ES2293736T3 - Ensayo de union a ligando y kit con una zona de separacion para analitos perturbadores. - Google Patents
Ensayo de union a ligando y kit con una zona de separacion para analitos perturbadores. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para determinar un analito en una muestra por medio de reacciones de unión, comprendiendo el método: i. aplicar la muestra en una zona de aplicación para muestra (ASZ) en una matriz de flujo en la que puede producirse un flujo de transporte de componentes presentes en la muestra, comprendiendo adicionalmente la matriz de flujo: a) opcionalmente una zona de aplicación (AR*Z) para un reactivo de unión R* que es analíticamente detectable, b) una zona de detección (DZ) que se localiza corriente abajo de ASZ y comprende un Capturador constituido por otro reactivo de unión firmemente anclado a la matriz y en el que se forma durante el método un complejo de señal que contiene el Capturador y el analito y/o R*, y ii. detectar el complejo de señal en la zona de detección, usándose la señal medida para determinar el analito, caracterizado porque la matriz de flujo comprende al menos una zona de separación (SZ) entre ASZ y DZ y porque la zona SZ presenta una estructura de ligando que tiene capacidad de unión por al menos un componente de muestra distinto del analito, que se transporta en la matriz y que puede afectar la señal medible si el componente se transporta hacia DZ, de manera que dicho al menos un componente sustancialmente no perturba la detección del analito DZ.
Description
Ensayo de unión a ligando y kit con una zona de
separación para analitos perturbadores.
La invención se refiere a un método para
determinar un analito en una muestra y a un kit para usar en el
método.
Partiendo de la técnica antecedente, el método
de la invención comprende las etapas:
i. La muestra se aplica en una zona de
aplicación de muestra (ASZ) en una matriz de flujo en la que puede
producirse el transporte de componentes presentes en la muestra
(flujo de transporte). La matriz de flujo comprende además:
- a)
- opcionalmente una zona de aplicación (AR*Z) para un reactivo de unión (Reactivo* = R*) que es analíticamente detectable,
- b)
- una zona de detección (DZ) que se localiza corriente abajo de ASZ y presenta otro reactivo de unión (Capturador) firmemente anclado a la matriz en la que se forma un complejo (complejo de señal) que contiene el Capturador y el analito y/o el Reactivo* en el método.
ii. Se permite que el flujo efectúe el
transporte de componentes de muestra.
iii. El complejo de señal se detecta en la zona
de detección y se usa la señal medida para la determinación del
analito.
La invención se refiere principalmente a la
matriz de flujo, que puede ser del mismo tipo que las que se han
usado anteriormente en, por ejemplo, inmunocromatografía, véase a
continuación.
Son reactivos de unión adecuados los que
participan en las denominadas reacciones de afinidad, especialmente
reacciones de afinidad bioespecíficas, y reacciones de unión
covalente, especialmente reacciones de intercambio entre grupos
tiol libre y disulfuro reactivo y otras reacciones entre
electrófilos débiles y nucleófilos débiles. Las reacciones de
afinidad bioespecíficas comunes son inmunoquímicas, es decir, entre
anticuerpo y antígeno o hapteno. Otros tipos de reacciones
bioafines son la reacción de hibridación entre ácidos nucleicos
complementarios (incluyendo oligonucleótidos), reacción entre
lectina y estructura de carbohidrato, entre estructura de
Ig(Fc) y proteína de unión a Ig(Fc), tal como
proteína A o proteína G, etc. Las reacciones bioafines incluyen la
reacción entre una biomolécula y un ligando/capturador preparado
sintéticamente.
Para el tipo de método en cuestión, se habla de
métodos no competitivos, por ejemplo la técnica de sándwich, y de
métodos competitivos. La técnica de sándwich significa habitualmente
que se forma un complejo analíticamente detectable en el que el
analito se une a dos homólogos bioafines, uno de los cuales es
analíticamente detectable y el otro es Capturador. En variantes
competitivas comunes, el analito y un análogo de analito
analíticamente detectable competirán por una cantidad limitante de
homólogo bioafín. Pueden mencionarse como ejemplos de dos variantes
competitivas los que usan: a) competición entre analito y análogo de
analito, que está marcado, por una cantidad limitante de ligando en
forma de Capturador firmemente anclado, y b) competición entre
analito y análogo de analito en forma de Capturador firmemente
anclado por una cantidad limitante de homólogo bioafín soluble y
analíticamente detectable.
Para información adicional sobre la metodología
usada anteriormente en el campo técnico de la invención, véanse los
documentos US-A-4.861.711
(Behringwerke), WO 88/08534 (Unilever),
US-A-5.120.643 y 4.740.468 (Abbott),
EP-A-284.232 y
US-A-4.855.240 (Becton Dickinson) y
WO 96/22532 (Pharmacia AB).
Compuestos que pueden competir por la unión a un
homólogo a través de una de las reacciones de unión mencionadas
anteriormente. Las heteroformas pueden ser isoformas de proteínas,
por ejemplo, isoenzimas, etc. Se incluyen dentro del término
heteroformas, entre otras, diferentes formas de complejos bioafines
que "se parecen" unos a otros de acuerdo con la definición
anterior. Son ejemplos inmunocomplejos en los que el antígeno es el
mismo pero el anticuerpo es de diferente clase/subclase. Véase
adicionalmente el apartado "Analito" a continuación.
Puede realizarse la determinación de si dos
compuestos son heteroformas entre sí mediante los denominados
ensayos de inhibición.
Los componentes de una muestra que pueden
afectar o influenciar la señal a detectar en DZ pueden dividirse en
dos grupos principales: a) el analito y b) componentes que perturban
directa o indirectamente la detección. Son componentes directamente
perturbadores los que interfieren con la señal como tal, por
ejemplo, componentes fluorescentes en suero en el caso de que el
complejo se vaya a detectar por fluorescencia. Son ejemplos de
componentes indirectamente perturbadores heteroformas con respecto
al Capturador y/o un reactivo bioafín R añadido (por ejemplo R*).
Pueden estar presentes otros componentes indirectamente
perturbadores, por ejemplo, anticuerpos heterófilos, en la muestra
original e interferir con la formación del complejo de señal en DZ.
En ciertas realizaciones de la invención, pueden actuar de manera
perturbadora los ligandos que se liberan de la zona de separación
de la invención (véase el Ejemplo 1).
Con frecuencia, los problemas con componentes
perturbadores en muestras han significado que, para analitos
presentes a bajas concentraciones, se realice la separación de
componentes perturbadores y la detección en sistemas
diferentes.
