KR100577700B1 - 생물학적 유체 중에서 β-락탐 코어를 갖는 항생제를 측정하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 유체 중에서 β-락탐 코어를 갖는 항생제를 검출하는 방법에 관한 것으로, a) 정해진 부피의 생물학적 유체를, 생물학적 유체 중에 존재할 수 있는 항생제가 인지제와 복합체 형성되도록 하는 조건하에서 인지제와 접촉하도록 하고, 이에 따라 얻어진 혼합물을 인큐베이팅시키는 단계, b) 단계 a)에서 얻어진 혼합물을, 기준 항생제가 단계 a)에서 반응하지 않은 인지제와 복합체 형성되도록 하는 조건하에서 지지체 상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제와 접촉하도록 하는 단계, 및 c) 지지체에 결합된 인지제의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 인지제가 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에서 얻어진 β-락탐 코어를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 포함함을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)의 β-락탐 고리를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 이용하여, 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 측정하는 신규하고, 신속하며 민감한 방법에 관한 것이다.
현재, 항생제는 박테리아에 의한 전염병에서 치료제로서 뿐만 아니라 영양분 저장제 및 성장을 자극하기 위한 동물 영양분으로의 첨가제로서 매우 널리 사용되고 있다. 따라서 우유, 소변, 혈액, 혈청, 타액, 고기 추출물, 발효액과 같은 복합적인 생물학적 유체 또는 완충 수용성 배지에서 항생제의 존재를, 심지어 매우 낮은 농도로 존재하더라도 검출할 필요성이 증가하고 있다.
젖소의 특정 전염병을 치료하는 데에 항생제를 사용하는 것은 널리 공지되어 있으므로, 유제 생산의 경우가 상기의 한 예가 된다.
그러나, 분명한 의학적 원인을 위하여, 원칙적으로 인간이 소비하는 우유는 어떠한 미량의 항생제도 없어야 한다. 또한, 0.005 I.U./㎖ 이하의 페니실린 농도는 치즈, 요거트 등의 우유를 기재로 한 제품의 제조 동안 해로운 영향을 미칠 수 있다.
여러가지 상황이 고려될 수 있다. 첫번째 경우, 예컨대 웨건으로 운반하기 전에 농장에서 항생제의 존재를 검출하기 위해 우선 가장 신속하고(5분 미만) 단순한 시험을 할 것이다. 또한, 예컨대 치료에 사용되는 항생제가 공지되어 있고 더우기 이 시험이 법적 기준에서 문제가 되는 항생제의 검출을 가능하게 하는 경우, 이러한 신속한 시험을 이용하는 것을 고려할 수 있다. 두번째 경우, 속도가 중요하지 않다면, 법적 기준의 모두가 아닌, 대부분의 항생제를 검출하는 것이 중요하다.
이러한 이유는 일부 나라의 법이 상당히 구체적인 품질 기준을 부과하기 때문이다. 예를들면, 미국 정부는 우유에서 하기 6가지 항생제의 농도가 특정값을 초과하지 않을 것을 요구하고 있다: 페니실린, 5pb; 암피실린, 10ppb; 아목시실린(amoxicillin), 10ppb; 클록사실린, 10ppb; 세파피린, 20ppb; 세프티오푸르(ceftiofur), 50ppb. 유럽 연합은 다음의 특성 기준을 부여하고 있다: 페니실린, 4ppb; 아목시실린, 4ppb; 암피실린, 4ppb; 클록사실린, 30ppb; 디클록사실린, 30ppb; 옥사실린, 30ppb; 세파피린, 10ppb; 세프티오푸르, 100ppb; 세프퀴논 20ppb; 나프실린, 30ppb; 세파졸린, 50ppb.
따라서, 대부분의 항생제가 검출되는 시험을 이용하는 것이 유익할 수 있다. 또한, 낙농 산업에서, 속도, 민감도 및 단순성의 모든 특성을 갖는 시험이 존재하지 않는 경우, 이들이 모두 갖추어지지는 않더라도 이 세가지 파라미터들의 가장 바람직한 조합을 허용하는 시험이 유익하다는 점을 고려할 수 있다.
이미 다양한 유형의 시험이 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 검출하기 위해 제안되었다.
이러한 시험들은 일반적으로 항생제 또는 이 항생제의 유사체, 및 표지제(방사성 원소, 효소, 형광제 등)을 특이적으로 인지하는 인지제(수용체 또는 항체)를 사용하는 검출 방법을 이용하며, 이 제(agent)들은 검출 시약으로서 본원 후반에 언급된다. 선택된 요소들에 따라 방사선면역측정법(RIA), 방사선수용체분석법(RRA), 효소면역분석법(EIA) 등을 사용한다. 이들의 일반적인 원리에 있어서, 이 시험들은 존재하는 분석체의 양을 표시하는 결과를 얻을 수 있는 두개의 상술된 요소(검출 시약)의 최소 조합을 이용한다.
선택된 검출 방법에 따라 표지제는 선택적으로 인지제, 항생제 또는 인지제의 인식이라는 점에서 항생제 유사 물질과 결합될 수 있다는 점이 주목된다. 또한, 인지제, 항생제 또는 항생제 유사 물질이 고유하게 표지제(예를들면, 방사선표지된 분석물)를 함유하는 방법이 있다.
낙농 제품에 대한, 가장 널리 설명된 분석물 검출 시험은 항생제의 검출에 관한 것이다.
미국 특허 제 4,239,852호는 β-락탐 고리를 갖는 항생제를 우유에서 검출하기 위한 미생물학적 방법을 개시하고 있다. 이 방법에 따르면, 우유 샘플을 우선 항생제에 매우 민감한 미생물, 특히 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus)의 세포 부분들의 존재하에, 다음으로 방사성 원소 또는 효소로 표지된 ("태그된(tagged)") 항생제의 존재하에 인큐베이팅시킨다. 인큐베이팅은 샘플에 항생제가 존재하는 경우의 항생제 및 표지된 항생제가 세포 부분들과 결합하는 것을 허용하는 조건하에 수행된다.
인큐베이팅 후에, 세포 부분은 혼합물로부터 분리된 후 세척된다. 따라서, 세포 부분에 결합되며 표지된 항생제의 양을 측정하여 기준과 비교한다. 세포 부분에 결합되며 표지된 항생제의 양은 분석되는 우유 샘플에 존재하는 항생제의 농도에 반비례한다.
이 방법은 특히 혼합물로부터 세포 부분들을 분리하는 단계에서 상당히 세심한 취급을 요한다. 또한, 우유에서 페니실린 G를 0.01 I.U./㎖ 이하, 및 심지어 0.001 I.U./㎖ 이하까지 검출가능하게 하는 가장 감도있는 버전으로, 이 방법은 방사성 원소(14C 또는 125I)로 표지된 항생제를 이용한다. 이 경우, 우유 중에 존재하는 항생제 양의 측정 또는 그외의 측정은 예컨대 신틸레이션(scintillation) 계수기와 같은 특별한 장치의 사용을 필요로 한다. 또한, 매우 소량이라도 방사성 제품의 취급은 분석 수행자에 대한 위험이 전혀 없지는 않다.
유럽 특허 출원 593 112호는 우유에서 항생제의 검출을 가능하게 하는 방법을 개시하고 있다. 이 방법은 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus)와 같은 항생제에 민감한 미생물로부터 분리되는 단백질을 이용한다. 이 단백질은 추가로 퍼옥시다제와 같은 효소로 표지된다.
