JP2000037199A - 病原微生物及び微量成分の高感度測定法 - Google Patents
病原微生物及び微量成分の高感度測定法Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】
【課題】食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生物試
料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモン、ウイルス
等）及び微生物の菌体を高感度に測定する方法を提供す
る。 【解決手段】酵素と阻害剤との特異的吸脱着を利用し
て、菌数及び微量成分を酵素もしくは阻害剤定性反応に
置換させる測定方法
料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモン、ウイルス
等）及び微生物の菌体を高感度に測定する方法を提供す
る。 【解決手段】酵素と阻害剤との特異的吸脱着を利用し
て、菌数及び微量成分を酵素もしくは阻害剤定性反応に
置換させる測定方法
Description
【０００１】
【発明に属する技術分野】本発明は、食品、飲料水、下
水、稙物、動物や人の生物試料中に含まれる微量成分
（蛋白、ホルモン、ウイルス等）及び微生物の菌体を高
感度に測定するために、酵素と阻害剤との間の特異的吸
脱着を利用して測定する方法に関する。
水、稙物、動物や人の生物試料中に含まれる微量成分
（蛋白、ホルモン、ウイルス等）及び微生物の菌体を高
感度に測定するために、酵素と阻害剤との間の特異的吸
脱着を利用して測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来は、食品、飲料水、下水、植物、動
物や人の生物試料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモ
ン、ウイルス、遺伝子等）及び微生物の菌体を測定する
場合、酵素、蛍光物質、放射性同位元素を標識した抗体
と未標識抗体を菌体に加えて反応させて、サンドイッチ
法で測定する方法が広く使われている。この場合、試料
中の菌量が微量のことが多かった。抗原抗体反応させる
前にあらかじめ増菌培養する必要があった。最近、病原
性大腸菌Ｏ１５７の感染が全国的に発生するようになっ
てから、未然に食材中の汚染をチェックしたり、その感
染経路を調べるために迅速でしかも高感度に測定できる
方法の開発が強く求められてきた。特に病原性大腸菌Ｏ
１５７の感染濃度は数１０個と考えられており、食材に
数１０個の菌数でも摂取すると腸管内で急速に増殖し、
ベロ毒素が産成され、腎障害等の重篤な症状を引き起
し、最悪の場合には死に至らしめることがある。微生物
以外の食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生物試料
中に含まれる食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生
物試料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモン、ウイル
ス、遺伝子等）の測定は、生物発光や化学発光、最近で
は電気化学発光法等が開発せれてサンドイッチ法による
免疫学的測定の感度が急速に良くなってきたが、もはや
これ以上の感度を上げられない限界にまできている。
物や人の生物試料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモ
ン、ウイルス、遺伝子等）及び微生物の菌体を測定する
場合、酵素、蛍光物質、放射性同位元素を標識した抗体
と未標識抗体を菌体に加えて反応させて、サンドイッチ
法で測定する方法が広く使われている。この場合、試料
中の菌量が微量のことが多かった。抗原抗体反応させる
前にあらかじめ増菌培養する必要があった。最近、病原
性大腸菌Ｏ１５７の感染が全国的に発生するようになっ
てから、未然に食材中の汚染をチェックしたり、その感
染経路を調べるために迅速でしかも高感度に測定できる
方法の開発が強く求められてきた。特に病原性大腸菌Ｏ
１５７の感染濃度は数１０個と考えられており、食材に
数１０個の菌数でも摂取すると腸管内で急速に増殖し、
ベロ毒素が産成され、腎障害等の重篤な症状を引き起
し、最悪の場合には死に至らしめることがある。微生物
以外の食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生物試料
中に含まれる食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生
物試料中に含まれる微量成分（蛋白、ホルモン、ウイル
ス、遺伝子等）の測定は、生物発光や化学発光、最近で
は電気化学発光法等が開発せれてサンドイッチ法による
免疫学的測定の感度が急速に良くなってきたが、もはや
