JP4873492B2 - 電気化学発光を利用した免疫測定法及び該免疫測定法に使用される電気化学発光量測定用キット - Google Patents

Description

本発明は、生体分子や環境分子を測定する際に用いられる、電気化学発光を利用した免疫測定法及び該免疫測定法に使用される電気化学発光量測定用キットに関する。

従来、抗体が有する特異的相互作用を利用して、生体分子や環境分子を計測することが盛んに行われている。放射性同位体を標識した抗体を用いる放射性免疫測定法は極めて高感度な定量が可能であるものの、放射性同位元素を必要とするため安全性に問題があり、特殊施設を必要とする。このため、近年は酵素標識抗体を用いる酵素免疫測定法が主流となってきている。

しかしながら、一般的に酵素免疫測定法の検出下限濃度は、放射性免疫測定法の検出下限濃度に比べ高いために、極低濃度分子測定への応用は困難である。例えば、ヒト血液中には脳性ナトリウム利尿ペプチドなどpg/mL程度で存在する重要なペプチドがあるが、これまで用いられてきた酵素免疫測定法を用いて、このような極低濃度ペプチドを定量することは感度的に困難な場合がある。このため、安全性が高く、さらに酵素免疫測定法を高感度化する新規な手法が必要とされている。
また、放射性免疫測定法に比べ、酵素免疫測定法は簡便且つ小型化されてはいるが、感度を維持したままオンサイト測定が可能なサイズにまでさらに小型化することは極めて難しい。これは、従来、酵素免疫測定法の検出に用いられてきた吸光および蛍光測定は、感度が光路長に大きく依存し、入射もしくは励起光も必要であるためである。

近年、電気化学発光現象を利用した免疫測定法が注目されている。従来の蛍光あるいは吸光度測定を行う免疫測定法のように、励起光や入射光を必要とせず、安全・安価かつ低ノイズレベルでの測定が可能であり、さらなる小型化や低電力化が見込める。電気化学発光を示す発光分子としては、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムが中性溶液で高輝度を得やすいことから多くの報告例があり、近年は免疫測定法への応用も報告されている（特許文献１）。
この方法は、目的分子（測定対象分子）と特異的に結合する抗体にトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを標識し、抗原抗体反応を生じさせた後、トリプロピルアミン溶液中においてトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムとトリプロピルアミンを酸化して発光させることにより、目的分子と結合した抗体、或いは結合しなかった抗体量を求めることで、目的分子濃度を見積もる手法である。
特開平１０−１１１２９３号公報

しかしながら、電気化学発光現象は、電極表面でのみ発光が行われるために高輝度化することが難しく、免疫測定法として高感度化することは困難であった。電気化学発光による免疫測定法の高感度化の試みとしては、Ｚｈｏｕらが抗体へデンドリマーを介して多くのトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを標識することを報告している（非特許文献１）。
しかしながら、生体分子への過剰な分子修飾は生体分子の特異的結合能の低下や拡散速度の低下に繋がるなど、免疫測定法としての高感度化には必ずしも結びついていない。
J. Macromolecules (2001) 34, 244

したがって、本発明は上述した電気化学発光現象を利用した酵素免疫測定法において、電極表面への酵素生成物の濃縮効果によって電気化学発光強度を増強させ、酵素免疫測定法を高感度化する方法、及びこの方法に使用する測定用キットを提供することを目的とする。

本発明者等は、先にチオール基を有する分子が金属表面へ吸着濃縮される特性を利用し、表面プラズモン共鳴法を検出原理とする免疫測定法の高感度化について提案をしている（特許文献２参照）。
特開２００６−２５０７２０号公報