시험은 다음과 같이 수행한다: 우유 샘플을 표지된 단백질의 존재 하에 튜브에서 인큐베이팅시키고; 인큐베이팅 후, 우유를 벽에 기준 항생제가 고정되어 있는 제 2 튜브로 옮기고, 제 2 인큐베이팅을 수행시킨 다음, 튜브의 내용물을 제거하고; 제 2 튜브의 벽을 그자체가 제거되는 세척용액으로 3회 세척하고, 제 2 튜브에 존재하는 잔여물을 흡수지로 옮긴 후; 착색 기질을 제 2 튜브에 첨가하여 다시 한번 인큐베이팅시킨 후, 발색을 지연시키는 용액을 첨가하고; 튜브 착색을, 항생제 기준 샘플에 대해 동일하게 실행된 동일성 시험의 착색과 비교한다. 지지체 상에 고정된 표지된 단백질의 양과, 이에 따른 착색 강도는 분석된 우유에 존재하는 항생제의 양에 반비례한다.
상기 특허 출원의 실시예 1에 따르면, 이 시험은 페니실린 G를 5ppb 정도의 농도까지 검출할 수 있고, 아목시실린(5ppb), 암피실린(10ppb), 세파피린(5ppb) 및 세프티오푸르(5ppb)를 검출할 수 있다. 그러나, 이 시험은 유럽 규정에 의해 부과된 수준까지 페니실린, 아목시실린 및 암피실린을 검출할 수 없고, 다른 한편 시험이 상당히 복잡하여 본 발명에서 추구되는 관련한 민감성 및 단순성의 범주를 완전히 충족시키지 못한다.
또한, 상기 시험은 특히 당업자가 아닌 사람들에 의해 수행하기에는 매우 지루하다. 사실, 상기 시험은 하나의 용기로부터 액체 및 잔류물을 다른 용기로 운반하는 단계 및 다수의 세척단계를 포함하는 다수의 단계를 포함한다. 이 시험에 요구되는 단계의 수와 유형이 정해지면, 신뢰성있는 결과를 얻는 것은 작업자의 실험 노하우에 달려있다.
또한, 결과를 해석하는 데에는 대응하여 실행되는 두개의 시험이 요구되어 작업이 다양해지고 복잡해진다.
또한, 우유에서 항생제의 낮은 농도를 측정할 수 있는 다른 유형의 효소 방법이 개시되어 있으며[참조: J.M. Frere et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980), 및 특허 EP 85 667 및 EP 468 946], 이 방법은 특정 효소, 즉 악티노마두라 R39(Actinomadura R39)(이후, "효소 R39"로 지칭함)에 의해 생성되는 가용성 세포외 D-알라닐-D-알라닌 카르복시펩티다제의 이용에 근거한다. 효소 R39는 다양한 펩티드의 D-알라닐-D-알라닌기를 가수분해하는 특이적인 활성을 가지며, 또한 일부 티오에스테르를 가수분해할 수도 있다.
또한, 효소 R39는 β-락탐 고리를 갖는 항생제와 반응하여, 반응하지 않고 실질적으로 비가역적인 동일몰의 효소-항생제 복합체를 매우 신속하게 형성한다.
이 시험의 가장 최신 버전(EP 468 946)에서는, 조사하기 위한 정해진 부피의 액체 샘플을, 샘플 중에 존재할 수 있는 β-락탐 항생제가 효소와 반응하여, 반응하지 않고 실질적으로 비가역적인 동일몰의 효소-항생제 복합체를 형성하는 조건하에서 소정량의 효소 R39와 함께 인큐베이팅시킨다.
이어서, 소정량의 티오에스테르 유형의 기질을, 기질이 제 1 배양 과정 동안 항생제와 복합체 형성하지 않는 잔여 효소에 의해 가수분해되도록 하는 조건하에 제 1 단계에서 수득된 생성물과 함께 인큐베이팅시킨다. 이에 따라, 형성된 메르캅토알칸산의 양은 메르캅토알칸산의 유리 SH기와의 반응에 의해 착색시킬 수 있는 시약의 작용으로 비색분석에 의해 측정된다. 착색 강도를 공지된 양의 항생제를 함유하는 샘플로부터 이전에 확립한 기준과 비교한다. 정량 측정은 분광 광도계에서 측정되며, 우유인 경우에는 미리 샘플을 정화시키는 것이 필요할 수 있다.
특허 EP 468, 946호의 구체예에 따르면, 이 방법은 우유에서 전체 인큐베이팅 시간 5분 동안 페니실린 G 10ppb를, 그리고 전체 인큐베이팅 시간 15분 동안 페니실린 G 약 2.5ppb를 측정할 수 있다.
식료품에서의 항생제 검출 방법에 요구되는 속도, 단순성 및 민감성의 기준을 고려하여, 본 출원인은 생물학적 유체 중에서 항생제를 검출하는 신규하고 더욱 효과적인 방법을 연구하는 것 자체에 목적을 두었다. 특히, 본 출원인은 단일 시험에서, 유럽 및 미국 정부에 의해 규정된 함량의 항생제 대부분을 검출하는 방법을 연구하는 것 자체에 목적을 두었다. 또한, 연구되는 방법은 바람직하게는 비자격자에 의해 수행될 수 있는, 한정된 수의 단계로 이러한 결과를 얻어야 한다. 또한, 본 출원인은 현재 방법들에서 보다 더 단축된 인큐베이팅 시간으로 이러한 목적을 달성하는 방법을 연구했다.
본 출원인은 본 발명의 목적을 주목할만한 방식으로 달성하도록 하며, 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 검출하는 신규한 방법을 발견하였다.
이에 따르면, 본 발명은 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 검출하는 신규한 방법으로서,
a) 정해진 부피의 생물학적 유체를 소정량의 인지제와 접촉시키고, 생물학적 유체 중에 존재할 수 있는 항생제를 인지제와 복합체 형성시키는 조건하에서 상기에서 얻어진 혼합물을 인큐베이팅시키는 단계,
b) 기준 항생제를 단계 a)에서 반응하지 않은 인지제와 복합체 형성시키는 조건하에서 단계 a)에서 얻어진 혼합물을 지지체 상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제와 접촉시키는 단계, 및
c) 지지체에 결합된 인지제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, , 인지제는 바실루스 리케니포르미스로부터 얻어진 β-락탐 고리를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 포함함을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
b) 기준 항생제를 단계 a)에서 반응하지 않은 인지제와 복합체 형성시키는 조건하에서 단계 a)에서 얻어진 혼합물을 지지체 상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제와 접촉시키는 단계, 및
c) 지지체에 결합된 인지제의 양을 측정하는 단계를 포함하며, , 인지제는 바실루스 리케니포르미스로부터 얻어진 β-락탐 고리를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 포함함을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
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도 1은 본 발명에 의해 사용될 수 있는 지지체 유형을 도시한 것으로, 이 지지체는 멤브레인(2), (3) 및 (4)이 부착되어 있는 고체 지지체(1)를 포함하는 시험 기구의 형태이다. 도 1a는 전면도이고 도 1b는 시험 기구의 종단면도이다.
본 발명에 따른 방법의 예외적인 실행은 바실루스 리케니포르미스, 즉 문헌[Y. Zhu et al., J. Bacteriol., 1137-1141, (1990)]에 분리 및 펩티드 서열이 개시된 B1aR 단백질, 또는 문헌[B. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990)]에 분리 및 펩티드 서열이 개시된 B1aR-CTD 폴리펩티드로부터 얻어진 β-락탐 고리를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 포함하는, 특정 인지제의 이용에 근거한다.