これ以上の感度を上げられない限界にまできている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】未標識抗体と酵素、蛍
光物質、放射性同位元素等を標識した抗体を菌体または
微量成分に反応させる免疫学的測定法が用いられるよう
になってから、菌体及び微量成分（蛋白、ホルモン、ウ
イルス、遺伝子等）を高感度に測定できるようになり、
より高感度と迅速化を目指して絶え間ない努力が各方面
でなされいる。ところが、標識した抗体を試薬に加えて
反応させた場合、標識物が菌体のみならず試料中の不溶
性物質に非特異的に吸着し、ブランク反応として発生し
正しく菌量を測定することができず、測定対象の菌量が
微量であればあるほど、特異性に欠け、検出感度に限界
があった。同様に、微生物以外の微量成分（蛋白、ホル
モン、ウイルス、遺伝子等）を測定する場合にも、抗体
または抗原を結合させた磁性体粒子、プレート、ガラス
ビーズ等の固相表面に抗体または抗原の標識物が非特異
的に吸着するため、ある程度以上になると感度に限界が
あった。
光物質、放射性同位元素等を標識した抗体を菌体または
微量成分に反応させる免疫学的測定法が用いられるよう
になってから、菌体及び微量成分（蛋白、ホルモン、ウ
イルス、遺伝子等）を高感度に測定できるようになり、
より高感度と迅速化を目指して絶え間ない努力が各方面
でなされいる。ところが、標識した抗体を試薬に加えて
反応させた場合、標識物が菌体のみならず試料中の不溶
性物質に非特異的に吸着し、ブランク反応として発生し
正しく菌量を測定することができず、測定対象の菌量が
微量であればあるほど、特異性に欠け、検出感度に限界
があった。同様に、微生物以外の微量成分（蛋白、ホル
モン、ウイルス、遺伝子等）を測定する場合にも、抗体
または抗原を結合させた磁性体粒子、プレート、ガラス
ビーズ等の固相表面に抗体または抗原の標識物が非特異
的に吸着するため、ある程度以上になると感度に限界が
あった。
【０００４】病原性大腸菌Ｏ１５７の迅速、簡易測定法
が多数報告されているが、いずれも感度が余り良くな
く、少なくとも１回の増菌培養が必要であり、増菌には
時間、設備及び技術を要するという問題がある。本発明
者らは、増菌培養を必要とせず、比較的簡易な操作で菌
体の存在を確認できる方法を開発した。
が多数報告されているが、いずれも感度が余り良くな
く、少なくとも１回の増菌培養が必要であり、増菌には
時間、設備及び技術を要するという問題がある。本発明
者らは、増菌培養を必要とせず、比較的簡易な操作で菌
体の存在を確認できる方法を開発した。
【０００５】本発明は、微量の菌数や微量成分（蛋白、
ホルモン、ウイルス、遺伝子等）をより高感度に測定す
るために、酵素と阻害剤による特異的吸着と特異的脱着
を利用して、菌数を酵素または阻害剤の定性反応に置換
させる方法を考案することにより実現したものである。
ホルモン、ウイルス、遺伝子等）をより高感度に測定す
るために、酵素と阻害剤による特異的吸着と特異的脱着
を利用して、菌数を酵素または阻害剤の定性反応に置換
させる方法を考案することにより実現したものである。
【０００６】具体的には、抗原抗体反応と酵素β−ガラ
クトシダーゼ、阻害剤Ｐ−アミノフェニル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＰＡＰＴＧ）を組み合
わせて高感度を実現した。阻害剤ＰＡＰＴＧはβ−ガラ
クトシダーゼに特異的な阻害剤であり、この酵素の特異
的基質であるＯ−ニトロペニル−β−ガラクトピラノサ
イド（ＯＮＰＧ）の存在下ではβ−ガラクトシダーゼと
の結合に対して基質と阻害剤との間で競合阻害を起こ
す。従って、ＰＡＰＴＧを標識したＯ１５７抗体にβ−
ガラクトシダーゼを結合させ、洗浄後、特異的基質であ
るＯＮＰＧを加えることで、特異的にβ−ガラクトシダ
ーゼを遊出させる。このように、β−ガラクトシダーゼ
と阻害剤の特異的吸着と特異的脱着を起こすことができ
るため、菌体量とβ−ガラクトシダーゼもしくはＰＡＰ
ＴＧ量に置換することができた。
クトシダーゼ、阻害剤Ｐ−アミノフェニル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＰＡＰＴＧ）を組み合
わせて高感度を実現した。阻害剤ＰＡＰＴＧはβ−ガラ
クトシダーゼに特異的な阻害剤であり、この酵素の特異
的基質であるＯ−ニトロペニル−β−ガラクトピラノサ
イド（ＯＮＰＧ）の存在下ではβ−ガラクトシダーゼと
の結合に対して基質と阻害剤との間で競合阻害を起こ
す。従って、ＰＡＰＴＧを標識したＯ１５７抗体にβ−
ガラクトシダーゼを結合させ、洗浄後、特異的基質であ
るＯＮＰＧを加えることで、特異的にβ−ガラクトシダ
ーゼを遊出させる。このように、β−ガラクトシダーゼ
と阻害剤の特異的吸着と特異的脱着を起こすことができ
るため、菌体量とβ−ガラクトシダーゼもしくはＰＡＰ
