ES2268015T3 - Procedimiento de inmunoensayo. - Google Patents
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Abstract
Un inmunoensayo, que utiliza una partícula portadora insoluble, que comprende (i) utilización de una partícula portadora magnética insoluble en un estado sustancialmente libre de ningún antígeno y/o anticuerpo adsorbido. (ii)adsorción de una sustancia antigénica presente en una muestra bajo análisis sobre dicha partícula portadora magnética insoluble o la unión de una sustancia antigénica a dicha partícula portadora magnética insoluble. (iii) hacer reaccionar la partícula portadora magnética insoluble resultante del tratamiento anterior (ii) con un anticuerpo que es un anticuerpo marcado que es específicamente reactivo con una parte de dicha sustancia antigénica, siendo específicamente reactivo dicho anticuerpo con una forma de la sustancia antigénica en fase sólida, pero siendo sustancialmente no reactivo con una forma de la sustancia antigénica en estado nativo, en la que dicha forma de la sustancia antigénica en fase sólida está unida a dicha partícula portadora insoluble, y dicha sustancia en estado nativo está presente en la fase líquida, y (iv)medida, como indicador, del marcaje sobre el anticuerpo marcado resultante capturado por dicha sustancia antigénica en fase sólida.
Description
Procedimiento de inmunoensayo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para medir inmunológicamente (ensayo inmunológico de)
una sustancia antigénica en un fluido (tal como una muestra
biológica) utilizando una partícula magnética.
En años recientes se han realizado en
hospitales, centros de diagnóstico, etc. intentos para la
automatización de diversos análisis que incluye análisis clínicos
y/o ahorro de la cantidad de tiempo de medida a la vista de una
disminución de personal, propósitos de disminuir costes, demandas
para el tratamiento de grandes cantidades de muestras, etc. Un
procedimiento en el que las sustancias antigénicas se someten a un
ensayo cualitativo o cuantitativo con partículas portadoras
magnéticas insolubles ha atraído la atención como técnica adecuada
para esta automatización.
Además, en el campo inmunoquímico en el que se
utilizan tales partículas magnéticas insolubles portadoras, se han
utilizado partículas magnéticas insolubles con antígeno o anticuerpo
unido (partículas magnéticas insolubles sensibilizadas) en las que
dichos portadores magnéticos llevan un antígeno o anticuerpo
idéntico al analito diana que se quiere analizar. Los conocidos
públicamente en el presente campo son aquellos (por ejemplo, los
descritos en los documentos JP, A, 06-160387 (1994)
y JP, A, 07-72, 155 (1995)) que comprenden, en el
caso de que se analice una sustancia antigénica en un fluido
(muestra bajo análisis) tal como una muestra biológica, la etapa de
mezclado de dicha muestra bajo análisis con partículas magnéticas
insolubles en las que se ha adsorbido previamente y transportado un
anticuerpo capaz de unirse específicamente a dicha sustancia
antigénica o a un fragmento de la misma, y la etapa de medir
entonces el grado de unión de la mencionada sustancia antigénica a
las mencionadas partículas magnéticas insolubles en las que la
mencionada sustancia antigénica será detectada o cuantificada. Otros
procedimientos de acuerdo con este formato se revelan en los
documentos EP-A-0351857,
EP-A-0709680, P.L.Lim et al.
(1998) J. Clin. Microbiol. 36, 2271 and D.
Müller-Schulte and H. Brunner (1995) J. Chromatog.
711, 53.
Sin embargo, cuando se adsorben previamente
anticuerpos, etc. a partículas magnéticas insolubles y se usan para
el ensayo, no se puede evitar el problema de la estabilidad de las
partículas magnéticas insolubles sensibilizadas. Por tanto, a pesar
de todos los esfuerzo, todavía quedan problemas que incluyen el
asunto de la fecha de caducidad de los reactivos, la dificultad para
preparar los mismos, etc. Además, existe el problema adicional de
que cuando las partículas magnéticas insolubles se preservan por un
periodo largo tienden a formar precipitados en una suspensión de las
mismas.
En la introducción de los instrumentos de
análisis para análisis clínicos totalmente automatizados, etc., para
ahorrar trabajo o para el tratamiento de grandes cantidades de
muestras en un tiempo corto, es necesario habitualmente realizar
tratamientos de lavado en el ensayo para la separación del material
unido y el libre (B/F). Un propósito inevitable para hacer la medida
eficiente y rápida es reducir incluso unas pocas etapas o llevar a
cabo el ensayo de una forma simple. Para estos propósitos, se ha
intentado desarrollar recientemente un sistema de inmunoensayo en el
que se utilizan partículas magnéticas insolubles como portadoras
aunque es inevitable perder las partículas magnéticas insolubles
utilizadas en el mismo durante la etapa de lavado. Esto es también
una causa de consumo de los preciados anticuerpos que lleva dicho
portador, etc. Así, existe la desventaja de que se requieren más
anticuerpos, etc, en los instrumentos de análisis clínicos
automatizados utilizando partículas magnéticas que en el caso de los
inmunoensayos habituales debido a la utilización de cantidades
relativamente grandes de partículas magnéticas. Además, existe un
problema de perdida de partículas debida a los lavados
repetidos.
Como resultado de una investigación intensiva,
los presentes inventores han tenido éxito en descubrir que tras
ensayos de detección de sustancias antigénicas en muestras de
ensayo, sin utilizar ninguna partícula magnética insoluble que lleve
un anticuerpo específico frente a la mencionada sustancia antigénica
si no proporcionando una partícula portadora magnética insoluble en
tal estado que ninguno de dichos anticuerpos y los similares sean
sustancialmente adsorbidos por la misma, dicha sustancia antigénica
(analito diana que se quiere analizar) en sí misma se puede adsorber
a dicha partícula magnética portadora insoluble libre de anticuerpo
y seguidamente, por reacción con un anticuerpo marcado específico de
la sustancia antigénica resultante adsorbida sobre dicha partícula,
la sustancia antigénica presente en la muestra de ensayo se puede
analizar eficientemente de forma adecuada para la automatización.
Así, los presentes inventores han tenido éxito en completar la
siguiente invención.
Más particularmente, el inmunoensayo de la
presente invención incluye las etapas de
proporcionar una partícula portadora magnética
insoluble en un estado sustancialmente libre de cualquier
anticuerpo, etc.,
adsorber o unir entonces una sustancia
antigénica presente en la muestra bajo análisis a una partícula
portadora magnética insoluble, y
hacer reaccionar la mezcla resultante con un
anticuerpo marcado que reacciona específicamente con dicha sustancia
antigénica adsorbida, por lo que el mencionado inmunoensayo permite
la medida selectiva de la sustancia antigénica portada en la
partícula portadora magnética insoluble.
Con el fin mantener la capacidad de
cuantificación del ensayo en la presente invención, es preferible
que se seleccionen las condiciones, incluyendo las concentraciones
de los materiales biológicos y las concentraciones de tampones para
las suspensiones de partículas portadoras insolubles, dependiendo
de las cuestiones específicas del ensayo de forma que la sustancia
antigénica en el material biológico se pueda adsorber sobre una
partícula portadora magnética insoluble de forma proporcional a la
cantidad en la que está presente.
La presente invención proporciona:
(1) Un inmunoensayo, que utiliza una
partícula portadora insoluble, que comprende
- (i)
- utilización de una partícula portadora magnética insoluble en un estado sustancialmente libre de cualquier antígeno y/o anticuerpo,
- (ii)
- adsorción de una sustancia antigénica presente en una muestra bajo análisis sobre dicha partícula portadora magnética insoluble o unión de la sustancia antigénica a dicha partícula portadora magnética insoluble.
