合、法的基準で全てではないがほとんどの抗生物質を検出することが重要である。
【０００５】
この理由は、特定の国の法が、極めて特異的な質の基準を強いるからである。例えば、ＵＳ当局は、以下の６種の抗生物質のミルク中の濃度が極めて特定の値を超えないことを要求とする：ペニシリン、５ppb ；アンピシリン、１０ppb ；アモキシシリン、１０ppb ；シクロキサシリン、１０ppb ；セファピリン、２０ppb ；セフチオフル、５０ppb 。ヨーロッパ共同体は、以下の質的基準を強いる：ペニシリン、４ppb ；アモキシシリン、４ppb ；アンピシリン、４ppb ；シクロキサシリン、３０ppb ；ジシクロキサシリン、３０ppb ；オキサシリン、３０ppb ；セファピリン、１０ppb ；セフチオフル、１００ppb ；セフキノン、２０ppb ；ナフシリン、３０ppb ；セファゾリン、５０ppb 。
【０００６】
従って、抗生物質のほとんどが検出されるのを許容するであろうテストにアクセスすることが有利であり得る。更に、乳業において、速度、感度及び簡単さの特徴全てを有するテストの欠如下で、これら３つのパラメータの最も優れた組合せを許容するテストが、それらが全体としてカバーされないなら、有利であろうと考えることができる。
【０００７】
生物流体中にβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出のために種々の型のテストが既に提案されている。
これらのテストは一般に、抗生物質又はこの抗生物質のアナログを特異的に認識する認識剤（レセプター又は抗体）、及びラベリング剤（放射性元素、酵素、蛍光剤等）を用いる検出方法を利用する。ここでこれらの剤は、以後、検出剤と呼ぶ。選択した要素により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）等が用いられる。それらの一般的な原理において、これらのテストは、その値が存在する被検体の質を示す結果を得ることを可能にするであろう上述の２つの要素（検出試薬）の最小の組合せを用いる。
【０００８】
選択した検出法により、ラベリング剤は、認識剤による認識に関して認識剤に、抗生物質に、又は抗生物質のアナログ物質にかわりに結合させることができることに注意すべきである。認識剤、抗生物質又は抗生物質のアナログ物質は固有的にラベリング剤を含む（例えば放射性標識化被検体）方法もある。
乳製品のために、最も広く記述される被検体検出テストは抗生物質の検出に関する。
【０００９】
ＵＳ特許４，２３９，８５２号は、β−ラクタム環を有する抗生物質のミルク中での検出のための微生物学的方法を記載する。この方法によれば、ミルクのサンプルは最初に、抗生物質に対して極めてセンシティブである微生物、特にバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）の細胞部分の存在下で、そして２番目に放射性元素で又は酵素で標識化（“タグ”）された抗生物質の存在下でインキュベートされる。そのインキュベーションは、サンプル中に存在するなら、抗生物質及び標識化抗生物質が細胞部分に結合するのを許容する条件下で行われる。
【００１０】
インキュベーションの後、細胞の部分はその混合物から分離され、次に洗浄される。次に、細胞部分に結合した標識化抗生物質の量が決定され、標準と比較される。細胞部分に結合した標識化抗生物質の量は分析するミルクサンプル中に存在する抗生物質の濃度に逆比例する。
この方法は、特に混合物から細胞部分を分離する段階に、かなりきめ細かい取扱いを要求する。更に、ミルク中に０．０１I.V.／mlまで及び０．００１I.V.／mlまでさえのペニシリンＧの検出を許容する最もセンシティブな型において、この方法は放射性元素（14Ｃ又は 125Ｉ）で標識された抗生物質を用いる。この場合において、存在する又はさもなければミルク中に存在する抗生物質の量の測定は、例えばシンチレーションカウンターのような特別の装置の使用を必要とする。更に、極めて小量でさえ放射性物質を取り扱うことは、分析を行う人についての危険性を完全になくさない。
【００１１】
欧州特許出願５９３ １１２は、ミルク中の抗生物質の検出を許容する別の方法を記載する。この方法は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）のような抗生物質感受性微生物から単離されたタンパク質を用いる。このタンパク質は、ペルオキシダーゼのような酵素で更に標識される。テストは次の通り行われる：ミルクのサンプルを標識化タンパク質の存在下でチューブ内でインキュベートし；インキュベーションの後、ミルクを、その壁に参照抗生物質が固定されている第２のチューブに移し；第２のインキュベーションを行い、そして次にそのチューブの内容物を除去し；この第２のチューブの壁を洗浄液で３回、洗い、それ自体を除去し、そして次に第２のチューブ中に存在する残留物を吸収性紙の断片に移し；次にその第２のチューブに有色物質を加え、それを再び１回、インキュベートし、そして次にその色の発達を遅らせる溶液を加え；そのチューブの色を抗生物質の標準サンプルで平行に行った同一のテストの色と比較する。支持体上に固定された標識化タンパク質の量、及びそれゆえ色の強度は分析したミルクサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
【００１２】
この特許出願の実施例１によれば、このテストはペニシリンＧを５ppb のオーダーの濃度まで検出することを可能にし、アモキシシリン（５ppb ）、アンピシリン（１０ppb ）、セファピリン（５ppb ）及びセフチオフル（５ppb ）を検出することを可能にする。このテストは、ヨーロッパの規制により強いられるレベルまでペニシリン、アモキシシリン及びアンピシリンの検出を許容せず、他方、このテストはむしろ複雑であり；それは本発明の文脈に見い出される感度及び簡単さの基準を全体的に満足しない。
【００１３】
しかしながら、そのテストは特に熟練していない人が行うには極めて面倒である。実際、このテストは、１つの容器から別の容器に液体及び残留物を移すステップ、及びいくつかのゆすぎステップを含む多数のステップを含む。このテストに要求されるステップの数及び型を仮定すれば、信頼できる結果を得ることは、ひどく、作業者の実験上のノウハウに依存する。
【００１４】
更に、結果を解釈するには平行して行うべき２つのテストを要求し、これによりその作業を増加させ更に複雑にする。
他の型の酵素的方法も開示されており、それは、アクチノマデュラＲ３９（Actinomadure R39）により生産される特定の酵素、即ち可溶性細胞外Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ（以後、“酵素Ｒ３９”と呼ぶ）の使用に基づく、ミルク内の低濃度の抗生物質を測定することを可能にする（J.M.Frereら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510(1980) 、並びに特許ＥＰ ８５ ６６７及びＥＰ ４６８ ９４６）。酵素Ｒ３９は種々のペプチドのＤ−アラニル−Ｄ−アラニン基を加水分解する比活性を有し、特定のチオエステルを加水分解することもできる。
【００１５】
更に、酵素Ｒ３９はβ−ラクタム環を有する抗生物質と反応して、極めて迅速に、不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成する。
このテストの最新型（ＥＰ ４６８ ９４６）においては、検査すべき予め決められた容量のサンプルが、予め決められた量の酵素Ｒ３９と、サンプル中に存在し得るβ−ラクタム抗生物質が酵素と反応して不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成するのを許容する条件下でインキュベートされる。
【００１６】
次に、予め決められた量のチオエステル型基質が第１段階で得られた産物と、第１のインキュベーションの過程で抗生物質と複合体形成していない残存酵素Ｒ３９により基質が加水分解される条件下でインキュベートする。これにより形成されたメルカプトアルカン酸は、次にそのメルカプトアルカン酸の遊離ＳＨ基との反応により色を形成することができる試薬の助けで比色アッセイにより測定される。その色の強度は既知の量の抗生物質を含むサンプルから事前に確認された標準と比較される。定量的測定は、分光光度計での測定により行うことができ；ミルクの場合、事前にサンプルを浄化することが必要になり得る。
【００１７】
特許ＥＰ ４６８，９４６の実施形態によれば、この方法は、ミルク内で、５分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ １０ppb を、１５分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ約２．５ppb を測定することを可能にする。
食品中の抗生物質を検出するための方法のために必要とされる速度、簡単さ及び感度の基準を仮定すれば、その出願人は、生物流体中の抗生物質を検出するための新規なより有効な方法を研究する目的を主張する。特に、出願人は、１回のテストで、ヨーロッパ及びＵＳ当局によりその含有が規制される抗生物質のほとんどを検出するための方法を研究する目的を主張する。更に、その研究した方法は、好ましくは資格のない人が行うことができる限られた数のステップでこの結果を得ることを可能にするはずである。その出願人は、現在の方法より短いインキュベーション時間でこれらの目的を達成するための方法も研究した。
【００１８】
本出願人は、これらの目的を注目すべき様式で達成することを許容する、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規方法を発見した。
従って、本発明は、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規な方法であって、
ａ）決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合体形成を許容する条件下で、インキュベートし；
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前記参照抗生物質との複合体形成を許容する条件下で接触させ；そして
ｃ）前記支持体に結合した認識剤の量を決定すること
を含み、ここで、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００１９】
本発明による方法の例外的性能は特定の認識剤の使用に基づき、それは、バチルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプター、即ちその単離及びペプチド配列がY.Zhu ら、J.Bacteriol., 1137-1141, (1990) に記載されるＢｌａＲタンパク質、又はその単離及びペプチド配列がB.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)に記載されるＢｌａＲのカルボキシ末端領域であるＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチドを含む。
【００２０】
β−ラクタム環を含む抗生物質の検出のための本発明によるＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターの使用は、以前に用いられる認識剤よりかなりの利点を有する。この理由は、ＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは、極めて迅速に極めて多数の抗生物質と複合体を形成することができ、そして既知の認識剤、例えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）から得られるレセプターのために要求されるのより短いインキュベーション時間でそれを行うことができるからである。
【００２１】
本発明による方法により検出することができる抗生物質の例としては次の抗生物質がある：ベンジルペニシリン（又はペニシリンＧ）、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、メチルシリン、クロキサシリン、６−ＡＰＡ、モノラクタム、アズトレオナム、メシリナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、ニトロセフィン、セファトキシム、セフオロキシム、セフチオフル、セファピリン、７−ＡＣＡ。特に、本発明による方法は、ＵＳ及びヨーロッパ当局により支配される全ての抗生物質を、許容される限界域値上で検出することを可能にする。
【００２２】
本発明による方法は、生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出液、発酵液又は緩衝水性媒体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出を許容する。
本発明の好ましい実施形態によれば、認識剤はラベリング剤と結合した形態で用いられる。このラベリング剤は、異なる性質のものであってよい。ラベリング剤は、特定の型のもの、例えば金属コロイド粒子（プラチナ、金、銀等）、セレン、炭素、硫黄もしくはテルルのコロイド粒子、又は有色合成ラテックスのコロイド粒子であり得る。ラベリング剤は、蛍光物質、例えば活性化フルオレセイン（Boeringher-Mannheim Biochemicaから利用できる）、フルオレセインイソシアネート、ロダミンテトラメチルイソシアネート又は当業者に知られたいずれかの他の蛍光物質でもあり得る。ラベリング剤は、酵素、例えばβ−ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等であってもよい。この場合、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは化学的に又は遺伝学的にこの酵素ラベリング剤と結合されて融合タンパク質を形成する。
【００２３】