その後、さらに検討をした結果、チオール基を有する分子の１つであるチオコリンとトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを同時に電極上で酸化することにより、高輝度に発光する現象を新規に見出し、この現象を応用することによって本発明を完成したものである。
すなわち、本発明では次の１〜８の構成を採用する。
１．試料中の測定対象分子に対する抗体と、基質との反応によりチオコリンを生成する標識酵素とが結合した酵素標識抗体を、試料と混合して抗原抗体反応を生じさせた後、測定対象分子と結合した酵素標識抗体又は結合していない酵素標識抗体の酵素活性を、前記標識酵素と基質との反応により得られたチオコリンをトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体とともに電気化学的に酸化させることにより生じる電気化学発光量を測定することにより試料中の測定対象分子を定量する方法。
２．前記標識酵素と基質との反応により得られたチオコリンを金属電極表面に吸着させた後に、該金属電極をトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体溶液と接触させて電気化学的に酸化させることを特徴とする１に記載の方法。
３．前記金属電極として金電極を使用することを特徴とする２に記載の方法。
４．前記チオコリンを生成する標識酵素としてコリンエステラーゼを、基質としてアシルチオコリンを使用して、標識酵素と基質の反応により第４級アンモニウム化合物としてアシルチオコリンからチオコリンを生成させることを特徴とする１〜３のいずれかに記載の方法。
５．アシルチオコリンとしてアシル基の炭素数が１〜４のアシルチオコリンを使用することを特徴とする４に記載の方法。
６．前記標識酵素がアセチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．７）又はブチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．８）であることを特徴とする４又は５に記載の方法。
７．試料中の測定対象分子に対する抗体と、基質との反応によりチオコリンを生成する標識酵素とが結合した酵素標識抗体；前記標識酵素との反応によりチオコリンを生成する基質；及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を組み合わせて構成した電気化学発光量測定用キット。このキットは、上記１〜６の試料中の測定対象分子を定量する方法に用いられる。
８．コリンエステラーゼ標識抗体；アセチルチオコリン；及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を組み合わせて構成したことを特徴とする７に記載の電気化学発光量測定用キット。

従来の酵素免疫測定法は、放射性免疫測定法に比べ感度の面で劣ることが多いが、本発明に係る方法では標識酵素の酵素活性を電気化学発光法により測定し、この電気化学発光現象をより高輝度に観測するチオール類の濃縮効果を測定法に組み込むことにより、高感度化が可能である。これにより、生体中に極低濃度でしか存在しない分子を、簡便かつ安全に測定することを可能にする。

本発明では、試料中の測定対象分子に対する抗体と、基質との反応によりチオール基を有する第４級アンモニウム化合物を生成する標識酵素とが結合した酵素標識抗体を、試料と混合して抗原抗体反応を生じさせた後、測定対象分子と結合した酵素標識抗体又は結合していない酵素標識抗体の酵素活性を、前記標識酵素と基質との反応により得られた第４級アンモニウム化合物を金属錯体とともに電気化学的に酸化させることにより生じる電気化学発光量を測定することにより試料中の測定対象分子を定量する。

本発明において、チオール基を有する第４級アンモニウム化合物を生成する標識酵素としては、コリンエステラーゼを用いることができる。
好ましいコリンエステラーゼとしては、例えばアセチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．７）及びブチリルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．８）があげられる。これらの酵素による標識抗体の作製方法には特に制限がなく、酵素免疫測定法において汎用される、ヒンジ法やカルボジイミドカップリング法、アビジン−ビオチン法等が利用できる。

これらの標識酵素は、基質としてアセチルチオコリン等のアシルチオコリンを分解して、チオコリンを生成することができる。アシルチオコリンとしては、アシル基の炭素数が１〜１０、特に１〜４程度のアシルチオコリンを使用することが好ましい。
生成したチオコリンは、金電極等の金属電極の表面に吸着させた後に、該金属電極を金属錯体溶液と接触させて電気化学的に酸化させて、生じる電気化学発光量を測定することによって試料中の測定対象分子を定量する。
金属錯体としては、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム、トリス（２，２’−ビピリジル）オスミウム等を使用することが好ましい。

本発明に係る方法により定量され得る測定対象分子は、抗原性を有するものであれば特に限定されない。具体的な測定対象分子としては、例えばペプチド、タンパク質、多糖類、ポリヌクレオチド等が挙げられる。
特に、本法は高感度測定を実現するものであるため、極低濃度分子の検出には有効であると考えられ、生体濃度がpg/mLオーダーと極めて低い利尿ペプチド類検出に特に有効であると考えられる。利尿ペプチドの一つである脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は健常人の血液中においては数ｐｇ／ｍＬ程度であるが、急性心不全、慢性心不全、狭心症、急性心筋梗塞、腎不全、高血圧症等においてその濃度が上昇し、特に心不全ではその病状に従って濃度が上昇することが知られている等、医療分野における重要なマーカー分子である。