Un ejemplo en el que se ha realizado el análisis
después de la separación por intercambio iónico mediante sistemas
inmunológicos o mediante medición en línea de un grupo absorbente
(460 nm), es en la medición de transferrinas deficientes en
carbohidratos (CDT = CD-transferrina = asialo-,
monosialo- y disialo-transferrina). Cuando CDT está
presente a una concentración relativamente alta (10^{-9} M), son
posibles ambas alternativas de detección, pero a concentraciones
menores de analito, se requiere medición inmunológica. La separación
por cromatografía de intercambio iónico se controla por un equipo
avanzado y costoso, que requiere personal especialmente formado.
También son caros los ensayos inmunológicos tradicionales y
requieren personal bien formado.
Se ha descrito la técnica para medición
inmunológica en línea después de una fase de separación
cromatográfica en Afeyan et al. (Nature 358 (1992)
603-604) y en Irth et al. (Anal. Chem. 14
(1995) 355-361). Se han resumido sus dificultades
en Krull et al. (LC-GC 15 (7) (1997)
620-629).
El transporte de células completas en DZ puede
interferir con la señal del complejo de detección. Se conoce el uso
anteriormente de matrices de flujo en las que se capturan las
células mecánicamente (mediante filtración) en una
pre-zona más densa (Oudheusden et al., Ann.
Clin. Biochem. 28 (1991) 55-59).
El documento
EP-A-696.735 describe un sistema
inmunoanalítico cromatográfico en el que, para aumentar el intervalo
de medición para el analito, se ha inmovilizado una cantidad
predeterminada de anticuerpo de unión a analito en la zona de
aplicación de muestra, de manera que se retienen en ella cierta
cantidad de analitos.
El documento
EP-A-702.233 describe un sistema
inmunoanalítico cromatográfico en el que, de manera similar a la
descrita en el documento
EP-A-696.735, se consigue un efecto
de dilución de la muestra capturando cierta cantidad de analito
antes de que reaccione con reactivo marcado que posteriormente se
detecta en la zona de detección.
El documento WO 97/35205 describe una membrana
cromatográfica para inmunoanálisis que tiene (i) una zona para la
detección de reactivo de unión a analito marcado que no se haya
unido al analito, y (ii) una zona para la detección del complejo
entre reactivo de unión a analito y el analito. Las cantidades
relativas de reactivo de unión a analito no unido y de complejo
analito:reactivo proporcionan una medida de la cantidad de analito
en la muestra.
El documento WO 94/06012 describe un equipo de
ensayo analítico que tiene una zona de control negativa colocada
antes de la zona de detección de analito. La zona de control
negativa tiene la función de indicar la presencia en la muestra de
componentes que afectan la detección de analito de manera que se
vuelva poco fiable.
Un primer objeto principal de la invención es
generar un método simple y rápido que facilite la determinación de
un analito en presencia de componentes perturbadores. Un objeto
particular es evitar problemas con componentes perturbadores que
son solubles o que pueden suspenderse en medios líquidos de
interés.
Un segundo objeto principal de la invención es
generar determinaciones más rápidas y más simples de heteroformas
individuales o combinaciones de las mismas, especialmente
heteroformas, que presentan estructuras de péptidos, carbohidratos
o lípidos, incluyendo diversos tipos de compuestos biológicamente
activos. Se incluyen entre los lípidos esteroides y otras
sustancias solubles en grasa.
Un tercer objeto principal de la invención es
facilitar la medición de analitos en el intervalo de concentración
de < 10^{-7} M, particularmente de < 10^{-9} M,
especialmente para muestras que contienen heteroformas
perturbadoras del analito.
Un cuarto objeto principal de la invención es
simplificar la determinación de heteroformas individuales o de
combinaciones de las mismas en muestras originadas a partir de
materiales biológicos.
Un quinto objeto principal de la invención es
proporcionar evaluaciones más rápidas y más simples de bibliotecas
de compuestos, por ejemplo bibliotecas químicas, tales como
bibliotecas combinatorias.
Un subobjeto de los cuatro objetos principales
mencionados anteriormente es mejorar las posibilidades de realizar
determinaciones en el entorno de campo (habitualmente
semicuantitativamente) así como en laboratorios avanzados (con la
posibilidad de una cuantificación precisa).
Los objetos mencionados anteriormente pueden
alcanzarse con el método mencionado en la parte introductoria de
este documento, si la matriz de flujo contiene una o más zonas de
separación (SZ) entre ASZ y DZ, que permitirían que se
retrase/separe al menos un componente de muestra distinto del
analito capaz de influenciar la señal procedente del complejo de
señal en DZ. Esto debería producirse en SZ por medio de las
interacciones de ligando mencionadas a continuación, que pueden ser
reversibles o irreversibles. Si el componente no es un analito, el
retraso significa que el componente (o componentes) migran más
despacio que el analito por SZ o se unen irreversiblemente a SZ y,
de este modo, se evita que alcancen DZ de manera que la detección
del analito en DZ no se perturbe esencialmente por el componente (o
componentes) en cuestión. Habitualmente, esto significa que debería
haber una cantidad suficiente de ligando para sustancialmente todo
el componente o componentes perturbadores en la muestra afectada.
La expresión "sustancialmente todo" depende de las
concentraciones relativas del (de los) componente(s), pero
habitualmente significa que al menos el 90%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 95% y más preferiblemente al menos el 99%
del (de los) componente(s) perturbador(es) se retrasan
o capturan en la zona de separación.
La selección de la estructura retardante/ligando
en la zona de separación se determina por los componentes que se
retrasan. El retraso puede basarse en diversas interacciones más o
menos específicas entre la estructura de ligando y el (los)
componente(s) a retrasar; véase a continuación el apartado
"Zona de separación". Después de atravesar SZ, el analito
migrará con el flujo de transporte a la zona de detección (DZ), en
la que se forma un complejo que contiene el Capturador y el analito
y/o R*.
En los casos en los que se pretende retrasar uno
o más componentes perturbadores, se producirá la formación de
complejos de señal en ausencia de los mismos. La detección de
complejos señal en DZ puede tomarse como una medida cualitativa o
cuantitativa del analito.
Las Figuras 1-3 ilustran
diferentes variantes de matrices de flujo de acuerdo con la
invención.
La Figura 1 es una variante simple que tiene una
ASZ, una ARZ, una SZ y una DZ. ARZ y ASZ están separadas.
La Figura 2A difiere de la variante de la Figura
1 principalmente por tener cinco zonas de separación con el mismo
ligando. ARZ y ASZ están separadas.
La Figura 2B es la misma que la de la variante
de la Figura 2A excepto porque ARZ y ASZ coinciden.