認識剤は、当業者に知られた慣用的な方法に従ってラベリング剤に結合させることができる。認識剤は、ラベリング剤に直接結合させても、中間複合体の形成を介して結合させてもよい。認識剤とラベリング剤との間の結合は、本発明の方法を行う間の異なる時間に行うことができる。第１の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間の結合は、認識剤を分析すべき生物流体に接触させる前に行われる。本発明の方法の他の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間の結合は、認識剤を生物流体のサンプルに接触させる時又はその後に行うことができる。好ましくは、認識剤のラベリングはその認識剤を分析すべきサンプルに接触させる前に行われる。
【００２４】
本発明による方法の最初のステップａ）は、決められた量の生物流体を所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、生物流体中に存在し得る。抗生物質の認識剤との複合化を許容する条件下でインキュベートすることからなる。
生物流体は、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターと共に、４〜６０℃の温度範囲でインキュベートすることができる。好ましくはこの温度は約４７℃である。インキュベーション温度の増加はその継続時間を減少させる効果を有するであろうし、その逆も同じであろう。従って、その温度を増加させることによりその方法の時間を減少させることが常に可能である。
【００２５】
本発明による方法の第２のステップｂ）において、ステップａ）で得られた混合物は、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と接触させる。
本発明により用いることができる支持体は、極めて多様な型のものであり得る。それらは、固体支持体、例えば参照抗生物質調製物でコートされたチューブ、プレート又はロッドであり得る。それは、膜が結合している固体支持体の形態のテスト装置であって、１又は複数の捕獲物質が決められた検出ゾーンにあるものであり得る。それらは、ゲルを形成することができ、参照抗生物質が固定されている磁石又は非磁石ビーズの形態（アガロース、ポリスチレン等）の支持体であり得る。
【００２６】
参照抗生物質は、当業者に知られている方法により、例えば任意にスペーサーを介した支持体への共有結合又は非共有結合吸着により、支持体上に固定することができる。
本発明の特定の実施形態によれば、ステップａ）及びｂ）は同時に行うことができる。
【００２７】
本発明による方法のステップｃ）は、参照抗生物質が固定された支持体に結合したレセプターを測定することからなる。この測定のために用いる方法は、用いるラベリング剤の型に直接、関連する。ラベリング剤が酵素によるなら、測定ステップは、例えば所定の色の形成を伴う、関連するこの酵素に特異的な反応に関するであろう。ラベリング剤が蛍光によるなら、測定は単に支持体の蛍光を測定することにより行われるだろう。金属粒子又は有色ラテックスの場合、支持体に結合したレセプターの存在は、その強度が支持体に結合したレセプターの数に直接、比例する色によって反映される。用いるラベリング剤の型と関係なく、検出するシグナルの強度は、分析するサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
【００２８】
本発明は、生物流体中の抗生物質を検出するためのテストキットであって、バチルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対してセンシティブであるレセプターを含む少くとも１の認識剤、及び支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質を含むキットにも関する。
以下の例は本発明を行うための種々の態様及び方法を詳述するが、その範囲を限定するものではない。
【００２９】
実施例１．ミルク中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の測定
この例は、ヘルス・オーソリティーにより規制されているβ−ラクタム環を含む抗生物質のミルク中での測定を示す。この例に記載されるテストは、ラベリング剤として機能する金のビーズに結合したＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、膜が結合している固体支持体を含むテスト装置の形態の支持体を用いる。
【００３０】
１．１．金のビーズへのＢｌａＲ−ＣＴＤのカップリング
１．１．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤのビオチニル化
６．６mg／mlの濃度を有する認識剤ＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液３．７９mlをリン酸ナトリウム緩衝液２０mM pH７にとる。次にこのＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液に、４１．７１mlの重炭酸緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及び２．２３mg／mlの重炭酸緩衝液を含むＮ−ヒドロキシスクシニミド６−（ビオチンアミド）カプロン酸エステルの２mlの溶液を加える。この溶液を環境温度で光なしで、２時間、２回転／分の速度で（VEL, Belgiumから利用できる）回転軸上のチューブについてのＬＡＢＩＮＣＯスターラーで静かに撹拌する。２．５mlのＴｒｉｓ緩衝液、１Ｍ pH８の溶液を３０分、同じ条件下で反応混合物と共にインキュベートする。得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １００mM、pH８、ＮａＣｌ １００mM、ＭｇＣｌ2 ５０mM）に対して２４時間、透析する。この方法において、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を得てそれをＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で緩衝液１ml当り２５０mgのビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤの濃度に希釈する。
【００３１】
１．１．２．ラベリング剤
ラベリング剤として、ヤギ抗ビオチン抗体が、（British Biocell (Ret. GAB 40）から利用できる）０．１％のアジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２のテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態で析出している４０nmの直径を有する金の粒子を用いる。これら懸濁液の５２０nmでの光学密度は約１０でありタンパク質濃度は約２４mg／mlである。
【００３２】
１．１．３．ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤの金粒子へのカップリング
実施例３．１．１で調製したビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で１１４．７倍に希釈する。室温で、この希釈ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液２２．５容量部、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液７．５容量部、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤを標識するために用いる金の粒子懸濁液９．２７容量部、及び参照金粒子懸濁液６容量部を混合する。
【００３３】
１．１．４．独立した参照物質
このテストにおいて、その強度がサンプル中に存在する抗生物質の迅速な定量を可能にするバンドを供給する参照物質を用いる。
この目的のために、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体が析出している金の４０nm粒子を用いた。これらの粒子は０．１％アジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２の２mMテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態でBritish Biocell (Ref. GAR40)から利用できる。これらの懸濁液の５２０nmにおける光学密度は約３であり、タンパク質濃度は約６mg／mlである。
【００３４】
１．２．テスト装置
用いたテスト装置は、第１の端から始まり連続的に結合している第１及び第２の端を有する固体支持体（１）、
分析する流体を精製するための膜（２）、
２種の捕獲物質（参照抗生物質及び独立した参照物質に結合することができる物質）が固定されている膜（３）、及び
吸収膜（４）
を含む。
【００３５】
１．２．１．アッセイ装置のアセンブル
３００×７６．２mmの大きさを有するカードを、まず最初に、以下の方法に従って（BioDot, Inc.から利用できる）Clamshell laminator 型のラミネーターを用いてアセンブルする：
（Adhesive Research から利用できる）型ＡｒＣａｒｅ８５６５の長方形のプラスチック支持体を３００×７６．２mmを測定して切断する（固体支持体（１））。次に、３００×２０mmの大きさの（Pall Gelman Sciencesから利用できる）長方形のＬｅｕｋｏｓｏｒｂ ＬＫ４膜（膜（２））、３００×２５mmの大きさの（Millipore から利用できる）長方形のＨｉ−Ｆｌｏｗ ＳＸ膜（膜（３））、３００×４０mmの大きさの（Whatman から利用できる）長方形の３mmセルロース膜（膜（４））を切断する。
【００３６】
続けて、膜（２）及び（４）、次に（３）をラミネーターの下方の鋳型の特定の位置におく。接着剤で包んだ固体支持体（１）を、その部分を、接着剤面が空気に露出するように装置のカバー内に保持する。下側の鋳型においた膜を、ラミネーターを閉じることにより接着支持体に接触させ；その膜を真空ポンプからの空気吸引により正確な場所に保持する。真空をなくした時に、膜（２），（３）及び（４）がその上に固定された固体支持体（１）からなるカードを得る。
【００３７】
次に、以下の溶液を膜（３）上に析出させる：近位側：第１の捕獲物質；バンドNo. １；遠位側：第２の捕獲物質；バンドNo. ２。これらの捕獲物質をBioDot IncからのX-Y Platform Biojet Quanti-3000タイプの“Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ”を用いて析出させる。
その析出した溶液を、カード全体を１分間、６０℃の熱い強制空気下におくことにより直ちにエバポレートする。
【００３８】
アセンブリー後に得られたカードを、ギロチン型装置で、又はロータリー装置でストリップに切断する（BioDot, Kinematic 又はAkzoから利用可）。その端のストリップを除去し、他のストリップを直ちに用いる。
図１はこのようなアッセイ装置を示す。
それらを保護するために、アッセイ装置はデシカント（Silgelac, France）の存在下で不透明な密閉した容器に入れる。
【００３９】
１．２．２．第１の捕獲物質、参照抗生物質
炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトガンマグロブリン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノ−チオランヒドロクロライド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
【００４０】
更に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファロスポリンＣ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
次に先に調製した２つの溶液を混合する。得られた溶液のpHを３mlのＮａＨ2 ＰＯ4 ５００mMを加えることにより７．１に調節し、その溶液を２５℃で２時間、インキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶液を０．２２mmフィルターを介してろ過し、次にアリコートに分けて使用まで−２０℃で凍結する。
【００４１】
使用の時にアリコートを解凍し、析出物の正確な位置及び微量物の質をいつでも示すように、それらを膜上に析出させる前に、それらに食品着色剤を加える。
第１の捕獲物質はサンプル中に存在する抗生物質の量に対して過剰に金粒子に結合したＢｌａＲ−ＣＴＤを固定することを可能にする。
１．２．３．第２の捕獲物質。独立した参照物質を固定することができる物質
第２の捕獲物質のために、１０mMリン酸ナトリウムpH７．５、ヒトガンマグロブリン５mg／ml緩衝液中０．５mg／mlのイムノグロブリン濃度を有するウサギイムノグロブリン溶液（Sigma Ｉ ５００６）を用いる。この第２の捕獲物質は、液体がアッセイ装置を超えてマイグレートする時に参照物質を停止させる。
【００４２】
１．３．ミルク中の抗生物質の測定
１．３．１．３分テスト−迅速テスト
各々０；１；２；３；４；５及び６ppb のペニシリンＧを含む新しいミルクの７つのサンプルを調製する。次にこれらの溶液各々を以下の方法で分析する：
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４３】
以下の表１は、テストした７つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するペニシリンＧの量に反比例する。
【００４４】
【表１】
【００４５】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表１に示す結果は、このテストが３分で、ミルクのサンプル中の４ppb 未満のペニシリンＧの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この３分間、行ったテストは、５ppb までのアモキシシリン、５ppb までのアンピシリン、１０ppb 未満までのシクロキサシリン、２０ppb 未満までのジシクロキサシリン、２０ppb 未満までのオキサシリン及び２０ppb までのセファピリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００４６】