β-락탐 고리를 함유하는 항생제의 검출에 본 발명에 따른 B1aR 또는 B1aR-CDT 수용체를 이용하는 것은 본원에 사용되는 인식제에 대해 상당한 이점을 갖는다. 이러한 이유는 B1aR 및 B1aR-CDT 수용체가 다수의 항생제와 매우 신속하게 복합체 형성할 수 있고, 검출이 예컨대 바실루스 스테아로테르모필루스로부터 얻어진 수용체와 같은 공지된 인지제에 요구되는 것보다 더 단축된 배양 시간에서 가능하다는 점이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 검출가능한 항생제의 예로서, 하기 항생제가 언급될 수 있다: 벤질페니실린(또는 페니실린 G), 암피실린, 아목시실린, 카르베니실린, 메틸실린, 클록사실린, 6-APA, 모노락탐, 아즈트레오남, 메실리남, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로리딘, 니트로세핀, 세파톡심, 세푸오록심, 세프티오푸르, 세파피린, 7-ACA. 보다 상세하게, 본 발명에 따른 방법은 미국 및 유럽 정부에 의해 구제되는 모든 항생제를 허용 한계치까지 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 우유, 소변, 혈액, 혈청, 타액, 고기 추출물, 발효액 또는 완충 수용액 배지를 함유하는 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 검출할 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 인지제는 표지제와 결합된 형태로 사용된다. 표지제는 다양한 성질을 가질 수 있다. 표지제는 특별한 유형, 예컨대 금속 콜로이드 입자(백금, 금, 은 등), 셀렌, 탄소, 황 또는 텔루륨의 콜로이드 입자, 또는 다르게는 착색된 합성 라텍스의 콜로이드 입자일 수 있다. 또한, 표지제는 형광 물질, 예컨대 활성된 플루오레신(fluorescein)["Boeringher-Mannheim Biochemica"에서 시판함], 플루오레신 이소시아네이트, 로다민 테트라메틸이소시아네이트 또는 당업자에계 공지된 임의의 다른 형광 물질일 수 있다. 또한 표지제는 효소, 예컨대 β-락타마제, 퍼옥시다제, 포스파타제 등일 수 있다. 이 경우, B1aR 또는 B1aR-CTD는 이 효소의 표지제와 화학적으로 또는 유전적으로 결합되어 융합 단백질을 형성한다.
인지제는 당업자들에게 공지된 통상적인 방법에 따라 표지제와 결합될 수 있다. 인지제는 표지제에 직접 또는 중간 생성 착체의 형성에 의해 결합될 수 있다. 인지제와 표지제 사이의 결합은 본 발명의 방법을 수행하는 동안 다른 시기에 일어날 수 있다. 첫번째 구체예에 따르면, 인지제와 표지제 사이의 결합은 인지제가 분석될 생물학적 유체와 접촉하기 전에 발생한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 인지제와 표지제의 결합은 인지제가 생물학적 유체 샘플과 접촉하게 될 때 또는 이후에 일어날 수 있다. 바람직하게, 인지제의 표지는 인지제가 분석 샘플과 접촉하도록 되기 전에 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법 중 제 1 단계인 a)는 정해진 양의 생물학적 유체를 인지제와 접촉하도록 하고, 이에 따라 얻어진 혼합물을, 생물학적 유체에 존재가능한 항생제와 인지제와의 복합체 형성 가능한 조건하에서 인큐베이팅시키는 단계를 포함한다.
생물학적 유체를 4 내지 60℃의 온도 내에서 B1aR 또는 B1aR-CTD 수용체와 함께 인큐베이팅시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 온도는 약 47℃이다. 인큐베이팅 온도를 증가시키는 것은 인큐베이팅의 기간을 감소시키며, 역은 그 반대이다. 따라서, 반응 시간은 온도를 증가시키므로써 항상 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 방법중 단계 b)에서는, 단계 a)에서 얻어진 혼합물을 지지체상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제와 접촉하도록 한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 지지체는 매우 다양한 유형이 될 수 있다. 이들은 기준 항생제 제품으로 코팅된 튜브, 플레이트 또는 막대와 같은 고체 지지체일 수 있다. 이것은 멤브레인이 결합된 고체 지지체 형태의 시험 기구일 수 있으며, 하나 이상의 포획 물질을 측정되는 검출 영역에 배치시킬 수 있다. 이들은 자기 또는 비자기 비드 형태의 지지체(아가로스, 폴리스티렌 등)일 수 있으며, 겔을 형성할 수 있고, 그 위에 기준 항생제가 고정된다.
기준 항생제는 당업자에게 공지된 방법, 예를들면 스페이서에 의해 선택적으로 지지체 상에서 공유결합 또는 비공유결합의 흡수에 의해 지지체 상에 고정될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 단계 a) 및 b)는 동시에 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 c)는 그 위에 기준 항생제가 고정되어 있는 지지체에 부착된 수용체를 측정하는 단계로 구성된다. 이러한 측정에 사용되는 방법은 사용되는 표지제의 유형과 직접적으로 관계된다. 표지제가 효소이면, 측정 단계는 주어진 착색의 형성과 관련된 효소에 대해 특이적인 반응을 포함한다. 표지제가 형광성이면, 측정은 단순히 지지체의 형광을 측정하여 수행될 것이다. 금속 입자 또는 착색된 격자들의 경우에는, 지지체에 부착된 수용체의 존재는 지지체에 부착된 수용체의 수에 직접적으로 비례하는 착색 강도에 의해 반영된다. 사용되는 표지제의 유형과 관계없이, 검출된 신호의 강도는 분석 샘플에 존재하는 항생제 양에 반비례한다.
또한 본 발명은 생물학적 유체 중에서 항생제를 검출하는 시험 키트에 관한 것으로, 이 시험 키트는 바실루스 리케니포르미스로부터 얻어진 β-락탐 고리와, 지지체 상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제를 함유하는 항생제에 민감한 수용체를 포함하는 하나 이상의 인지제를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 수행하기 위한 여러 일면 및 방법을 예시한 것이나, 본 발명의 범주가 이로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 우유 중에서의 β-락탐 고리를 함유하는 항생제의 측정
이 실시예는 우유 중에서 보건부에 의해 통제되는 β-락탐 고리 함유 항생제를 검출하는 것을 예시한 것이다. 이 실시예에서 기술되는 시험은 표지제로서 역할하는 금 비드와 결합된 B1aR-CTD 수용체를 이용하고, 멤브레인을 부착시킨 고체 지지체를 포함하는 시험 기구 형태의 지지체를 이용한다.
1.1 금 비드로의 B1aR-CTD의 결합
1.1.1 B1aR-CTD의 비오티닐화(Biotinylation)
6.6㎎/㎖ 농도의 인지제 B1aR-CTD 용액 3.79㎖를 pH 7인 20mM 인산나트륨 완충액에 용해시켰다. 이후, 이 B1aR-CTD 용액에, 중탄산염 완충액(0.1M 중탄산나트륨, pH 9) 41.71㎖와 유사하게 중탄산염 완충액 2.23㎎/㎖를 함유하는 N-히드록시숙신이미드 6-(비오틴아미도)카프르산 에스테르 2㎖를 첨가하였다. 이 용액을 주위 온도에서 빛을 멀리하여 2시간 동안 2회전/분의 속도로 회전축 상의 튜브에 대해 라빈코(LABINCO) 교반기(Vel에서 시판함, 벨기에)에서 부드럽게 교반하였다. pH 8인 1M 트리스(Tris) 완충액 2.5㎖를 30분 동안 동일한 조건하에 반응 혼합물과 함께 인큐베이팅시켰다. 이렇게하여, 얻어진 용액을 HNM 완충액(Hepes 100mM, pH 8, NaCl 100mM, MgCl2 50mM)으로 24시간 동안 투석하였다. 이러한 방법으로, HNM-BSA 완충액(Hepes 500mM, pH 8, NaCl 500mM, MgCl2 250mM, BSA 10㎎/㎖)에서 완충액 1㎖당 250㎎의 비오티닐화된 B1aR-CTD 농도로 희석된 비오틴화된 B1aR-CTD 용액을 얻었다. 이 용액을 -20℃에서 저장하였다.
