KR20040010589A

KR20040010589A - 면역 분석법

Info

Publication number: KR20040010589A
Application number: KR10-2003-7010647A
Authority: KR
Inventors: 사쿠라이마사키; 타카나시나오키; 오카마사노리; 히라타미노루
Original assignee: 가부시키가이샤 에스알엘
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-04-26
Publication date: 2004-01-31
Also published as: CA2435535A1; JPWO2002095407A1; US6964872B2; CN1258091C; EP1400808B1; EP1400808A4; EP1400808A1; WO2002095407A1; DE60212840D1; CN1491359A; US20040058387A1; ES2268015T3; JP3863493B2; DK1400808T3; ATE331953T1; DE60212840T2; TWI224674B

Abstract

본 발명은 불용성 자성 담체 입자를 사용하여 면역분석을 행하는 경우, 감작(感作) 불용성 자성 입자의 안정성이나 조제의 곤란함 등의 문제를 해결하여 노동력 절약화나 다량의 검체를 단시간에 처리하는 데 알맞은 방법을 제공하는 것으로서, 피검 시료중의 항원성 물질의 측정에 있어서 그 항원성 물질에 특이적인 항체를 담지시킨 불용성 자성 담체 입자를 이용하는 것이 아니라, 그 항체 등이 실질적으로 흡착되지 않은 상태에 있는 불용성 자성 담체 입자를 준비하여, 측정 시료인 항원성 물질 자체를 불용성 자성 담체 입자에 흡착시켜, 이 흡착된 항원 물질에 특이적인 표지화된 항체를 반응시킴으로써, 자동화에 알맞은 방식으로 피검 시료중의 항원성 물질을 효율적으로 측정할 수 있다.

Description

면역 분석법{IMMUNOASSAY METHOD}

최근, 병원, 검사센터 등에 있어서는, 일손 부족, 비용삭감, 또는 다량 검체 처리의 요청 등으로 인하여, 임상검사 등의 여러 가지 검사의 자동화 및/또는 측정 시간의 단축화가 도모되어 왔다. 이러한 자동화에 알맞은 방법으로서, 불용성 자성 담체 입자를 이용하여 항원성 물질을 정성 내지 정량하는 방법이 주목받기에 이르렀다. 이러한 불용성 자성 담체 입자를 이용하는 목적의 하나는 분석상 피할 수 없는 B/F 분리를 자장 작용을 이용하여 간편하게 행할 수 있도록 하려고 하는 데에 있다.

또한, 이러한 불용성 자성 담체 입자를 이용한 면역 화학 분야에 있어서는, 그 자성 담체에 측정하고자 하는 항원 또는 항체와 동일한 항원 또는 항체를 담지시켜 둔 불용성 자성 입자(감작 불용성 자성 입자)를 사용하는 것이 행해져 왔다. 이 분야에 있어서 공지의 것으로서는, 예컨대 일본 특허 공개 평성 제06-160387호 공보, 일본 특허 공개 평성 제07-72155호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 생체 시료 등의 유체(피검 시료)중에 있어서의 항원성 물질을 측정하는 경우, 그 항원성물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 미리 담지시킨 불용성 자성 입자를 피검 시료와 혼합하여, 불용성 자성 입자에 항원성 물질이 결합하는 정도를 측정함으로써, 상기 항원성 물질을 검출 또는 정량하는 것이다.

그러나, 불용성 자성 입자에 미리 항체 등을 담지해 두고 분석에 사용하는 경우에는, 감작 불용성 자성 입자의 안정성 문제를 피할 수 없고, 어떻게 해도 시약의 사용 기한, 조제의 곤란함 등의 문제가 남는다. 또한, 감작 불용성 자성 입자는 장기간 보존하면 어떻게 해도 그 현탁액에 침전이 생기기 쉽다고 하는 문제도 있다.

노동력 절약화나 다량의 검체를 단시간에 처리하기 위해서 완전히 자동화된 임상검사 등의 검사기기 도입에 있어서는, 분석상, 통상 B/F를 분리시키기 위한 세정 처리가 필요하지만, 이 공정을 조금이라도 생략하거나, 간결하게 행하는 것은 측정의 효율화·신속화를 위해서는 피할 수 없는 명제이다. 또한, 이러한 목적을 위하여, 최근에는, 불용성 자성 입자를 담체로 한 면역분석계의 개발이 시도되고 있지만, 그것에 사용하는 불용성 자성 입자는 세정 공정에 의한 손실을 피할 수 없고, 그것에 담지하는 귀중한 항체 등을 소모시키는 원인을 수반하고 있다. 이와 같이 자성 입자를 이용한 임상검사용 자동기기에 있어서 단점은 비교적 다량의 자성 입자를 사용하고 있기 때문에, 통상의 면역 측정법에 비하여 다량의 항체 등이 필요하다는 점이다. 또한, 세정 횟수가 많음으로 인한 입자의 손실이 문제가 되고 있다.

본 발명은 생체 시료 등의 유체 중에 있어서의 항원성 물질을 자성 입자를 이용하여 면역학적으로 측정하는 방법(면역 분석법)에 관한 것이다.

도 1은 자성 라텍스 입자에 HbA1c를 흡착시키는 공정을 포함하는 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 사용한 HbA1c 측정에 있어서, 불용성 자성 담체 입자의 입자 표면적 및 얻어지는 시그널과의 관계를 도시하는 도면.

도 2는 자성 라텍스 입자에 HbA1c를 흡착시키는 공정을 포함하는 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 사용한 HbA1c 측정에 있어서의 계에 존재하는 항체량과 시그널과의 관계를 도시하는 도면.

도 3은 자성 라텍스 입자에 HbA1c를 흡착시키는 공정을 포함하는 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 사용한 HbA1c 측정에 있어서, 표식으로서 직접 검지 가능한 것을 이용한 경우의 결과를 도시하는 도면.

도 4는 자성 라텍스 입자에 HbA1c를 흡착시키는 공정을 포함하는 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 사용한 HbA1c 측정법과 라텍스 응집법과의 상관성을 도시하는 도면.

도 5는 자성 라텍스 입자에 HbA1c를 흡착시키는 공정을 포함하는 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 사용한 HbA1c 측정법에 있어서, 사용한 불용성 자성 담체 입자의 상이함에 따른 측정에의 영향을 도시하는 도면.

본 발명에서는, 표지화된 항체, 특히 표지화 모노클로날 항체를 액상 중의 항원성 물질과 실질적으로 반응시키지 않고, 불용성 자성 담체에 흡착·고상화된 항원성 물질과 선택적으로 반응시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 상기 면역 분석법에 있어서, 피검 시료중의 항원성 물질을 불용성 담체에 흡착시킨 후, 그 피검 시료를 세정에 의해 제거하지 않고, 상기 항원성 물질에 대한 모노클로날 항체를 반응시키는 것이 가능하다.

즉, 본 발명의 보다 바람직한 구체예에 있어서는, 사용하는 모노클로날 항체로서, 불용성 담체 입자에 흡착된 항원과는 반응하지만, 액상 중의 미흡착의 항원성 물질과는 실질적으로 반응하지 않는 것을 선택함으로써, 미흡착 성분에 의한 방해 작용을 실질적으로 방지할 수 있다.