１．３．２．５分テスト
各々０；２；４；６；８及び１０ppb のシクロキサシリンを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する：
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を３分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４７】
以下の表２は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するシクロキサシリンの量に反比例する。
【００４８】
【表２】
【００４９】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表２に示す結果は、このテストが５分で、ミルクのサンプル中の４ppb 未満のシクロキサシリンの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この５分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリン、４ppb までのアンピシリン、８ppb までのジシクロキサシリン、８ppb までのオキサシリン、１６ppb までのセファピリン、１００ppb までのセフチオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb までのナフシリン、及び６０ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５０】
このテストは、ミルクワゴンをサイロに出す前のソーティングテストとして特に適している。
１．３．３．９分テスト
各々０；４；６；８；１０及び１２ppb のセファピリンを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する。
【００５１】
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を７分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５２】
以下の表３は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するセファピリンの量に反比例する。
【００５３】
【表３】
【００５４】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表３に示す結果は、このテストが９分で、ミルクのサンプル中の６ppb 未満のセファピリンの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この９分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリン、４ppb までのアンピシリン、４ppb までのシクロキサシリン、８ppb 未満までのジシクロキサシリン、８ppb 未満までのオキサシリン、８０ppb までのセフチオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb 未満までのナフシリン、及び４５ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５５】
これにより、９分間、行ったこのテストは、ヨーロッパ当局により現在、規制されている全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出を許容する。
１．３．４．２０分テスト
各々０；２０；３０；４０；５０及び６０ppb のセフチオフルを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次にこれら溶液の各々を以下の方法で分析する。
【００５６】
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１８分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５７】
以下の表４は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するセフチオフルの量に反比例する。
【００５８】
【表４】
【００５９】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表４に示す結果は、このテストが２０分で、ミルクのサンプル中の３０ppb までのセフチオフルの検出を許容することを示す。
これにより、２０分でのこのテストは、ヨーロッパ及び米国当局により現在規制される全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出を許容する。
【００６０】
実施例２．ミルク中の６の抗生物質の測定
この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストはβ−ラクタマーゼとの融合タンパク質の形態でＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、磁気ビーズの形態で支持体を用いる。
【００６１】
２．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, 1990 ）とバチルス・セレウス（Bacillus cereus ）からのＺｎβ−ラクタマーゼ（M.Hussain ら、1985, J.Bact., 164: 1, 223〜229, 1985 ）との間の遺伝子カップリングにより得る。
【００６２】
そのカップリングは以下の方法で行われる：
２．１．１．プラスミドの作製：
ＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチド及びβ−ラクタマーゼの遺伝子間で１／１カップリングを行った。β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を同時にＢｌａＲ−ＣＴＤ遺伝子の後に導入した。その遺伝子融合を有するプラスミドは、カナマイシンに対する耐性を示す。その融合タンパク質を以後、Ｆｕｓｌと呼ぶ。
【００６３】
２．１．２．生産：
株：融合遺伝子を有するプラスミドを大腸菌に導入した。その組換えプラスミドを有するクローンをＬＢ＋Ｋｍ（５０μｇ／ml）上で選択する。
選択：放射性抗生物質での細胞抽出物のラベリング、次の変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動は、そのタンパク質のほとんどが、その分子量が約５０，０００である融合タンパク質の形態で生産されることを示す。しかしながら、翻訳後タンパク質分解が極めて小さい割合（２％）のこれらの分子を２つの別個の活性に解離させるようである。
【００６４】
培養：５００mlのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）を−７０℃で保存した組換え細胞を用いて接種する。そのプレカルチャーを３７℃でインキュベートし、２２５rpm で一晩、撹拌する。１８リッターのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）に５００mlのこのプレカルチャーを接種する。その６００nmでの光学密度は４である。その１８リッター培養を、光学密度が６の値に達した時に停止させる。
【００６５】
２．１．３．抽出：
培養を停止した直後に、細胞をろ過し次に遠心する。粉砕機内で溶解した細胞ペレットからの上清を維持する。それは融合タンパク質ＦＵＳＩを含む。
２．１．４．精製：
用いる緩衝液：
・緩衝液Ａ：２０mM pH８．０ Ｔｒｉｓ、１０％エチレングリコール、５０μｍ ＤＴＴ；
・緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮＡＣｌ
融合タンパク質を、イオンクロマトグラフィーにより及び分子ふるいで部分精製する。その抽出物を析出させ、緩衝液Ａ中でＱＳＦＦカラム（Pharmacia, Upsala ）で洗浄した後、ＦＵＳＩを緩衝液Ｂの直線勾配で溶出する。次にその活性画分（±０．２５Ｍ ＮａＣｌ）を組み合わせＧ−１００分子ふるい（Pharmacia, Upsala ）に析出し；それらを緩衝液Ａで溶出する。回収したバッチの平均比活性は３０％であると評価される。
【００６６】
２．１．５．β−ラクタマーゼの阻害：
融合タンパク質（９／１０容量）を、３７℃で４５分、５０mM ＥＤＴＡ（１／１０容量）と共にインキュベートする。その阻害を、１０mM pH６．０カコジル酸緩衝液中ニトロセファイン（nitrocefine ）を用いて検査する。Ｚｎの存在又は欠如下で、シグナルは各々陽性又は陰性であるはずである。阻害の後、β−ラクタマーゼ活性に基づいて測定した有効な濃度は７．７４pmol／μｌである。
【００６７】
２．２．固体支持体：磁気ビーズ−セファロスポリンＣ（参照抗生物質）
（ＡＭ ４１００ＢとしてDRG Instrument GmbH, Marburg, Germany から利用できる）ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子を用いる。そのＮＨ2 端は以下の方法でグルタルアルデヒトで活性化されている。
ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子の開始溶液１容量を５容量の０．０１Ｍ pH６．０ピリジン緩衝液で４回、ゆすぐ。その粒子をピリジン緩衝液中５％で２．５容量のグルタルアルデヒトにとり、室温で３時間、回転させて撹拌する。次にそれらを２容量の０．０１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液で１０回、ゆすぐ。次にその粒子をＫｐｉ緩衝液中０．１ＭセファロスポリンＣの１容量に再度懸濁し、＋４℃で一晩、回転させて撹拌する。最後のゆすぎを、セファロスポリンＣが０．１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液から完全に除去されるまで行う。
【００６８】
２．３．ミルク中の６の抗生物質、ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセルチオフルの測定
２．３．１．用いる溶液：
溶液１：１００mM、pH８ Ｔｒｉｓ、１mg／ml ＢＳＡ、５０mM ＥＤＴＡ、５０μｍ ＤＴＴ中に凍結乾燥した融合タンパク質７００ピコモルを５mlのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再び水和する。この溶液５０μｌが測定を行うために必要とされる。
【００６９】
溶液２：１００％イソプロパノール中実施例１．２で調製したＢｉｏＭａｇ−セファロスポリンＣ粒子２ml；測定を行うために２０μlが要求される。
溶液３：凍結乾燥し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５００mlで再び水和した１０mM、pH６カコジル酸緩衝液。
溶液４：ＤＭＦ中１０mMニトロセファインの４００mlを溶液３で４０mlに希釈する。検出のために４００μｌが要求される。
【００７０】
２．３．２．検出法：
５０μｌの溶液１を５００ｍｌのドープト（ｄｏｐｅｄ）ミルクサンプルに入れ、４７℃で２分、インキュベートする。２０μｌの溶液２をそのミルクに懸濁し、それを４７℃で２分、再びインキュベートする。その粒子を常磁性磁石を用いて容器の壁に引きつけながら、上清をチューブからとる。その粒子を溶液３で２回、ゆすぎ、磁石で同じ方法を行う。最後に４００μｌの溶液４を４７℃で３分、その粒子の存在下でインキュベートする。次に、４８２nmでの残存溶液の吸光度をニトロセファイン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎｅ）溶液に対して測定する。
【００７１】
この方法は、ＵＳ当局で示される６種の抗生物質の、当業により強制される基準未満の濃度で、即ちペニシリンを５ppb 、アンピシリンを１０ppb 、アモキシシリンを１０ppb 、シクロキサシリンを１０ppb 、セファピリンを２０ppb 及びセフチオフルを５０ppb での検出を許容する。
実施例３．ミルク中の３種の抗生物質（ペニシリンＧ、シクロキサシリン、セフチオフル）の測定
この例はヘルス・オーソリティーにより規制されるμ−ラクタム環を含む３種の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストは、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼ各々との２つの融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、マイクロプレートの形態の支持体を用いる。
【００７２】
３．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114 (1990)）とリフェレンス１４６４７５２としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用できる活性化アルカリホスファターゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７３】
カップリングは以下の方法で行った：
３．１．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びアルカリホスファターゼをpH９．８で１００mM炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。１５ナノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを２５℃で２時間、１００μｌの活性化アルカリホスファターゼ（２０mg／ml）の存在下でインキュベートする。