La Figura 3 ilustra la variante de matriz de
flujo de la invención que se usa en el Ejemplo 1, con tres zonas de
separación, presentando dos zonas de las mismas (SZ1) un cierto
ligando y presentando una zona (SZ2) otro ligando. ASZ y ARZ (=
AR*Z) están separadas.
Se proporciona una descripción más detallada de
la Figura 1 en el apartado "Matriz y flujo de transporte", y
de las Figuras 2-3 en la introducción al Ejemplo 1.
Las matrices de flujo representadas por las Figuras
1-3 pueden tener, en principio, cualquiera de las
realizaciones geométricas descritas a continuación.
La matriz es del mismo tipo que las usadas
anteriormente en los denominados métodos de determinación
inmunocromatográfica (matriz de flujo) y define el espacio en el
que se transportan reactivos y componentes de muestra. Por lo
tanto, la matriz puede ser la superficie interna de un canal de
flujo individual (por ejemplo un capilar), la superficie interna de
una matriz porosa que tiene un sistema de penetración de canales de
flujo (matriz porosa), etc. La matriz puede estar en forma de
monolito, lámina, columna, membrana, canal(es) de flujo
separado(s), por ejemplo de dimensiones capilares, o
sistemas agregados de tales canales de flujo, etc. También pueden
estar en forma de partículas empaquetadas en cartuchos de columna o
en surcos cortados, fibras comprimidas, etc. Otra alternativa son
las denominadas nanocolumnas para cromatografía líquida, es decir,
placas de silicio o de cuarzo que tienen canales de aproximadamente
dos \mum o menos realizados por microlitografía (véase, por
ejemplo, He. B., et al. Anal. Chem. 1998, 70,
3790-3797). La superficie interna de la matriz, es
decir, la superficie de los canales de flujo, debe ser
suficientemente hidrófila para permitir que se transporte un medio
acuoso (principalmente agua) a través de la matriz, por medio de
fuerza capilar o por medio de aplicación de presión o de succión.
La dimensión interna más pequeña de los canales de flujo (para
canales redondos medida como diámetro) debe ser suficientemente
grande para permitir el transporte a través de la matriz de analito,
reactivos añadidos y componentes que interfieren en la zona de
detección y que deben retrasarse en SZ. La regla general es que
pueden seleccionarse matrices adecuadas de entre las que tienen
canales de flujo que tienen una dimensión interna más pequeña en el
intervalo de 0,1-1000 \mum, preferiblemente de
0,4-100 \mum si la matriz tiene un sistema de
canales de flujo comunicantes. Son principalmente de interés canales
de flujo que tienen su dimensión más pequeña en la parte superior
del amplio intervalo (de hasta 1000 \mum) para flujos impulsados
por presión/succión aplicada externamente.
Con frecuencia se construyen matrices adecuadas
a partir de un polímero, por ejemplo nitrocelulosa, poliéster,
polietersulfona, nailon, nitrato/acetato de celulosa, celulosa y
celulosa regenerada. De manera ventajosa, estas membranas pueden
proporcionarse con un fondo hermético de, por ejemplo,
poliéster.
El material de la matriz así como el diseño
físico y geométrico de los canales de flujo puede variar a lo largo
del flujo dependiendo del uso que se pretende de una cierta parte de
la matriz [documentos WO 96/22532 (Pharmacia AB); WO 94/15215
(Medix)]. La misma matriz puede comprender varios flujos de
transporte que sean paralelos o que se dirijan radialmente desde un
centro común, por ejemplo en forma de canales separados. En algunas
de las realizaciones más importantes, al menos la zona de detección
y las partes más adyacentes de la matriz deben ser de forma tal que
el flujo de transporte hacia dentro y hacia fuera de DZ pueda
producirse lateralmente en la matriz, es decir, que al menos esta
parte de la matriz esté en forma de una tira de membrana o placa
que tiene surcos cortados o similares.
Se describen diversas matrices de flujo que
pueden usarse en el tipo de ensayos en cuestión en publicaciones de
patentes anteriores. Véanse, por ejemplo, los documentos
US-A-4.861.711 (Behringwerke), WO
88/08534 (Unilever), US-A-5.120.643
y US-A.4.740.468 (Abbott),
EP-A-284.232 y
US-A-4.855.240 (Becton Dickinson);
WO 96/22532 (Pharmacia AB).
La realización más importante de la invención en
la fecha de prioridad se basa en el transporte de líquido en una
matriz de flujo que está en forma de, por ejemplo, una tira de
membrana (véase la Fig. 1). La tira está hecha de una matriz que
define un flujo de transporte (1) y se aplica sobre un fondo
hermético a líquidos (2) adecuado de plástico. En la matriz existe
una zona de aplicación de muestra (3, ASZ) y una zona de detección
(4, DZ) localizada corriente abajo de la misma. El flujo de
transporte es en la dirección de ASZ a DZ. Entre la zona de
aplicación de muestra (ASZ) y la zona de detección existe una zona
de separación (5, SZ). En el flujo de transporte pueden existir
también, si se requiere en la realización particular, zonas de
aplicación (6) para reactivos adicionales (R, por ejemplo R*, con
zona de aplicación ARZ, por ejemplo AR*Z). Entre dichas zonas
pueden existir zonas (7) cuya única función sea transportar
reactivos. La posición de una zona de aplicación ARZ (AR*Z) se
determina por el protocolo de ensayo a usar, y puede ser corriente
arriba o corriente abajo de o coincidente con ASZ. Para el caso en
el que ARZ (por ejemplo AR*Z) está corriente arriba de ASZ, puede
ser ventajoso que la adición de líquido en ASZ se produzca
sustancialmente al mismo tiempo que la adición de líquido en la
zona ARZ (AR*Z), localizada corriente arriba de la misma. Véase la
solicitud de patente internacional presentada anteriormente
PCT/SE98/02463 (incorporada como referencia en este documento). Para
ciertos tipos de protocolos de ensayo, ARZ (AR*Z) puede coincidir
con DZ.
En algunas realizaciones es ventajoso que se
predeposite un reactivo R, por ejemplo R*. Éste es especialmente el
caso si ARZ se localiza corriente abajo de ASZ y la variante de
protocolo de ensayo usada es simultánea, es decir, el reactivo R y
el analito migran hacia DZ sustancialmente al mismo tiempo.
En los casos en los que se desee usar variantes
que sean secuenciales en el sentido de que el analito deba
transportarse hacia DZ antes que el reactivo (R), R debería añadirse
después de que la muestra pase ARZ si la zona de aplicación para
reactivo (ARZ) está corriente abajo de ASZ. También pueden
conseguirse métodos secuenciales si ARZ está corriente arriba de
ASZ, en cuyo caso R opcionalmente puede predepositarse en ARZ.