- (iii)
- Hacer reaccionar a la partícula portadora magnética insoluble resultante del tratamiento anterior (ii) con un anticuerpo que es un anticuerpo marcado que es específicamente reactivo con una parte de la mencionada sustancia antigénica, siendo dicho anticuerpo específicamente con una forma de la sustancia antigénica en fase sólida, pero siendo sustancialmente no reactivo con una forma de la sustancia antigénica en estado nativo, en la que dicha sustancia antigénica en fase sólida está unida a la mencionada partícula portadora insoluble, y dicha sustancia antigénica en estado nativo está todavía presente en la fase líquida, y
- (iv)
- medida, como indicador, del marcaje sobre el anticuerpo marcado resultante capturado por dicha sustancia antigénica en fase sólida;
(2) El inmunoensayo de acuerdo con lo
mencionado anteriormente (1), en el que dicho inmunoensayo
comprende
- (A)
- adsorción de la mencionada sustancia antigénica presente en dicha muestra bajo análisis a una partícula portadora magnética insoluble o unión de dicha sustancia antigénica a la partícula portadora magnética insoluble, y
- (B)
- hacer reaccionar posteriormente a la sustancia antigénica capturada con el mencionado anticuerpo, que reacciona específicamente con la sustancia antigénica en fase sólida, sin eliminar la mencionada muestra bajo análisis mediante lavados;
(3) El inmunoensayo de acuerdo con lo
mencionado anteriormente (1) ó (2), en el que dicho inmunoensayo
comprende
- (a)
- hacer reaccionar a dicho anticuerpo marcado con una partícula portadora magnética insoluble a la que se adsorbe o se une la mencionada sustancia antigénica en la mencionada muestra bajo análisis,
- (b)
- separación posteriormente del anticuerpo marcado, que no ha reaccionado, de la partícula portadora magnética insoluble en presencia de la acción de un campo magnético, y
- (c)
- medida, como indicador, del marcaje sobre el anticuerpo marcado resultante capturado por dicha sustancia antigénica en fase sólida;
(4) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (3), en el que dicho
anticuerpo es monoclonal;
(5) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (3), en el que dicho
anticuerpo es policlonal;
(6) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (5), en el que dicha
partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre
partículas finas, en el que dicha partícula fina es sustancialmente
insoluble en medio líquido acuoso e incluye una fase de material
polimérico orgánico y una fase de material
magnético;
magnético;
(7) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (6), en el que dicha
partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre
partículas finas, en el que dicha partícula fina incluye no solo una
fase de cubierta hecha de uno o más materiales poliméricos si no
también de una fase nuclear hecha de uno o más materiales
magnéticos;
(8) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (7), en el que dicha
partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre
partículas de látex, en el que dicha partícula de látex tiene (a) un
tamaño medio de partícula en el intervalo de 0,01 a 20 micras y (b)
un núcleo hecho de uno o más materiales magnéticos;
(9) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (7), en el que dicha
partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre
partículas de látex, en el que dicha partícula de látex tienen un
tamaño medio de partícula en el intervalo de 0,1 a 6 micras y un
núcleo que incluye de uno a más materiales magnéticos;
(10) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (9), en el que el
inmunoensayo se puede practicar de una forma automatizada en etapas
desde la distribución de la mencionada muestra bajo análisis hasta
la obtención de los resultados del análisis con un instrumento de
análisis clínico automatizado o con un autoanalizador de química
clínica apropiado para partículas magnéticas; y
(11) El inmunoensayo de acuerdo con
cualquiera de lo anteriormente mencionado (1) a (10), en el que la
sustancia antigénica presente en la muestra bajo análisis es
HbA1c.
La Fig. 1 muestra la relación área de la
superficie de la partícula-señal entre las
partículas portadoras magnéticas insolubles y las señales
resultantes en el ensayo HbA1c con Acm anti-HbA1c,
que incluye la etapa de adsorción de HbA1c sobre las partículas de
látex magnéticas.
La Fig. 2 muestra la relación
señal-cantidad de anticuerpo entre las señales
resultantes y los anticuerpos que existen en un sistema para el
ensayo de HbA1c con un Acm anti-HbA1c marcado, que
incluye la etapa de adsorción de HbA1c sobre las partículas
magnéticas de látex.
La Fig. 3 muestra los resultados cuando el
marcaje utilizado se detecta directamente en el ensayo HbA1c con un
Acm anti-HbA1c marcado, que incluye la etapa de
adsorción de HbA1c sobre partículas magnéticas de látex.
La Fig. 4 muestra la correlación entre un
procedimiento de agregación de látex y un procedimiento para el
ensayo de HbA1c con un Acm anti-HbA1c marcado, que
incluye la etapa de adsorción de HbA1c sobre partículas magnéticas
de látex.
La Fig. 5 muestra la influencia que tienen las
variaciones en las partículas portadoras magnéticas insolubles
utilizadas, en el ensayo de HbA1c con Acm anti-HbA1c
marcado, que incluye la etapa de adsorción de HbA1c sobre partículas
magnéticas de látex.
En la presente invención, es posible hacer
reaccionar un anticuerpo marcado (Ac marcado), particularmente un
anticuerpo monoclonal marcado (Acm marcado), con una sustancia
antigénica específica que se adsorbe sobre o se une a un portador
magnético insoluble, sin reacción sustancial de dicho anticuerpo
marcado (particularmente, dicho Acm marcado) con la mencionada
sustancia antigénica específica que permanece todavía en la fase
líquida. De acuerdo con esto, en un aspecto preferible de la
presente invención, es posible la adsorción de sustancias
antigénicas que están presentes en una muestra bajo análisis sobre
un portador insoluble, seguida por reacción con un Acm específico de
dicha sustancia antigénica mediante el inmunoensayo mencionado
anteriormente sin eliminar dicha muestra bajo análisis con
lavados.
Así, en una forma de realización preferida de la
presente invención, el Acm utilizado aquí se selecciona entre
aquellos que reaccionan con un antígeno adsorbido sobre una
partícula portadora insoluble pero que sustancialmente no reaccionan
con la sustancia antigénica no adsorbida (no unida) presente en la
fase líquida, siendo así posible excluir sustancialmente la acción
de interferencia debida al componente no adsorbido (no unido).
Las sustancias antigénicas que se pueden ensayar
de acuerdo con la presente invención incluyen cualquiera que se
pueda adsorber sobre (o unir a) un portador magnético insoluble, con
tal de que sea posible producir u obtener al menos un anticuerpo
policlonal o monoclonal dirigido contra dicha sustancia antigénica
específica, aunque no se pretende limitar aquí al ámbito de la
sustancia antigénica. Con el fin de facilitar la adsorción sobre el
portador magnético insoluble, sin embargo, es preferible seleccionar
una sustancia que este presente en una muestra biológica a no menos
de 100 \mug/ml (mejor no menos de 1 mg/ml) o a no menos del 1%
(del peso total de proteína). Además, con el fin de facilitar la
producción de los anticuerpos policlonales y/o monoclonales
mencionados anteriormente, es preferible que la sustancia antigénica
mencionada anteriormente sea una sustancia (tal como una proteína)
que tenga un peso molecular no menor de 10.000.
\newpage
La "sustancia antigénica" que se va a
analizar de acuerdo con el inmunoensayo de la presente invención
puede ser cualquiera con tal de que se pueda producir o este
disponible al menos un anticuerpo policlonal o monoclonal específico
de esa sustancia antigénica diana. La "sustancia antigénica"
incluye una variedad de sustancias tales como proteínas,
polipéptidos y proteínas recombinantes producidas por medio de
técnicas de ingeniería genética. Éstas pueden ser las conocidas
públicamente o nuevas en el campo de dicho inmunoensayo. Una
sustancia antigénica representativa es HbA1c.
Tal como se utiliza aquí, el término
"anticuerpo específicamente reactivo con una sustancia
antigénica" puede incluir cualquiera de los anticuerpos
policlonales y/o monoclonales, y también aquellos que son bien
moléculas intactas o bien fragmentos derivados de las mismas, que
incluyen los fragmentos F(ab')_{2}, Fab', y Fab. Las
técnicas preferidas para la producción de anticuerpos monoclonales
incluyen, por ejemplo, los procedimientos que utilizan células de
hibridoma (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256,
pp.495-497 (1975); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), etc. y,
además de éstos, los siguientes documentos se pueden tomar como
ejemplo en lo referente a los anticuerpos: J.J. Langone et
al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121
(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and
Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986), o
documentos citados en los mismos.