【００７４】
３．１．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートする。
【００７５】
３．１．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液を加える。
３．１．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約３００μｌ）を３回、８時間、０．５Ｌの５０mM、pH７．６トリエタノールアミン緩衝液、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ2 、０．５mM ＺｎＣｌ2 、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
【００７６】
３．１．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り約５０pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。
３．２．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, (1990) ）とリファレンス１４２８８６１としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用できる活性化ペルオキシダーゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７７】
カップリングは以下の通り行う：
３．２．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びペルオキシダーゼを１００mM、ｐＨ９．８炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。４０ナノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを１００μｌの活性化ペルオキシダーゼ（１６mg／ml）の存在下で２時間、25℃でインキュベートする。
【００７８】
３．２．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートする。
【００７９】
３．２．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液を加える。
３．２．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約４６０μｌ）を３回、８時間、０．５Ｌの１０mM、pH７．５ リン酸カリウム緩衝液、２００mM ＮａＣｌ、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
【００８０】
３．２．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り約１００pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。
３．３．固体支持体：マイクロプレート−セファロスポリンＣ
３．３．１．参照抗生物質溶液の調製
炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトγ−グロブリン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノチオランヒドロクロライド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を１時間、２５℃でインキュベートする。
【００８１】
別個に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファロスポリン−Ｃ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
次に、先に調製した２つの溶液を一緒に混合する。得られた溶液のpHを、３mlの５００mM ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより７．１に調節し、その混合物を２時間、２５℃でインキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を、１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶液を０．２２μｍフィルターを介してろ過する。
【００８２】
３．３．２．参照抗生物質でのマイクロプレートのコーティング
ブランド名ＮＵＮＫ（Immuno Plate: Maxisorp Type ）又はブランド名ＧＲＥＩＮＥＲ（microlon 600, reterence 705071）の、高タンパク質吸着のポリスチレンマイクロプレートを用いる。マイクロプレートキュベットを１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液で洗う。次に、実施例３．３．１．で調製した溶液のアリコートを２４時間、４℃でそのキュベット中でインキュベートする。インキュベーションの後、そのキュベットを３回、１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗う。次にチューブを２時間、２０℃で１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ飽和緩衝液、５％ ＢＳＡで満たす。洗浄液で３回、洗った後、そのチューブを乾燥させ、水分を遠ざけて４℃で保存する。
【００８３】
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤を意図したキュベットのために、用いる洗浄液は１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 であり；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤を意図したキュベットのために、用いる洗浄緩衝液は５０mM、pH５リン酸カリウムである。
３．４．ミルク中の３種の抗生物質の測定
１．４ピコモルの標識化認識剤を４７℃で５分、１００μｌのドープトミルクの存在下でインキュベートする。そのミルクをピペットを用いて、実施例２．３．に示すようにプレ処理したキュベットに移す。次にそのミルクを２分、４７℃でインキュベートする。ミルクを除去した後、洗浄液で２回、洗い（実施例２．３．２を参照）、その後、顕在化基質を含む３００μｌの緩衝液を２分、キュベット中でインキュベートする（ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤のための顕在化基質：５０mM、pH５リン酸カリウム、９．１mM ＡＢＴＳ、０．００２％ Ｈ2Ｏ2；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤のための顕在化基質：１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ４−ＮＰＰ）。次にそのプレートをＥＬＩＳＡプレートのための自動分光光度計に入れる。ここでその波長は４０５nmにセットする。
【００８４】
このテストは、ＵＳ当局により要求される規制域値での３種の抗生物質ペニシリンＧ、シクロキサシリン及びセフチオフルの検出を許容する（５ppb のペニシリンＧ、１０ppb のシクロキサシリン及び５０ppb のセフチオフル）。
実施例４．ミルク中の６種の抗生物質ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセフチオフルの測定
この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６種の抗生物質の、これらの当局により現在要求される基準以下までのミルク中での検出を示す。この例に記載するテストは、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼとの融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、コートしたチューブの形態の支持体を用いる。
【００８５】
４．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質
実施例３．１．を参照のこと。
４．２．固体支持体：参照抗生物質でコートしたチューブ
この例において、ブランド名ＮＶＮＫ（Maxisorp type ）の高タンパク質吸着のポリスチレンチューブを用い、それを実施例３．３．２に示すような参照抗生物質溶液で処理する。
【００８６】
４．３．ミルク中の６種の抗生物質の測定
７ピコモルの認識剤を、エッペンドルフチューブ内で４７℃で５分、５００μｌのミルクの存在下でインキュベートする。次に、そのミルクをピペットを用いて、実施例３．２に記載されるように処理したチューブに移す。次にそのミルクを４７℃で２分、インキュベートする。ミルクを除去した後、チューブを２回、１mLの１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン緩衝液、０．５mM ＭｇＣｌ2 で洗う。次に、１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ４−ＮＰＰ顕在化基質を含む５００μｌの緩衝液を加え、その基質を２分、４７℃でインキュベートする。次にその上清の吸光度を、４０５nmに波長を設定した分光光度計を用いて測定する。
【００８７】
この方法は、ＵＳ当局により要求される基準以下の６種の抗生物質の測定を許容する：５ppb 未満のペニシリンＧ；１０ppb 未満のアンピシリン；１０ppb 未満のアモキシシリン；１０ppb 未満のシクロキサシリン；２０ppb 未満のセファピリン；５０ppb 未満のセフチオフル。
【図面の簡単な説明】
【図１】 膜（２），（３）及び（４）が結合した固体支持体（１）を含むテスト装置の型である。本発明により用いることができる支持体の型を示す。図１ａはテスト装置の正面図であり、図１ｂはテスト装置の縦断面図である。
本発明は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを用いて、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための新規、迅速かつセンシティブな方法に関する。本発明は、これらの方法を行うためのキットにも関する。
【０００２】
現在、抗生物質は、細菌によって引きおこされる感染性の疾患の治療における治療剤としてばかりでなく、食物を保存するための剤として及び成長を刺激するための動物飼料中の添加物としても極めて広範囲に用いられている。従って、複合生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出物、発酵液又は緩衝化水性媒体中で極めて低い濃度でさえ抗生物質の存在を検出することができる必要性が次第に感じられている。
【０００３】
ミルク生産の場合はこの一例である。なぜなら乳牛の特定の感染性疾患を治療するために抗生物質を用いることは公知であるからである。
しかしながら、明らかな医学的理由のため、ヒトの消費を意図したミルクは原則として、いずれの微量の抗生物質も含んではならない。更に、０．００５I.V.／ml又はそれ未満のペニシリン濃度は、チーズ、ヨーグルト等のようなミルクベースの製品の製造の間に有害な効果を有し得る。
【０００４】
いくつかの状況を心に描くことができる。第１の場合、例えばワゴンに移す前に農場で抗生物質の存在を検出するために、極めて迅速（５分未満）かつ簡単なテストが優先される。例えば処理のために用いられている抗生物質が既知である場合、及び更にこのテストが法的基準で問題の抗生物質の検出を許容する場合、このような迅速なテストを用いることを考えることもできる。第２の場合、速度が強調されない場合、法的基準で全てではないがほとんどの抗生物質を検出することが重要である。
【０００５】
この理由は、特定の国の法が、極めて特異的な質の基準を強いるからである。例えば、ＵＳ当局は、以下の６種の抗生物質のミルク中の濃度が極めて特定の値を超えないことを要求とする：ペニシリン、５ppb ；アンピシリン、１０ppb ；アモキシシリン、１０ppb ；シクロキサシリン、１０ppb ；セファピリン、２０ppb ；セフチオフル、５０ppb 。ヨーロッパ共同体は、以下の質的基準を強いる：ペニシリン、４ppb ；アモキシシリン、４ppb ；アンピシリン、４ppb ；シクロキサシリン、３０ppb ；ジシクロキサシリン、３０ppb ；オキサシリン、３０ppb ；セファピリン、１０ppb ；セフチオフル、１００ppb ；セフキノン、２０ppb ；ナフシリン、３０ppb ；セファゾリン、５０ppb 。
【０００６】
従って、抗生物質のほとんどが検出されるのを許容するであろうテストにアクセスすることが有利であり得る。更に、乳業において、速度、感度及び簡単さの特徴全てを有するテストの欠如下で、これら３つのパラメータの最も優れた組合せを許容するテストが、それらが全体としてカバーされないなら、有利であろうと考えることができる。
【０００７】
生物流体中にβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出のために種々の型のテストが既に提案されている。
これらのテストは一般に、抗生物質又はこの抗生物質のアナログを特異的に認識する認識剤（レセプター又は抗体）、及びラベリング剤（放射性元素、酵素、蛍光剤等）を用いる検出方法を利用する。ここでこれらの剤は、以後、検出剤と呼ぶ。選択した要素により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）等が用いられる。それらの一般的な原理において、これらのテストは、その値が存在する被検体の質を示す結果を得ることを可能にするであろう上述の２つの要素（検出試薬）の最小の組合せを用いる。
【０００８】