En realizaciones alternativas, pueden migrar
reactivos (R), por ejemplo R*, hacia DZ en flujos de transporte
separados desde otra dirección distinta de la del flujo que
transporta al analito hacia DZ. Véase, por ejemplo, el documento
US-A-4.855.240 (Becton &
Dickinson).
En el mismo flujo de transporte pueden existir
varias zonas de detección que tienen por objeto diferentes analitos
o diferentes intervalos de concentración del mismo analito. Para el
caso de que los analitos sean diferentes, los Capturadores en las
respectivas DZ no deben presentar, por supuesto, ninguna reactividad
cruzada sustancial contra ninguno de los analitos.
El flujo de transporte desde ASZ a través de la
zona de separación (SZ) y adicionalmente hacia la zona de detección
(DZ) puede ser un flujo líquido impulsado por fuerza capilar. Cuando
sea necesario, la matriz de flujo puede presentar un depósito de
líquido (8) en forma de una matriz porosa que se empapa con líquido
de transporte y se aplica corriente arriba de ASZ y/o una matriz
porosa absorbente (9) localizada corriente abajo de DZ. El depósito
de líquido y la matriz absorbente ayudan a mantener el flujo. Puede
conseguirse también el flujo de líquido a través de la matriz por
medio de presión o de succión. Por lo tanto, la presión puede
ejercerse hidrostáticamente, por ejemplo, diseñando una parte de la
matriz como una minicolumna colocada verticalmente y con su salida
en comunicación líquida directa con una matriz de flujo localizada
horizontalmente. En la última forma, la parte localizada
horizontalmente de la matriz puede estar en forma de una
tira/membrana. Puede ser una alternativa para el transporte de
analito, reactivos y componentes perturbadores la aplicación de un
campo eléctrico a través de la matriz.
También pueden construirse secuencias de zonas
similares, como las de la Figura 1, para otros tipos de matrices de
flujo, por ejemplo tubos capilares y matrices en las que el flujo de
transporte puede ser en profundidad.
Pueden colocarse juntas una o más
matrices/flujos de transporte de acuerdo con lo anterior, por
ejemplo sobre un fondo común, opcionalmente con una barrera líquida
entre ellos. Opcionalmente, los flujos pueden tener una ASZ común,
una ARZ común (AR*Z), etc. Como norma, DZ es distinto para cada
flujo de transporte.
En las variantes mencionadas anteriormente,
pueden usarse matrices que tienen una zona de separación para
determinar una heteroforma (analito). Puede usarse una matriz sin
zona de separación para determinar todas las heteroformas del
analito que pueden estar presentes en la muestra de manera análoga a
la del analito. Combinando estos dos tipos de secuencias de zona,
pueden medirse fácilmente cantidades relativas así como absolutas
de analito en la muestra.
La zona de separación presenta un
ligando/estructura que tiene capacidad de unión por uno o más
componentes de muestra que perturbarían la detección en DZ. Un
rasgo característico es que se consigue la separación por medio de
algún tipo de reacción de unión específica/selectiva y no porque la
matriz proporcione en SZ un obstáculo mecánico para componentes
perturbadores (filtración). Los principios que sirven como guía para
la selección de ligando/estructura de separación/retardante,
especialmente con respecto a la especificidad, fuerza de unión
(afinidad) y cinética, son los mismos que en cromatografía de
afinidad, incluyendo cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía covalente y métodos analíticos bioespecíficos en los
que se usa tecnología de fase sólida para captura. Con respecto a
la fuerza de unión (afinidad, avidez) y cinética, el objeto
principal de las variantes preferidas de la presente invención es
retrasar componentes pertubadores en relación con el analito, de
manera que pueda producirse la detección en DZ sin la presencia de
estos componentes. En general, esto significa que los componentes
perturbadores deben retrasarse tan eficazmente como sea posible o
unirse tan fuerte y tan rápidamente como sea posible a la zona de
separación.
Los ligandos que hacen posible la separación en
SZ pueden ser posiblemente, por lo tanto, a) cargados (aniónicos,
catiónicos, anfóteros = ligandos de intercambio iónico),
anfóteros/anfífilos, bioafines, quelantes, contener azufre
(principalmente tioéter para la denominada afinidad tiófila), los
que permiten cromatografía covalente (disulfuro reactivo tal como
piridil disulfuro) o interacción \pi-\pi,
hidrófobos, etc.
La regla general es que la capacidad de unión
del ligando a uno o más componentes perturbadores a retrasar debe
ser más fuerte que la del analito. Esto se aplica a las condiciones
que se usan para la separación en SZ. Los factores que determinan
en qué medida tendrá éxito la separación son la longitud de la zona
de separación, densidad de ligando, disponibilidad de ligando,
temperatura, velocidad de flujo, tampón, fuerza iónica, pH,
etc.
Entre los ligandos de afinidad bioespecífica se
señalan principalmente los denominados inmunoligandos, es decir,
anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y
antígenos y haptenos. Otros ejemplos de ligandos de afinidad son
lectina (por ejemplo, lectinas de unión a ácido siálico); proteína
de unión a Ig(Fc) (tal como proteína A y G); ácido nucleico,
tal como oligo- o polinucleótido en forma sencilla o de doble
cadena, análogos de sustratos para enzimas, inhibidores de enzimas,
etc. Para ligandos de afinidad bioespecífica, la especificidad
puede dirigirse hacia uno o más sitios de unión sobre el(los)
componente(s) a retrasar. Los sitios de unión
correspondientes no deben estar disponibles en el mismo grado en el
analito (por lo que también se pretende el caso en el que ni
siquiera existan en forma no expuesta).
Los ligandos/estructuras en cuestión pueden
anclarse a la zona de separación, por unión covalente a la matriz,
mediante adsorción física o bioespecífica. Son ejemplos de esto
último la interacción entre biotina y estreptavidina, entre
anticuerpo muy afín y hapteno, etc. El anclaje a la matriz puede
producirse mediante un polímero u otro sustituyente que a su vez
lleva ligandos que se usan en la separación unidos covalentemente,
adsorbidos físicamente o bioespecíficamente. Otra posibilidad es la
deposición de partículas poliméricas que presentan un tipo deseado
de ligando. Las partículas pueden tener carácter hidrófilo o
hidrófobo y a ellas se habrá adsorbido o unido covalentemente un
compuesto que presenta la estructura de ligando. La técnica para
unir un ligando de separación a la matriz SZ puede seleccionarse
básicamente de la misma forma descrita anteriormente para el
Capturador en DZ. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente
internacional presentadas anteriormente PCT/SE98/02462,
PCT/SE98/02463 y PCT/SE98/02464, que se incorporan en este documento
como referencia con respecto a la introducción de Capturador en la
zona de detección. A este respecto puede mencionarse que existen
membranas disponibles en el mercado que tienen ligandos unidos
covalentemente, por ejemplo papel de DEAE (dietil aminoetil)
celulosa (DE81, Whatman International Ltd. Inglaterra).