ＴＧ量に置換することができた。
【０００７】病原性大腸菌Ｏ１５７に、ＰＡＰＴＧ標識
抗Ｏ１５７抗体を作用させたあと、ビオチン化β−ガラ
クトシダーゼを加えて反応させる。洗浄を行い過剰に存
在するビオチン化β−ガラクトシダーゼや共雑物などを
除去したのち、アビジン化標識またはストレプトアビジ
ン化標識したペルキシダーゼを反応させる。菌体に結合
したＰＡＰＴＧ標識抗Ｏ１５７抗体からビオチン化β−
ガラクトシダーゼ・アビジン化（またはストレプトアビ
ジン化）ペルオキシダーゼの複合物を解離せるために、
基質ガラクトースを加える。菌体から遊離した「ビオチ
ン化β−ガラクトシダーゼ・アビジン化（またはストレ
プトアビジン化）ペルオキシダーゼ」の複合物を、さら
に抗β−ガラクトシダーゼ抗体結合担体にトラップした
あと、ペルオキシダーゼ反応をさせて発色反応に導くも
のである。
抗Ｏ１５７抗体を作用させたあと、ビオチン化β−ガラ
クトシダーゼを加えて反応させる。洗浄を行い過剰に存
在するビオチン化β−ガラクトシダーゼや共雑物などを
除去したのち、アビジン化標識またはストレプトアビジ
ン化標識したペルキシダーゼを反応させる。菌体に結合
したＰＡＰＴＧ標識抗Ｏ１５７抗体からビオチン化β−
ガラクトシダーゼ・アビジン化（またはストレプトアビ
ジン化）ペルオキシダーゼの複合物を解離せるために、
基質ガラクトースを加える。菌体から遊離した「ビオチ
ン化β−ガラクトシダーゼ・アビジン化（またはストレ
プトアビジン化）ペルオキシダーゼ」の複合物を、さら
に抗β−ガラクトシダーゼ抗体結合担体にトラップした
あと、ペルオキシダーゼ反応をさせて発色反応に導くも
のである。
【０００８】このように菌体表面における非特異的に結
合したビオチン化β−ガラクトシダーゼやアビジン化
（またはストレプトアビジン化）ペルオキシダーゼの干
渉を防ぐために、菌体表面の阻害剤ＰＡＰＴＧを介して
結合した「ビオチン化β−ガラクトシダーゼ・アビジン
化（またはストレプトアビジン化）ペルオキシダーゼ」
を菌体から切り離して、菌体の存在しない反応の場でペ
ルオキシダーゼ発色させれば、非特異吸着によるブラン
ク反応がなく菌体を鋭敏に検出することが可能になる。
ここで本発明の核心となる部分は、阻害剤と酵素との親
和力を利用して菌数を酵素もしくは阻害剤定性反応に置
換させる点にある。したがって、本発明の阻害剤と酵素
は、ＰＡＰＴＧとβ−ガラタトシダーゼに限らず、基質
と阻害剤が互いに競合するものであれぱ、その限りでは
ない。
合したビオチン化β−ガラクトシダーゼやアビジン化
（またはストレプトアビジン化）ペルオキシダーゼの干
渉を防ぐために、菌体表面の阻害剤ＰＡＰＴＧを介して
結合した「ビオチン化β−ガラクトシダーゼ・アビジン
化（またはストレプトアビジン化）ペルオキシダーゼ」
を菌体から切り離して、菌体の存在しない反応の場でペ
ルオキシダーゼ発色させれば、非特異吸着によるブラン
ク反応がなく菌体を鋭敏に検出することが可能になる。
ここで本発明の核心となる部分は、阻害剤と酵素との親
和力を利用して菌数を酵素もしくは阻害剤定性反応に置
換させる点にある。したがって、本発明の阻害剤と酵素
は、ＰＡＰＴＧとβ−ガラタトシダーゼに限らず、基質
と阻害剤が互いに競合するものであれぱ、その限りでは
ない。
【０００９】これまで記述したように、病原性微生物や
微量成分の測定において、高感度に測定しようとした場
合、検出物質以外の菌体や固相表面への特異的な吸着が
感度低下の最大の原因となる。本実施例にように食材中
の大腸菌Ｏ１５７の測定では、菌体への検出物質以外の
非特異的物質が最大の問題となる。これを排除する目的
で非常に特異的に吸着する関係の２種類の物質を用いて
吸着させ、非常にマイルドな条件で特異的に脱離させる
ことで、非特異反応の低減を計った。このような目的に
達成できる関係は、酵素と阻害剤、レクチンと糖鎖化合
物、ブルデキストランと脱水素酵素類等の組み合わせが
ある。その他アフイニテイクロマトグラフにて精製でき
る可能性のある物質が本発明に適用できる。
微量成分の測定において、高感度に測定しようとした場
合、検出物質以外の菌体や固相表面への特異的な吸着が
感度低下の最大の原因となる。本実施例にように食材中
の大腸菌Ｏ１５７の測定では、菌体への検出物質以外の
非特異的物質が最大の問題となる。これを排除する目的
で非常に特異的に吸着する関係の２種類の物質を用いて
吸着させ、非常にマイルドな条件で特異的に脱離させる
ことで、非特異反応の低減を計った。このような目的に
達成できる関係は、酵素と阻害剤、レクチンと糖鎖化合
物、ブルデキストランと脱水素酵素類等の組み合わせが
ある。その他アフイニテイクロマトグラフにて精製でき
る可能性のある物質が本発明に適用できる。
【００１０】
【実施例１】１）ＰＡＰＴＧ標識抗Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１