選択した検出法により、ラベリング剤は、認識剤による認識に関して認識剤に、抗生物質に、又は抗生物質のアナログ物質にかわりに結合させることができることに注意すべきである。認識剤、抗生物質又は抗生物質のアナログ物質は固有的にラベリング剤を含む（例えば放射性標識化被検体）方法もある。
乳製品のために、最も広く記述される被検体検出テストは抗生物質の検出に関する。
【０００９】
ＵＳ特許４，２３９，８５２号は、β−ラクタム環を有する抗生物質のミルク中での検出のための微生物学的方法を記載する。この方法によれば、ミルクのサンプルは最初に、抗生物質に対して極めてセンシティブである微生物、特にバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）の細胞部分の存在下で、そして２番目に放射性元素で又は酵素で標識化（“タグ”）された抗生物質の存在下でインキュベートされる。そのインキュベーションは、サンプル中に存在するなら、抗生物質及び標識化抗生物質が細胞部分に結合するのを許容する条件下で行われる。
【００１０】
インキュベーションの後、細胞の部分はその混合物から分離され、次に洗浄される。次に、細胞部分に結合した標識化抗生物質の量が決定され、標準と比較される。細胞部分に結合した標識化抗生物質の量は分析するミルクサンプル中に存在する抗生物質の濃度に逆比例する。
この方法は、特に混合物から細胞部分を分離する段階に、かなりきめ細かい取扱いを要求する。更に、ミルク中に０．０１I.V.／mlまで及び０．００１I.V.／mlまでさえのペニシリンＧの検出を許容する最もセンシティブな型において、この方法は放射性元素（14Ｃ又は 125Ｉ）で標識された抗生物質を用いる。この場合において、存在する又はさもなければミルク中に存在する抗生物質の量の測定は、例えばシンチレーションカウンターのような特別の装置の使用を必要とする。更に、極めて小量でさえ放射性物質を取り扱うことは、分析を行う人についての危険性を完全になくさない。
【００１１】
欧州特許出願５９３ １１２は、ミルク中の抗生物質の検出を許容する別の方法を記載する。この方法は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）のような抗生物質感受性微生物から単離されたタンパク質を用いる。このタンパク質は、ペルオキシダーゼのような酵素で更に標識される。テストは次の通り行われる：ミルクのサンプルを標識化タンパク質の存在下でチューブ内でインキュベートし；インキュベーションの後、ミルクを、その壁に参照抗生物質が固定されている第２のチューブに移し；第２のインキュベーションを行い、そして次にそのチューブの内容物を除去し；この第２のチューブの壁を洗浄液で３回、洗い、それ自体を除去し、そして次に第２のチューブ中に存在する残留物を吸収性紙の断片に移し；次にその第２のチューブに有色物質を加え、それを再び１回、インキュベートし、そして次にその色の発達を遅らせる溶液を加え；そのチューブの色を抗生物質の標準サンプルで平行に行った同一のテストの色と比較する。支持体上に固定された標識化タンパク質の量、及びそれゆえ色の強度は分析したミルクサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
【００１２】
この特許出願の実施例１によれば、このテストはペニシリンＧを５ppb のオーダーの濃度まで検出することを可能にし、アモキシシリン（５ppb ）、アンピシリン（１０ppb ）、セファピリン（５ppb ）及びセフチオフル（５ppb ）を検出することを可能にする。このテストは、ヨーロッパの規制により強いられるレベルまでペニシリン、アモキシシリン及びアンピシリンの検出を許容せず、他方、このテストはむしろ複雑であり；それは本発明の文脈に見い出される感度及び簡単さの基準を全体的に満足しない。
【００１３】
しかしながら、そのテストは特に熟練していない人が行うには極めて面倒である。実際、このテストは、１つの容器から別の容器に液体及び残留物を移すステップ、及びいくつかのゆすぎステップを含む多数のステップを含む。このテストに要求されるステップの数及び型を仮定すれば、信頼できる結果を得ることは、ひどく、作業者の実験上のノウハウに依存する。
【００１４】
更に、結果を解釈するには平行して行うべき２つのテストを要求し、これによりその作業を増加させ更に複雑にする。
他の型の酵素的方法も開示されており、それは、アクチノマデュラＲ３９（Actinomadure R39）により生産される特定の酵素、即ち可溶性細胞外Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ（以後、“酵素Ｒ３９”と呼ぶ）の使用に基づく、ミルク内の低濃度の抗生物質を測定することを可能にする（J.M.Frereら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510(1980) 、並びに特許ＥＰ ８５ ６６７及びＥＰ ４６８ ９４６）。酵素Ｒ３９は種々のペプチドのＤ−アラニル−Ｄ−アラニン基を加水分解する比活性を有し、特定のチオエステルを加水分解することもできる。
【００１５】
更に、酵素Ｒ３９はβ−ラクタム環を有する抗生物質と反応して、極めて迅速に、不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成する。
このテストの最新型（ＥＰ ４６８ ９４６）においては、検査すべき予め決められた容量のサンプルが、予め決められた量の酵素Ｒ３９と、サンプル中に存在し得るβ−ラクタム抗生物質が酵素と反応して不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成するのを許容する条件下でインキュベートされる。
【００１６】
次に、予め決められた量のチオエステル型基質が第１段階で得られた産物と、第１のインキュベーションの過程で抗生物質と複合体形成していない残存酵素Ｒ３９により基質が加水分解される条件下でインキュベートする。これにより形成されたメルカプトアルカン酸は、次にそのメルカプトアルカン酸の遊離ＳＨ基との反応により色を形成することができる試薬の助けで比色アッセイにより測定される。その色の強度は既知の量の抗生物質を含むサンプルから事前に確認された標準と比較される。定量的測定は、分光光度計での測定により行うことができ；ミルクの場合、事前にサンプルを浄化することが必要になり得る。
【００１７】
特許ＥＰ ４６８，９４６の実施形態によれば、この方法は、ミルク内で、５分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ １０ppb を、１５分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ約２．５ppb を測定することを可能にする。
食品中の抗生物質を検出するための方法のために必要とされる速度、簡単さ及び感度の基準を仮定すれば、その出願人は、生物流体中の抗生物質を検出するための新規なより有効な方法を研究する目的を主張する。特に、出願人は、１回のテストで、ヨーロッパ及びＵＳ当局によりその含有が規制される抗生物質のほとんどを検出するための方法を研究する目的を主張する。更に、その研究した方法は、好ましくは資格のない人が行うことができる限られた数のステップでこの結果を得ることを可能にするはずである。その出願人は、現在の方法より短いインキュベーション時間でこれらの目的を達成するための方法も研究した。
【００１８】
本出願人は、これらの目的を注目すべき様式で達成することを許容する、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規方法を発見した。
従って、本発明は、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規な方法であって、
ａ）決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合体形成を許容する条件下で、インキュベートし；
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前記参照抗生物質との複合体形成を許容する条件下で接触させ；そして
ｃ）前記支持体に結合した認識剤の量を決定すること
を含み、ここで、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００１９】
本発明による方法の例外的性能は特定の認識剤の使用に基づき、それは、バチルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプター、即ちその単離及びペプチド配列がY.Zhu ら、J.Bacteriol., 1137-1141, (1990) に記載されるＢｌａＲタンパク質、又はその単離及びペプチド配列がB.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)に記載されるＢｌａＲのカルボキシ末端領域であるＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチドを含む。
【００２０】
β−ラクタム環を含む抗生物質の検出のための本発明によるＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターの使用は、以前に用いられる認識剤よりかなりの利点を有する。この理由は、ＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは、極めて迅速に極めて多数の抗生物質と複合体を形成することができ、そして既知の認識剤、例えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）から得られるレセプターのために要求されるのより短いインキュベーション時間でそれを行うことができるからである。
【００２１】
本発明による方法により検出することができる抗生物質の例としては次の抗生物質がある：ベンジルペニシリン（又はペニシリンＧ）、アンピシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、メチルシリン、クロキサシリン、６−ＡＰＡ、モノラクタム、アズトレオナム、メシリナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、ニトロセフィン、セファトキシム、セフオロキシム、セフチオフル、セファピリン、７−ＡＣＡ。特に、本発明による方法は、ＵＳ及びヨーロッパ当局により支配される全ての抗生物質を、許容される限界域値上で検出することを可能にする。
【００２２】
本発明による方法は、生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出液、発酵液又は緩衝水性媒体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出を許容する。
本発明の好ましい実施形態によれば、認識剤はラベリング剤と結合した形態で用いられる。このラベリング剤は、異なる性質のものであってよい。ラベリング剤は、特定の型のもの、例えば金属コロイド粒子（プラチナ、金、銀等）、セレン、炭素、硫黄もしくはテルルのコロイド粒子、又は有色合成ラテックスのコロイド粒子であり得る。ラベリング剤は、蛍光物質、例えば活性化フルオレセイン（Boeringher-Mannheim Biochemicaから利用できる）、フルオレセインイソシアネート、ロダミンテトラメチルイソシアネート又は当業者に知られたいずれかの他の蛍光物質でもあり得る。ラベリング剤は、酵素、例えばβ−ラクタマーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等であってもよい。この場合、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは化学的に又は遺伝学的にこの酵素ラベリング剤と結合されて融合タンパク質を形成する。
【００２３】
認識剤は、当業者に知られた慣用的な方法に従ってラベリング剤に結合させることができる。認識剤は、ラベリング剤に直接結合させても、中間複合体の形成を介して結合させてもよい。認識剤とラベリング剤との間の結合は、本発明の方法を行う間の異なる時間に行うことができる。第１の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間の結合は、認識剤を分析すべき生物流体に接触させる前に行われる。本発明の方法の他の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間の結合は、認識剤を生物流体のサンプルに接触させる時又はその後に行うことができる。好ましくは、認識剤のラベリングはその認識剤を分析すべきサンプルに接触させる前に行われる。
【００２４】
本発明による方法の最初のステップａ）は、決められた量の生物流体を所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、生物流体中に存在し得る。抗生物質の認識剤との複合化を許容する条件下でインキュベートすることからなる。
生物流体は、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターと共に、４〜６０℃の温度範囲でインキュベートすることができる。好ましくはこの温度は約４７℃である。インキュベーション温度の増加はその継続時間を減少させる効果を有するであろうし、その逆も同じであろう。従って、その温度を増加させることによりその方法の時間を減少させることが常に可能である。
【００２５】
本発明による方法の第２のステップｂ）において、ステップａ）で得られた混合物は、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と接触させる。
本発明により用いることができる支持体は、極めて多様な型のものであり得る。それらは、固体支持体、例えば参照抗生物質調製物でコートされたチューブ、プレート又はロッドであり得る。それは、膜が結合している固体支持体の形態のテスト装置であって、１又は複数の捕獲物質が決められた検出ゾーンにあるものであり得る。それらは、ゲルを形成することができ、参照抗生物質が固定されている磁石又は非磁石ビーズの形態（アガロース、ポリスチレン等）の支持体であり得る。
【００２６】