(항원성 물질)

본 발명의 면역 분석법에 의해 측정되어야 할 항원성 물질은 불용성 자성 담체로의 흡착(내지 결합)이 가능하고, 또한 그 항원성 물질에 대응하는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 적어도 한쪽의 작성 내지 입수가 가능한 한 특별히 제한되지 않지만, 불용성 자성 담체로의 흡착 용이성의 점에서는, 생체 시료 중에 100 ㎍/㎖ 이상(나아가서는 1 ㎎/㎖ 이상) 또는 (총 단백질 중량의) 1% 이상 함유되는 물질인 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리클로날 항체 내지 모노클로날 항체 제조의 용이성의 점에서는, 상기 항원성 물질은 분자량 10,000 이상의 물질(단백질 등)인 것이 바람직하다.

본 발명의 면역 분석법에 의해 측정되어야 할 「항원성 물질」은 이것에 대응하는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 적어도 한쪽의 제조 내지 입수가 가능한 것이면 좋다. 「항원성 물질」은, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 유전자 공학적으로 생성된 재조합 단백질 등 여러 가지의 것을 들 수 있지만, 그 면역분석 분야에서 공지된 것이어도 좋고, 신규의 것이어도 좋다. 대표적인 항원성 물질로서는, HbA1c를 들 수 있다.

(항원성 물질에 특이적인 항체)

본 발명에 있어서, 「항원성 물질에 특이적으로 반응하는 항체」로서는 폴리클로날 항체 및/또는 모노클로날 항체 중 어느 하나를 이용하는 것도 가능하고, 더욱이 F(ab')₂, Fab' 및 Fab라는 항체 단편을 포함하는 천연형(intact) 분자 및 이들의 단편 및 유도체인 것을 이용하는 것도 좋다. 모노클로날 항체를 제조하는 적합한 방법의 예로서는 하이브리도마법(G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497(1975)); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York(1987)를 들 수 있으며, 이외에도, 항체에 관한 이하의 문헌을 들 수 있다: J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121(Immunochemical Techniques, Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York(1986) 또는 여기에 인용된 문헌(이들 중에 있는 기재는 참고문헌으로서 본 명세서의 개시에 포함됨).

적합하게는, 모노클로날 항체는 Koehler & Milstein(Nature, 256, 495-497, 1975) 등이 보고한 세포 융합법에 의해 얻을 수 있다. 이 방법 자체는 통상의 방법으로서 다시 기술할 필요는 없지만, 이 방법에 있어서는, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 효율적으로 선별할 필요가 있다. 대량 검체 처리가 용이하기 때문에, 96웰 플레이트에 소정의 항원을 고상화시켜, 그것에 하이브리도마 세포의 배양 상청을 반응시키고, 추가로 효소 표식 항 마우스 면역 글로블린을 반응시키는 소위 ELISA법(효소면역측정법)에 의한 선별이 행해지는 경우가 많다. 이 때, 항원은 고상화되어 있기 때문에, 항원이 고상화되어 있는 상태에서 항체를 반응시키는 분석계를 조합하는 경우에는, 이 선별법으로 좋지만, ELISA법으로 선별하여 얻은 하이브리도마 세포가 생성하는 모노클로날 항체 중에, 방사면역 분석법(RIA)과 같이, 항원과 항체를 액상 중에서 반응시키는 분석계에서는 반응하지 않는다고 하는 항체가 존재하는 경우를 볼 수 있다.

이러한 현상 자체는 당 분야에 있어서는 공지 내지 주지된 것이지만, 본 발명의 면역 분석법에 있어서 이러한 모노클로날 항체를 이용함으로써 액상 중의 항원성 물질의 저해를 받지 않고서, 불용성 담체 입자에 고상화된 항원성 물질과 특이적으로 반응시키는 것이 가능해진다.

대표적인 모노클로날 항체로서는, 예컨대 일본 특허 제2677753호에 기재된바와 같은 것을 들 수 있다. 특히 대표적인 모노클로날 항체로서는, 예컨대 일본 특허 제2677753호에 기재된 항 HbA1c 모노클로날 항체를 들 수 있다.

항체로서는 통상 IgG가 이용되지만, 펩신, 파파인 등의 소화 효소 또는 디티오스레이톨(dithiothreitol), 머캅토에탄올 등의 환원제를 이용하여 F(ab')₂, Fab', Fab 등의 저분자화한 것을 이용하여도 좋다. 또한, IgG뿐만 아니라 IgM 또는 이것을 IgG와 동일한 처리로 저분자화한 단편을 이용하여도 좋다. 인식 에피토프가 상이한 모노클로날 항체를 2종류 이상 조합하여 사용할 수도 있다.

(항체의 표지화)

본 발명의 항체는 적당한 표식으로 표지화되어 있을 수 있다.

표식으로서는 효소, 효소 기질, 효소 저해제, 보결 분자류, 보효소, 효소 전구체, 아포 효소, 형광 물질, 색소 물질, 화학 발광 화합물, 발광 물질, 발색 물질, 자기 물질, 금속 입자, 예컨대 금 콜로이드 등, 방사성 물질 등을 들 수 있다. 효소로서는, 탈수소 효소, 환원 효소, 산화 효소 등의 산화환원 효소, 예컨대 아미노기, 카르복실기, 메틸기, 아실기, 인산기 등을 전이하는 것을 촉매하는 전이 효소, 예컨대 에스테르 결합, 글리코시드 결합, 에테르 결합, 펩티드 결합 등을 가수분해하는 가수분해 효소, 리아제, 이성질화효소, 리가아제 등을 들 수 있다. 효소는 복수의 효소를 복합적으로 이용하여 검지에 이용할 수도 있다.

예컨대 효소적 사이클링을 이용할 수도 있다. 대표적인 효소 표식으로서는 서양 고추냉이 퍼옥시다제 등의 퍼옥시다제, 대장균 β-D-갈락토시다아제 등의 갈락토시다아제, 말레인산염 탈수소효소, 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코즈옥시다아제, 글루코아밀라아제, 아세틸콜린에스테라아제, 카탈라아제, 소 소장 알칼리 포스파타아제, 대장균 알칼리 포스파타아제 등의 알칼리 포스파타아제 등을 들 수 있다. 알칼리 포스파타아제를 이용한 경우, 4-메틸움베리페릴포스페이트(Methylumbelliferylphosphate)　등의 움베리페론 유도체, 니트로페닐포스페이트 등의 인산화 페놀 유도체, NADP를 이용한 효소적 사이클링계, 루시페린 유도체, 디옥시세탄 유도체 등의 기질을 사용하거나 하여 생기는 형광, 발광 등에 의해 측정할 수 있다. 루시페린, 루시페라아제계를 이용하거나 이용할 수도 있다. 카탈라아제를 이용한 경우, 과산화수소와 반응하여 산소를 생성하기 때문에, 이 산소를 전극 등으로 검지할 수도 있다. 전극으로서는 유리 전극, 난용성 염막을 이용하는 이온 전극, 액막형 전극, 고분자막 전극 등의 것도 가능하다. 효소 표식은 비오틴 표식체와 효소 표식 아비딘(스트렙토아비딘)으로 대체하는 것도 가능하다. 표식은 복수의 상이한 종류의 표식을 사용할 수도 있다. 이러한 경우, 복수의 측정을 연속적으로, 또는 비연속적으로, 그리고 동시에 또는 따로따로 행하는 것을 가능하게 할 수도 있다.