Se pueden producir anticuerpos monoclonales
adecuados adoptando las técnicas de fusión celular descritas por
Kohler and Milstein (Nature, 256, 495-497, 1975),
etc. El procedimiento mencionado es en sí mismo una técnica
convencional . Por tanto, no será necesario ilustrarlo
particularmente; sin embargo, en este procedimiento se requiere la
selección eficiente de las células de hibridoma productoras del
anticuerpo monoclonal diana. Debido a su facilidad para el
tratamiento de un número elevado de muestras, la selección se lleva
a cabo por el procedimiento llamado "ELISA"
(enzimoinmunoensayo) en el que un antígeno predeterminado se acopla
a una fase sólida en una placa de 96 pocillos, entonces se le hace
reaccionar con el sobrenadante de cultivo de las células de
hibridoma y posteriormente se permite la reacción con un anticuerpo
anti-inmunoglobulina de ratón marcado con una
enzima. Ya que el antígeno está en fase sólida en este caso, este
procedimiento de selección es aceptable cuando se puede constituir
un sistema de ensayo en el que el anticuerpo puede reaccionar con el
antígeno en estado de fase sólida, pero hay algunos casos en los que
existe un anticuerpo, entre los anticuerpos monoclonales producidos
por las células de hibridoma y seleccionados por ELISA, que no
reacciona en un sistema de ensayo en el que la interacción
antígeno-anticuerpo se realiza en fase líquida como
es el caso del radioinmunoensayo (RIA).
Aunque tal fenómeno es por sí mismo conocido
públicamente o conocido comúnmente en el presente campo, cuando se
utiliza dicho anticuerpo monoclonal, el inmunoensayo de la presente
invención permite una reacción específica con la sustancia
antigénica diana que está en fase sólida sobre partículas portadoras
insolubles sin ninguna inhibición debida a la sustancia antigénica
todavía presente en la fase líquida.
Anticuerpos monoclonales representativos
incluyen, por ejemplo, aquellos revelados en la Patente Japonesa No.
2.677.753. Particularmente, son anticuerpos monoclonales
representativos, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales
anti-HbA1c (Acm anti-HbA1c)
revelados en la Patente Japonesa No. 2.677.753.
Aunque el anticuerpo utilizado es habitualmente
IgG, se podrían incluir también fragmentos de anticuerpo, que
incluyen F(ab')_{2}, Fab', y Fab, etc., que son moléculas
menores derivadas de los anticuerpos parentales por tratamiento con
enzimas digestivas tales como tripsina, papaína, pepsina y otras, y
ocasionalmente reducción con un agente reductor tal como
ditiotreitol y mercaptoetanol. Además es posible utilizar IgM en
lugar de IgG, o utilizar fragmentos que son moléculas menores
derivadas de la IgM parental por el mismo tratamiento que para IgG.
Es, además, posible utilizar una combinación de dos o más
anticuerpos monoclonales que reconozcan epítopos diferentes.
El anticuerpo como se utiliza aquí puede estar
macado un marcador apropiado.
El marcaje puede incluir enzimas, sustratos de
enzimas, inhibidores de enzimas, grupos prostéticos, coenzimas,
precursores de enzimas, apoenzimas, sustancias fluorescentes,
pigmentos, compuestos quimioluminiscentes, sustancias luminiscentes,
sustancias coloreadas, sustancias magnéticas, partículas metálicas
tales como oro coloidal, sustancias readiactivas, etc. Las enzimas
pueden incluir deshidrogenasas, oxidoreductasas tales como
reductasas y oxidasas; transferasas que catalizan la transferencia
de grupos funcionales tales como grupos amino, carboxilo, metilo,
acilo y fosfato; hidrolasas que hidrolizan enlaces tales como éster,
glucósido, éter, y enlaces peptídicos; liasas; isomerasas; ligasas;
etc. Se pueden utilizar enzimas plurales en una forma conjugada para
la detección.
También se puede utilizar ciclamiento enzimático
por ejemplo. Enzimas típicas para el marcaje incluyen peroxidasas
tales como la peroxidasa de rábano; galactosidasas tales como
beta-D-galactosidasa de
E.coli; malato deshidrogensasa;
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;
glucosa oxidasas; glucoamilasas; acetilcolinesterasas; catalasas;
fosfatasa alcalina tal como la fosfatasa de ternera intestinal y la
fosfatasa alcalina de E. coli, etc. Cuando se utiliza la
fosfatasa alcalina, las medidas se pueden realizar registrando o
inspeccionando la fluorescencia, luminiscencia, etc., generada con
sustratos tales como los derivados de umbeliferona que incluyen
4-metil-umbeliferil fosfato,
derivados de fenol fosforilado tales como nitrofenil fosfato,
derivados de luciferina y derivados de dioxietano; sistemas de
ciclamiento enzimático que utilizan NADP; y otros. También es
posible utilizar sistemas luciferina/luciferasa. Cuando tiene lugar
la reacción con peróxido de hidrógeno para generar oxigeno, éste se
puede detectar con un electrodo o por otros procedimientos. El
electrodo puede ser un electrodo de cristal, un electrodo iónico que
utiliza una membrana de sal insoluble, un electrodo tipo membrana
líquida, un electrodo de membrana polimérica y similares. El marcaje
enzimático se puede reemplazar por un marcaje con biotina y una
enzima marcada con avidina (estreptavidina). Para el marcaje, se
pueden utilizar múltiples tipos de marcajes o marcadores diferentes.
En este caso, es posible realizar medidas conjuntas continua o
discontinuamente y/o simultánea o separadamente.
De acuerdo con la presente invención, la
formación de señal se puede realizar utilizando combinaciones
enzima-reactivo, tales como combinaciones de
peroxidasa de rábano u otras peroxidasas con un miembro seleccionado
entre ácido 4-hidroxifenilacético, 1,fenilendiamina,
tetrametilbencidina, etc.; combinaciones de
beta-D-galactosidasas o
glucosa-6-fosfato deshidrogenasas
con un miembro seleccionado entre umbeliferil galactosidasas,
nitrofenil galactósidos, etc.; y otros. La señal se puede formar con
aquellos reactivos capaces de formar enzimáticamente compuestos
quinol tales como hidroquinona, hidroxibenzoquinona e
hidroxiantraquinona; compuestos de tiol tales como ácido lipoico y
glutation; derivados fenólicos; derivados de ferroceno; etc.
Las sustancias fluorescentes y compuestos
quimioluminiscentes pueden incluir isotiocianato de fluoresceína;
derivados de Rodamina tales como isotiocianato de Rodamina B y
isotiocianato de tetrametil Rodamina; cloruro de dancilo (cloruro de
5-(dimetilamino)-1-naftalenosulfonilo),
fluoruro de dancilo, fluorescamina
(4-fenilespiro[furano-2
(3H),1'-(3'H)-isobenzofurano]-3,3'-diona);
ficobiliproteínas tales como ficocianina y ficoeritrina; sales de
acridina; compuestos luminol tales como lumiferina, luciferasa y
acuorina; imidazoles; ésteres del ácido oxálico:; compuestos
quelados de elementos de tierras raras tales como europio (Eu),
terbio (Tb) y samario (Sm); derivados de coumarina tales como
7-amino-4-metilcumarina;
etc.
El acoplamiento entre el anticuerpo y el marcaje
se puede llevar a cabo por técnicas que incluyen procedimientos
físicos tales como adsorción; un procedimiento químico que utiliza
un agente de acoplamiento, etc. o un reactante activado; un
procedimiento que utilice un acoplamiento por interacción química.
El marcaje puede realizarse por reacción de un grupo tiol con un
grupo maleimido, por reacción de un grupo piridil disulfuro con un
grupo tiol, por reacción de un grupo amino con un grupo aldehido,
etc. Adicionalmente, se pueden seleccionar adecuadamente técnicas,
que pueden ser llevadas a la práctica fácilmente por una persona
experta en el tema, entre los procedimientos conocidos extensamente
y cualquiera de las modificaciones derivadas de ellos. Los agentes
de acoplamiento incluyen, por ejemplo, formaldehído, glutaraldehido,
diisocianato de hexametileno; diisotiocianato de hexametileno,
N,N'-polimetilen bisiodoacetamida,
N,N'-etilen bismaleimida, etilenglicol
bisuccinimidil succinato, bisdiazobencidina,
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida, 3-(2-piridilditio) propionato de
succinimidilo (SPDP), N-succinimidil
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC), N- sulfoccinimidil
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato,
N-succinimidil
(4-iodoacetil)-aminobenzoato,
N-succinimidil
4-(1-maleimidofenil)butirato,
N-(epsilon-maleimidocaproiloxi) succinimida (EMCS),
iminotiolano, anhidrido S-acetilmercaptosuccinico,
metil-3-(4'ditiopiridio)propinimidato,
metil-4-mercaptobutirilimidato,
metil-3-mercaptopropionimidato,
N-succinimidil-S-acetilmercaptoacetato,
etc.