参照抗生物質は、当業者に知られている方法により、例えば任意にスペーサーを介した支持体への共有結合又は非共有結合吸着により、支持体上に固定することができる。
本発明の特定の実施形態によれば、ステップａ）及びｂ）は同時に行うことができる。
【００２７】
本発明による方法のステップｃ）は、参照抗生物質が固定された支持体に結合したレセプターを測定することからなる。この測定のために用いる方法は、用いるラベリング剤の型に直接、関連する。ラベリング剤が酵素によるなら、測定ステップは、例えば所定の色の形成を伴う、関連するこの酵素に特異的な反応に関するであろう。ラベリング剤が蛍光によるなら、測定は単に支持体の蛍光を測定することにより行われるだろう。金属粒子又は有色ラテックスの場合、支持体に結合したレセプターの存在は、その強度が支持体に結合したレセプターの数に直接、比例する色によって反映される。用いるラベリング剤の型と関係なく、検出するシグナルの強度は、分析するサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
【００２８】
本発明は、生物流体中の抗生物質を検出するためのテストキットであって、バチルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対してセンシティブであるレセプターを含む少くとも１の認識剤、及び支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質を含むキットにも関する。
以下の例は本発明を行うための種々の態様及び方法を詳述するが、その範囲を限定するものではない。
【００２９】
実施例１．ミルク中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の測定
この例は、ヘルス・オーソリティーにより規制されているβ−ラクタム環を含む抗生物質のミルク中での測定を示す。この例に記載されるテストは、ラベリング剤として機能する金のビーズに結合したＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、膜が結合している固体支持体を含むテスト装置の形態の支持体を用いる。
【００３０】
１．１．金のビーズへのＢｌａＲ−ＣＴＤのカップリング
１．１．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤのビオチニル化
６．６mg／mlの濃度を有する認識剤ＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液３．７９mlをリン酸ナトリウム緩衝液２０mM pH７にとる。次にこのＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液に、４１．７１mlの重炭酸緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及び２．２３mg／mlの重炭酸緩衝液を含むＮ−ヒドロキシスクシニミド６−（ビオチンアミド）カプロン酸エステルの２mlの溶液を加える。この溶液を環境温度で光なしで、２時間、２回転／分の速度で（VEL, Belgiumから利用できる）回転軸上のチューブについてのＬＡＢＩＮＣＯスターラーで静かに撹拌する。２．５mlのＴｒｉｓ緩衝液、１Ｍ pH８の溶液を３０分、同じ条件下で反応混合物と共にインキュベートする。得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １００mM、pH８、ＮａＣｌ １００mM、ＭｇＣｌ2 ５０mM）に対して２４時間、透析する。この方法において、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を得てそれをＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で緩衝液１ml当り２５０mgのビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤの濃度に希釈する。
【００３１】
１．１．２．ラベリング剤
ラベリング剤として、ヤギ抗ビオチン抗体が、（British Biocell (Ret. GAB 40）から利用できる）０．１％のアジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２のテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態で析出している４０nmの直径を有する金の粒子を用いる。これら懸濁液の５２０nmでの光学密度は約１０でありタンパク質濃度は約２４mg／mlである。
【００３２】
１．１．３．ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤの金粒子へのカップリング
実施例３．１．１で調製したビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で１１４．７倍に希釈する。室温で、この希釈ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液２２．５容量部、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液７．５容量部、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤを標識するために用いる金の粒子懸濁液９．２７容量部、及び参照金粒子懸濁液６容量部を混合する。
【００３３】
１．１．４．独立した参照物質
このテストにおいて、その強度がサンプル中に存在する抗生物質の迅速な定量を可能にするバンドを供給する参照物質を用いる。
この目的のために、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体が析出している金の４０nm粒子を用いた。これらの粒子は０．１％アジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２の２mMテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態でBritish Biocell (Ref. GAR40)から利用できる。これらの懸濁液の５２０nmにおける光学密度は約３であり、タンパク質濃度は約６mg／mlである。
【００３４】
１．２．テスト装置
用いたテスト装置は、第１の端から始まり連続的に結合している第１及び第２の端を有する固体支持体（１）、
分析する流体を精製するための膜（２）、
２種の捕獲物質（参照抗生物質及び独立した参照物質に結合することができる物質）が固定されている膜（３）、及び
吸収膜（４）
を含む。
【００３５】
１．２．１．アッセイ装置のアセンブル
３００×７６．２mmの大きさを有するカードを、まず最初に、以下の方法に従って（BioDot, Inc.から利用できる）Clamshell laminator 型のラミネーターを用いてアセンブルする：
（Adhesive Research から利用できる）型ＡｒＣａｒｅ８５６５の長方形のプラスチック支持体を３００×７６．２mmを測定して切断する（固体支持体（１））。次に、３００×２０mmの大きさの（Pall Gelman Sciencesから利用できる）長方形のＬｅｕｋｏｓｏｒｂ ＬＫ４膜（膜（２））、３００×２５mmの大きさの（Millipore から利用できる）長方形のＨｉ−Ｆｌｏｗ ＳＸ膜（膜（３））、３００×４０mmの大きさの（Whatman から利用できる）長方形の３mmセルロース膜（膜（４））を切断する。
【００３６】
続けて、膜（２）及び（４）、次に（３）をラミネーターの下方の鋳型の特定の位置におく。接着剤で包んだ固体支持体（１）を、その部分を、接着剤面が空気に露出するように装置のカバー内に保持する。下側の鋳型においた膜を、ラミネーターを閉じることにより接着支持体に接触させ；その膜を真空ポンプからの空気吸引により正確な場所に保持する。真空をなくした時に、膜（２），（３）及び（４）がその上に固定された固体支持体（１）からなるカードを得る。
【００３７】
次に、以下の溶液を膜（３）上に析出させる：近位側：第１の捕獲物質；バンドNo. １；遠位側：第２の捕獲物質；バンドNo. ２。これらの捕獲物質をBioDot IncからのX-Y Platform Biojet Quanti-3000タイプの“Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ”を用いて析出させる。
その析出した溶液を、カード全体を１分間、６０℃の熱い強制空気下におくことにより直ちにエバポレートする。
【００３８】
アセンブリー後に得られたカードを、ギロチン型装置で、又はロータリー装置でストリップに切断する（BioDot, Kinematic 又はAkzoから利用可）。その端のストリップを除去し、他のストリップを直ちに用いる。
図１はこのようなアッセイ装置を示す。
それらを保護するために、アッセイ装置はデシカント（Silgelac, France）の存在下で不透明な密閉した容器に入れる。
【００３９】
１．２．２．第１の捕獲物質、参照抗生物質
炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトガンマグロブリン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノ−チオランヒドロクロライド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
【００４０】
更に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファロスポリンＣ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
次に先に調製した２つの溶液を混合する。得られた溶液のpHを３mlのＮａＨ2 ＰＯ4 ５００mMを加えることにより７．１に調節し、その溶液を２５℃で２時間、インキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶液を０．２２mmフィルターを介してろ過し、次にアリコートに分けて使用まで−２０℃で凍結する。
【００４１】
使用の時にアリコートを解凍し、析出物の正確な位置及び微量物の質をいつでも示すように、それらを膜上に析出させる前に、それらに食品着色剤を加える。
第１の捕獲物質はサンプル中に存在する抗生物質の量に対して過剰に金粒子に結合したＢｌａＲ−ＣＴＤを固定することを可能にする。
１．２．３．第２の捕獲物質。独立した参照物質を固定することができる物質
第２の捕獲物質のために、１０mMリン酸ナトリウムpH７．５、ヒトガンマグロブリン５mg／ml緩衝液中０．５mg／mlのイムノグロブリン濃度を有するウサギイムノグロブリン溶液（Sigma Ｉ ５００６）を用いる。この第２の捕獲物質は、液体がアッセイ装置を超えてマイグレートする時に参照物質を停止させる。
【００４２】
１．３．ミルク中の抗生物質の測定
１．３．１．３分テスト−迅速テスト
各々０；１；２；３；４；５及び６ppb のペニシリンＧを含む新しいミルクの７つのサンプルを調製する。次にこれらの溶液各々を以下の方法で分析する：
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４３】
以下の表１は、テストした７つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するペニシリンＧの量に反比例する。
【００４４】
【表１】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表１に示す結果は、このテストが３分で、ミルクのサンプル中の４ppb 未満のペニシリンＧの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この３分間、行ったテストは、５ppb までのアモキシシリン、５ppb までのアンピシリン、１０ppb 未満までのシクロキサシリン、２０ppb 未満までのジシクロキサシリン、２０ppb 未満までのオキサシリン及び２０ppb までのセファピリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００４６】
１．３．２．５分テスト
各々０；２；４；６；８及び１０ppb のシクロキサシリンを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する：
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を３分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４７】
以下の表２は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するシクロキサシリンの量に反比例する。
【００４８】
【表２】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表２に示す結果は、このテストが５分で、ミルクのサンプル中の４ppb 未満のシクロキサシリンの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この５分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリン、４ppb までのアンピシリン、８ppb までのジシクロキサシリン、８ppb までのオキサシリン、１６ppb までのセファピリン、１００ppb までのセフチオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb までのナフシリン、及び６０ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５０】
このテストは、ミルクワゴンをサイロに出す前のソーティングテストとして特に適している。
１．３．３．９分テスト
各々０；４；６；８；１０及び１２ppb のセファピリンを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する。