1.1.2. 표지제
표지제로서, 산양 항비오틴 항체가 아지드화나트륨 0.1%["British BioCell"에서 시판함(Ref. GAB40)]에 의해 안정화되며 pH 7.2인 2mM 나트륨 테트라보레이트 수용액에서 현탁액의 형태로 용착되어 있는 직경 40㎚의 금 입자를 사용하였다. 520㎚에서 이러한 현탁액의 광학 밀도는 약 10이고, 단백질 농도는 약 24㎎/㎖였다.
1.1.3. 금 입자로의 비오티닐화된 B1aR-CTD의 결합
실시예 3.1.1에서 제조된 비오티닐화된 B1aR-CTD 용액을 HNM-BSA 완충액(Hepes 500mM, pH 8, NaCl 500mM, MgCl2 250mM, BSA 10㎎/㎖)으로 114.7배 희석하였다. 실온에서, 희석액 비오티닐화된 B1aR-CTD 용액의 22.5 부피부, HNM-BSA 완충액의 7.5 부피부, 비오티닐화된 B1aR-CTD를 표지하기 위해 사용된 금 입자 현탁액 9.27 부피부 및 기준 금 입자 현탁액 6 부피부를 혼합하였다(하기 실시예 3.1.4 참조).
1.1.4. 독립적인 기준
이 시험에서는, 또한 샘플에 존재하는 항생제의 신속한 정량을 가능하게 하는 강도의 밴드를 공급하는 기준 물질을 사용하였다.
이러한 목적을 위해서, 산양 항토끼 면역 글로블린 항체가 그 위에 용착되어 있는 금 40㎚ 입자를 사용하였다. 이러한 입자는 0.1% 아지드화나트륨에 의해 안정화되며, pH 7.2인 2mM 나트륨 테트라보레이트 용액의 현탁액 형태로 브리티쉬 바이오셀(Ref. GAR40)에서 시판되며, 520㎚에서 이러한 현탁액의 광학 밀도는 약 3이고, 단백질 농도는 약 6㎎/㎖였다.
1.2. 시험 기구
사용되는 시험 기구는 제 1 및 제 2 단부를 갖는 고체 지지체(1)를 포함하며,
-분석되는 유체를 정제하기 위한 멤브레인(2),
-그 위에 두개의 포획 물질(기준 항생제 및 독립되는 기준과 결합할 수 있는 물질)이 고정되는 멤브레인(3), 및
-흡수 멤브레인(4)이 제 1 단부에서 시작하여 상기 고체 지지체(1)에 연속적으로 부착된다.
1.2.1. 어셈블링 분석 장치
300×76.2㎜ 크기의 카드를 하기 방법에 따라 클램쉘 라미네이터(clamshell laminator) 유형["BioDot, Inc에서 시판함]의 라미네이터를 이용하여 우선 어셈블링하였다.
아르케어(ArCare) 8596 유형["Adhesive Research"에서 시판함]의 사각형 플라스틱 지지체를 절단시켜 300×76.2㎜ (고체 지지체(1))를 측정하였다. 이어서, 사각형의 류코소르브(Leukosorb) LK4 멤브레인["Pall Gelman Sciences"에서 시판함]을 300×20㎜(멤브레인(2))로 측정하고, 사각형의 하이-플로우(Hi-Flow) SX 멤브레인(Millipore에서 시판함)을 300×25㎜(멤브레인(3))로 측정하고, 사각형의 3㎜ 셀룰로스 멤브레인("Whatman"에서 시판함]을 300×40㎜(멤브레인(4))로 측정하였다.
연속하여, 멤브레인 (2)와 (4), 그리고나서 (3)을 라미네이터의 하부 몰드의 특정 위치에 배치하였다. 접착제가 입혀진 고체 지지체(1)는 접착제면이 공기에 노출되면서 장치의 커버로서 역할한다. 하부 몰드에 위치한 멤브레인은 라미네이터를 닫음으로써 접착성이 있는 지지체와 접촉하게 되며, 이 멤브레인은 진공 펌프로부터 공기 흡입에 의해 정확하게 적소에 위치하게 된다. 진공이 깨지는 경우에는, 지지체와 그 위에 고정되는 멤브레인(2), (3), 및 (4)으로 구성되는 카드가 재생된다.
이후, 하기 용액을 멤브레인(3)에 용착시켰다: 기부측: 제 1 포획 물질; 제 1 밴드; 말단부측: 제 2 포획 물질; 제 2 밴드. 이러한 포획 물질들을 바이오 닷 인코포레이션의 X-Y 플랫폼 바이오젯 퀀티(Platform Biojet Quanti)-3000 유형의 "디스펜서"를 이용하여 용착시켰다.
1분 동안 60℃에서 뜨거운 강제 공기 하에 카드 전체를 위치시킴으로써 용착된 용액을 즉시 증발시켰다.
어셈블리 후 얻어진 카드를 절단기 유형 장치를 이용하여 또는 회전 장치["BioDot, Kinetic 또는 Akzo"에서 시판함]를 이용하여 스트립으로 절단하였다. 단부 스트립이 제거되면, 다른 스트립은 곧 사용할 수 있다.
도 1은 이러한 분석 기구를 도시한 것이다.
이들을 보호하기 위해, 분석 기구를 건조제(Silgelac, France)의 존재하에 불투명하며 밀폐된 용기에 배치시킬 수 있다.
1.2.2. 제 1 포획 물질. 기준 항생제
탄산나트륨 완충액(100mM, pH 9)중에 인간 감마 글로불린(G4386, 시그마) 213㎎과 2-이미노-티올란 히드로클로라이드(Aldrich, 33056-6) 8.6㎎을 함유하는 용액 8㎖를 한시간 동안 25℃에서 인큐베이팅시켰다.
또한, 탄산나트륨 완충액(100mM, pH 9) 중에 세팔로스포린 C 119.8㎎, 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sSMCC, 22322 Pierce) 54㎎을 함유하는 용액 20㎖를 1시간 동안 25℃에서 인큐베이팅시켰다.
이후, 제조된 두 용액을 혼합하였다. 생성된 용액의 pH를 NaH2PO4 500mM 3㎖를 첨가하여 7.1로 조정하고 이 용액을 2시간 동안 25℃에서 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 후에 얻어진 혼합물을 인산나트륨 완충액(10mM, pH 7.5) 1리터에 대해 3회 투석하였다. 생성된 용액을 0.22㎜ 필터로 여과시킨 후, 일정 부분들로 나누고, 사용할 때까지 -20℃에서 냉동시켰다.
사용시 일정 부분들을 녹이고, 이를 멤브레인에 용착시키기 전에 식품 착색제를 첨가하여 언제든지 미량의 특성과 용착물의 정확한 위치를 나타내도록 하였다.
제 1 포획 물질은 샘플에 존재하는 항생제의 양에 대해 과량으로 금 입자에 결합된 B1aR-CTD를 고정시킬 수 있다.
1.2.3. 제 2 포획 물질. 독립적인 기준을 고정시킬 수 있는 물질
제 2 포획 물질용으로, 5㎎/㎖ 인간 감마 글로불린 완충액, pH 7.5인 10mM 인산나트륨 중의 0.5㎎/㎖ 면역 글로불린 농도를 갖는 토끼 면역글로불린 용액(Sigma I 5006)을 사용하였다. 제 2 포획 물질은 액체가 분석 장치를 통해 이동하므로 기준을 중단시켰다.