Las partículas portadoras magnéticas insolubles
utilizadas aquí son preferiblemente partículas finas en las que la
partícula fina es sustancialmente insoluble en un medio líquido
acuoso e incluye una fase de material polimérico orgánico y una fase
de material o sustancia magnética. Partículas portadoras magnéticas
insolubles representativas son partículas finas, cada una de las
cuales incluye no solo una fase de recubrimiento hecha de uno o más
materiales poliméricos orgánicos si no también un fase nuclear hecha
de uno o más materiales o sustancias magnéticas. Dicha partícula
portadora magnética insoluble puede incluir, por ejemplo, partículas
finas que incluyen uno o más miembros seleccionados entre el grupo
que consiste en tetróxido triférrico (Fe_{3}O_{4}), trióxido
diférrico (gamma-Fe_{2}O_{3}), varios ferritos,
metales tales como hierro, manganeso, níquel, cobalto y cromo,
aleaciones tales como aleaciones de cobalto, aleaciones de níquel,
aleaciones de manganeso, etc.; partículas de látex, partículas de
gelatina, partículas de liposoma, etc. que contienen la partícula
magnética dentro de ellas; y otros. Convenientemente, la partícula
portadora magnética insoluble incluye partículas de látex
constituidas por una cubierta de látex que rodea el núcleo del
mencionado material o sustancia magnética. Originalmente, el término
látex significaba la savia lechosa que rezuma del árbol del caucho
tras hacerle un corte o herida, pero el látex tal como se utiliza
aquí también se refiere a una suspensión o emulsión en la que
partículas finas discontinuas se resuspenden o dispersan en una
solución acuosa. Las partículas magnéticas insolubles utilizadas
aquí preferiblemente incluyen, pero no se limitan a, partículas
finas en las que la superficie del núcleo de dicha partícula
magnética se somete a un tratamiento de superficie con una sustancia
orgánica, etc.
Cuando se lleva a cabo el inmunoensayo de forma
cuantitativa, se requiere generalmente de tales partículas de látex
un alto nivel de homogeneidad o uniformidad en el tamaño, del
control del estado de su superficie, de la elección de su estructura
interna, etc. Tales partículas de látex de alta calidad apropiadas
para analizar las aplicaciones del reactivo, se pueden seleccionar
entre los productos disponibles comercialmente. Los materiales de
polímeros orgánicos que se pueden utilizar como componentes de las
partículas anteriores pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos
para partículas finas de materiales de polímeros orgánicos revelados
en anteriores trabajos (por ej. JP, A, 58-11575
(1983)). Dichos materiales poliméricos orgánicos incluyen, por
ejemplo, polímeros hidrofóbicos tales como poliestireno,
poliacrilonitrilo, poli(metil metacrilato), policapramida y
tereftalato de polietileno; polímeros hidrofílicos entrecruzados
tales como poliacrilamida, polimetacrilamida, polivinilpirrolidona,
poli(vinil alcohol), poli(2-oxietil
acrilato), poli(2-oxietil metacrilato), poli
(2,3-dioxipropil acrilato),
poli(2,3-dioxipropil metacrilado) y
polietilenglicol metacrilato; copolímeros que incluyen
aproximadamente de 2 a 4 tipos de cada monómero; y otros. Aunque no
existe ninguna limitación particular para el material del látex, se
utilizan preferiblemente los látex tipo estireno tales como los
látex poliestireno, los látex tipo ácido acrílico, etc. Se prefiere
la utilización de látex que tengan una fuerte hidrofobicidad de
superficie (tales como látex de poliestireno) con el fin de
facilitar una buena adsorción de proteínas o péptidos. También, es
posible utilizar varios tipos de látex desnaturalizados (tales como
los látex desnaturalizados por ácido carboxílico) dependiendo de las
necesidades. Los portadores insolubles mencionados anteriormente
para su utilización aquí incluyen preferiblemente látex tales como
los látex de poliestireno. Las partículas de látex particularmente
preferidas son las partículas de poliestireno preparadas por
procedimientos de polimerización por emulsión que no utilicen
emulsionante. El látex como tal se mantendrá estable incluso sin
ningún emulsionante debido a la repulsión entre cargas negativas en
la superficie. Partículas portadoras magnéticas insolubles
representativas, disponibles comercialmente, son Dynabeads
M-270 Epoxy, Dynabeads M-270 Amine,
Dynabeads M-270 Carboxilic Acid, Dynabeads
M-270 Toxylactivated, Dynabeads
M-450 Epoxy y Dynabeads M-450
Toxylactivated (VERITAS Corporation, Japan),
IMMUTEX-MAG (JSR Corporation, Japan), and
SMG-11 (Fujikura Kasei Co., Ltd., Japan). Las
partículas portadoras están también disponibles en Bangs
Laboratories, Ins., etc.
El tamaño de partícula de las partículas
portadoras magnéticas insolubles utilizadas aquí oscila entre 0,01
\mum a 20 \mum. Es preferible seleccionar partículas magnéticas
insolubles con un tamaño de partícula en el intervalo de 0,1 \mum
a 6 \mum. Los procedimientos para la adsorción de la sustancia
antigénica a la partícula magnética insoluble o para la unión de la
sustancia antigénica a la partícula magnética insoluble pueden
incluir adsorción física o unión de la sustancia antigénica presente
en la muestra bajo análisis o enlace químico de la sustancia
antigénica presente en la muestra bajo análisis. Son adecuadas la
adsorción física o la unión.
Con el fin de adsorber las sustancias
antigénicas contenidas en la muestra bajo análisis sobre las
partículas de látex, se pueden aplicar técnicas sustancialmente
equivalentes a aquellas para la unión de un antígeno a una placa en
ELISA, etc., en lo que se refiere al tampón para resuspender las
partículas de látex. Se acepta que tenga lugar agregación natural en
algunas partículas de látex. En este caso, con el fin de mantener la
estabilidad, es preferible resuspenderlas en un tampón glicina
débilmente alcalino o en tampón borato. Con respecto a la
concentración de látex, es preferible utilizar un suspensión del
0,05 al 1% en peso.
En la presente invención, las sustancias
antigénicas contenidas en la muestra bajo análisis se fijan (o se
inmovilizan) a una fase sólida y posteriormente se les les hace
reaccionar con un Ac marcado que reacciona específicamente con dicha
sustancia antigénica en fase sólida para marcar la sustancia
antigénica capturada sobre un portador magnético insoluble que
incluye látex, etc. Es preferible que la solución acuosa utilizada
contenga un agente activo de superficie (tal como Tween 20), a
aproximadamente 0,1 a 0,3%, para prevenir la adsorción de dicho
anticuerpo al portador insoluble que incluye látex, etc.
No existe una limitación particular acerca del
recipiente en el que se lleva a cabo la reacción de acuerdo con la
presente invención. Es posible utilizar un recipiente con forma de
tubo normal (tubo de análisis; por ejemplo, tubo de análisis de
poliestireno). Cuando se tiene en cuenta la facilidad para tratar
cientos o miles de muestras simultáneamente, es muy conveniente
utilizar una placa de ELISA con múltiples pocillos, tales como una
placa de ELISA de 96 pocillos (NUNC-IMMUNO PLATE,
etc). Como se mencionará posteriormente, con el fin de realizar las
medidas por procedimientos ópticos más sencillos, es preferible
realizar la reacción utilizando un contenedor sustancialmente
transparente. Cuando se utilice un autoanalizador, como el que
mencionará posteriormente, es de destacar que la reacción se llevará
a cabo habitualmente en un reactor en el mencionado analizador.
No existe una limitación particular acerca de
los procedimientos de medida del nivel de marcaje de las partículas
portadoras magnéticas insolubles. Por ejemplo, en el caso de que el
marcaje sea medido cualitativamente o
semi-cuantitativamente, es posible juzgar
visualmente el nivel de marcaje de las partículas portadoras
insolubles mencionadas anteriormente basándose en comparaciones del
nivel de turbidez de muestras conocidas. Cuando dicho marcaje se
mide cuantitativamente, es preferible llevar a cabo medidas ópticas
por su simplicidad y conveniencia.
Para la medida óptica del marcaje en las
partículas portadoras magnéticas insolubles que incluyen látex,
etc., se pueden utilizar procedimientos conocidos
convencionalmente.