본 발명에 있어서는, 신호의 형성에 4-히드록시페닐아세트산, 1,2-페닐렌디아민, 테트라메틸벤지딘 등과 서양 고추냉이·퍼옥시다제, 움베리페릴갈락토시드, 니트로페닐갈락토시드 등과 β-D-갈락토시다아제, 글루코즈-6-인산 탈수소효소 등의 효소 시약의 조합도 이용할 수 있고, 히드로퀴논, 히드록시벤조퀴논, 히드록시안트라퀴논 등의 퀴놀 화합물, 리포산, 글루타치온 등의 티올 화합물, 페놀 유도체, 페로센 유도체 등을 효소 등의 작용으로 형성할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 형광 물질 또는 화학 발광 화합물로서는, 플루오레세인이소티오시아네이트, 예컨대 로다민 B 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 등의 로다민 유도체, 댄실 클로라이드(dancyl chloride), 댄실 플루오라이드, 플루오레스카민, 예컨대 피코시아닌, 피코에리트린 등의 피코빌리프로테인(phycobiliprotein), 아크리디늄염, 루미페린, 루시페라아제 및 에쿼린 등의 루미놀, 이미다졸, 옥살산에스테르, 예컨대, 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 및 사마륨(Sm) 등의 희토류 킬레이트 화합물, 7-아미노-4-메틸쿠마린 등의 쿠마린 유도체 등을 들 수 있다.

항체와 표식의 결합에는 흡착 등의 물리적인 기법, 또는 축합제 등을 이용하거나, 활성화된 것 등을 이용한 기법 및/또는 사이에 스페이서 분자를 화학 결합으로 도입하는 등의 화학적인 방법, 나아가서는 상호의 화학적인 결합 반응을 이용한 기법 등에 의해 행할 수 있다. 표식하기 위해서는 티올기와 말레이미드기의 반응, 피리딜디술피드기와 티올기의 반응, 아미노기와 알데히드기의 반응 등을 이용하여 행할 수 있고, 공지의 방법 또는 그 분야의 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법, 나아가서는 이들을 변형시킨 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. 축합제로서는, 예컨대 포름알데히드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소티오시아네이트, N,N'-폴리메틸렌비스요오도아세트아미드, N,N'-에틸렌비스말레이미드, 에틸렌글리콜비스숙신이미딜숙시네이트, 비스디아조벤지딘, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, 숙신이미딜3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), N-숙신이미딜4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), N-술포숙신이미딜4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, N-숙신이미딜4-(1-말레이미도페닐)부틸레이트, N-(ε-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(EMCS), 이미노티오란, S-아세틸머캅토숙신산무수물, 메틸-3-(4'-디티오피리딜)프로피온이미데이트, 메틸-4-머캅토부티릴이미데이트, 메틸-3-머캅토프로피온이미데이트, N-숙신이미딜-S-아세틸머캅토아세테이트 등을 들 수 있다.

(불용성 자성 담체 입자)

본 발명에서 사용하는 불용성 자성 담체 입자는, 바람직하게는 수성 액체 매체에 실질적으로 불용성인 미립자인 동시에 유기 고분자 물질상과 자성 물질의 상으로 이루어진 미립자이다. 대표적인 불용성 자성 담체 입자는 유기 고분자 물질로 이루어진 피막상과 자성 물질로 이루어진 코어상으로 이루어진 미립자이다. 상기 불용성 자성 담체 입자로서는, 예컨대, 사삼산화철(Fe₃O₄), 삼이산화철(γ-Fe₂O₃), 각종 페라이트, 철, 망간, 니켈, 코발트, 크롬 등의 금속, 코발트, 니켈, 망간 등의 합금으로 이루어진 미립자 또는 이들 자성 입자를 내부에 포함한 라텍스, 젤라틴, 리포좀 등이 있다. 적합하게는, 자성 물질의 핵을 둘러싸는 라텍스 피막으로 구성되는 라텍스 입자를 들 수 있다. 본래 라텍스란, 고무 나무에 상처를 냈을때에 침출하는 유액이지만, 본 발명에서 말하는 라텍스란, 수성액 중에 있어서 불연속인 미립자가 현탁되어 있는 현탁액 내지 유탁액을 말한다. 본 발명에서 사용하는 불용성 자성 담체 입자는 자성 입자의 핵의 표면을 유기물 등으로 표면 처리한 미립자가 바람직하게 이용되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

이러한 라텍스 입자는 정량적으로 면역분석을 행하는 경우, 통상은 입자 크기의 균일성, 표면 상태의 제어, 내부 구조의 선택 등이 고도의 차원으로 요구되지만, 이러한 시약용의 양호한 라텍스 입자는 시판품 중에서 선택하여 이용하는 것이 가능하다. 상기 입자를 구성하는 데 사용할 수 있는 유기 고분자 물질로서는, 예컨대, 종래 기술(일본 특허 공고 소화 제58-11575호 공보 등)에서 말하는 유기 고분자 물질의 미립자용의 것 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 이 유기 고분자 물질로서는, 예컨대, 폴리스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴, 폴리메타크릴산메틸, 폴리카프라미드, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 소수성 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리(2-옥시에틸아크릴레이트), 폴리(2-옥시에틸메타크릴레이트), 폴리(2,3-디옥시프로필아크릴레이트), 폴리(2,3-디옥시프로필메타크릴레이트), 폴리에틸렌글리콜메타크릴레이트 등의 가교된 친수성 중합체, 또는 각각의 단량체의 2-4종 정도의 공중합체 등을 들 수 있다. 라텍스의 재질은 특별히 제한되지 않지만, 폴리스티렌 라텍스 등의 스티렌계 라텍스, 아크릴산계 라텍스 등이 바람직하게 이용된다. 표면의 소수성이 강한 라텍스(예컨대 폴리스티렌 라텍스)를 이용하는 것은 단백질 내지 펩티드의 흡착을 원활하게 하는 데에 있어서 바람직하다. 나아가서는, 여러 가지 변성 라텍스(예컨대, 카르복실산 변성 라텍스) 등을 필요에 따라 이용하여도 좋다. 본 발명에 있어서는, 상기 불용성 담체로서, 폴리스티렌 라텍스 등의 라텍스가 특히 바람직하게 이용된다. 라텍스 입자로서는, 유화제를 이용하지 않는 유화 중합에 의해 얻어지는 폴리스티렌 입자가 특히 바람직하게 이용된다. 이러한 라텍스는 표면의 부전하 끼리의 반발에 기초하여 유화제 없이도 안정하게 존재할 수 있다. 시판되고 있는 대표적인 불용성 자성 담체 입자로서는, 베리타스(VERITAS)사의 Dynabeads M-270 Epoxy, Dynabeads M-270 Amine, Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynabeads M-270 Tosylactivated, Dynabeads M-450 Epoxy, Dynabeads M-450 Tosylactivated, JSR사의 IMMUTEX-MAG, 후지쿠라카세이 가부시키가이샤의 SMG-11 등 외에, Bangs사 등으로부터 입수 가능한 것이 있다.

불용성 자성 담체 입자의 입자 지름은 0.01 ㎛∼20 ㎛인 것이 이용되고, 0.1 ㎛∼6 ㎛ 범위내의 입자 지름을 갖는 불용성 자성 입자가 바람직하다. 불용성 자성 입자에 항원성 물질을 흡착 또는 결합시키는 방법으로서는, 피검체 중의 항원성 물질을 물리적으로 흡착 또는 결합시키거나 또는 화학적으로 결합시킴으로써 행해진다. 적합하게는, 물리적으로 흡착 또는 결합시킨다.