El Capturador en la zona de detección puede
seleccionarse de acuerdo con las mismas normas que se aplican al
ligando en la zona de separación, con la salvedad de que la
capacidad de unión del Capturador debe dirigirse hacia el analito
y/o hacia el reactivo relacionado con el analito. Es ventajoso
seleccionar capturadores de alta afinidad con rápida cinética de
captura del ligando. Es principalmente de interés usar anticuerpos o
antígeno/hapteno para los que sea frecuente encontrar fácilmente
anticuerpos de alta afinidad.
Por reactivo relacionado con analito se entiende
un reactivo (R) que se añade y que cuando migra a través de DZ
puede unirse al Capturador en una cantidad que está relacionada con
la presencia de analito en la muestra. Son ejemplos de reactivos
relacionados con analito R* en forma de a) análogo de analito
marcado en métodos competitivos que usan competición para una
cantidad limitante de anticuerpo anti-analito unido
a fase sólida, y b) anticuerpo anti-analito soluble
marcado o no marcado en métodos que usan competición/inhibición
entre análogo de analito unido a fase sólida y analito para una
cantidad limitante de anticuerpo anti-analito en
forma disuelta.
El Capturador puede anclarse a la zona de
detección mediante una técnica análoga a la usada para unir el
ligando a la zona de separación.
Puede ser adecuado combinar un principio de
separación en la zona de separación con un principio de captura
diferente en la zona de detección, por ejemplo, cromatografía de
intercambio iónico para separación y adsorción inmunoquímica para
captura en DZ. En algunas situaciones puede ser práctico usar el
mismo principio para retrasar y capturar en las dos zonas (por
ejemplo, dos anticuerpos monoclonales que tengan diferentes
especificidades, véanse los Ejemplos).
Por analito se entiende el compuesto o
compuestos que se determinan cuantitativamente o cualitativamente.
Determinación cuantitativa se refiere a la medición de cantidades en
términos absolutos así como relativos. Determinación cualitativa de
un analito se refiere a detección de existencia o inexistencia de
algo (ensayo si/no) o propiedades cualitativas de un compuesto,
tales como capacidad de afinidad-unión a un cierto
ligando.
Por medición relativa se entiende que el valor
de medición obtenido es una proporción de la suma de una o más
heteroformas seleccionadas y de la suma de otra combinación de
heteroformas. Un ejemplo es la proporción de cantidad de analito y
de cantidad total de todas las heteroformas con respecto a un cierto
homólogo (cantidad total incluye la cantidad de analito).
La invención es aplicable a analitos que pueden
funcionar como reactivo de unión. Esto significa que el analito
puede ser básicamente cualquier sustancia para la que es posible
proporcionar un Capturador como se ha descrito anteriormente.
Pueden mencionarse como ejemplos específicos antígeno/hapteno,
enzima o anticuerpo o ácido nucleico que esté completamente o
parcialmente en forma de cadena sencilla. El analito puede presentar
estructura de aminoácido/péptido, carbohidrato o lípido.
Se obtienen ventajas particularmente importantes
para analitos que existen junto con heteroformas con respecto a
capacidad de unión al Capturador y/o a un reactivo R añadido, por
ejemplo R*. Esto se aplica particularmente a los casos en los que
el analito está en concentraciones de muestra que son de <
10^{-7} M, especialmente de < 10^{-9} M. Pueden mencionarse
como ejemplos de este tipo de heteroformas: a) compuestos que
difieren unos de otros en la carga, tales como isotransferrinas
con, por ejemplo, CDT como analito, isohemoglobinas con, por
ejemplo, HbA1c como analito; b) compuestos que difieren unos de
otros en ciertas partes de la estructura básica, tal como
aminoácidos adicionalmente insertados o escindidos (por ejemplo, por
degradación), o diferencias parciales en cadenas peptídicas; c)
compuestos que difieren unos de otros debido al hecho de que se han
añadido diferentes sustancias/estructuras a una estructura básica,
por ejemplo estructuras de carbohidratos unidas covalentemente; d)
macromoléculas constituidas por dos o más subunidades que se unen
entre sí en la macromolécula mediante enlaces no covalentes, tales
como enlaces bioafines entre receptor y ligando en complejos
receptor-ligando y entre antígeno y anticuerpo en
inmunocomplejos, o mediante puentes de cistina, por ejemplo entre
las cadenas de un anticuerpo.
Son ejemplos de usos potenciales/analitos:
a) El analito es una heteroforma que difiere de
otras heteroformas con respecto al contenido en carbohidratos
(glicosilación), por ejemplo, gliproteínas que tienen la misma parte
proteica o una parte proteica similar. Se conocen variaciones en
este tipo de heteroformas en varias patologías tales como cáncer,
inflamación y enfermedades hepáticas. (Turner G A,
"N-glycosylation of serum proteins in disease and
its investigation using lectins", Clin. Chim. Acta 208 (1992)
149-171; y Varki A, "Biological roles of
oligosaccharides: all of the theories correct", Glycobiology 3
(2) (1993) 97-130). Puede mencionarse
particularmente la medición de i) combinaciones de asialo-,
monosialo- y disialo-transferrina para las que puede
realizarse la separación mediante ligando de intercambio iónico y
también mediante ligando de lectina en SZ, y ii) HbA1c que puede
separarse por medio de ligando de intercambio iónico o de boronato.
También se conocen variaciones en los contenidos de carbohidratos
de proteínas en cambios biológicos normales, por ejemplo, durante el
ciclo menstrual y por diferencias en edad y sexo.
b) El grado de glicosilación de proteínas
recombinantes puede determinarse por medio de ligandos de
intercambio iónico, de lectina o de boronato en SZ. El analito será
en este caso la fracción de una proteína recombinante que no
contiene una estructura de carbohidrato que se une al ligando en SZ
y, de este modo, migra más rápidamente a través de SZ.
c) Pueden comprobarse proteínas recombinantes en
las que se ha insertado un asa de separación, por ejemplo, una
secuencia de histidina o una secuencia de unión a IgG, y en las que
la escisión total del asa es importante, después de la separación
en SZ por medio de un ligando quelante de metal o un ligando de
IgG(Fc), respectivamente. El analito será en este caso la
fracción de proteína recombinante de la cual se haya escindido la
secuencia de histidina o la secuencia de unión a IgG(Fc),
respectivamente.
d) Pueden separarse enzimas en su forma activa e
inactiva por medio de un ligando en SZ, que sea un análogo de
sustrato o un inhibidor de la enzima en cuestión. El analito será la
enzima inactiva.
e) Pueden separarse proteínas, péptidos u otras
biomoléculas que ejercen su función biológica por unión a un
receptor específico por medio de un ligando en SZ que es un receptor
para la biomolécula. El analito será la fracción de las moléculas
que carecen o que tienen una capacidad reducida de unión al
receptor.
f) Las proteínas (por ejemplo, IgE) pueden tener
autoanticuerpos (IgG, IgA, IgM) unidos a las mismas in vivo.