1.3. 우유 중에서의 항생제 측정
1.3.1. 3-분 시험-신속 시험
0;1;2;3;4;5 및 6ppb의 페니실린 G 각각을 함유하는 신선한 우유 7개의 샘플을 준비하였다. 이후, 각각의 용액을 하기 방법으로 분석하였다.
우유 샘플의 200㎕ 분취액과 실시예 1.1.3.에서 제조된 용액 45.27㎕를 취하여 유리 플라스크에 넣었다. 이 혼합물을 1분동안 47℃에서 인큐베이팅시켰다. 시험 기구를 취하여 유리 플라스크에 수직으로 위치시켜, 시험 기구의 제 1 단부를 혼합물에 접촉시키고 제 2 단부를 유리 플라스크의 벽에 기대 놓았다. 어셈블리를 2분간 47℃에서 인큐베이팅시키는 동안, 혼합물은 방치되어 시험 기구로 이동하였다.
표 1은 시험된 7개의 샘플에서 얻은 결과를 요약하였다. 0 내지 10의 강도값은 검출된 밴드에 따른 것으로, 10은 가장 강한 밴드로 정해지고, 0은 가장 약한 강도의 밴드로 정해졌다. 이러한 등급에 따라, 6이 기준 밴드로 정해졌다. 제 1 밴드에서 관찰된 신호의 강도는 샘플에 존재하는 페니실린 G의 양에 반비례하였다.
| 페니실린 G(ppb) | 강도 | |
| 제 1 밴드 | 제 2 밴드 | |
| 0 | 10 | 6 |
| 1 | 9 | 6 |
| 2 | 9 | 6 |
| 3 | 4 | 6 |
| 4 | 0 | 6 |
| 5 | 0 | 6 |
| 6 | 0 | 6 |
이 실시예에서, 제 1 밴드가 제 2 밴드 보다 약한 강도를 갖는 경우, 시험을 양성(positive)인 것으로 간주하였다. 표 1에 주어진 결과는 이 시험이 우유 샘플에서 3분 동안 4ppb 미만까지 페니실린 G의 검출을 허용하였음을 나타낸다.
또한, 동일한 조건하에 β-락탐 고리를 함유하는 다른 항생제로 시험을 수행하였다. 3분 동안 수행한 이 시험은 우유 샘플에서 아목시실린을 5ppb까지, 암피실린을 5ppb까지, 클록사실린을 10ppb 미만까지, 디클록사실린을 20ppb 미만까지, 옥사실린을 20ppb 미만까지, 그리고 세파피린을 20ppb까지 검출할 수 있었다.
1.3.2. 5-분 시험
0;2;4;6;8 및 10ppb의 클록사실린 각각을 함유하는 신선한 우유 6개의 샘플을 준비하였다. 이후, 각각의 용액을 하기 방법으로 분석하였다.
우유 샘플의 200㎕ 분취액과 실시예 1.1.3.에서 제조된 용액 45.27㎕를 취하여 유리 플라스크에 넣었다. 이 혼합물을 3분동안 47℃에서 인큐베이팅시켰다. 시험 기구를 취하여 유리 플라스크에 수직으로 위치시켜, 시험 기구의 제 1 단부를 혼합물과 접촉시키고 제 2 단부를 유리 플라스크의 벽에 기대 놓았다. 어셈블리를 2분간 47℃에서 인큐베이팅시키는 동안, 혼합물은 방치되어 시험 기구로 이동하였다.
표 2는 시험된 6개의 샘플에서 얻은 결과를 요약하였다. 0 내지 10의 강도값은 검출된 밴드에 따른 것으로, 10은 가장 강한 밴드로 정해지고, 0은 가장 약한 강도의 밴드로 정해졌다. 이러한 등급에 따라, 6이 기준 밴드로 정해졌다. 제 1 밴드에서 관찰된 신호의 강도는 샘플에 존재하는 클록사실린의 양에 반비례하였다.
| 클록사실린(ppb) | 강도 | |
| 제 1 밴드 | 제 2 밴드 | |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 6 | 6 |
| 4 | 5 | 6 |
| 6 | 3 | 6 |
| 8 | 3 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
이 실시예에서, 제 1 밴드가 제 2 밴드 보다 약한 강도를 갖는 경우, 시험을 양성인 것으로 간주하였다. 표 2에 주어진 결과는 이 시험이 우유 샘플에서 5분 동안 4ppb 미만까지 클록사실린의 검출을 허용하였음을 나타낸다.
또한, 동일한 조건하에 β-락탐 고리를 함유하는 다른 항생제로 시험을 수행하였다. 5분 동안 수행한 이 시험은 우유 샘플에서 페니실린 G을 3ppb까지, 아목시실린을 4ppb까지, 암피실린을 4ppb까지, 디클록사실린을 8ppb까지, 옥사실린을 8ppb까지, 세파피린을 16ppb까지, 세프티오푸르를 100ppb까지, 세프퀴논을 20ppb 미만까지, 나프실린을 20ppb까지, 그리고 세파졸린을 60ppb까지 검출할 수 있었다.
이 시험은 우유 웨건이 지하실로 옮겨지기 전의 분류 시험으로서 특히 적합하다.
1.3.3. 9-분 시험
0;4;6;8;10 및 12ppb의 세파피린 각각을 함유하는 신선한 우유 6개의 샘플을 준비하였다. 이후, 각각의 용액을 하기 방법으로 분석하였다.
우유 샘플의 200㎕ 분취애과 실시예 1.1.3.에서 제조된 용액 45.27㎕를 취하여 유리 플라스크에 넣었다. 이 혼합물을 47℃에서 7분동안 인큐베이팅시켰다. 시험 기구를 취하여 유리 플라스크에 수직으로 위치시켜, 시험 기구의 제 1 단부를 혼합물과 접촉시키고 제 2 단부를 유리 플라스크의 벽에 기대 놓았다. 어셈블리를 2분간 47℃에서 인큐베이팅시키는 동안, 혼합물은 방치되어 시험 기구로 이동하였다.
표 3은 시험된 6개의 샘플에서 얻은 결과를 요약하였다. 0 내지 10의 강도값은 검출된 밴드에 따른 것으로, 10은 가장 강한 밴드로 정해지고, 0은 가장 약한 강도의 밴드로 정해졌다. 이러한 등급에 따라, 6이 기준 밴드로 정해졌다. 제 1 밴드에서 관찰된 신호의 강도는 샘플에 존재하는 세파피린의 양에 반비례하였다.
| 세파피린(ppb) | 강도 | |
| 제 1 밴드 | 제 2 밴드 | |
| 0 | 10 | 6 |
| 4 | 6 | 6 |
| 6 | 5 | 6 |
| 8 | 4 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
| 12 | 3 | 6 |
이 실시예에서, 제 1 밴드가 제 2 밴드 보다 약한 강도를 갖는 경우, 시험을 양성인 것으로 간주하였다. 표 3에 주어진 결과는 이 시험이 우유 샘플에서 9분 동안 6ppb까지 세파피린의 검출을 허용하였음을 나타낸다.
또한, 동일한 조건하에 β-락탐 고리를 함유하는 다른 항생제로 시험을 수행하였다. 9분 동안 수행한 이 시험은 우유 샘플에서 페니실린 G을 3ppb까지, 아목시실린을 4ppb까지, 암피실린을 4ppb까지, 클록사실린을 4ppb까지, 디클록사실린을 8ppb 미만까지, 옥사실린을 8ppb 미만까지, 세프티오푸르를 80ppb까지, 세프퀴논을 20ppb 미만까지, 나프실린을 20ppb 미만까지, 그리고 세파졸린을 45ppb 까지검출할 수 있었다.