【００５１】
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を７分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５２】
以下の表３は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するセファピリンの量に反比例する。
【００５３】
【表３】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表３に示す結果は、このテストが９分で、ミルクのサンプル中の６ppb 未満のセファピリンの検出を許容することを示す。
同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この９分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリン、４ppb までのアンピシリン、４ppb までのシクロキサシリン、８ppb 未満までのジシクロキサシリン、８ppb 未満までのオキサシリン、８０ppb までのセフチオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb 未満までのナフシリン、及び４５ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５５】
これにより、９分間、行ったこのテストは、ヨーロッパ当局により現在、規制されている全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出を許容する。
１．３．４．２０分テスト
各々０；２０；３０；４０；５０及び６０ppb のセフチオフルを含む新しいミルクの６のサンプルを調製する。次にこれら溶液の各々を以下の方法で分析する。
【００５６】
ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１８分間、４７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５７】
以下の表４は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察されたシグナルの強度はサンプル中に存在するセフチオフルの量に反比例する。
【００５８】
【表４】
この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、テストは陽性であると考えられる。表４に示す結果は、このテストが２０分で、ミルクのサンプル中の３０ppb までのセフチオフルの検出を許容することを示す。
これにより、２０分でのこのテストは、ヨーロッパ及び米国当局により現在規制される全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出を許容する。
【００６０】
実施例２．ミルク中の６の抗生物質の測定
この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストはβ−ラクタマーゼとの融合タンパク質の形態でＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、磁気ビーズの形態で支持体を用いる。
【００６１】
２．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, 1990 ）とバチルス・セレウス（Bacillus cereus ）からのＺｎβ−ラクタマーゼ（M.Hussain ら、1985, J.Bact., 164: 1, 223〜229, 1985 ）との間の遺伝子カップリングにより得る。
【００６２】
そのカップリングは以下の方法で行われる：
２．１．１．プラスミドの作製：
ＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチド及びβ−ラクタマーゼの遺伝子間で１／１カップリングを行った。β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を同時にＢｌａＲ−ＣＴＤ遺伝子の後に導入した。その遺伝子融合を有するプラスミドは、カナマイシンに対する耐性を示す。その融合タンパク質を以後、Ｆｕｓｌと呼ぶ。
【００６３】
２．１．２．生産：
株：融合遺伝子を有するプラスミドを大腸菌に導入した。その組換えプラスミドを有するクローンをＬＢ＋Ｋｍ（５０μｇ／ml）上で選択する。
選択：放射性抗生物質での細胞抽出物のラベリング、次の変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動は、そのタンパク質のほとんどが、その分子量が約５０，０００である融合タンパク質の形態で生産されることを示す。しかしながら、翻訳後タンパク質分解が極めて小さい割合（２％）のこれらの分子を２つの別個の活性に解離させるようである。
【００６４】
培養：５００mlのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）を−７０℃で保存した組換え細胞を用いて接種する。そのプレカルチャーを３７℃でインキュベートし、２２５rpm で一晩、撹拌する。１８リッターのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）に５００mlのこのプレカルチャーを接種する。その６００nmでの光学密度は４である。その１８リッター培養を、光学密度が６の値に達した時に停止させる。
【００６５】
２．１．３．抽出：
培養を停止した直後に、細胞をろ過し次に遠心する。粉砕機内で溶解した細胞ペレットからの上清を維持する。それは融合タンパク質ＦＵＳＩを含む。
２．１．４．精製：
用いる緩衝液：
・緩衝液Ａ：２０mM pH８．０ Ｔｒｉｓ、１０％エチレングリコール、５０μｍ ＤＴＴ；
・緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮＡＣｌ
融合タンパク質を、イオンクロマトグラフィーにより及び分子ふるいで部分精製する。その抽出物を析出させ、緩衝液Ａ中でＱＳＦＦカラム（Pharmacia, Upsala ）で洗浄した後、ＦＵＳＩを緩衝液Ｂの直線勾配で溶出する。次にその活性画分（±０．２５Ｍ ＮａＣｌ）を組み合わせＧ−１００分子ふるい（Pharmacia, Upsala ）に析出し；それらを緩衝液Ａで溶出する。回収したバッチの平均比活性は３０％であると評価される。
【００６６】
２．１．５．β−ラクタマーゼの阻害：
融合タンパク質（９／１０容量）を、３７℃で４５分、５０mM ＥＤＴＡ（１／１０容量）と共にインキュベートする。その阻害を、１０mM pH６．０カコジル酸緩衝液中ニトロセファイン（nitrocefine ）を用いて検査する。Ｚｎの存在又は欠如下で、シグナルは各々陽性又は陰性であるはずである。阻害の後、β−ラクタマーゼ活性に基づいて測定した有効な濃度は７．７４pmol／μｌである。
【００６７】
２．２．固体支持体：磁気ビーズ−セファロスポリンＣ（参照抗生物質）
（ＡＭ ４１００ＢとしてDRG Instrument GmbH, Marburg, Germany から利用できる）ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子を用いる。そのＮＨ2 端は以下の方法でグルタルアルデヒトで活性化されている。
ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子の開始溶液１容量を５容量の０．０１Ｍ pH６．０ピリジン緩衝液で４回、ゆすぐ。その粒子をピリジン緩衝液中５％で２．５容量のグルタルアルデヒトにとり、室温で３時間、回転させて撹拌する。次にそれらを２容量の０．０１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液で１０回、ゆすぐ。次にその粒子をＫｐｉ緩衝液中０．１ＭセファロスポリンＣの１容量に再度懸濁し、＋４℃で一晩、回転させて撹拌する。最後のゆすぎを、セファロスポリンＣが０．１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液から完全に除去されるまで行う。
【００６８】
２．３．ミルク中の６の抗生物質、ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセルチオフルの測定
２．３．１．用いる溶液：
溶液１：１００mM、pH８ Ｔｒｉｓ、１mg／ml ＢＳＡ、５０mM ＥＤＴＡ、５０μｍ ＤＴＴ中に凍結乾燥した融合タンパク質７００ピコモルを５mlのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再び水和する。この溶液５０μｌが測定を行うために必要とされる。
【００６９】
溶液２：１００％イソプロパノール中実施例１．２で調製したＢｉｏＭａｇ−セファロスポリンＣ粒子２ml；測定を行うために２０μlが要求される。
溶液３：凍結乾燥し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５００mlで再び水和した１０mM、pH６カコジル酸緩衝液。
溶液４：ＤＭＦ中１０mMニトロセファインの４００mlを溶液３で４０mlに希釈する。検出のために４００μｌが要求される。
【００７０】
２．３．２．検出法：
５０μｌの溶液１を５００ｍｌのドープト（ｄｏｐｅｄ）ミルクサンプルに入れ、４７℃で２分、インキュベートする。２０μｌの溶液２をそのミルクに懸濁し、それを４７℃で２分、再びインキュベートする。その粒子を常磁性磁石を用いて容器の壁に引きつけながら、上清をチューブからとる。その粒子を溶液３で２回、ゆすぎ、磁石で同じ方法を行う。最後に４００μｌの溶液４を４７℃で３分、その粒子の存在下でインキュベートする。次に、４８２nmでの残存溶液の吸光度をニトロセファイン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎｅ）溶液に対して測定する。
【００７１】
この方法は、ＵＳ当局で示される６種の抗生物質の、当業により強制される基準未満の濃度で、即ちペニシリンを５ppb 、アンピシリンを１０ppb 、アモキシシリンを１０ppb 、シクロキサシリンを１０ppb 、セファピリンを２０ppb 及びセフチオフルを５０ppb での検出を許容する。
実施例３．ミルク中の３種の抗生物質（ペニシリンＧ、シクロキサシリン、セフチオフル）の測定
この例はヘルス・オーソリティーにより規制されるμ−ラクタム環を含む３種の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストは、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼ各々との２つの融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、マイクロプレートの形態の支持体を用いる。
【００７２】
３．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114 (1990)）とリフェレンス１４６４７５２としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用できる活性化アルカリホスファターゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７３】
カップリングは以下の方法で行った：
３．１．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びアルカリホスファターゼをpH９．８で１００mM炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。１５ナノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを２５℃で２時間、１００μｌの活性化アルカリホスファターゼ（２０mg／ml）の存在下でインキュベートする。
【００７４】
３．１．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートする。
【００７５】
３．１．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液を加える。
３．１．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約３００μｌ）を３回、８時間、０．５Ｌの５０mM、pH７．６トリエタノールアミン緩衝液、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ2 、０．５mM ＺｎＣｌ2 、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
【００７６】
３．１．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り約５０pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。
３．２．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, (1990) ）とリファレンス１４２８８６１としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用できる活性化ペルオキシダーゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７７】
カップリングは以下の通り行う：
３．２．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びペルオキシダーゼを１００mM、ｐＨ９．８炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。４０ナノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを１００μｌの活性化ペルオキシダーゼ（１６mg／ml）の存在下で２時間、25℃でインキュベートする。
【００７８】