피검 시료중의 항원성 물질을 라텍스 입자에 흡착시키기 위해서는 라텍스 입자를 현탁시키는 완충액에 대해서는 ELISA 등으로 플레이트에 항원을 고상화시키는 경우와 기본적으로 동일한 기술을 사용할 수 있다. 라텍스 입자에 따라서는, 자연 응집을 일으키기 쉬운 것도 있지만, 이러한 경우에는, 약 알칼리성의 글리신 완충액 또는 붕산 완충액에 현탁시켜 둔 것이 안정성의 점에서 바람직하다.

라텍스 농도에 관해서는 0.05∼1중량 퍼센트의 현탁액으로서 이용하는 것이 바람직하다.

(항원-항체 반응)

본 발명에 있어서는, 피검 시료중의 항원성 물질을 고상화한 후, 그 항원성 물질에 대하여 특이적으로 반응하는 표지화된 항체를 반응시켜, 라텍스 등으로 이루어진 불용성 자성 담체상의 항원성 물질을 표지화한다. 이 때에 이용하는 수성 용액은 그 항체가 라텍스 등으로 이루어지는 불용성 담체에 흡착되는 것을 막기 위해서, Tween 20 등의 계면활성제를 0.1∼0.3% 정도 함유하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 반응을 행하는 용기는 특별히 한정되지 않지만, 통상의 튜브(시험관; 예컨대 폴리스티렌제)형의 용기를 이용하는 것이 가능하다. 다수 검체의 동시 처리가 용이한 점을 고려하면, 복수의 웰(구멍)을 갖는 ELISA용 플레이트(예컨대, 96-웰 ELISA용 플레이트(NUNC-IMMUNO PLATE 등)를 이용하는 것이 가능하다. 후술하는 바와 같이, 광학적 기법에 의한 측정을 용이하게 하는 점에서는, 실질적으로 투명한 용기를 이용하여 반응을 행하는 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 자동 분석기를 이용하는 경우에는, 통상은 그 분석기 안의 반응조 속에서 반응을 시키게 된다.

(측정)

불용성 자성 담체 입자의 표식의 정도를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 표식을 정성적 내지 반정량적으로 측정하는 경우에는, 기지의 시료의 탁도의 정도와 비교하여, 상기 불용성 담체 입자의 표식의 정도를 눈으로 확인함으로써 판정하는 것도 가능하다. 그 표식을 정량적으로 측정하는 경우, 간편성의 점에서는, 예컨대 광학적으로 측정하는 것이 바람직하다.

라텍스 등으로 이루어진 불용성 자성 담체 입자의 표식의 광학적 측정법으로서는, 공지의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서는, 시료 검체의 측정 처리; 검체의 분주 처리로부터 분석 결과를 측정할 때까지를 자동화한 기기, 예컨대 자성 입자를 이용한 임상검사용 자동기기를 사용하여 행할 수 있다. 이러한 임상검사용 자동기기로서는, 예컨대 바이엘사: 애드비어(상품명), 다이나봇사: 아키텍트(상품명), IMX(상품명), 베크만사: 액세스(상품명), 로슈사: 에클시스(상품명), 후지레비오: 루미펄스(상품명) 등을 들 수 있다. 이러한 기기는 면역(항원항체 반응을 이용함) 측정계에서 널리 이용되어 있고, 그러한 것이면 본 발명의 면역 분석법에 제한 없이 사용될 수 있다. 이들 기기의 특징으로서는, 랜덤 액세스 방식으로 다항목의 측정이 가능하고, 측정 감도가 높으며, 광범위하게 측정이 가능하고, 단시간에 측정이 가능하며, 분주로부터 결과 제시까지의 공정이 전부 자동이기 때문에 측정 정밀도가 높고, 전용 카트리지를 사용하고 있기 때문에 오염 등이 적다는 등의 장점이 있다.

그런데, 통상의 시료중의 항원을 측정하는 경우 종래의 임상검사용 자동기기에서는, 항체 감작 자성 입자가 사용되고, (a) 1차 반응으로서 (1) 자성 입자와 시료중의 항원 반응 후에 (2) 세정 ; (b) 2차 반응으로서 (3) 항원에 대한 제2 항체(마커로서 효소, 형광 물질 등의 표식을 사용)와의 반응 후에 (4) 세정 ; (c) 3차 반응으로서 (5) 마커에 대한 기질과의 반응 및 (6) 측정의 순서로 행하여 졌다. 그러나, 본 발명에 따르면, (a) 1차 반응으로서 (1) 자성 입자와 시료중의 항원 반응 ; (b) 2차 반응으로서 (2) 항원에 대한 제2 항체(마커로서 효소, 형광 물질 등의표식을 사용)와의 반응 후에 (3) 세정 ; (c) 3차 반응으로서 (5) 마커에 대한 기질과의 반응 및 (6) 측정이라고 하는 것처럼 세정 횟수를 줄일 수 있어, 입자의 감소가 대폭 개선된다.

또한, 라텍스 입자의 응집을 광학적으로 검출하는 방법에서는, 비교적 많은 입자를 사용하는 것이 조건이 되지만, 본 방법에서는 입자에 결합한 물질의 양을 검출하기 위해서, 입자량 및 마커 표식 항체량도 종래의 방법에 비하여 10배 이상 적은 양으로 측정이 가능해진다.

본 발명에 따르면, 종래법에서 사용하는 항체 복합체에 관한 것으로, 그 제작법에 곤란성이 있거나, 사용 농도에서의 불안정성이 있거나 하는 제조상의 문제점을 회피하는 것이 가능하고, 단일 항체만의 사용에 의해, 물질의 안정성이 개선되어, 제조 로트(manufacturing lot)간 차이도 없으며, 안정한 제조가 가능해진다. 모노클로날 항체만을 사용하여, 그 이점을 살릴 수 있다. 예컨대, 항체 로트(antibody lot)간의 차를 배제할 수 있고, 안정된 품질로 신뢰성이 높은 시약을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 시약인 불용성 담체 입자는 그것에 항원 등을 감작시킨 것이 아니기 때문에, 시약 키트에 있어서 입자의 로트상에 차이가 난다는 문제점을 대폭 개선할 수 있고, 또한 자성체가 코어이고 표면이 플라스틱으로 형성되어 있는 것으로서, 항원성 물질의 흡착 또는 결합 성능이 우수하다.

본 발명에서 사용 가능한 불용성 자성 담체 입자를 사용할 수 있는 측정용 기기로서는, 예컨대 후지레비오, 루미펄스(ALP-AMPPD); 베크만, 액세스(ALP-LumigenPPD); 동, 루미워드(ALP-LumigenPPD); 일본 DPC, 임라이즈(ALP-AMPPD); 바이엘, ACS(아크리디뮴에스테르); 오르토, 비트로스 ECi(HRP-루미놀); 프래시죤, HiMICO; 다이나봇, 아키텍트(아크리디뮴에스테르); 로슈, 피코루미(루테늄 복합체); 도소, AIA-600II(ALP-4MUP) 등을 들 수 있고, 효소를 사용한 화학 발광, 루테늄 복합체를 이용한 전기화학 발광, 아크리디늄 에스테르를 이용한 화학 발광 등을 사용하고 있는 것을 들 수 있다.

(헤모글로빈 A1c 측정예)

본 발명의 면역 분석법의 특징을 잘 나타내는 하나의 실시 형태로서, 이하에 헤모글로빈 A1c(HbA1c)의 측정예에 대해서 기술하지만, 본 발명의 면역 분석법은 헤모글로빈 A1c의 측정에 한정되지 않는다.