５７；Ｈ７抗体の調製 ピス（スルホサクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）
を架橋剤に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７；Ｈ７に対
するポリクローナル抗体（フナコシ社製）とＰＡＰＴＧ
を加え反応させる。５０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で３回透析して、ＰＡＰＴＧ標識抗Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｏ１５７；Ｈ７抗体を得る。
５７；Ｈ７抗体の調製 ピス（スルホサクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）
を架橋剤に用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７；Ｈ７に対
するポリクローナル抗体（フナコシ社製）とＰＡＰＴＧ
を加え反応させる。５０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で３回透析して、ＰＡＰＴＧ標識抗Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｏ１５７；Ｈ７抗体を得る。
【００１１】２）抗ガラクトシダーゼ抗体結合磁性粒子
体の調製 磁性粒子体（ダイナービーズＭ４５０）１ｍｌに０．１
ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて磁石で
数回洗浄したあと、上清を捨て、抗ガラクトシダーゼ抗
体１００μｌを加え２４時間転倒混和する。リン酸緩衝
液で磁性体粒子を洗浄し、０．１％ヒト血清アルブミン
を含む０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
を１ｍｌ加え、２４時間転倒混和しブロックする。
体の調製 磁性粒子体（ダイナービーズＭ４５０）１ｍｌに０．１
ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて磁石で
数回洗浄したあと、上清を捨て、抗ガラクトシダーゼ抗
体１００μｌを加え２４時間転倒混和する。リン酸緩衝
液で磁性体粒子を洗浄し、０．１％ヒト血清アルブミン
を含む０．０１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
を１ｍｌ加え、２４時間転倒混和しブロックする。
【００１２】３）操作法 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７；Ｈ７の陽性コントロール（フ
ナコシ社製）を５０％グリセロール溶液１ｍｌにて懸濁
した。次にこれを１×１０２〜７×１０９ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの濃度になるように調製し検体として用いた。この
検体１５０μｌにＰＡＰＴＧ標識抗Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１
５７；Ｈ７抗体を１５０μｌ添加し、ローテーターで転
倒混和しながら３７℃、２時間加温した。この反応液２
００μｌをセファデックスＧ−５０（ベットボリュウ
ム；４ｍｌ）を充填したミニカラムに添加した。１０ｍ
ｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を６ｍｌ流し過
剰な抗体を取り除いた。次にビオチン化β−ガラクトシ
ダーゼをカラム上に添加し室温で１時間反応させた。１
０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を６ｍｌ流
し過剰なビオチン化β−ガラクトシダーゼを取り除いた
後、３４ｍｍｏｌ／ｌＯＮＰＧを１５０μｌ加え２分間
反応させた。その後、このカラムに１０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｒｌｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１４ｍｌを流し
溶出させた。溶出された液（全量１４ｍｌ）に抗ガラク
トシダーゼ抗体を結合させた磁性粒子体を１００μｌを
加え３７℃で２時間振とう加温した。磁石を用いてＢ／
Ｆ分離し洗浄液で５０ｍｍｏｌ／ｌＭＥＳ（２−（Ｎ−
モーフォリン）エタンスルフォニクアシド）緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で洗浄した後、アビジン化ペルオキシダーゼ
１００μｌを加え３７℃で３０分間振とう加温した。同
様に磁石を用いてＢ／Ｆ分離した後洗浄を行った。５０