Estos autoanticuerpos dan lugar a, por un lado, una respuesta
diferente en la determinación inmunoquímica de la proteína, y, por
otro lado, una función/índice de renovación alterado. Usando
anticuerpos contra los autoanticuerpos en cuestión como ligando en
la zona de separación, pueden separarse autoanticuerpos en forma
libre y unida a inmunocomplejos y puede calcularse la cantidad de la
forma libre de la proteína (= analito, por ejemplo, de IgE).
g) Por medio de un anticuerpo monoclonal
dirigido contra un cierto sitio de unión de una proteína e
inmovilizado en SZ, puede detectarse la presencia de heteroformas
de la proteína que no presentan el sitio de unión (= analito)
mediante cuantificación en DZ.
h) Puede medirse la presencia de diferentes
sustancias unidas a proteínas de transporte, por ejemplo, un fármaco
unido a albúmina, usando ligandos adecuados en SZ. Pueden medirse
proteínas de transporte unidas o no a fármaco en DZ mediante la
selección de un ligando adecuado en SZ.
i) IgG e IgA en suero pueden tener una adsorción
aumentada a diferentes superficies en ciertas enfermedades
reumáticas o autoinmunes. Será posible medir la proporción de IgG e
IgA con propiedades de adsorción no alteradas (= analito) anclando
ligandos en la zona de separación que son capaces de unirse a IgG e
IgA con propiedades alteradas en DZ. Pueden medirse autoanticuerpos
específicos de clase IgG o IgA con mejor sensibilidad usando el
correspondiente autoantígeno/hapteno como capturador en DZ.
j) Muchos compuestos biológicamente activos (por
ejemplo, péptidos o esteroides) se transportan en el suero en forma
de complejos con proteínas de unión. Usando anticuerpos contra la
proteína de unión como ligando en SZ, puede determinarse
inmunoquímicamente la forma no unida a complejos (libre) de estos
compuestos (= analito) en la siguiente zona de detección. Son
ejemplos triyodotironina y tiroxina, que se transportan unidas a
globulina de unión a tiroxina (TBG) o a prealbúmina de unión a
tiroxina (TBPA). De manera análoga, pueden medirse formas libres de
estradiol y de testosterona que se transportan de forma unida con
globulina de unión a hormonas sexuales.
k) Puede determinarse con la invención la
capacidad de unión de un primer compuesto (= analito) por un segundo
compuesto. En esta realización, se puede tener el segundo compuesto
como ligando en SZ, y un Capturador con una capacidad de unión al
analito conocida en DZ. La captura/retraso en SZ será una medida de
la capacidad de unión del analito y puede medirse en DZ.
Esta realización de la invención puede ser
particularmente ventajosa en la exploración de diferentes
bibliotecas de compuestos con los miembros de bibliotecas como
ligandos en SZ (bibliotecas químicas, por ejemplo).
l) Pueden determinarse mediante la invención
isoformas de degradación de proteínas en las que se han escindido
aminoácidos. Por ejemplo, son marcadores cardiacos interesantes
isoformas de degradación de creatina quinasa (CK).
La detección y cuantificación de complejos de
señal puede realizarse por medio de un reactivo analíticamente
detectable (Reactivo* = R*). Para los casos en los que el analito
por sí mismo es detectable y forma parte de un complejo de señal,
puede producirse la detección y cuantificación sin usar R*.
R* es habitualmente un reactivo de afinidad
bioespecífica que está marcado con un grupo analíticamente
detectable, tal como un grupo enzimáticamente activo, grupo
radiactivo, grupo fluorescente, grupo cromógeno, hapteno, biotina,
partículas, etc. Los reactivos analíticamente detectables (R*)
también incluyen reactivos que por sí mismos tienen sitios de unión
o propiedades que pueden detectarse analíticamente cuando el
reactivo es parte del complejo de señal. Son ejemplos de tales
sitios de unión determinantes específicos de clase de Ig y de
subclase de Ig cuando el reactivo es un anticuerpo y se usa la
parte de unión a antígeno del mismo para formar el complejo en la
zona de detección.
Son formas habituales de reactivo analíticamente
marcado anticuerpo marcado y antígeno/hapteno marcado. El
anticuerpo marcado tiene su uso principal en
A) técnicas no competitivas, tales como técnica
de sándwich, en las que el capturador es
- a)
- un anticuerpo que se dirige contra el mismo antígeno (= analito) que el anticuerpo marcado, o
- b)
- un antígeno/hapteno, o
B) técnicas competitivas en las que la
competición tiene lugar entre un analito y un análogo de analito
unido a fase sólida para una cantidad limitante de anticuerpo
anti-analito y la detección de sitios libres u
ocupados en la fase sólida puede realizarse por medio de anticuerpo
anti-analito marcado y anticuerpo
anti-anti-analito,
respectivamente.
El antígeno/hapteno marcado tiene su uso
principal en
A) técnicas competitivas en las que se permite
que un antígeno/hapteno marcado compita con un antígeno/hapteno no
marcado por una cantidad limitante de anticuerpo (Capturador), o
B) técnicas de sándwich en las que se determina
anticuerpo específico de antígeno/hapteno con un
anti-anticuerpo como Capturador.
Son ejemplos de variantes de la invención en las
que no se utiliza un reactivo analíticamente detectable (R*)
aquellas en las que el analito por sí mismo es detectable cuando
forma parte del complejo en DZ. Esto se ilustra con enzima como
analito junto con un sustrato que proporciona un producto
analíticamente detectable, por ejemplo, un sustrato que proporciona
un producto coloreado o fluorescente que debería ser insoluble.
R* puede presentar, pero es necesario que no
presente capacidad de unión con los componentes perturbadores que
se separan en SZ. En la medida en que R* tiene capacidad de unión
por ellos, su zona de aplicación debe localizarse corriente abajo
de la zona de separación (SZ), a menos que se desee medir el nivel
de heteroformas perturbadoras por medio de la cantidad de unión de
R* a SZ.