여기서 상기 「헤모글로빈 A1c」은 헤모글로빈(Hb)의 β쇄 N 말단의 아미노산 잔기인 발린의 α-아미노기에 글루코즈가 비효소적으로 결합하여, 글리코실화 헤모글로빈으로 된 것으로서, 이 헤모글로빈 A1c의 혈중량은 당뇨병의 비교적 장기간의 혈당 조절 상태를 반영한다. 따라서, 이 HbA1c를 측정하는 것은 혈당 조절 상태를 아는 데에 있어서 임상적으로 매우 의의가 있다{예컨대, 일본 임상, 48, 증간호, 315-322(1990) 참조}.

헤모글로빈은 α쇄 2개, β쇄 2개로 이루어진 헤테로테트라머이지만, 헤모글로빈 A1c는 2개의 β쇄 중 1개의 N 말단의 α아미노기가 글리코실화되어 있는 것이 특징이며, 따라서, 헤모글로빈 A1c에 특징적인 반응 부위는 1지점이다. 바꾸어 말하면, 헤모글로빈 A1c에 특이적인 모노클로날 항체와의 반응성의 면에서는 헤모글로빈 A1c는 1가 항원으로서 기능한다.

본 발명의 면역 분석법에 따르면, 헤모글로빈 A1c의 측정에 관해서는, 예컨대, 피검 시료(예컨대, 전 혈(血)에 정제수를 첨가하여 용혈한 것)를 불용성 자성 담체 입자(라텍스 피복 자성 입자)에 흡착시켜, 표지화 항 헤모글로빈 A1c 모노클로날 항체를 반응시킴으로써, 라텍스막상의 헤모글로빈 A1c를 선택적으로 표지화할 수 있고, 이 선택적으로 표지화된 표식의 정도를 측정함으로써, 헤모글로빈 A1c를 정량할 수 있다. 예컨대, HPLC 등으로 측정한 헤모글로빈 A1c% 값이 기지의 표준 시료를, 본 발명의 면역 분석법에 의해 동시에 정량하여 검량선을 작성함으로써, 이 검량선에 기초하여 미지의 시료인 헤모글로빈 A1c의 분획% 값을 구할 수 있다.

(항 HbA1c 모노클로날 항체)

항 HbA1c 모노클로날 항체로서는, 흡착 내지 고상화된 HbA1c에 대하여 실질적으로 반응하고, 고상화된 HbA0와 실질적으로 반응하지 않는(바람직하게는, 추가로 액상중의 HbA1c 및 HbA0과 실질적으로 반응하지 않음) 항 HbA1c 모노클로날 항체라면, 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 면역원으로서 당화 펩티드를 사용하여 모노클로날 항체를 제작하면, 이러한 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. HbA1c 및 HbA0에 대한 반응성은 예컨대 특허 제2677753호에 기재된 바와 같이 하여 측정하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서는, 항 HbA1c 모노클로날 항체는 HbA1c와 일본 특허 제2677753호에 기재된 면역 플레이트 리더의 스케일로 1.0 이상(나아가서는 2.0 이상)의 반응성을 나타내는 것이 바람직하고, 또한, HbA0과는 0.1 이하(나아가서는0.05 이하)의 반응성을 나타내는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서는, 항 HbA1c 모노클로날 항체는 미변성의 HbA1c나 HbA0, 나아가서는 변성된 HbA0 등과, 액상 중에서는 10 ㎍/㎖(나아가서는 20 ㎍/㎖)라도 반응성을 나타내지 않고, 한편, 변성 HbA1c와는 액상 중에서 1 ㎍/㎖(나아가서는 0.5 ㎍/㎖) 이하라도 반응성을 나타내는 것이 바람직하다.

다음에, 본 발명에 있어서 HbA1c를 측정하는 경우의 바람직한 일 실시 형태에 대해서 기술한다.

본 발명에 있어서는, 각 튜브에 통상 피검 시료로서 용혈액 1∼20 ㎕(나아가서는 2∼5 ㎕) 정도를 채취한다. 실제로 이용하는 용혈액으로서는, 피검 시료(예컨대, 전 혈 50 ㎕에 순수 1 ㎖를 첨가한 것)를 5∼10배 정도로 글리신 완충액 등으로 희석하여 이용할 수도 있다.

계속해서, 각 튜브에 자성 라텍스 입자 현탁액(예컨대 0.12 ㎛ 자성 입자 피복 라텍스, 0.2% 농도)을 100∼300 ㎕(나아가서는 150∼200 ㎕) 정도 첨가하여 37℃에서 1∼30분(나아가서는 3∼10분) 정도 방치하여 라텍스에 시료중의 HbA1c를 흡착시킨다. 이 때 이용하는 자성 라텍스 입자 현탁액은 자성 라텍스 입자 원액을 글리신 완충액 등으로 희석하여 이용하는 것이 바람직하다.

계속해서 라텍스에 흡착시킨 HbA1c에, 적당한 표식으로 표지화된 항 HbA1c 모노클로날 항체{예컨대 마우스 복수(腹水) 유래의 모노클로날 항체}를 함유하는 용액을 100∼300 ㎕(나아가서는 150∼200 ㎕) 정도 첨가하여 37℃에서 2∼30분(나아가서는 3∼10분) 정도 방치(항온처리)하여, HbA1c와 표지화 모노클로날 항체를반응시킨다. 이 때에 이용하는 모노클로날 항체 용액의 농도는 예를 들면 항 HbA1c 모노클로날 항체의 희석 계열을 만들어 최적 농도를 구하는 것이 바람직하다. 희석에 이용하는 완충액은 예를 들면, 0.05∼0.1 M 글리신 완충액(GBS; glycine buffered saline; pH 8.2∼8.5, 0.15 M NaCl을 함유함) 등을 들 수 있다. 이 때 이용하는 완충액에는 계면활성제(Tween 20 등)를 0.1∼0.5%(나아가서는 0.2∼0.3%) 정도 첨가해 두는 것이 모노클로날 항체의 라텍스 표면으로의 물리적 흡착을 막을 수 있다는 점에서 바람직하다.

당 분야에 있어서는, 불용성 자성 담체 입자로서 라텍스 입자를 사용하고 있는 경우, 이 라텍스 시약(항원, 항체 등이 담지된 라텍스)에 대해서, 항상 동등한 품질의 것을 만들어 비특이 응집이나 침전이 생기는 것을 방지하면서, 안정한 상태로 보존하는 것은 용이한 것이 아니다.

이것에 대하여, 본 발명에 따르면, 불용성 자성 담체(라텍스 등)에 항원이나 항체는 실질적으로 감작되어 있지 않기 때문에, 그 불용성 자성 담체로서 시판되고 있는 미감작 자성 라텍스를 그대로 사용하는 것이 가능해진다. 더욱이 항체에 대해서도 반드시 정제품일 필요는 없고, 또한 시약이 단순하기 때문에 보존 안정성을 높게 유지하는 것이 가능해져, 제조업자에게 있어서도 유리한 방법이라고 할 수 있다. 전술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 시약의 제조가 단순, 용이하기 때문에, 보존 안정성이 높은 시약을 이용한 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 면역 분석법을 적용하는 데에 있어서는, 각각의 방법에 있어서의 통상 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 덧붙여 본 발명의 그 대상 물질 또는 그것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 물질과 관련된 측정계를 구축하면 좋다.