次に、図面を参照しながら、標識酵素としてブチリルエステラーゼ、基質としてアセチルコリン、電極として金電極、金属錯体としてトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを用いる場合を例にとり、いわゆる競合法により本発明の免疫測定法を実施する手順の１例について説明する。
（１）ある測定対象分子の濃度を測定しようとする場合、予め、図１のＡにみられるように測定対象分子を基材へと固定化された基材を作製しておく。基材としては金属、炭素、ガラス、高分子等の固体材料が広く利用される。例えばポリスチレンを基材とする場合には測定対象分子を含む溶液を数時間から一昼夜滴下しておくことにより、疎水性相互作用により吸着・固定化することが可能である。基材の形状には特に制限はなく、板状体、粒子等、任意の形状とすることができる。

（２）一方、測定対象分子を含有する試料液とブチリルエステラーゼ標識抗体とを混合し、図１のＢにみられるように、抗原抗体反応をおこして抗原（測定対象分子）と酵素標識抗体とを結合させる。こうして得られた反応液中には測定対象分子と結合した酵素標識抗体と、測定対象分子と結合していない酵素標識抗体とが含まれる。なお、当業者には自明であるが、酵素標識抗体は抗原に対して過剰量用いるのが普通である。

（３）次いで、（２）で得られた反応液を（１）で作成した測定対象分子固定化基材と接触させ、適当な時間抗原抗体反応を行わせる。（２）の反応において測定対象分子と結合していない酵素標識抗体は、この過程で、図１のＣにみられるように、該基材上の測定対象分子と結合する。しかしながら、既に測定対象分子と結合している酵素標識抗体は、基板上の測定対象分子とは結合できず、溶液中に留まることになる。

（４）次いで（３）で得られた基板を洗浄することにより、溶液中に留まっている酵素標識抗体を洗い流し、さらに酵素の基質となるアセチルチオコリンを導入する。ここで、図１のＤに示すように、基材上に固層化されている酵素標識抗体の酵素活性量に応じて、アセチルチオコリンの一部は、チオコリンに加水分解される。

（５）次いで、（４）の一部がチオコリンに加水分解されたアセチルチオコリン溶液を金電極と接触させる。
この際に、加水分解されたチオコリンは、分子末端にチオール基を有するため、図２に示すように金表面に吸着濃縮されていく。しかしながら、アセチルチオコリンは、チオール基を有していないため、金表面への吸着は僅かである。なお、当業者には自明であるが、チオール類と結合する特性を示す電極素材であれば金電極以外でも利用可能である。具体的には、銀や銅電極を用いることが可能である。

（６）次いで、（５）の金電極をトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを含む中性付近の緩衝溶液に浸し、金電極の電位を銀／塩化銀参照電極に対して０Ｖから２．０Ｖへと掃引する。この際に、１．１５Ｖ付近でチオコリン並びにトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムは電極上で酸化される。さらに酸化したチオコリンとトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムが衝突し、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムが再び基底状態に戻る際に、図２に示すように発光する。
一定濃度のトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム中で電極電位を掃引した場合、発光量は金電極表面に吸着したチオコリン濃度の上昇に伴い増加するため、発光強度を測定することにより、吸着したチオコリン量を見積もることが可能である。ここで、吸着したチオコリン量は基板上に固層化された酵素標識抗体の酵素活性の増加に伴い増加する。言い換えれば、発光強度は固層化されなかった酵素標識抗体量、つまり測定対象分子の量と負の相関を有するため、発光強度を求めることで、測定対象分子濃度を測定可能である。なお、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体構造を有していれば、その誘導体に於いても発光させることが可能である。

（７）発光強度の測定は、市販のフォトダイオードや光電子増倍管を用いて行うことが可能である。光電子増倍管では、フォトダイオードに比べより微弱光の測定が可能であるため、より高感度測定が可能である。

また、本発明の免疫測定法は、図３にみられるように、サンドイッチイムノアッセイ法と呼ばれる手法によって、次のような手順で実施することができる。
（１’）図３のＡに示すように、予め、キャプチャー抗体と呼ばれる、測定対象分子に対して酵素標識抗体とは異なるエピトープを有している抗体が固定化された基材を作製する。
（２’）上記基材を試料液と接触させることにより、図３のＢに示すように試料液中に含まれる測定対象分子を基材上に固定化されている抗体と結合させる。
（３’）次いで、酵素標識抗体を接触させることにより、基材上に固定化された測定対象分子を酵素標識抗体と結合させて、図３のＣに示すように酵素標識抗体を基材上に固定する。
（４’）過剰の酵素標識抗体を洗浄後、上記基材を酵素の基質であるアセチルチオコリンを含む溶液と接触させることにより、図３のＤに示すように基材上に留まっている酵素標識抗体の活性に応じてアセチルコリンを加水分解させてチオコリンを生成する。