Son un grupo marcador particularmente útil
partículas que opcionalmente contienen uno de los grupos detectables
mencionados anteriormente, tales como un grupo fluoróforo o un
grupo cromógeno (partículas fluorescentes y coloreadas,
respectivamente). Las partículas útiles tienen frecuentemente un
tamaño en el intervalo de 0,001 a 5 \mum, preferiblemente en el
intervalo de 0,05 a 5 \mum. Las partículas pueden tener
dimensiones coloidales, denominadas sol (es decir, habitualmente
esféricas y monodispersas que tienen un tamaño en el intervalo de
0,001 a 1 \mum). Pueden mencionarse especialmente partículas de
metales (por ejemplo, sol de oro), partículas no metálicas (por
ejemplo, SiO_{2}, carbono, látex y eritrocitos y bacterias
inactivadas). También se han usado partículas de dimensiones no
coloidales. Estas partículas eran más o menos irregulares y más o
menos polidispersas (por ejemplo, partículas de carbono < 1
\mum; Pharmacia AB, documento WO 96/22532).
Cuando las partículas son el grupo marcador en
la invención, el complejo en DZ puede detectarse con frecuencia
visualmente o mediante un equipo de medición óptica (por ejemplo,
una cámara CCD acoplada a un ordenador con software especial para
el análisis de imágenes o un escáner láser).
En relación con las partículas como grupo
marcador, véanse los documentos WO 88/08534 (Unilever);
US-A-5.120.643 (Abbott);
EP-A-284.232 (Becton Dickinson) y
otros.
La invención se refiere principalmente a
muestras biológicas, por ejemplo, sangre (suero, plasma, sangre
completa), saliva, fluido lagrimal, orina, fluido cerebroespinal,
sudor, etc. La invención también es aplicable a otras muestras,
tales como soluciones de fermentación, mezclas de reacción,
soluciones que contienen una cierta proteína para la que se quiere
examinar su capacidad de unión a un ligando en SZ, etc. Véase el
apartado anterior "Analitos". Puede ser particularmente
interesante usar la invención para el análisis de muestras
medioambientales.
Además del método, la invención también se
refiere a un equipo y a un kit, respectivamente, que contiene la
matriz de flujo definida anteriormente.
Las invenciones descritas en las solicitudes
internacionales mencionadas anteriormente WO 99/36780, WO 99/
36776 y WO 99/36777 pueden constituir, en partes importantes, realizaciones preferidas de la presente invención.
36776 y WO 99/36777 pueden constituir, en partes importantes, realizaciones preferidas de la presente invención.
En las Figuras 2A, 2B y 3 se indica la dirección
del flujo de transporte mediante una flecha (10). En cada variante
puede existir una zona ASZ (11) para la muestra al principio el
flujo de transporte, corriente abajo de la misma una zona DZ (12),
al final del flujo de transporte una parte absorbente (13), y entre
cada tipo de zona, partes que sólo sirven como zonas de transporte
(14).
Figura 2A: La variante de acuerdo con esta
figura tiene cinco zonas de separación (SZ) en las que el ligando
puede ser el mismo o diferente o estar presente en diferentes
cantidades (15-19) y una AR*Z (20) para
reactivos.
Figura 2B: Ésta es la misma secuencia de zonas
que en la Figura 2A, excepto porque ASZ (11) y AR*Z (20) coinciden
(21). Esta secuencia de zonas puede usarse también para los casos en
los que el analito por sí mismo es detectable cuando forma parte de
un complejo de señal en DZ. Entonces, AR*Z no es necesaria.
Figura 3: La secuencia de zonas de acuerdo con
esta figura presenta dos tipos de zonas de separación SZ1 (22, 23)
y SZ2 (24), respectivamente, y una zona AR*Z separada (25) corriente
abajo de SZ1 (23) y SZ2 (24).
Antecedentes: Puede ser interesante medir
IgE libre y complejo de IgE unida a autoanticuerpo (IgA, IgE e IgM).
Por encima de todo, sin embargo, la IgE libre debe cuantificarse
correctamente. En los ensayos actuales para medición de IgE, los
autoanticuerpos pueden unirse a los mismos epítopos en IgE que los
anticuerpos de reacción (anticuerpo anti-IgE) y
esto puede dar lugar a niveles totales de IgE falsamente demasiado
bajos que varían dependiendo del diseño del ensayo. Puede
detectarse IgE libre separando IgG, IgM e IgA antes de la medición
de IgE. La cantidad de autoanticuerpos debe cuantificarse también
tanto en forma de complejos como en forma de anticuerpos IgG libres
dirigidos contra IgE.
Los ensayos más comunes miden anticuerpos libres
por métodos que usan IgE unida a una fase sólida (que se
corresponde con DZ) con la que se permite que interactúe una muestra
de suero muy diluida. Si la muestra de suero contiene anticuerpo
anti-IgE, este último se une a la fase sólida
formando un inmunocomplejo. Después de retirar mediante lavado los
componentes del suero no unidos, se añade anticuerpo
anti-IgG que está marcado (R*), por ejemplo, con
enzima. Se retira el exceso de anticuerpo marcado (R*) y se
determina la cantidad de anticuerpo anti-IgG
marcado con enzima (R*) unido al inmunocomplejo inmovilizado
mediante la adición de un sustrato adecuado. La sensibilidad de
estos ensayos está limitada por la unión inespecífica de IgG a la
fase sólida. La parte específica de IgE de la población de IgG es
generalmente muy pequeña y puede ser difícil de distinguir de la
cantidad de IgG unida inespecíficamente. Esta limitación puede
salvarse capturando IgG en la fase sólida y midiendo la unión de
IgE.
Cuando se mide IgE unida a complejo de IgG, IgG
se captura en una fase sólida s (que se corresponde con DZ)
que contiene anticuerpo anti-IgG unido
covalentemente (Capturador). Puede medirse la cantidad de IgE unida
a complejo añadiendo anticuerpo anti-IgE marcado
(R*).