ｍｍｏｌ／ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ
で再懸濁した。このうち９０μｌをマイクロプレートに
分注し、ペルオキシダーゼ発色試薬（和光純薬製ニトロ
ブルーテトラゾリウム法）を３０μｌ添加した。乾燥を
防ぐためにマイクロプレートをパラフィルムにて覆った
後、３７℃で振とう加温し２時間経過した時点の吸光度
（５７０ｎｍ）を測定した。なお、本測定に用いたビオ
チン化β−ガラクトシダーゼ、抗β−ガラクトシダーゼ
抗体は、コスモバイオ社裂、アビジン化ペルオキシダー
ゼはシグマ社製を用いた。
ナコシ社製）を５０％グリセロール溶液１ｍｌにて懸濁
した。次にこれを１×１０２〜７×１０９ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの濃度になるように調製し検体として用いた。この
検体１５０μｌにＰＡＰＴＧ標識抗Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１
５７；Ｈ７抗体を１５０μｌ添加し、ローテーターで転
倒混和しながら３７℃、２時間加温した。この反応液２
００μｌをセファデックスＧ−５０（ベットボリュウ
ム；４ｍｌ）を充填したミニカラムに添加した。１０ｍ
ｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を６ｍｌ流し過
剰な抗体を取り除いた。次にビオチン化β−ガラクトシ
ダーゼをカラム上に添加し室温で１時間反応させた。１
０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を６ｍｌ流
し過剰なビオチン化β−ガラクトシダーゼを取り除いた
後、３４ｍｍｏｌ／ｌＯＮＰＧを１５０μｌ加え２分間
反応させた。その後、このカラムに１０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｒｌｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１４ｍｌを流し
溶出させた。溶出された液（全量１４ｍｌ）に抗ガラク
トシダーゼ抗体を結合させた磁性粒子体を１００μｌを
加え３７℃で２時間振とう加温した。磁石を用いてＢ／
Ｆ分離し洗浄液で５０ｍｍｏｌ／ｌＭＥＳ（２−（Ｎ−
モーフォリン）エタンスルフォニクアシド）緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で洗浄した後、アビジン化ペルオキシダーゼ
１００μｌを加え３７℃で３０分間振とう加温した。同
様に磁石を用いてＢ／Ｆ分離した後洗浄を行った。５０
ｍｍｏｌ／ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ
で再懸濁した。このうち９０μｌをマイクロプレートに
分注し、ペルオキシダーゼ発色試薬（和光純薬製ニトロ
ブルーテトラゾリウム法）を３０μｌ添加した。乾燥を
防ぐためにマイクロプレートをパラフィルムにて覆った
後、３７℃で振とう加温し２時間経過した時点の吸光度
（５７０ｎｍ）を測定した。なお、本測定に用いたビオ
チン化β−ガラクトシダーゼ、抗β−ガラクトシダーゼ
抗体は、コスモバイオ社裂、アビジン化ペルオキシダー
ゼはシグマ社製を用いた。
【００１３】４）結果 図１のように、菌体数１×１０５個以上で菌数に応じて
直線的に吸光度が上がり、直線的に反応した。
直線的に吸光度が上がり、直線的に反応した。
【実施例２】
【００１４】甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第
１抗体にアルカリ性ホスファターゼを標識する。ＴＳＨ
第２抗体にペルオキシダーゼを標識する。試料５０μｌ
に２種類の標識抗体４０μｌずつ添加し、３７℃にて９
０分間加温した。この反応液にレクチン固定化ガラスビ
ーズ１個を加え、洗浄する。洗浄後のガラスビーズに１
ｇ／ｄｌスクロース溶液１００μｌを加える。添加２分
後スクロース溶液５０μｌを採取し、この溶液中のペル
オキシダーゼ活性を測定するため、ＴＯＯＳと４−アミ
ノアンチピリンを含む溶液５０μｌと、過酸化硼酸２０
μｌを加え、発色させることで５６５ｎｍでＴＳＨ定量
を行った。その結果０．０５ｆｍｏ１／ｍｌまで測定可
能であった。この感度は従来法に比べて数１００倍高感
度化された（図２）。
１抗体にアルカリ性ホスファターゼを標識する。ＴＳＨ
第２抗体にペルオキシダーゼを標識する。試料５０μｌ
に２種類の標識抗体４０μｌずつ添加し、３７℃にて９
０分間加温した。この反応液にレクチン固定化ガラスビ
ーズ１個を加え、洗浄する。洗浄後のガラスビーズに１
ｇ／ｄｌスクロース溶液１００μｌを加える。添加２分
後スクロース溶液５０μｌを採取し、この溶液中のペル
オキシダーゼ活性を測定するため、ＴＯＯＳと４−アミ
ノアンチピリンを含む溶液５０μｌと、過酸化硼酸２０