３．２．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートする。
【００７９】
３．２．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液を加える。
３．２．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約４６０μｌ）を３回、８時間、０．５Ｌの１０mM、pH７．５ リン酸カリウム緩衝液、２００mM ＮａＣｌ、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
【００８０】
３．２．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り約１００pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。
３．３．固体支持体：マイクロプレート−セファロスポリンＣ
３．３．１．参照抗生物質溶液の調製
炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトγ−グロブリン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノチオランヒドロクロライド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を１時間、２５℃でインキュベートする。
【００８１】
別個に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファロスポリン−Ｃ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。
次に、先に調製した２つの溶液を一緒に混合する。得られた溶液のpHを、３mlの５００mM ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより７．１に調節し、その混合物を２時間、２５℃でインキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を、１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶液を０．２２μｍフィルターを介してろ過する。
【００８２】
３．３．２．参照抗生物質でのマイクロプレートのコーティング
ブランド名ＮＵＮＫ（Immuno Plate: Maxisorp Type ）又はブランド名ＧＲＥＩＮＥＲ（microlon 600, reterence 705071）の、高タンパク質吸着のポリスチレンマイクロプレートを用いる。マイクロプレートキュベットを１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液で洗う。次に、実施例３．３．１．で調製した溶液のアリコートを２４時間、４℃でそのキュベット中でインキュベートする。インキュベーションの後、そのキュベットを３回、１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗う。次にチューブを２時間、２０℃で１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ飽和緩衝液、５％ ＢＳＡで満たす。洗浄液で３回、洗った後、そのチューブを乾燥させ、水分を遠ざけて４℃で保存する。
【００８３】
ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤を意図したキュベットのために、用いる洗浄液は１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 であり；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤を意図したキュベットのために、用いる洗浄緩衝液は５０mM、pH５リン酸カリウムである。
３．４．ミルク中の３種の抗生物質の測定
１．４ピコモルの標識化認識剤を４７℃で５分、１００μｌのドープトミルクの存在下でインキュベートする。そのミルクをピペットを用いて、実施例２．３．に示すようにプレ処理したキュベットに移す。次にそのミルクを２分、４７℃でインキュベートする。ミルクを除去した後、洗浄液で２回、洗い（実施例２．３．２を参照）、その後、顕在化基質を含む３００μｌの緩衝液を２分、キュベット中でインキュベートする（ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤のための顕在化基質：５０mM、pH５リン酸カリウム、９．１mM ＡＢＴＳ、０．００２％ Ｈ2Ｏ2；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤のための顕在化基質：１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ４−ＮＰＰ）。次にそのプレートをＥＬＩＳＡプレートのための自動分光光度計に入れる。ここでその波長は４０５nmにセットする。
【００８４】
このテストは、ＵＳ当局により要求される規制域値での３種の抗生物質ペニシリンＧ、シクロキサシリン及びセフチオフルの検出を許容する（５ppb のペニシリンＧ、１０ppb のシクロキサシリン及び５０ppb のセフチオフル）。
実施例４．ミルク中の６種の抗生物質ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセフチオフルの測定
この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６種の抗生物質の、これらの当局により現在要求される基準以下までのミルク中での検出を示す。この例に記載するテストは、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼとの融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、コートしたチューブの形態の支持体を用いる。
【００８５】
４．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質
実施例３．１．を参照のこと。
４．２．固体支持体：参照抗生物質でコートしたチューブ
この例において、ブランド名ＮＶＮＫ（Maxisorp type ）の高タンパク質吸着のポリスチレンチューブを用い、それを実施例３．３．２に示すような参照抗生物質溶液で処理する。
【００８６】
４．３．ミルク中の６種の抗生物質の測定
７ピコモルの認識剤を、エッペンドルフチューブ内で４７℃で５分、５００μｌのミルクの存在下でインキュベートする。次に、そのミルクをピペットを用いて、実施例３．２に記載されるように処理したチューブに移す。次にそのミルクを４７℃で２分、インキュベートする。ミルクを除去した後、チューブを２回、１mLの１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン緩衝液、０．５mM ＭｇＣｌ2 で洗う。次に、１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ４−ＮＰＰ顕在化基質を含む５００μｌの緩衝液を加え、その基質を２分、４７℃でインキュベートする。次にその上清の吸光度を、４０５nmに波長を設定した分光光度計を用いて測定する。
【００８７】
この方法は、ＵＳ当局により要求される基準以下の６種の抗生物質の測定を許容する：５ppb 未満のペニシリンＧ；１０ppb 未満のアンピシリン；１０ppb 未満のアモキシシリン；１０ppb 未満のシクロキサシリン；２０ppb 未満のセファピリン；５０ppb 未満のセフチオフル。
【図面の簡単な説明】
【図１】 膜（２），（３）及び（４）が結合した固体支持体（１）を含むテスト装置の型である。本発明により用いることができる支持体の型を示す。図１ａはテスト装置の正面図であり、図１ｂはテスト装置の縦断面図である。
Claims (19)
- 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための方法であって、
ａ）混合物を形成するために、決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合体形成を許容する条件下で、インキュベートするステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少なくとも１の参照抗生物質と、ステップａ）で複合体を形成するように反応していない量の認識剤と前記参照抗生物質との複合体形成を許容する条件下で接触させるステップと、
ｃ）固定された参照抗生物質と複合化され、それによって前記支持体に結合した認識剤の量を決定するステップと、
を含み、ここで、前記認識剤が、β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であり、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）から得られるＢｌａＲレセプター又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを含み；そして前記抗生物質は５分以内で検出されることを特徴とする方法。 - 前記レセプターが、ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターが、金属コロイド粒子、セレニウム、炭素、硫黄又はテルルのコロイド粒子、及び有色合成ラテックスのコロイド粒子から選択されるラベリング剤に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターが、蛍光物質から選択されるラベリング剤に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターが、酵素から選択されるラベリング剤に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記抗生物質に対して感受性であるレセプターが、化学的又は遺伝学的に酵素ラベリング剤に結合していることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターが、ステップａ）の前にラベリング剤に結合されることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一に記載の方法。
- 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターが、ステップａ）の間又は後にラベリング剤に結合されることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一に記載の方法。
- ステップａ）又はｂ）を同時に行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一に記載の方法。
- ステッブｂ）に用いる支持体が、前記参照抗生物質でコートされたチューブ、プレート又はロッドから選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一に記載の方法。
- ステップｂ）に用いる支持体が、以下：
（ｉ）第１及び第２の端を有する固体支持体（１）；
（ii）分析する流体を精製するための膜（２）、ここで該膜（２）は、第１の端で固体支持体（１）に結合されている；
（iii）第２の端で固体支持体（１）に結合された吸収膜（４）；及び
（iv）少なくとも１の参照抗生物質が固定された膜（３）、ここで該膜（３）は、膜（２）と膜（４）との間にある固体支持体（１）に結合されている、
を含むテスト装置であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一に記載の方法。 - ステップｂ）に用いる支持体が、磁気又は非磁気ビーズからなることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれか一に記載の方法により生物流体中の抗生物質を検出するためのテストキットであって、
バチルス・リケニホルミスから得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるＢｌａＲレセプター又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを含む少なくとも１の認識剤と、
支持体上に固定された少なくとも１の参照抗生物質
とを含み、ここで、該抗生物質を５分以内で検出することができる、前記キット。 - 前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペリオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ及びそれらの混合物から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- 前記生物流体が、ミルク試料を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- ３分以内に４ｐｐｂ未満の濃度のペニシリンＧを検出することができることを特徴とする、請求項１〜１２、１４及び１５のいずれか一に記載の方法。
- ３分以内に、５ｐｐｂの濃度のアンピシリン、５ｐｐｂの濃度のアモキシシリン及び５ｐｐｂの濃度のシクロキサシリンを更に検出することができることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
- ５分以内に３ｐｐｂの濃度のペニシリンＧを検出することができることを特徴とする、請求項１〜１２、１４及び１５のいずれか一に記載の方法。
- ５分以内に、４ｐｐｂの濃度のアンピシリン、４ｐｐｂの濃度のアモキシシリン及び４ｐｐｂ未満の濃度のシクロキサシリンを更に検出することができることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
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