En la presente invención, es posible llevar a
cabo tratamientos de medida para las muestras bajo análisis; las
etapas desde los tratamientos para repartir la muestra hasta la
adquisición de los resultados del ensayo, mediante un instrumento
automatizado tal como un autoanalizador de análisis clínicos para
partículas magnéticas. Tales instrumentos automatizados (sistemas)
para análisis clínicos incluyen ADVIA™ (nombre comercial, Bayer),
ARCHITECT™ (nombre comercial, Dinabbot), IMx™ (nombre comercial,
Dinabbot), Access™ (nombre comercial, Beckmann), ECLusys™ (nombre
comercial, Roche Diagnostics), LUMIPULSE™ (nombre comercial
FUJIREBIO), etc. Tales instrumentos se han utilizado ampliamente en
sistemas de inmunoensayo (que utilizan interacciones
antígeno-anticuerpo) y pueden adoptarse para la
presente invención sin ninguna limitación mientras que sean los
adecuados. Los rasgos característicos de estos instrumentos tienen
méritos y ventajas que incluyen la capacidad para medir múltiples
muestras en una forma de acceso al azar, la alta sensibilidad del
ensayo, la disponibilidad del ensayo por encima en un amplio
intervalo, la terminación del ensayo en un tiempo corto, una alta
precisión del ensayo debido a que todas las etapas desde la
distribución hasta la obtención de los resultados del ensayo se
realizan de forma automática, el bajo nivel de contaminación debida
a que se utilizan cartuchos exclusivos, etc.
Cuando se miden antígenos en muestras normales,
las partículas magnéticas sensibilizadas por el anticuerpo se
utilizan en instrumentos de análisis clínicos automatizados
convencionales en los que las etapas incluyen:
(a) primera reacción:
- (1)
- hacer reaccionar las partículas magnéticos con el antígeno en la muestra y (2) lavado posterior,
(b) segunda reacción:
- (3)
- hacer reaccionar el producto resultante con un segundo anticuerpo (que utiliza un marcaje tal como una enzima o sustancia fluorescente como marcador) específico de dicho antígeno y (4) lavado posterior, y
(c) tercera reacción:
- (5)
- hacer reaccionar el producto resultante con un sustrato específico del marcador y (6) medida posterior.
De acuerdo con la presente invención, sin
embargo, el número de etapas de lavado se puede reducir como
sigue:
(a) primera reacción:
- (1)
- hacer reaccionar las partículas magnéticas con un antígeno en una muestra,
(b) hacer reaccionar el producto resultante con
un segundo anticuerpo (que utiliza un marcaje tal como una enzima o
sustancia fluorescente como marcador) específico de dicho antígeno y
(3) lavado posterior, y
(c) tercera reacción:
- (5)
- hacer reaccionar el producto resultante con un sustrato para el marcador, y (6) medida posterior.
Como resultado, la pérdida de partículas se
puede inhibir considerablemente en la presente invención.
En los procedimientos para la detección óptica
de agregación de partículas de látex es necesario utilizar grandes
cantidades de partículas. En la presente invención, sin embargo, se
puede detectar la cantidad de sustancias unidas a las partículas.
Por tanto, en la presente invención se pueden medir tanto las
partículas como los anticuerpos marcados cuando su cantidad es un
décimo o incluso menos de la cantidad requerida en los
procedimientos convencionales.
De acuerdo con la presente invención, es posible
evitar los problemas de manufactura relacionados con los complejos
de anticuerpos utilizados en los procedimientos convencionales en
los que los problemas incluyen la dificultad en el procedimiento de
preparación de los mismos, inestabilidad a la concentración real de
uso, etc. Así, la utilización de un único Ac en la presente
invención proporciona una mejora en la estabilidad de las sustancias
sin variación entre los lotes manufacturados, permitiendo por tanto
una manufactura estable y fiable. El uso de un único Acm permite la
utilización de sus cualidades. Por ejemplo, es posible eliminar
variaciones entre lotes de anticuerpos y proporcionar reactivos
altamente fiables con calidad constante.
Debido a que el reactivo "partícula portadora
insoluble" de la presente invención no es sensibilizado nunca con
un antígeno, etc., los kits de reactivos se han mejorado
considerablemente en relación con los problemas acerca de las
variaciones entre partículas de distintos lotes. Además, la
partícula no sólo incluye un núcleo hecho de materiales o sustancias
magnéticas si no también una superficie hecha de plásticos y tiene
unas propiedades de adsorción o unión de sustancias antigénicas
excelentes.
Los instrumentos de análisis en los que se
pueden utilizar las partículas portadoras magnéticas insolubles
aplicables en la presente invención incluyen, por ejemplo, FUJIREBIO
LUMIPULS™ (ALP-AMPPD™); Beckmann Coulter Access™
(ALP-Lumigen™ PPD); Beckmann Coulter LUMIWARD™
(ALP-Lumigen™ PPD); Nippon DPC Corporation
"Immulize"™ (ALP-AMPPD™); Bayer ACS™ (éster de
acridinio); Ortho Clinical Diagnostics VITROS™ ECi
(HPR-Luminol); Precision System Science Co., Ltd.
HiMICO™; Dinabbot ARCHITECT™ (éster de acridinio); Roche Picolumi™
(complejo de rutenio); Tosoh AIA-600II
(ALP-4MUP); etc. Estos instrumentos pueden incluir
también aquellos que utilizan quimioluminiscencia con enzimas,
electroquimioluminiscencia con complejos de rutenio,
quimioluminiscencia con ésteres de acridina, etc.
Como una realización que ilustra bien las
características del inmunoensayo de acuerdo con la presente
invención, se describe a continuación un ensayo ejemplo para
hemoglobina A1c (HbA1c) aunque el inmunoensayo de la invención no se
limita al ensayo de hemoglobina A1c.
La anteriormente mencionada "hemoglobina
A1c" se refiere a un tipo específico de hemoglobina glucada que
se forma por la unión no enzimática de glucosa al grupo
a-amino de la valina, aminoácido
N-terminal de la cadena b de la hemoglobina (Hb). La
cantidad de hemoglobina A1c en sangre refleja estados de control de
glucosa sanguínea en diabetes durante un periodo relativamente
largo. De acuerdo con esto, el ensayo para HbA1c es bastante
significativo clínicamente con el fin de evaluar el control de la
glucemia (remitirse a, por ejemplo, Nippon-Rinsho,
48, Special Issue, 315-322 (1990).
La hemoglobina es un heterotetrámero, que consta
básicamente de dos cadenas \alpha y dos cadenas \beta. La
hemoglobina A1c se caracteriza por que el grupo
\alpha-amino N-terminal está
glucosilado en una de las dos cadenas \beta. Así, la hemoglobina
A1c tiene un sitio característico de reacción. En otras palabras, la
hemoglobina A1c funciona como un antígeno monovalente en base a su
reactividad con un Acm específico de hemoglobina A1c.
En el inmunoensayo de la presente invención,
para medir la hemoglobina A1c, por ejemplo, una muestra bajo
análisis (tal como una muestra de sangre hemolizada preparada vía la
adición de agua purificada a sangre total) se puede adsorber en
partículas portadoras magnéticas insolubles (partículas magnéticas
cubiertas de látex) seguido por reacción con un Acm marcado
anti-hemoglobina A1c para marcar selectivamente la
hemoglobina A1c presente en la capa de látex. La medida del nivel de
moléculas marcadas selectivamente permite el análisis cuantitativo
de la hemoglobina A1c. Por ejemplo, una muestra patrón en la que se
conoce el porcentaje de hemoglobina A1c mediante determinación por
HPLC u otros procedimientos se cuantifica simultáneamente por medio
del inmunoensayo de la presente invención para preparar una curva de
calibrado. Sobre las bases de dicha curva de calibración, se puede
determinar el valor del % de la fracción de hemoglobina A1c en
muestras desconocidas.
Se puede utilizar aquí cualquier Acm
anti-HbA1c sin ninguna limitación particular excepto
que sea sustancialmente reactivo con la HbA1c adsorbida o unida a
fase sólida pero que no reaccione sustancialmente con la HbA0 en
fase sólida (preferiblemente, dicho Acm anti-HbA1c
no tendría que reaccionar sustancialmente ni con la HbA1c ni con la
HbA0 todavía presentes en la fase líquida). Dicho anticuerpo
monoclonal se puede obtener cuando se utiliza para su generación un
péptido glucado como inmunógeno. La reactividad con HbA1c y HbA0 se
puede medir, por ejemplo, de la forma revelada en la Patente
Japonesa No. 2.677.753.