μｌを加え、発色させることで５６５ｎｍでＴＳＨ定量
を行った。その結果０．０５ｆｍｏ１／ｍｌまで測定可
能であった。この感度は従来法に比べて数１００倍高感
度化された（図２）。
【００１５】
【発明の効果】酵素と阻害剤との特異的吸脱着を利用し
て、食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生物試料中
に含まれる微生物の菌体及び微量成分（蛋白、ホルモ
ン、ウイルス、遺伝子等）を効率良く測定できるように
なった。試薬ブランクは全く生じないため、極めて高感
度に測定できる。食前の食品検査や、飲料水貯蔵槽等の
大量試料中のレジオネラ菌の検出などに有効である。ま
た、血液中のホルモンや微量物質の測定にも有効であ
る。
て、食品、飲料水、下水、植物、動物や人の生物試料中
に含まれる微生物の菌体及び微量成分（蛋白、ホルモ
ン、ウイルス、遺伝子等）を効率良く測定できるように
なった。試薬ブランクは全く生じないため、極めて高感
度に測定できる。食前の食品検査や、飲料水貯蔵槽等の
大量試料中のレジオネラ菌の検出などに有効である。ま
た、血液中のホルモンや微量物質の測定にも有効であ
る。
【図１】は０１５７の菌数を横軸に、測定された吸光度
を縦軸に取り、検量線を示したものである。
を縦軸に取り、検量線を示したものである。
【図２】は横軸にＴＳＨ濃度、縦軸に吸光度を取り、Ｔ
ＳＨ測定の検量線を示したものである。直線（実線）部
が測定可能範囲、点線部は測定できない領域であること
を示した。
ＳＨ測定の検量線を示したものである。直線（実線）部
が測定可能範囲、点線部は測定できない領域であること
を示した。
Claims (3)
- 【請求項１】２種類物質の特異的吸脱着を利用して、菌
数及び微量成分を測定する方法 - 【請求項２】酵素と阻害剤との特異的吸脱着を利用し
て、菌数及び微量成分を酵素もしくは阻害剤定性反応に
置換させる測定方法 - 【請求項３】酵素と阻害剤との特異的吸脱着を利用し
て、抗原抗体反応の免疫学的方法により菌数及び微量成
分を測定する方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10227485A JP2000037199A (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | 病原微生物及び微量成分の高感度測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10227485A JP2000037199A (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | 病原微生物及び微量成分の高感度測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000037199A true JP2000037199A (ja) | 2000-02-08 |
Family
ID=16861634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10227485A Pending JP2000037199A (ja) | 1998-07-08 | 1998-07-08 | 病原微生物及び微量成分の高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000037199A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002355097A (ja) * | 2001-06-01 | 2002-12-10 | Kyowa Medex Co Ltd | α−アミラーゼ活性測定用試薬と測定方法 |
| CN112074609A (zh) * | 2018-05-10 | 2020-12-11 | 东洋纺株式会社 | 生物成分测定试剂盒的灵敏度降低抑制方法 |
-
1998
- 1998-07-08 JP JP10227485A patent/JP2000037199A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002355097A (ja) * | 2001-06-01 | 2002-12-10 | Kyowa Medex Co Ltd | α−アミラーゼ活性測定用試薬と測定方法 |
| CN112074609A (zh) * | 2018-05-10 | 2020-12-11 | 东洋纺株式会社 | 生物成分测定试剂盒的灵敏度降低抑制方法 |
| CN112074609B (zh) * | 2018-05-10 | 2024-02-09 | 东洋纺株式会社 | 生物成分测定试剂盒的灵敏度降低抑制方法 |
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