이들 일반적인 기술 수단의 상세한 설명에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다[예컨대, 이리에 히로시 지음, 「방사면역분석」, 코단샤, 1974년 발행; 이리에 히로시 지음, 「속 방사면역분석」, 코단샤, 1979년 발행; 이시카와 에이지 등 지음, 「효소면역측정법」, 이가꾸쇼인, 1978년 발행; 이시카와 에이지 등 지음, 「효소면역측정법」(제2판), 이가꾸쇼인, 1982년 발행; 이시카와 에이지 등 지음, 「효소면역측정법」(제3판), 이가꾸쇼인, 1987년 발행; H. V. Vunakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 70(Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York(1980); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 73(Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York(1981); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74(Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York(1981); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84(Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York(1982); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92(Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York(1983); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York(1986); J. J. Langone etal.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 178(Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York(1989); M. Wilchek et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184(Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York(1990); J. J. Langone et al.(ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 203(Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B: Antibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York(1991) 또는 여기에 인용된 문헌(이들 중에 있는 기재는 참조문헌으로서 본 명세서의 개시에 포함됨).

발명의 개시

예의 연구한 결과 본 발명자는, 피검 시료중의 항원성 물질의 측정에 있어서 그 항원성 물질에 특이적인 항체를 담지시킨 불용성 자성 담체 입자를 이용하는 것이 아니라, 항체 등이 실질적으로 흡착되지 않은 상태에 있는 불용성 자성 담체 입자를 준비하여, 측정 시료인 항원성 물질 자체를 불용성 자성 담체 입자에 흡착시켜, 흡착된 항원 물질에 특이적인 표지화된 항체를 반응시킴으로써, 자동화에 알맞은 형태로 효율적으로 피검 시료중의 항원성 물질을 측정할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 면역 분석법은, 보다 상세하게는, 항체 등이 실질적으로 흡착되어 있지 않은 상태에 있는 불용성 자성 담체 입자를 준비하고, 다음에 피검 시료중의 항원성 물질을 불용성 자성 담체 입자에 흡착 또는 결합시키며, 그 흡착된 항원성 물질에 특이적으로 반응하는 표지화된 항체를 반응시켜, 불용성 자성 담체 입자상의 항원성 물질을 선택적으로 측정하는 것을 가능하게 하고 있다.

본 발명에 있어서는, 정량성의 확보를 용이하게 하는 점에서, 생체 시료의 농도 및 불용성 담체 입자 현탁액의 완충액 농도 등은 생체 시료중의 항원성 물질이 그 존재량에 비례하여 불용성 담체 입자에 흡착되도록, 측정 항목의 특성에 따라 조건을 선택하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명은,

[1] 불용성 담체 입자를 사용하는 면역 분석법으로서,

(i) 항원 및/또는 항체가 실질적으로 흡착되지 않은 상태에 있는 불용성 자성 담체 입자를 사용하고,

(ii) 불용성 자성 담체 입자에 대하여, 피검 시료중의 항원성 물질을 흡착 또는 결합시키며,

(iii) 항원성 물질에 특이적으로 반응하는 표지화된 항체인 동시에 불용성 담체 입자에 고상화(固相化)된 항원성 물질에는 특이적으로 반응하지만, 네이티브한 상태로 액상 중에 존재하는 항원성 물질에는 실질적으로 반응하지 않는 항체를 상기 (ii)의 처리에 의해 얻어진 불용성 자성 담체 입자와 반응시키고,

(iv) 항원성 물질과 반응한 표지화된 항체의 표식을 지표로 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 면역 분석법;

[2] 피검 시료중의 항원성 물질을 불용성 자성 담체 입자에 흡착 또는 결합시킨 후, 그 피검 시료를 세정에 의해 제거하지 않고, 항원성 물질에 특이적으로 반응하는 항체를 반응시키는 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재한 면역 분석법;

[3] 그 표지화된 항체를 피검 시료중의 항원성 물질을 흡착 또는 결합시킨 불용성 자성 담체 입자와 반응시킨 후, 자장의 작용 하에 그 불용성 자성 담체 입자와 반응하지 않은 표지화된 항체를 분리하고, 다음에 그 항원성 물질과 반응한 표지화된 항체의 표식을 지표로 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재한 면역 분석법;

[4] 상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[5] 상기 항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[6] 상기 불용성 자성 담체 입자가 수성 액체 매체에 실질적으로 불용성인 미립자인 동시에 유기 고분자 물질상과 자성 물질의 상으로 이루어진 미립자인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[7] 상기 불용성 자성 담체 입자가 유기 고분자 물질로 이루어진 피막상과 자성 물질로 이루어진 코어상으로 이루어진 미립자인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[8] 상기 불용성 자성 담체 입자가 평균 입자 지름 0.01∼20 마이크론 범위의 라텍스 입자인 동시에 자성 물질로 이루어진 핵을 갖는 것임을 특징으로 하는 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[9] 상기 불용성 자성 담체 입자가 평균 입자 지름 0.1∼6 마이크론 범위의 라텍스 입자인 동시에 자성 물질로 이루어진 핵을 갖는 것임을 특징으로 하는 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법;

[10] 그 면역분석이 자성 입자용 임상검사용 자동기기에 있어서, 검체 시료의 분주에서 측정 결과의 취득까지를 자동화하여 행할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법; 및

[11] 피검 시료중의 항원성 물질이 HbA1c인 것을 특징으로 하는 상기 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재한 면역 분석법을 제공한다.

본 발명의 그 밖의 목적, 특징, 우수성 및 본 발명이 보유하는 관점은 이하의 기재로부터 당업자에게 있어서는 명백할 것이다. 그러나, 이하의 기재 및 구체적인 실시예 등의 기재를 포함한 본 건 명세서의 기재는 본 발명의 바람직한 형태를 예시하는 것으로, 설명을 위해서만 예시되어 있는 것임을 이해해주기 바란다. 본 명세서에 개시한 본 발명의 의도 및 범위 내에서, 여러 가지 변화 및/또는 개변(또는 수식)을 이루는 것은, 이하의 기재 및 본 명세서의 그 밖의 부분으로부터의 지식에 의해, 당업자에게는 너무나도 명백할 것이다. 본 명세서에서 인용되어 있는 모든 특허 문헌 및 참고 문헌은 설명의 목적으로 인용되어 있는 것으로, 이들은 본 명세서의 일부로서 그 내용은 여기에 포함시켜 해석되어야 되는 것이다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 단순히 본 발명의 설명을 위해, 그 구체적인 양태의 참고를 위해 제공되어 있는 것이다. 이들 예시는 본 발명의 특정한 구체적인 양태를 설명하기 위한 것이지만, 본원에서 개시하는 발명의 범위를 한정하거나 또는 제한하는 것을 나타내는 것이 아니다. 본 발명에서는, 본 명세서의 사상에 기초한 여러 가지 실시 형태가 가능하다는 것을 이해해야 할 것이다.

모든 실시예는 따로 상세히 기재하는 것 이외에는 표준 기술을 이용하여 실시한 것, 또는 실시할 수 있는 것으로, 이것은 당업자에게 있어서 주지이며 관용적인 것이다.

실시예 1

입자 표면적과 얻어지는 시그널과의 관계

용혈액: 인간에게서 채취한 적혈구 5 ㎕에 정제수 500 ㎕를 가하여 용혈시켜, 피검 시료로 하였다.

비오틴 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체: 비오틴화 시약으로서, NHS-LC-Biotin(PIERCE사 제조, No. 21335)을 이용하여 그 시약에 첨부된 매뉴얼대로 항 HbA1c 모노클로날 항체의 비오틴화를 행하였다. 미반응의 비오틴은 투석을 반복함으로써 제거하였다. 항 HbA1c 모노클로날 항체는 일본 특허 제2677753호 공보에 기재한 것을 사용하였다(이 모노클로날 항체는 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 측정용 시약 「라피디아 오토 HbA1c」(후지 레비오 판매, 주식회사 SRL 제조)으로 사용한 것을 사용할 수도 있음).