En la presente invención, es preferible que el
Acm anti-HbA1c tenga una reactividad con la HbA1c
que no sea menor de 1,0 (más preferiblemente, no menor de 2,0) en
términos de la escala de un lector de placas para ensayos inmunes
tal como se describe en la Patente Japonesa No. 2.677.753. Es
también preferible que el Acm anti-HBA1c tenga una
reactividad con la HbA0 que no sea mayor de 0,1 (más
preferiblemente, no mayor de 0,05) en términos de dicha escala.
En la presente invención, es preferible que el
Acm anti-HbA1c no sea reactivo con la HbA1c no
desnaturalizada, ni con la HbA0, ni con HbA0 desnaturalizada, etc.
en fase líquida incluso a 10 \mug/ml (o mejor 20 \mug/ml)
mientras que es reactivo con la HbA1c desnaturalizada en fase
líquida a 1 \mug/ml (o mejor 0,5 \mug/ml) o menos.
Una realización preferida del ensayo para HbA1c
de acuerdo con la presente invención se revela aquí.
En la presente invención, aproximadamente 1 a
20 \mul (ó 2 a 5 \mul) de solución de sangre hemolizada se añade
habitualmente a cada tubo como muestra bajo análisis. Como
soluciones de sangre hemolizada utilizadas realmente aquí, se pueden
utilizar también los productos obtenidos por dilución de la muestra
bajo análisis (tal como una muestra de 50 \mul de sangre total a
la que se ha añadido 1 ml de agua purificada) con un tampón glicina,
etc. a una tasa de dilución de aproximadamente 5 a 20 veces.
Por tanto, una alícuota (aproximadamente 100 a
300 \mul (ó 150 a 200 \mul)) de suspensión de partículas
magnéticas de látex (tal como una suspensión de partículas
magnéticas de 0,12 \mum cubiertas de látex, a una concentración
del 0,2%) se añade a cada tubo y permanece así a 37ºC durante
aproximadamente de 1 a 30 min (ó de 3 a 20 min) de forma que la
HbA1c en la muestra se adsorba al látex. Es preferible que la
suspensión de partículas magnéticas de látex utilizada así sea un
producto de dilución de la solución de partículas magnéticas de
látex original con un tampón glicina,
etc.
etc.
A continuación, se añade una alícuota
(aproximadamente de 100 a 300 \mul (ó de 150 a 200 \mul)) del
Acm anti-HbA1c (tal como un Acm derivado de ascitis
de ratón) marcado con un marcador apropiado a la HbA1c adsorbida en
el látex, y la mezcla permanece (se incuba) a 37ºC durante
aproximadamente de 2 a 30 min (ó de 3 a 10 min) de forma que la
HbA1c reaccione con dicho Acm marcado. Es preferible que la
concentración de la solución de Acm utilizada así sea la óptima
establecida, por ejemplo, en base a una serie de diluciones de Acm
anti-HbA1c preparada. El tampón utilizado para la
dilución, puede incluir tampón glicina 0,05 a 0,1M (GBS: solución
salina tamponada con glicina; pH 8,1 a 8,5, que contenga 0,15M de
NaCl), etc. Es preferible que el tampón utilizado para este
propósito contenga un agente activo de superficie (tal como Tween
20) de aproximadamente 0,1 a 0,5% (ó de 0,2 a 0,3%) con el fin de
prevenir la adsorción física del Acm a la superficie de látex.
En el presente campo, cuando se utilizan
partículas de látex tales como las partículas portadoras magnéticas
insolubles, es difícil manufacturar reactivos de látex (látex
portadores de antígeno, anticuerpo, etc) que tengan una calidad
idéntica sin excepción y preservar los productos en un estado
estable a la vez que se prevenga la incidencia de agregación no
específica y precipitación.
Contrastando con esto, de acuerdo con la
presente invención, la no sensibilización de los portadores
magnéticos (látex, etc.) con un antígeno o un anticuerpo permite
aplicaciones de látex magnéticos, disponibles comercialmente, no
sensibilizados por sí mismos, como los portadores magnéticos
insolubles mencionados. Adicionalmente, no siempre es necesario que
el anticuerpo sea un producto puro. Además, debido a la simplicidad
del reactivo es posible mantener una estabilidad de almacenamiento
mayor a la vez que también es ventajoso para los fabricantes. Como
se mencionó aquí anteriormente, de acuerdo con la presente
invención, los reactivos se pueden fabricar de una forma simple y
sencilla por lo que es posible proporcionar ahora procedimientos que
utilizan reactivos que tienen una alta estabilidad tras
preservación.
En la aplicación del inmunoensayo de la presente
invención, los sistemas de ensayo para las dianas de la presente
invención, o las sustancias diana que tengan una actividad
sustancialmente equivalente a ellas, se podrían realizar por las
adaptaciones de consideración técnica dadas comúnmente por expertos
en el tema acerca de las condiciones generales y operaciones
adecuadas para cada uno de los procedimientos.
Para detalles de estos procedimientos técnicos
convencionales, es posible remitirse a una variedad de revisiones,
textos, libros, etc. Están, por ejemplo, Hiroshi Irie (ed.),
"Radioimmunoassay", Kodansha Ltd., Japan, 1974; Hiroshi Irie
(ed.), "Zoku-Radioimmunoassay"
(Radioimmunoassy; Second Edition), Kodansha Ltd., Japan, 1979; Eiji
Ishikawa et al. (ed.), "Koso Meneki Sokuteiho" (Enzyme
Immunoassays), Igaku-Shoin Ltd., Japan, 1978; Eiji
Ishikawa et al. (ed.), "Koso Meneki Sokuteiho" (Enzyme
Immunoassays) (2nd Edition), Igaku-Shoin Ltd.,
Japan, 1982; Eiji Ishikawa et al. (ed.), "Koso Meneki
Sokuteiho" (Enzyme Immunoassays) (3rd Edition),
Igaku-Shoin Ltd., Japan, 1987; H.V. Vunakis et
al. (ed), "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical
Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); J.J. Langone
et al (ed.); "Methods in Enzymology", Vol. 73
(Immunochemical Techniques, Part B), Academic Press, New York
(1981); J.J. Langone et al (ed.); "Methods in
Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C),
Academic Press, New York (1981); J.J. Langone et al (ed.);
"Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques,
Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982);
J.J. Langone et al (ed.); "Methods in Enzymology", Vol.
92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and
General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J.J.
Langone et al (ed.); "Methods in Enzymology", Vol. 121
(Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and
Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986); J.J.
Langone et al (ed.); "Methods in Enzymology", Vol. 178
(Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New
York (1989); M. Wilchek et al. (ed.), "Methods in
Enzymology", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology),
Academic Press, New York (1990); J.J. Langone et al (ed.);
"Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and
Modeling: Concepts and Applications, Part B: Antibodies and
Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic
Press, New York (1991); etc. y referencias citadas en los
documentos
anteriores.
anteriores.
La presente invención se describe
específicamente mediante los siguientes Ejemplos que se proporcionan
sólo por propósitos ilustrativos, y se refieren a realizaciones
específicas de la presente invención.
Todos los ejemplos se realizan o pueden
realizarse utilizando técnicas estándar bien o generalmente
conocidas por aquellos con experiencia normal en la materia a menos
que se especifique de otra forma.
Ejemplo
1
Sangre hemolizada: se hemolizaron hematíes (5
\mul) obtenidos de sangre humana por la adición de agua purificada
(500 \mul) y la mezcla resultante se utilizó como una muestra bajo
análisis.
Acm anti-HbA1c marcado con
Biotina: como reactivo de biotinilación se utilizó
NHS-LC-Biotin (No. 21335; Pierce).
El Acm anti-HbA1c se biotiniló de acuerdo al manual
proporcionado por el mencionado reactivo de biotilinación. La
biotina que no reaccionó se eliminó por diálisis repetida. El Acm
anti-HbA1c utilizado es el revelado en la Patente
No. 2.677.753 (para este anticuerpo monoclonal, se puede utilizar
también el agente anti-HbA1c contenido en el
reactivo de análisis de hemoglobina A1c (HbA1c) "RAPIDIA AUTO
HbA1c" (proveedor: FUJIREBIO Inc., Japan; fabricante: SRL, Inc.,
Japan).