이렇게 하여, 9분 동안 수행된 이 시험은 유럽 정부에 의해 현재 통제되는 모든 항생제를 정부가 부과한 법적 한도까지 검출할 수 있었다.
1.3.4. 20-분 시험
0;20;30;40;50 및 60ppb의 세푸티오프르 각각을 함유하는 신선한 우유 6개의 샘플을 준비하였다. 이후, 각각의 용액을 하기 방법으로 분석하였다.
우유 샘플의 200㎕ 분취액과 실시예 1.1.3.에서 제조된 용액 45.27㎕를 취하여 유리 플라스크에 넣었다. 이 혼합물을 47℃에서 18분동안 인큐베이팅시켰다. 시험 기구를 취하여 유리 플라스크에 수직으로 위치시켜, 시험 기구의 제 1 단부를 혼합물과 접촉시키고 제 2 단부를 유리 플라스크의 벽에 기대 놓았다. 어셈블리를 2분간 47℃에서 인큐베이팅시키는 동안, 혼합물은 방치되어 시험 기구로 이동하였다.
표 4는 시험된 6개의 샘플에서 얻은 결과를 요약하였다. 0 내지 10의 강도값은 검출된 밴드에 따른 것으로, 10은 가장 강한 밴드로 정해지고, 0은 가장 약한 강도의 밴드로 정해졌다. 이러한 등급에 따라, 6이 기준 밴드로 정해졌다. 제 1 밴드에서 관찰된 신호의 강도는 샘플에 존재하는 세프티오푸르의 양에 반비례하였다.
| 세프티오푸르(ppb) | 강도 | |
| 제 1 밴드 | 제 2 밴드 | |
| 0 | 10 | 6 |
| 20 | 6 | 6 |
| 30 | 5 | 6 |
| 40 | 4 | 6 |
| 50 | 3 | 6 |
| 60 | 3 | 6 |
이 실시예에서, 제 1 밴드가 제 2 밴드 보다 약한 강도를 갖는 경우, 시험을 양성인 것으로 간주하였다. 표 4에 주어진 결과는 이 시험이 우유 샘플에서 20분 동안 30ppb까지 세프티오푸르의 검출을 허용하였음을 나타낸다.
이렇게 하여, 20분 이상의 이 시험은 단일 시험에서 유럽 및 미국 정부에 의해 현재 통제되는 모든 항생제를 이들 정부가 부과한 법적 한도까지 검출할 수 있었다.
실시예 2 : 우유 중에서의 6가지 항생제의 측정
본 실시예는 우유 중에서 미국 정부에 의해 통제된 β-락탐 고리를 함유하는 6가지 항생제의 검출을 예시한 것이다. 본 실시예에서 기술되는 시험은 β-락타마제와 함께 융합 단백질의 형태로 B1aR-CTD 수용체를 사용하고, 자기 비드의 형태로 지지체를 사용하였다.
2.1 B1aR-CTD-β-락타마제 융합 단백질
B1aR-CTD-β-락타마제 융합 단백질을 B1aR-CTD 수용체[B. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990]와 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)의 유전적 결합에 의해 얻었다[M. Hussain et al., 1985, J. Bact., 164:1, 223-229, 1985].
결합은 다음의 방식으로 수행되었다:
2.1.1. 플라스미드의 제조: 1/1 결합은 B1aR-CTD 폴리펩티드의 유전자와 β-락타마제 사이에서 수행되었다: β-락타마제에 대해 코딩하는 유전자를 B1aR-CTD 유전자와 일치하게 및 뒤에 도입하였다. 유전적 융합을 지닌 플라스미드는 카나마이신에 대한 내성을 보여주었다. 융합 단백질을 하기에서 Fus 1로 언급하였다.
2.1.2. 제조:
-균주: 융합된 유전자를 지니는 플라스미드를 E. Coli에 도입하였다. 재조합 플라스미드를 지니는 클론을 LB + Km (50㎍/㎖) 상에서 선택하였다.
-선택: 세포 추출물을 방사성 항생제로 표지한 후, 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기이동에 의해, 대부분의 단백질이 분자량이 약 50,000인 형태로 생성됨을 나타내었다. 그러나, 후-번역 단백질 분해는 매우 작은 분율(2%)의 이들 분자를 두개의 별개의 활성으로 분해하는 것으로 여겨졌다.
-배양: LB + Km(50㎍/㎖) 배지 500㎖를 -70℃에서 저장된 재조합 세포를 이용하여 예방접종시켰다. 전배양물을 37℃에서 인큐베이팅시키고 225rpm에서 하룻밤 동안 교반하였다. LB + Km(50㎍/㎖) 배지 18리터를 이러한 전배양물 500㎖로 예방접종시켰으며, 이때 600㎚에서의 광학 밀도는 4였다. 광학 밀도가 6에 도달하면 18리터의 배양을 중단시켰다.
2.1.3. 추출: 배양을 멈춘 직후, 세포를 여과한 후 원심분리하였다. 분쇄기에 용해된 세포 펠릿의 상청액을 보존하였다. 이것은 융합 단백질 FUS 1을 함유하였다.
2.1.4. 정제:
-사용된 완충액:
● 완충액 A: 20mM pH 8.0 트리스, 10% 에틸렌글리콜, 50㎛ DTT;
● 완충액 B: 완충액 A + 1M NaCl
융합 단백질은 이온 크로마토그래피에 의해 그리고 분자사 상에서 부분적으로 정제하였다. 추출물을 용착하고 QSFF 컬럼(Pharmacia, Upsala) 상에서 완충액 A로 세척한 후, FUS1을 직선 경사도의 완충액 B로 용출시켰다. 이후, 활성 부분(±0.25M NaCl)을 조합하고 G-100 분자사(Pharmacia, Upsala) 상에 용착시켰으며, 이들을 완충액 A로 용출시켰다. 회수된 배치(batch)의 평균 특정 활성은 30%로 추정되었다.
2.1.5. β-락타마제의 억제: 융합 단백질(9/10 부피)을 37℃에서 45분 동안 50mM EDTA(1/10 부피)와 함께 인큐베이팅시켰다. 10mM pH 6.0 카코딜레이트 완충액 중의 니트로세핀을 사용하여 억제를 조사했다. Zn이 있는 경우와 없는 경우에, 신호는 각각 양성 또는 음성(negative)이었다. 억제 후에, β-락타마제 활성을 근거로 측정된 효과적인 농도는 7.74pmol/㎕이었다.
2.2 고체 지지체: 자기 비드-세팔로스포린 C (기준 항생제)
바이오마그(BioMag) 4100 입자들[기준 Am 4100 B 하에, "DRG Instrument GmbH, Marburg, Germany"에서 시판함]을 사용하고, 이것의 NH2 단부들은 하기 방법으로 글루타르알데히드로 활성시켰다:
- 바이오마그 4100 입자의 초기 용액 1부피를 0.01M pH 6.0 피리딘 완충액 5 부피로 4회 헹구었다. 피리딘 완충액중의 5%에서 글루타르알데히드 2.5부피에 입자를 흡수시켜 실온에서 3시간 동안 회전에 의해 교반하였다. 이후, 이들을 0.01M pH 7.0 Kpi 완충액 2부피로 10회 세척하였다. Kpi 완충액중의 0.1M 세팔로스포린 C의 1 부피 중에 입자들을 재현탁시켰다. 세팔라스포린 C가 0.1M pH 7.0 Kpi 완충액으로부터 완전히 제거될 때까지 최종 헹굼을 수행하였다.