불용성 자성 담체 입자로서는, SMG-11(후지쿠라카세이 가부시키가이샤)을 사용하였다. 이 자성 라텍스 입자의 물성은 입자 지름(nm): 990, 밀도: 1.58이었다. 불용성 자성 담체 입자는 물 희석액으로 하여, 2.5%, 0.25% 및 0.025%인 것을 조제하였다. 2.5%의 100 ㎕의 자성 라텍스 입자 물 희석액 중의 그 입자수는 3.12E+09, 표면적(m2)은 9.59E-03이고, 0.25%의 경우 그 입자수는 3.12E+08, 표면적(m2)은 9.59E-04이며, 0.025%의 경우 그 입자수는 3.12E+07, 표면적(m2)은 9.59E-05였다.

100 ㎕의 자성 라텍스 입자 물 희석액에 용혈액 5 ㎕를 첨가하고, 실온에서 5분간 방치하여 항원성 물질을 흡착시켰다. 다음에 비오틴화 항 HbA1c 모노클로날 항체 0.07 ㎎/㎖ 50 ㎕를 첨가한다. 혼합액을 실온에서 5분간 방치한 후, ALP용 완충액(1% BSA, 50 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0.1 mM ZnCl₂, 0.05%Tween20, pH 7.6)으로 1회 세정하였다. 다음에, 아비딘-ALP(*5000; DAKO D-365) 100 ㎕를 첨가한다. 혼합액을 실온에서 5분간 방치한 후, 비오틴-아비딘계를 사용하므로, ALP용 완충액으로 4회 세정하였다. AMPPD(Lumigen PPD, 와코쥰야뀨) 100 ㎕를 첨가한 후, 백색 플레이트에 옮겨, 10분 후의 발광량을 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 용혈액 중의 단백질량은 10 ㎍ 정도로 추정되기 때문에, 자성 입자 농도 2.5%, 표면적 9.6E-03 m2의 경우에는 단백질량이 적고, 이 때문에 반응 중에 응집이 발생하며, 그 내부로 들어가 버린 것은 측정할 수 없게 될 것으로 추정되었다. 그리고, 1 ㎛의 입자를 사용하는 경우에는 9.6E-03 m2 정도가 타당하다고 생각되었다.

실시예 2

항체량과 시그널의 관계

0.025% 자성 라텍스 입자 물 희석액 100 ㎕(불용성 자성 담체 입자로서는, 실시예 1과 동일한 것을 사용)에 용혈액 5 ㎕(실시예 1과 동일하게 조제)를 첨가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 비오틴화 항 HbA1c 모노클로날 항체(실시예 1과 동일하게 조제)를 0.048 ㎎/㎖(50 ㎕, 2.4 ㎍), 0.0048 ㎎/㎖(50 ㎕, 0.24 ㎍) 또는 0.00048 ㎎/㎖(50 ㎕, 0.024 ㎍)를 첨가하였다. 혼합액을 실온에서 5분간 방치한 후, ALP용 완충액(1% BSA, 50 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0.1 mM ZnCl₂, 0.05% Tween20, pH 7.6)으로 1회 세정하였다. 다음에, 실시예 1과 동일한 아비딘-ALP 100 ㎕를 첨가하였다. 혼합액을 실온에서 5분간 방치한 후, 비오틴-아비딘계를 사용하므로, ALP용 완충액으로 4회 세정하였다. 실시예 1과 같은 AMPPD 100 ㎕를 첨가한 후, 백색 플레이트에 옮겨, 10분후에 발광량을 측정하였다.

결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과, 항 HbA1c 모노클로날 항체량은 0.25 ㎍ 정도로 충분하다는 것이 판명되었다.

실시예 3

직접 표식 항체에서의 측정

측정의 간략화, 재현성의 향상을 목적으로 항 HbA1c 모노클로날 항체를 직접 ALP로 표식하였다.

(1) 알칼리 포스파타아제(ALP; 오리엔탈 효모)를 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC; 도타이트)로 표식하였다. 우선, 10 ㎎/㎖의 ALP(100 ㎕)를 0.1 M의 NaHCO₃완충액(400 ㎕)에 첨가하고, 다음에 디메틸포름아미드(DMF, 1 ㎖)에 4 ㎎의 FITC를 용해하여 얻은 FITC 용액 10 ㎕를 첨가하였다(ALP에 대하여 10배량의 FITC). 혼합물을 실온에서 10분간 교반한 후, PD-10(파마시아)을 사용하여 회수하였다. 용출에는 0.1 M의 NaH₂PO₄완충액, pH 7.5를 사용하였다. 1.7 ㎖의 FITC 표식 ALP액을 회수할 수 있었다.

상기에서 얻어진 FITC 표식 ALP(ALP-FITC)를 말레이미드화하였다. 우선, 상기 회수 ALP-FITC를 센트리콘 30(밀리포아)으로 500 ㎕로 농축하였다. 다음에, N-(ε-말레이미드카프로일옥시)숙신이미드(EMCS, 6 ㎎)를 DMF(1 ㎖)에 용해하여 얻은EMCS 용액 10 ㎕를 첨가하였다(ALP-FITC에 대하여 20배량의 EMCS). 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 후, PD-10(파마시아)을 사용하여 회수하였다. 용출시에는 5 mM의 에틸렌디아민4아세트산(EDTA)을 함유하는 0.1 M의 NaH₂PO₄완충액, pH 6.3을 사용하였다. 1.7 ㎖의 말레이미드화 ALP-FITC액을 회수할 수 있었다.

한편, 항 HbA1c 모노클로날 항체(실시예 1에서 사용한 것과 같은 것)를 SH화하였다. 19.1 ㎎/㎖의 항 HbA1c 모노클로날 항체(52.4 ㎕)를 0.1 M의 NaH₂PO₄완충액, pH 7.5(450 ㎕)에 첨가하고, 거기에 S-아세틸머캅토숙신산무수물(AMSA, 6 ㎎)을 DMF(1 ㎖)에 용해하여 얻은 AMSA 용액 10 ㎕를 첨가하였다(항체에 대하여 50배량의 AMSA). 혼합물을 실온에서 30분간 교반한 후, 50 mM의 EDTA를 함유하는 1 M Tris 완충액, pH 7.0(20 ㎕)과 1 M 염산히드록실아민액, pH 7.0(20 ㎕)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분간 교반한 후, PD-10(파마시아)을 사용하여 회수하였다. 용출시에는 5 mM의 EDTA를 함유하는 O.1 M의 NaH₂PO₄완충액, pH 6.3을 사용하였다. 1.7 ㎖의 SH화 항체(SH화 IgG)액을 회수할 수 있었다.

다음에, 상기에서 조제한 말레이미드화 ALP-FITC와 SH화 IgG의 전량을 혼화하였다. 혼합비는 추정으로 ALP:IgG=1.5:1(몰비)이다. 실온에서 2시간 반응시킨 후 센트리콘(밀리포아)으로 500 ㎕로 농축하고, 겔 여과(사용 담체: 수퍼 로즈 12: 파마시아)하여 ALP 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 얻었다.