Para las partículas portadoras magnéticas
insolubles, se utilizó SMG-11 (Fujikura Kasei Co.,
Ltd., Japan). Este producto de partículas magnéticas de látex tiene
las siguientes propiedades físicas: tamaño de partícula (nm): 990 y
densidad: 1,58. Las partículas portadoras magnéticas insolubles se
diluyeron con agua hasta formar una serie de diluciones acuosas:
2,5%, 0,25% y 0,025%. En 100 \mul de una dilución acuosa del 2,5%
de partículas magnéticas de látex, el número de partículas era
3,12E+0,9 y el área de superficie (m^{2}) era
9,59E-03; en el caso de la dilución del 0,25%, el
número de partículas era 3,12E+0,8 y el área de superficie (m^{2})
era 9,59E-04; y en el caso de la dilución 0,025%,
el número de partículas era 3,12E+0,7 y el área de superficie
(m^{2}) era 9,59E-05.
Se añadieron 5 \mul de una solución de sangre
hemolizada a 100 \mul de una dilución acuosa de partículas
magnéticas de látex y la mezcla permaneció a temperatura ambiente
durante 5 min para adsorber de esta forma las sustancias
antigénicas. Posteriormente, se añadieron a la misma 50 \mul de
0,07 mg/ml de Acm anti-HbA1c biotinilado. La mezcla
permaneció a temperatura ambiente durante 5 min y se lavó una vez
con un tampón ALP (1% BSA, 50 mM imidazol, 150 mM NaCl, 1 mM
MgCl_{2}, 0,1 mM ZnCl_{2}, 0,05% Tween 20; pH 7,6), y
posteriormente se añadieron a la misma 100 \mul de
avidina-ALP (*5000; DAKO D-365). La
mezcla resultante permaneció a temperatura ambiente durante 5 min y
se lavó cuatro veces con el tampón ALP debido a que se utilizó un
sistema biotina-avidina. Después de la adición de
AMPPD (100 \mul, Lumigen PPD; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.,
Japan), la mezcla se transfirió a una placa blanca. Diez minutos
después, se midió la cantidad de luminiscencia. Los resultados se
muestran en la Fig. 1.
Como resultado, se estimó que la cantidad de
proteína de la solución hemolizada era aproximadamente 10 \mug.
Por tanto, se supuso que cuando las partículas estaban a una
concentración del 2,5% y a un área de superficie de
9,6E-0,3 m^{2}, la cantidad de proteínas era
demasiado pequeña y consecuentemente la agregación tendría lugar
durante la reacción por lo que sería imposible analizar aquellos
analitos que hubieran entrado en los portadores. Cuando se
utilizaron partículas con un tamaño de 1 \mum, el valor,
aproximadamente 9,6E-0,3 m^{2}, parecía ser
apropiado.
Ejemplo
2
Se añadieron 5 \mul de una solución hemolizada
(preparada de la misma manera que en el Ejemplo 1) a 100 \mul una
dilución acuosa de partículas magnéticas de látex del 0,025% (se
utilizó como fuente de partículas portadoras magnéticas insolubles
el mismo producto de látex que en el Ejemplo 1), la mezcla
permaneció a temperatura ambiente durante 5 min, y se le añadió una
alícuota de Acm anti-HbA1c biotinilado (preparado de
la misma manera que en el Ejemplo 1, a 0,048 mg/ml (50 \mul, 2,4
\mug) ó 0,0048 mg/ml (50 \mul, 0,24 \mug)) ó 0,00048 mg/ml (50
\mul, 0,024 \mug)). La mezcla permaneció a temperatura ambiente
durante 5 min y se lavó una vez con tampón ALP (1% BSA, 50 mM
imidazol, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,1 mM ZnCl_{2}, 0,05%
Tween 20; pH 7,6). A continuación, se añadieron a la misma 100 ml de
ALP-avidina (el mismo reactivo que en el Ejemplo 1).
La mezcla resultante permaneció a temperatura ambiente durante 5 min
y se lavó cuatro veces con tampón ALP ya que se utilizó un sistema
biotina-avidina. Entonces, se añadieron 100 \mul
de AMPP (el mismo reactivo que en el Ejemplo 1), y la mezcla se
transfirió a una placa blanca. Diez minutos después, se midió la
cantidad de luminiscencia.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. Como
resultado, se encontró que una cantidad de aproximadamente 0,25
\mug de Acm anti-HbA era suficiente.
Ejemplo
3
Con el fin de simplificar los análisis y mejorar
la reproducibilidad, los Acm anti-HbA1c se marcaron
directamente con ALP.
(1) Se marcó fosfatasa alcalina (ALP;
Oriental Yeast, Co., Ltd., Japan) con isotiocianato de fluoresceína
(FITC; DOJINDO, Japan). Primeramente, se añadió ALP (10 mg/ml, 100
\mul) al tampón 0,1 M NaHCO_{3} (400 \mul), añadiéndose
entonces 10 \mul de una solución de FITC (4 mg de FITC en
dimetilformamida (DFM, 1 ml) (ALP: FITC = 1:10). La mezcla se agitó
a temperatura ambiente durante 10 min y el producto resultante se
recuperó utilizando PD-10 (Pharmacia). Para la
elución, se utilizó tampón 0,1 M NaH_{2}PO_{4}, pH 7,5. Se
recuperó ALP marcada con FITC (1,7 ml).
La ALP marcada con FITC preparada
anteriormente (ALP-FITC) se modificó con maleimida.
Primeramente, la ALP-FITC recuperada anteriormente
se concentró con Centricon 30 (Millipore) hasta 500 \mul. A
continuación, se añadieron 10 \mul de solución EMCS
(N-(\epsilon-maleimidocaproiloxi)-succinimida
(EMCS, 6 mg) en DMF (1 ml) (ALP-FITC:EMCS = 1:20).
La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 min y el
producto resultante se recuperó utilizando PD-10
(Pharmacia). Para la elución se utilizó tampón 0,1 M
NaH_{2}PO_{4}, pH 6,3 que contenía 5 mM de ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA). Se recuperó una solución de
ALP-FITC modificada con maleimida.
Mientras tanto, el Acm
anti-HbA1c (el mismo anticuerpo que se utilizó en el
Ejemplo 1) se convirtió a su forma SH. Así, 19,1 mg de Acm
anti-HbA1c (52,4 \mul) se añadieron al tampón 0,1
M NaH_{2}PO_{4}, pH 7,5 (450 \mul), añadiéndose entonces 10
\mul de solución AMSA (anhídrido del ácido
S-acetilmercaptosuccinico) (AMSA, 6 mg) en DMF (1
ml) (anticuerpo:AMSA = 1:50). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 30 min, añadiéndose entonces tampón 1M Tris, pH 7,0
(20 \mul) que contenía 50 mM EDTA y una solución 1M hidrocloruro
de hidroxilamina, pH 7,0 (20 \mul). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 15 min y el producto resultante se
recuperó utilizando PD-10 (Pharmacia). Para la
elución, se utilizó 0,1 M NaH_{2}PO_{4}, pH 6,3 que contenía 5
mM de EDTA. Se recuperó una forma SH del anticuerpo (IgG SH, 1,7
ml).
A continuación, una cantidad total del
ALP-FITC maleimidado preparado anteriormente se
mezcló con una cantidad total de la IgG SH preparada anteriormente.
Se estimó que la relación de la mezcla era ALP:IgG = 1,5:1 (relación
molar). Después de su reacción a temperatura ambiente durante 2 hr,
la mezcla se concentró con Centricon (Millipore) hasta 500 ml y
sometió a filtración en gel (soporte utilizado: Superose™ 12;
Pharmacia) hasta obtener el Acm anti-HbA1c marcado
con ALP.
(2) Se añadieron 5 \mul de solución de
sangre hemolizada (la misma muestra de sangre que en el Ejemplo 1) a
100 \mul de una dilución 0,025% de partículas magnéticas de látex
(la misma dilución de látex que en el Ejemplo 1). La mezcla
permaneció a temperatura ambiente durante 5 min, y se añadió el Acm
anti-HbA1c marcado con ALP. Respecto al anticuerpo,
se añadieron 50 \mul de IgG 5 \mug/ml. Se utilizaron, para su
comparación, una dilución de anticuerpo en la que el anticuerpo se
diluyó en PBS-Tween y otra dilución en la que el
anticuerpo se diluyó en tampón que contenía BSA. La mezcla
permaneció a temperatura ambiente durante 5 min y se lavó entonces
cuatro veces con PBS-Tween. Después de la adición de
AMPPD (100 \mul, el mismo reactivo que en el Ejemplo 1), la mezcla
se transfirió a una placa blanca. Quince minutos después, se midió
la cantidad de luminiscencia. Los resultados se muestran en la Fig.