2.3. 우유 중에서의 6가지(항생제, 페니실린 G, 암피실린, 아목시실린, 클록사실린, 세파피린, 및 세르티오푸르)의 측정
2.3.1. 사용된 용액
- 용액 1: 100mM pH 8 트리스, 1㎎/㎖ BSA, 50mM EDTA, 50㎛DTT 중의 동결건조 융합 단백질 700피코몰을 밀리-Q 물 (Milli-Q water) 5㎖로 재수화시키고, 측정을 위해 이 용액 50㎕를 취하였다.
- 용액 2: 100% 이소프로판올 중의 실시예 1.2에서 제조된 바이오마그-세팔로스포린 C 2㎖; 측정을 위해 이 용액 20㎕를 취하였다.
- 용액 3: 밀리-Q 물 500㎖로 재수화되며 1M NaCl 동결건조된 10mM, pH 6 카코딜레이트 완충액.
- 용액 4: DMF 중의 10mM 니트로세핀 400㎖를 용액 3의 40㎖로 희석하고; 검출을 위해 이 용액 400㎕를 취하였다.
2.3.2. 검출 방법:
용액 1의 50㎕를 도핑된 우유 샘플 500㎖의 존재하에 위치시켜 47℃에서 2분 동안 인큐베이팅시켰다. 용액 2의 20㎕를 우유에 현탁시키고, 47℃에서 2분 동안 재인큐베이팅시켰다. 입자들을 상자기성 자석을 이용하여 용기 벽으로 당긴 반면, 튜브에서 상청액을 제거하였다. 입자들을 용액 3으로 두번 헹구고, 자석으로 동일한 방법을 실행하였다. 마지막으로, 용액 4의 400㎕를 47℃에서 3분 동안 입자의 존재하에 인큐베이팅시켰다. 이후, 니트로세핀 용액에 대한 482㎚에서 잔여 용액의 흡수를 측정하였다.
이 방법은 미국규정에서 정부에 의해 부여된 기준 미만의 농도에서 6가지 항생제, 즉 5ppb에서 페니실린, 10ppb에서 아목시실린, 10ppb에서 클록사실린, 20ppb에서 세파피린, 및 50ppb에서 세프티오푸르를 검출할 수 있었다.
실시예 3 : 우유 중에서의 3가지 항생제(페니실린 G, 클록사실린, 세프티오푸르)의 측정
본 실시예는 우유 중에서 보건부에 의해 통제되는 μ-락탐 고리를 함유하는 3가지 항생제의 검출을 예시한 것이다. 본 실시예에서 기술되는 시험은 각각 B1aR-CTD 수용체를 알칼리 포스파타제와 퍼옥시다제를 이용하여 두개의 융합 단백질 형태로 이용하였으며, 마이크로플레이트 형태의 지지체를 사용하였다.
3.1. B1aR-CTD 알칼리 포스파타제 융합 단백질
B1aR-CTD 알칼리 포스파타제 융합 단백질을 B1aR-CTD 수용체[B. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990)]와, 기준 1464752 하에 베링거-만하임 바이오케미카에서 시판하는 활성된 알칼리 포스파타제의 화학 결합에 의해 얻었다.
결합은 하기 방법으로 수행되었다:
3.1.1. 접합(Conjuction): B1aR-CTD 및 알칼리 포스파타제를 pH 9.8의 100mM 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액 중에서 투석하였다. B1aR-CTD 15 나노몰을 25℃에서 2시간 동안 활성된 알칼리 포스파타제(20㎎/㎖) 100㎕의 존재하에 인큐베이팅시켰다.
3.1.2. 반응 중단: 2mM, pH 8 트리에탄올아민 용액 40㎕를 첨가하고 200mM 나트륨 보로히드라이드 용액 50㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 +4℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 2mM, pH 8 트리에탄올아민 용액 25㎕를 첨가한 후, 혼합물을 +4℃에서 2시간 동안 재인큐베이팅시켰다.
3.1.3. 결합의 안정화: 1M, pH 7.0 글리신 용액 10㎕를 첨가하였다.
3.1.4. 저장 완충액으로의 운반: 반응혼합물(약 300㎕)을 50mM, pH 7.6 트리에탄올아민 완충액, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5mM ZnCl2, 10mM 글리신의 0.5리터에 대해 +4℃에서 3회 8시간 동안 투석하였다.
3.1.5. 최종 적정량: 결합의 최종 적정량은 용액 ㎕당 활성 B1aR-CTD 약 50피코몰이었다.
3.2. B1aR-CTD-퍼옥시다제 융합 단백질
B1aR-CTD-퍼옥시다제 융합 단백질을 B1aR-CTD 수용체[B. Joris et al., FEMS Microbiology Letters, 107-114,(1990)]와 기준 1428861하에 베링거-만하임에서 시판하는 활성된 퍼옥시다제의 화학 결합에 의해 얻었다.
결합은 하기 방법으로 수행되었다:
결합은 하기 방법으로 수행되었다:
삭제
3.2.1. 접합: B1aR-CTD와 퍼옥시다제를 100mM, pH 9.8 탄산나트륨/중탄산나트륨 완충액에서 투석하였다. B1aR-CTD의 40나노몰을 활성된 퍼옥시다제 100㎕(16㎎/㎖)의 존재하에 25℃에서 2시간 동안 인큐베이팅시켰다.
3.2.2. 반응 중단: 2mM, pH 8 트리탄올아민 용액 40㎕를 첨가하고 200mM 나트륨 보로히드라이드 용액 50㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 +4℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 2mM, pH 8 트리에탄올아민 용액 25㎕를 첨가시킨 후, 혼합물을 +4℃에서 2시간 동안 재인큐베이팅시켰다.
3.2.3. 결합의 안정화: 1M, pH 7.0 글리신 용액 10㎕를 첨가하였다.
3.2.4. 저장 완충액으로의 운반: 반응혼합물(약 400㎕)을 10mM, pH 7.5 인산칼륨 완충액, 200mM NaCl, 10mM 글리신의 0.5리터에 대해 +4℃에서 3회 8시간 동안 투석하였다.
3.2.5. 최종 적정량: 결합의 최종 적정량은 용액 ㎕당 활성 B1aR-CTD 약 100피코몰이었다.
3.3. 고체 지지체: 마이크로플레이트-세팔로스포린 C
3.3.1. 기준 항생제 용액의 제조
탄산나트륨 완충액(100mM, pH 9)중에 인간 감마-글로불린 (G4386, Sigma) 213㎎과 2-이미노티올란 히드로클로라이드(Aldrich, 33056-6) 8.6㎎을 함유하는 용액 8㎖을 25℃에서 한시간 동안 인큐베이팅시켰다.
별도로, 탄산나트륨 완충액(100mM, pH 9)중에 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sSMCC, 22322 Pierce) 54㎎과 세팔로스포린-C 119.8㎎을 함유하는 용액 20㎖를 25℃에서 한시간 동안 인큐베이팅시켰다.
상기 제조된 두 용액을 함께 혼합하였다. 생성된 용액에 500mM NaH2PO4 3㎖를 첨가시켜 용액의 pH를 7.1로 조정하고, 혼합물을 25℃에서 두시간 동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 후에 얻어진 혼합물을 인산나트륨 완충액(10mM, pH 7.5) 1리터에 대해 3회 투석하였다. 생성된 용액을 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과하였다.