上記手順により生成したチオコリン量は、上記の（５）〜（７）に記載の手順により電気化学発光量から見積もることが可能である。この方法では、チオコリン量は基板上に固層化された酵素標識抗体の酵素活性の増加に伴い増加する。
すなわち、サンドイッチイムノアッセイ法では、測定対象分子の量と発光強度は正の相関を有するため、発光強度を求めることで測定対象分子濃度を測定することが可能となる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
（測定装置）
図４は、本発明の免疫測定方法に使用する測定装置の１例を示す模式図である。
この測定装置は、試料導入口１１及び試料排出口１２を有し流路１３内に金電極２を配置したフローセル１、金電極２に電位を印加するためにフローセル１に接続された参照電極３及び対向電極４、参照電極３及び対向電極４に接続され電極電位を制御する電気化学アナライザー５、金電極２の近傍に接続された光ファイバー６、光ファイバー６の他端に接続された光電子増倍管７、及び光電子増倍管７に接続されたパーソナルコンピューター８により構成される。
具体的には、例えば深さ０．５ｍｍの流路１３内に直径３ｍｍの金電極２（ＢＳＡ販売社製）を配置し、参照電極３としては３mol/Lの塩化ナトリウム溶液を内部溶液とする銀・塩化電極を、対向電極４としてはステンレス中空管を用いる。作用電極となる金電極２、参照電極３及び対向電極４は電気化学アナライザー５（ＡＬＳ社製）に接続し、電極電位の制御を行った。一方、金電極２の近傍に接続したコア径が1mmの光ファイバー６を、光電子増倍管７（浜松フォトニクス社製）に接続することで金電極２表面での光量を計測し、得られたデータはパーソナルコンピュータ８へと出力する。

（実施例１）
本実施例では、本発明における脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の検出例について述べる。まず、ブチリルコリンエステラーゼを標識酵素とする抗ＢＮＰ抗体（Ａｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥ）を以下のように作製した。
還元剤である２−メルカプトエチルアミンと抗ＢＮＰポリクローナル抗体（Phoenix Pharmaceuticals社製）を混合し、抗体のヒンジ部分を還元、解離させる。その後ゲル濾過を行い、過剰の２−メルカプトエチルアミンを除去する。
一方、スクシイミジル４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下、「Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ」と略記する）とブチリルコリンエステラーゼを混合し、ブチリルコリンエステラーゼへマレイミド基を導入する。その後ゲル濾過を行い、過剰のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを除去する。
つぎに、還元した抗ＢＮＰ抗体とマレイミド基を導入したブチリルコリンエステラーゼを混合することにより、抗ＢＮＰ抗体とブチリルコリンエステラーゼを結合させ、Ａｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥを得た。

（抗原抗体反応）
１０μｇ／ｍＬのＢＮＰ（Phoenix Pharmaceuticals社製）をマイクロタイタープレートへ各々２００μＬキャストし、一晩室温で放置する。この間に、ＢＮＰはマイクロタイタープレート壁面に吸着・固層化される。その後、２００μＬのｐＨ７．０リン酸バッファで３回洗浄し、過剰のＢＮＰを除去した。一方、10μｇ／ｍＬのＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥ溶液に、各々０，１，１０，１００ nｇ／ｍＬになるようにＢＮＰを混合し、室温で３０分抗原抗体反応をせしめた混合溶液を、マイクロタイタープレートの各ウエルに２００μＬずつ滴下し、室温で２時間放置した。この間に、試料溶液中のＢＮＰと結合していないＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥはマイクロタイタープレートに吸着されているＢＮＰと結合し、固層化される。その後、ｐＨ７．０リン酸バッファで３回洗浄し、溶液中に留まっているＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥを除去した。さらに、１００μＭのアセチルチオコリン溶液を１００μＬ加え、３０分間室温で放置することで、Ａｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥの活性に応じ、アセチルチオコリンの一部をチオコリンへと分解した。