(2) 실시예 1과 동일한 자성 라텍스 입자 0.025% 100 ㎕에, 실시예 1과 동일한 용혈액 5 ㎕를 첨가하여, 실온에서 5분간 방치한 후, ALP 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 첨가하였다. 항체는 IgG로서 5 ㎍/㎖ 50 ㎕를 첨가하였다. 또한, 항체를 PBS-Tween으로 희석한 것과 BSA가 들어있는 완충액으로 희석한 것을 비교용으로 사용하였다. 혼합액을 실온에서 5분간 방치한 후, PBS-Tween으로 4회 세정하였다. 실시예 1과 동일한 AMPPD 100 ㎕를 첨가한 후, 백색 플레이트에 옮겨, 15분 후 발광량을 측정하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.

항체를 첨가할 때에 단백질이 공존하면, 백그라운드가 감소하는 것이 관찰되었다. 백그라운드가 감소하면 재현성의 향상을 기대할 수 있다. 아비딘-ALP보다도 시그널이 증가한 것이 확인되었다. 도 4에는 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 측정용 시약 「라피디아 오토 HbA1c」(후지레비오 판매, 가부시키가이샤 SRL 제조)의 라텍스 응집법과의 상관성을 조사한 결과를 나타낸다. 양호한 상관성이 있는 것이 확인되었다.

실시예 4

불용성 자성 담체 입자의 상이함에 따른 비교

조작법 및 시약은 실시예 3과 동일한 것을 이용하였다. 실시예 1∼3에서 이용한 후지쿠라카세이 가부시키가이샤에서 제조한 것과 베리타스사에서 제조한 것을 비교하였다. 측정에 사용하는 자성 입자의 총 표면적을 동일한 방식으로 측정하였다. 베리타스사에서 제조한 입자는 입자 지름 2.8 ㎛, 입자 농도 4.0E+09 입자/㎖로 계산상의 면적 2.46E-11, 분석당 표면적을 9.59E-05 m 2/입자(m2로 하는데에는 1 ㎕ 필요)이고, 베리타스사에서 제조한 입자에 관해서는 물로 100배로 희석하여, 이 희석물 100 ㎕를 사용하였다.

각 자성 입자 100 ㎕(표면적으로 9.59E-11 m2)에 용혈액 5 ㎕를 첨가한 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 다음에 혼합물에 ALP 표식 항 HbA1c 모노클로날 항체를 첨가하였다. 항체는 IgG로서 5 ㎍/㎖ 50 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5분간 방치한 후, PBS-Tween으로 4회 세정하고, 실시예 1과 동일한 AMPPD 100 ㎕를 첨가한 후, 백색 플레이트에 옮겨, 15분 후의 발광량을 측정하였다.

결과를 도 5에 나타낸다. 또한, 캐리브레이터는 헤모글로빈 A1c(HbA1c)측정용 시약「라피디아 오토 HbA1c」(후지레비오 판매, 가부시키가이샤 SRL 제조)를 사용하였다.

본 발명의 면역 분석법에 따르면, 번잡한 전처리를 행하는 일없이, 간편하고도 신속하게 피검 시료중의 항원성 물질을 측정할 수 있기 때문에, 동시에 다수 검체를 병렬적으로 처리하는 것도 매우 용이해진다. 뿐만 아니라, 이러한 분석법은 전자동화된 임상검사기기에 적합하게 적용 가능하기 때문에, 측정의 자동화 및 다량 처리가 가능해진다. 더욱이, 본 발명에 따르면 분석법 자체뿐만 아니라, 시약의 제조라는 점에 대해서도 유리한 점이 있다. 즉, 일반적으로, 자성 라텍스 시약(라텍스에 항원, 항체 등이 결합되어 있음)의 제조의 경우에는 동일한 품질의 것을 만드는 것이 반드시 용이하다고는 할 수 없다. 또한, 보존 중에 응집이나 침전이 생기는 것을 막기 위한 노하우도 필요하다. 일반적으로, 라텍스 진단약의 가격 중에서 소재 라텍스의 비용은 낮은데, 시약 가격중 과반은, 생물 재료와 그것을 라텍스 입자에 피복하기 위한 공정에 드는 비용이 차지한다. 이것에 대하여, 본 발명에 따르면, 라텍스 등의 불용성 자성 담체에 항원이나 항체는 실질적으로 감작되어 있지 않고, 시판되고 있는 시약용 불용성 자성 담체(라텍스 등)를 그대로 사용하는 것도 가능하기 때문에, 새로운 「라텍스 시약」을 반드시 제조할 필요는 없다. 덧붙여, 본 발명에 있어서는, 항체에 대해서도, 반드시 정제품일 필요는 없고, 항체의 필요량도 대폭 저감시킬 수 있으며, 측정 시약의 제조가 용이해지고, 보존 안정성의 면에서도 매우 유리하다.

본 발명은 전술한 설명 및 실시예에 특별히 기재한 것 이외에도, 실행할 수 있는 것은 분명하다. 전술한 교시를 감안하여 본 발명의 많은 개변 및 변형이 가능하고, 따라서 이들도 본건 첨부의 청구범위의 범위 내의 것이다.

Claims

불용성 담체 입자를 사용하는 면역 분석법으로서,

(i) 항원 및/또는 항체를 실질적으로 흡착하지 않은 상태에 있는 불용성 자성 담체 입자를 사용하고,

(ii) 상기 불용성 자성 담체 입자에 대하여, 피검 시료중의 항원성 물질을 흡착 또는 결합시키며,

(iii) 상기 항원성 물질에 특이적으로 반응하는 표지화된 항체인 동시에 그 불용성 담체 입자에 고상화(固相化)된 항원성 물질에는 특이적으로 반응하지만, 네이티브한 상태로 액상 중에 존재하는 항원성 물질에는 실질적으로 반응하지 않는 항체를 상기 (ii)의 처리에 의해 얻어진 불용성 자성 담체 입자와 반응시키고,

(iv) 상기 항원성 물질과 반응한 표지화된 항체의 표식을 지표로 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항에 있어서, 피검 시료중의 항원성 물질을 불용성 자성 담체 입자에 흡착 또는 결합시킨 후, 이 피검 시료를 세정에 의해 제거하지 않고 항원성 물질에 특이적으로 반응하는 항체를 반응시키는 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표지화된 항체를 피검 시료중의 항원성 물질을 흡착 또는 결합시킨 불용성 자성 담체 입자와 반응시킨 후, 자장의 작용하에그 불용성 자성 담체 입자와 반응하지 않은 표지화된 항체를 분리하고, 다음에 그 항원성 물질과 반응한 표지화된 항체의 표식을 지표로 측정을 행하는 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 자성 담체 입자가 수성 액체 매체에 실질적으로 불용성인 미립자인 동시에 유기 고분자 물질상과 자성 물질의 상으로 이루어진 미립자인 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 자성 담체 입자가 유기 고분자 물질로 이루어진 피막상과 자성 물질로 이루어진 코어상으로 이루어진 미립자인 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 자성 담체 입자가 평균 입자 지름 0.01∼20 마이크론 범위의 라텍스 입자인 동시에 자성 물질로 이루어진 핵을 갖는 것임을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 자성 담체 입자가 평균 입자 지름 0.1∼6 마이크론 범위의 라텍스 입자인 동시에 자성 물질로 이루어진 핵을 갖는 것임을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역분석이 자성 입자용 임상검사용 자동기기에 있어서, 검체 시료의 분주에서 측정 결과의 취득까지를 자동화하여 행할 수 있는 것을 특징으로 하는 면역 분석법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피검 시료중의 항원성 물질이 HbA1c인 것을 특징으로 하는 면역 분석법.