3.3.2. 기준 항생제를 이용한 마이크로플레이트의 코팅
상품명 눈크(NUNK)(Immuno Plate: Maxisorp type) 또는 상품명 (GREINER)(microlon 600, reference 705071)인 단백질을 다량 흡착하는 폴리스티렌 마이크로플레이트를 사용하였다. 마이크로플레이트 쿠벳(cutette)을 150mM, pH 7.2 PBS 완충액을 사용하여 세척하였다. 다음 실시예 3.3.1에서 제조된 용액의 일부분을 쿠벳에서 4℃, 24시간 동안 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅 후에, 쿠벳을 150mM pH 7.2 PBS 완충액, 0.1% 트윈(Tween)-20을 사용하여 3회 세척하였다. 이후, 튜브를 20℃에서 2시간 동안 150mM, pH 7.2 PBS 포화 완충액, 5% BSA로 포화시켰다. 세척용 완충액으로 3회 세척한 후, 튜브를 건조시키고 습기로부터 멀리하여 4℃에서 저장하였다.
B1aR-CTD-알칼리 포스파타제 인지제를 위해 고안된 쿠벳에 대해, 사용된 세척용 완충액은 1M, pH 9.8 디에탄올아민, 0.5mM MgCl2이다. 즉, B1aR-CTD-퍼옥시다제 인지제를 위해 고안된 쿠벳에 대해, 사용된 세척용 완충액은 50mM, pH 5 인산칼륨이었다.
3.4. 우유 중에서의 3가지 항생제 측정
표지된 인지제 1.4피코몰을 도핑된 우유 100㎕의 존재하에서 47℃에서 5분 동안 인큐베이팅시켰다. 피펫을 이용하여 우유를 실시예 2.3에서 나타낸 것과 같이 전처리된 쿠벳으로 운반하였다. 이후, 우유를 47℃에서 2분 동안 인큐베이팅시켰다. 우유를 제거하여 세척용 완충액으로 두번 세척시킨 후(실시예 2.3.2와 비교), 드러나는 기질을 함유하는 완충액 300㎕를 쿠벳에서 2분 동안 인큐베이팅시켰다(B1aR-CTD-퍼옥시다제 인지제를 위해 드러나는 기질: 50mM, pH 5 인산칼륨, 9.1mM ABTS, 0.002% H2O2; B1aR-CTD-알칼리 포스파타제 인지제를 위해 드러나는 기질: 1M, pH 9.8 디에탄올아민, 0.5mM MgCl2, 10mM 4-NPP). 이후, 이 플레이트를 엘리사(ELISA) 플레이트용 자동 분광 광도계에 배치시켰으며, 파장은 405㎚로 설정하였다.
이 시험으로 미국 정부가 요구하는 통제 한계치에서 3가지 항생제, 페니실린 G, 클록사실린, 및 세프티오푸르를 검출할 수 있었다(5ppb에서 페니실린 G, 10ppb에서 클록사실린, 및 50ppb에서 세프티오푸르).
실시예 4 : 우유 중에서 6가지 항생제(페니실린 G, 암피실린, 아목시실린, 클록사실린, 세파피린 및 세프티오푸르)의 측정
본 실시예는 우유 중에서 미국 정부가 현재 요구하는 기준 이하로 통제되는 β-락탐 고리를 함유하는 6가지 항생제의 검출을 예시한 것이다. 본 실시예에서 설명되는 시험은 B1aR-CTD 수용체를 알칼리 포스파타제 또는 퍼옥시다제를 사용하여 융합 단백질 형태로 이용하였으며, 코팅된 튜브 형태의 지지체를 사용하였다.
4.1. B1aR-CTD-알칼리 포스파타제 융합 단백질
실시예 3.1 참조.
4.2. 고체 지지체: 기준 항생제로 코팅된 튜브
본 실시예에서, 상품명 눈크(NUNK)(Immuno Plate: Maxisorp type)이며 실시예 3.3.2에서 나타낸 바와 같이 기준 항생제 용액으로 처리된, 단백질을 다량 흡착하는 폴리스티렌 튜브를 사용하였다.
4.3. 우유 중에서의 6가지 항생제의 측정
인지제 7피코몰을 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 47℃에서 5분 동안 우유 500㎕의 존재하에 인큐베이팅시켰다. 이후, 우유를 피펫을 이용하여 실시예 3.2에서 기술된 바와 같이 처리된 튜브로 운반하였다. 우유를 47℃에서 2분 동안 인큐베이팅시켰다. 우유를 제거한 후, 튜브를 1M, pH 9.8 디에탄올아민 완충액, 0.5mM MgCl2의 1㎖로 두번 세척하였다. 1M, pH 9.8 디에탄올아민, 0.5mM MgCl2, 10mM 4-NPP 드러나는 기질의 500㎕를 첨가시킨 후, 기질을 47℃에서 2분 동안 인큐베이팅시켰다. 이후, 상청액의 흡수도를 파장이 405㎚로 설정된 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
이 방법은 6가지 항생제를 미국 정부가 요구하는 기준 미만까지 측정할 수 있다: 5ppb 미만의 페니실린 G; 10ppb 미만의 암피실린; 10ppb 미만의 아목시실린; 10ppb 미만의 클록사실린; 20ppb 미만의 세파피린; 50ppb 미만의 세프티오푸르.
Claims (13)
- 생물학적 유체 중에서 β-락탐 고리를 함유하는 항생제를 검출하는 방법으로서,a) 정해진 부피의 생물학적 유체를 소정량의 인지제와 접촉시키고, 생물학적 유체 중에 존재할 수 있는 항생제를 인지제와 복합체 형성시키는 조건하에서 상기에서 얻어진 혼합물을 인큐베이팅시키는 단계,b) 기준 항생제를 단계 a)에서 반응하지 않은 인지제와 복합체 형성시키는 조건하에서 단계 a)에서 얻어진 혼합물을 지지체 상에 고정된 하나 이상의 기준 항생제와 접촉시키는 단계, 및c) 지지체에 결합된 인지제의 양을 측정하는 단계를 포함하며,상기 인지제가 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에서 얻어진 B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체를 포함하는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 금속성 콜로이드 입자, 셀렌, 탄소, 황 또는 텔루륨의 콜로이드 입자, 및 착색된 합성 라텍스의 콜로이드 입자로부터 선택된 표지제와 결합되는 방법.
- 제 1항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 형광 물질로부터 선택된 표지제와 결합되는 방법.
- 제 1항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 알칼리 포스파타제, 퍼옥시다제 및 β-락타마제와 같은 효소로부터 선택된 표지제와 결합되는 방법.
- 제 5항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 효소 표지제와 화학적으로 결합되거나 유전적으로 재조합되어 결합되는 방법.
- 제 3항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 단계 a) 전에 표지제에 결합되는 방법.
- 제 3항에 있어서, B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체가 단계 a) 동안 또는 단계 a) 후에 표지제에 결합되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 a) 및 b)가 동시에 일어나는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 사용된 지지체가 기준 항생제로 코팅된 튜브, 플레이트 또는 막대로부터 선택되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 사용된 지지체가 제 1 및 제 2 단부를 가지며, 제 1 단부에서 시작하여 연속적으로-분석되는 유체를 정제하기 위한 멤브레인(2),-그 위에 하나 또는 여러 개의 포획 물질이 고정되는 멤브레인(3), 및-흡수 멤브레인(4)이 부착되는 고체 지지체(1)를 포함하는 시험 기구인 방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 사용된 지지체가 자기 또는 비자기 비드 세트로 구성되는 방법.
- 제 1항에 따른 방법에 의해 생물학적 유체 중의 항생제를 검출하는 시험 키트로서, 바실루스 리케니포르미스에서 얻어진 B1aR(β-락타마아제 R) 수용체 또는 B1aR-CTD(β-락타마아제 R-카복시 단말 도메인) 수용체인 하나 이상의 인지제 및 지지체에 고정된 하나 이상의 기준 항생제를 포함하는 시험 키트.
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