上記のようにして得た、チオコリンを含むアセチルチオコリン溶液を、図４の装置のフローセル１へ流速２０μＬ／分で１０分間導入し、チオコリンを金電極２へ濃縮させた。その後、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを流速２０μＬ／分で１０分間導入した。さらに、金電極２の電位を０から２．０Ｖへと掃引しながら、電極表面での電気化学発光量の計測を行った。なおこれらの試料溶液の導入にはシリンジポンプ（ＣＭＡ社製）を用いた。電極電位を０から２．０Ｖへと掃引した際の、光量の変化を図５に示す。

電極電位が０から１Ｖ付近までは、全く電気化学発光現象が観測されていない。しかしながら、１．１５Ｖ付近をピークとする光子の生成が観測された。なお、チオコリンを事前に導入せずにトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムのみを電極上で酸化した場合には、電気化学発光量は僅かであったことから、高輝度発光にはチオコリンが重要である。図５では、ＢＮＰ濃度の上昇に伴いピークの高さが小さくなる現象が確認された。これは、ＢＮＰの増加に伴い、マイクロタイタープレート壁面へ固層化されたＡｎｔｉ−ＢＮＰ−ＢｃｈＥが減少し、酵素反応時に生成されたチオコリン濃度が減少したためである。
図６は、本実験により得られたＢＮＰに対する検量線を示す。横軸にＢＮＰ濃度を、縦軸に１１５０ｍＶでの光量をプロットした。ＢＮＰ濃度の上昇に伴い光量は減少しており、本発明の方法によりＢＮＰが定量可能であることを示している。

（実施例２）
実施例１において、標識する酵素をアセチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．７）とした以外は実施例１と同様にして抗ＢＮＰ抗体を作製し、実施例１と同様にＢＮＰの定量を行った結果、実施例１と同様にＢＮＰが定量可能であった。これは、アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼの両者とも、アセチルチオコリンのチオコリンへの加水分解反応を触媒するためである。

競合法により、本発明を用いて測定対象分子を測定する手順を示す模式図である。 本発明の測定方法の検出原理を説明する図である。酵素反応により生成したチオコリンが、１．金表面へ濃縮され、さらに、２．トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムと共に濃縮膜を電気化学的に酸化する、ことにより、３．発光する。 サンドイッチイムノアッセイ法により、本発明を用いて測定対象分子を測定する手順を示す模式図である。 本発明で使用する、測定装置の１例を示す模式図である。 実施例１において、測定対象試料溶液中のＢＮＰ濃度を変化させた際の、電気化学発光強度を測定した結果を示す図である。 実施例１において、電極電位が１１５０ｍＶでの光量をＢＮＰ濃度に対してプロットすることにより得られたた検量線である。

符号の説明

１ フローセル
２ 金電極
３ 参照電極
４ 対向電極
５ 電気化学アナライザー
６ 光ファイバー
７ 光電子増倍管
８ パーソナルコンピュータ
１１ 試料導入口
１２ 試料排出口
１３ 流路

Claims (8)

1. 試料中の測定対象分子に対する抗体と、基質との反応によりチオコリンを生成する標識酵素とが結合した酵素標識抗体を、試料と混合して抗原抗体反応を生じさせた後、測定対象分子と結合した酵素標識抗体又は結合していない酵素標識抗体の酵素活性を、前記標識酵素と基質との反応により得られたチオコリンをトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体とともに電気化学的に酸化させることにより生じる電気化学発光量を測定することにより試料中の測定対象分子を定量する方法。
2. 前記標識酵素と基質との反応により得られたチオコリンを金属電極表面に吸着させた後に、該金属電極をトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体溶液と接触させて電気化学的に酸化させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記金属電極として金電極を使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記チオコリンを生成する標識酵素としてコリンエステラーゼを、基質としてアシルチオコリンを使用して、標識酵素と基質の反応によりアシルチオコリンからチオコリンを生成させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. アシルチオコリンとしてアシル基の炭素数が１〜４のアシルチオコリンを使用することを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記標識酵素がアセチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．７）又はブチルコリンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．８）であることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
7. 試料中の測定対象分子に対する抗体と、基質との反応によりチオコリンを生成する標識酵素とが結合した酵素標識抗体；前記標識酵素との反応によりチオコリンを生成する基質；及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を組み合わせて構成した電気化学発光量測定用キット。
8. コリンエステラーゼ標識抗体；アセチルチオコリン；及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体を組み合わせて構成したことを特徴とする請求項７に記載の電気化学発光量測定用キット。