3.
Se ha observado que el fondo disminuye cuando
coexiste proteína tras la adición de anticuerpo. Como resultado de
la disminución del fondo, se podría esperar una mejora de la
reproducibilidad. Se ha verificado que aumenta la señal en
comparación con el caso de ALP-avidina. La Fig. 4
muestra los resultados de examinar la correlación con el reactivo de
análisis de hemoglobina A1c (HbA1c), "RAPIDIA AUTO HbA1c"
(proveedor: FUJIREBIO Inc., Japan; fabricante: SRL, Inc., Japan)
entre un procedimiento de agregación de látex y el procedimiento de
la invención. Se verificó la existencia de una buena
correlación.
Ejemplo
4
Se aplicaron las mismas operaciones y reactivos
que en el Ejemplo 3. Las partículas de látex de Fujikura Kasei
(Fujikura Kasei Co., Ltd., Japan) que se utilizaron en los Ejemplos
1 a 3 se compararon con las partículas de látex VERITAS (VERITAS
Corporation, Japan). Se llevaron a cabo medidas en las que se
estableció que el área de la superficie total de cada uno de los
reactivos de partículas magnéticas utilizados para los ensayos fuera
igual.
Las partículas de látex VERITAS tenían un
tamaño de partículas de 2,8 \mum, una concentración de partículas
de 4,0E+09 partículas/ml, un área (calculada) de
2,46E-11 y un área de superficie por ensayo de
9,59E-05 m^{2}/partícula (1 \mul requerido para
ajuste a m^{2}). Las partículas de látex VERITAS se diluyeron 100
veces con agua. Se utilizaron 100 \mul de la dilución de
partículas de látex VERITAS.
Se añadieron 5 \mul de la solución de sangre
hemolizada a 100 \mul de cada suspensión de partículas magnéticas
(área de superficie = 9,59E-11 m^{2}) y la mezcla
permaneció a temperatura ambiente durante 5 min. Posteriormente, se
añadió a la mezcla el Acm anti-HbA1c marcado con
ALP. Respecto del anticuerpo, se añadieron 50 \mul de 5 \mug/ml
de IgG. La mezcla permaneció a temperatura ambiente durante 5 min,
se lavó cuatro veces con PBS-Tween y se le
añadieron 100 \mul de AMPPD (el mismo reactivo que en el Ejemplo
1). La mezcla resultante se transfirió a una placa blanca. Quince
minutos después, se midió la cantidad de luminiscencia.
Los resultados se muestran en la Fig. 5. Para la
calibración, se utilizó el reactivo de análisis de la hemoglobina
A1c (HbA1c), "RAPIDIA AUTO HbA1c" (proveedor: FUJIREBIO Inc.,
Japan; fabricante: SRL, Inc., Japan).
El inmunoensayo de la presente invención permite
medidas simples, convenientes y rápidas de sustancias antigénicas en
muestras bajo análisis sin ninguna molestia de pretratamiento, por
lo que se facilita mucho el tratamiento paralelo de un número
considerable de muestras simultáneamente. Además, tales
procedimientos de ensayo se pueden aplicar adecuadamente a
instrumentos totalmente automatizados para análisis clínicos. Por
tanto, será posible automatizar etapas de medida y llevar a cabo
tratamientos en masa. Adicionalmente, de acuerdo con la presente
invención, existen ventajas no sólo en términos del ensayo por sí
mismo si no también de la manufactura de los reactivos. Así, en
general, en la manufactura de reactivos magnéticos de látex (látex a
los que se ha unido un antígeno, anticuerpo, etc), no siempre es
fácil preparar reactivos que tengan la misma calidad. Además, se
necesita la destreza para prevenir la agregación y la precipitación
durante el almacenamiento. En general, el coste de los materiales de
látex constituye meramente una parte minoritaria de los gastos en
reactivos de látex para diagnóstico, y la mayoría de los costes de
reactivos son atribuibles al coste de los materiales biológicos y a
los gastos requeridos para las etapas de recubrimiento de las
partículas de látex con dichos materiales biológicos. Respecto a
esto, de acuerdo con la presente invención, el portador magnético
insoluble (tal como látex) no es sustancialmente sensibilizado con
ningún antígeno ni con ningún anticuerpo, permitiendo por tanto la
utilización de portadores magnéticos insolubles disponibles
comercialmente (látex, etc) como reactivos de análisis por sí
mismos, sin ninguna modificación, con el resultado de que no será
esencial manufacturar de nuevo un "reactivo de látex". Además,
no se requerirá siempre que los anticuerpos de acuerdo con la
presente invención sean productos purificados y se reducirá también
la cantidad necesaria de ellos. Así, se facilita la producción de
reactivos de análisis y se obtienen muchas ventajas en cuanto a la
estabilidad de preservación.
Claims (11)
-
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1. Un inmunoensayo, que utiliza una partícula portadora insoluble, que comprende(i) utilización de una partícula portadora magnética insoluble en un estado sustancialmente libre de ningún antígeno y/o anticuerpo adsorbido.(ii) adsorción de una sustancia antigénica presente en una muestra bajo análisis sobre dicha partícula portadora magnética insoluble o la unión de una sustancia antigénica a dicha partícula portadora magnética insoluble.(iii) hacer reaccionar la partícula portadora magnética insoluble resultante del tratamiento anterior (ii) con un anticuerpo que es un anticuerpo marcado que es específicamente reactivo con una parte de dicha sustancia antigénica, siendo específicamente reactivo dicho anticuerpo con una forma de la sustancia antigénica en fase sólida, pero siendo sustancialmente no reactivo con una forma de la sustancia antigénica en estado nativo, en la que dicha forma de la sustancia antigénica en fase sólida está unida a dicha partícula portadora insoluble, y dicha sustancia en estado nativo está presente en la fase líquida, y(iv) medida, como indicador, del marcaje sobre el anticuerpo marcado resultante capturado por dicha sustancia antigénica en fase sólida. - 2. El inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho inmunoensayo comprende(A) adsorción de dicha sustancia antigénica presente en dicha muestra bajo análisis sobre dicha partícula portadora magnética insoluble o unión de dicha sustancia antigénica a la partícula portadora magnética insoluble, y.(B) hacer reaccionar posteriormente la sustancia antigénica capturada con dicho anticuerpo que es específicamente reactiva con la sustancia antigénica en fase sólida sin eliminar la muestra bajo análisis mencionada mediante lavado.
- 3. El inmunoensayo de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho inmunoensayo comprende(a) hacer reaccionar dicho anticuerpo marcado con la partícula portadora magnética insoluble a la que se ha adsorbido o unido dicha sustancia antigénica presente en dicha muestra bajo análisis,(b) separación posteriormente del anticuerpo marcado, que no ha reaccionado, de la partícula portadora magnética insoluble mediante la acción de un campo magnético, y(c) medida, como indicador, del marcaje sobre el anticuerpo marcado resultante capturado por dicha sustancia antigénica en fase sólida.
- 4. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es monoclonal.
- 5. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es policlonal.
- 6. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre partículas finas, en el que dicha partícula fina es sustancialmente insoluble en un medio acuoso e incluye una fase de material polímero orgánico y una fase de material magnético.
- 7. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre partículas finas, en el que dicha partícula fina comprende no sólo una fase de cubierta hecha de uno o más materiales polímeros orgánicos si no también una fase nuclear hecha de uno o más materiales magnéticos.
- 8. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre partículas de látex, en el que dicha partícula de látex tiente (a) un tamaño medio de partícula en el intervalo de 0,01 a 20 micrometros y (b) un núcleo hecho de uno o más materiales magnéticos.
- 9. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha partícula portadora magnética insoluble se selecciona entre partículas de látex, en el que dicha partícula de látex tiente un tamaño medio de partícula en el intervalo de 0,1 a 6 micrometro y un núcleo que incluye uno o más materiales magnéticos.
- 10. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho inmunoensayo se puede practicar de una forma automatizada desde el reparto de la muestra bajo análisis mencionada hasta la obtención de los resultados del análisis con un autoanalizador para química clínica adecuado para partículas magnéticas.
- 11. El inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la sustancia antigénica presente en la muestra bajo análisis es HbA1c.
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