El uso de una técnica de inmunoensayo basada en
transporte lateral de líquido en membranas como se ha descrito
anteriormente, en la que el flujo pasa primero a través de una o más
zonas de separación (SZ) y después por una zona de detección (DZ),
abre muchas posibilidades para la medición simple de parámetros
relacionados con IgE-IgG. Si, por ejemplo, se hace
pasar una muestra que contiene una mezcla de IgE libre y de IgE
unida a un anticuerpo anti-IgE humana de clase IgG
primero a través de una zona que contiene anticuerpo
anti-IgG humana unido a fase sólida (Ligando en SZ)
y después por una zona que contiene anticuerpo
anti-IgE unido a fase sólida (Capturador en DZ), el
complejo entre IgE y anticuerpo anti-IgE de clase
IgG contenido en la muestra se unirá en la zona de separación
mientras que la IgE libre pasa hacia la zona de detección, en la que
se determina añadiendo anticuerpo anti-IgE marcado
(R*), corriente arriba de la zona de detección (12) pero corriente
abajo de las zonas de separación (15-19) para pasar
solamente a través de la zona de detección (adición en la zona 20
en la Fig. 2A). Haciendo que también el anticuerpo
anti-IgE (R*) pase a través de la zona de
separación, puede determinarse también la cantidad de complejo
IgE-IgG capturado en la zona de separación por unión
a IgG anti-humana (Ligando) (ASZ y AR*Z coinciden)
(adición en la zona 21 en la Fig. 2B, ASZ común con AR*Z). En la
zona de separación existen también, además del complejo entre IgE y
anticuerpo anti-IgE de clase IgG, anticuerpos
libres contra IgE. Puede determinarse la cantidad de estos últimos
haciendo pasar IgE marcada (R*_{1}) a través de la zona de
separación. Después, en un ensayo separado, se añade IgE marcada
(R*_{1}) en la tira de membrana corriente arriba de SZ. Véase la
Figura 2B.
Cuando la cantidad de IgG es muy alta en el
suero, deben usarse como SZ varias bandas con altas concentraciones
de anti-IgG. Después, se distribuirán anticuerpos
anti-IgE tanto unidos a complejo como libres por
encima de varias bandas debido a la cantidad total de IgG, y la
suma de las intensidades de señal de estas bandas dará la cantidad
de anticuerpos contra IgE.
En el ejemplo a continuación, se demuestra el
principio de ensayo de complejos de IgE e IgG preparados
artificialmente. Se han generado los complejos con anticuerpos
monoclonales contra IgE y, por lo tanto, se han unido anticuerpos
contra IgG de ratón a la membrana de separación. En el sistema de
detección, se han usado anticuerpos contra IgE dirigidos contra
otros epítopos distintos de los de anticuerpos que forman complejos.
Esto hace posible medir el complejo igual de bien que la IgE libre
en el sistema de detección.
Membrana de separación 1 (SZ1): Se
asociaron anticuerpos de oveja anti-IgG(Fc)
de ratón (Ligando 1) con partículas de aldehído de poliestireno
(0,29 \mum de diámetro, IDC, Portland, Oregon, Estados Unidos)
mezclando 1,0 mg/ml de anticuerpos y 20 mg/ml de partículas de
aldehído de poliestireno en tampón fosfato 25 mM, pH 6,6, a +4ºC
durante 20 horas. Se lavaron las partículas en tampón borato 20 mM,
pH 8,6, y se hicieron reaccionar con 15 mg de NaCNBH_{3}
(Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemania) por 50
mg de partículas durante 20 horas. Después, las partículas se
lavaron en tampón borato 20 mM, pH 8,6, mediante suspensión,
centrifugación y decantación repetidas. La suspensión de partículas
se diluyó en trehalosa al 3%, tampón borato 20 mM, a 25 mg de
partículas/ml. La suspensión diluida se pulverizó sobre tiras (20
cm x 3 cm) de membranas de nitrocelulosa (nitrocelulosa sobre
poliéster, 5 \mum de tamaño de poro, Whatman International Ltd.,
Inglaterra) en dos líneas de 0,3 cm de ancho que eran paralelas a
los lados largos de las tiras. El equipo de pulverización (IVEK
linear striper, IVEK Corporation, Vermont, Estados Unidos) depositó
aproximadamente 50 \mug de partículas de poliestireno/cm por cada
línea. Se secaron las membranas a temperatura ambiente y después se
cortaron en trozos más pequeños (0,5 cm x 3 cm).
Membrana de separación 2 (SZ2): Se diluyó
IgG de ratón (Ligando 2) en tampón borato 20 mM a 3,4 mg de
proteína/ml. El anticuerpo se pulverizó diluido sobre tiras (20 cm
x 4 cm) de membranas de nitrocelulosa (del mismo tipo que las
anteriores) en una línea de 0,3 cm de ancho (equipo de pulverización
como anteriormente) con aproximadamente 6,8 \mug de
anticuerpos/cm. Las membranas se secaron a temperatura ambiente y
después se cortaron en trozos más pequeños (0,5 cm x 1 cm).
\newpage
Membrana de detección (DZ): Se diluyó
anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgE (dirigido
contra el dominio 4 de IgE, Capturador) en tampón borato 20 mM a
1,0 mg de proteína/ml. El anticuerpo diluido se pulverizó sobre
tiras (20 cm x 4 cm) de membranas de nitrocelulosa (del mismo tipo
que las anteriores) en una línea de 0,15 de ancho (equipo de
pulverización como anteriormente) con aproximadamente 1 \mug de
anticuerpos/cm. Las membranas se secaron a temperatura ambiente y
después se cortaron en trozos más pequeños (0,5 cm x 4 cm) de
manera que la línea con anticuerpo fuera paralela a un lado
corto.
Membrana de combinación: Véase la Figura
3. Se montó un trozo de membrana de separación 1 (0,5 cm x 3 cm,
SZ1, 22 y 23, respectivamente, en la Figura 3) con un trozo de
membrana de separación 2 (0,5 cm x 1 cm, SZ2, 24 en la Figura 3) y
la membrana de separación combinada obtenida se unió a su vez con
una tira de la membrana de detección (0,5 cm x 4 cm, la línea = DZ
= 12 en la Figura 3) (lado corto hacia lado corto con un espacio
entre ellos). Los trozos se mantuvieron juntos por su lado inferior
mediante cinta adhesiva. En el lado superior se colocaron trozos de
nitrocelulosa (0,5 cm x 0,3 cm) (A100, 12 \mum, Schleicher and
Schull, Dassel, Alemania) que solapaban algo con los dos lados
cortos adyacentes. Estos últimos trozos se mantuvieron en su lugar
mediante más cinta adhesiva. Se montó un filtro de celulosa (13 en
la Figura 3) (0,5 cm x 2 cm; GB 004, Schleicher and Schull, Dassel,
Alemania) que solapaba con el lado corto libre de la membrana de
detección, como una membrana absorbente. La secuencia de las zonas
era ASZ, SZ1, SZ2 y DZ.
Suspensión de carbono (solución madre):
Se suspendieron 2 g de partículas de carbono (sp 100, Degussa,
Alemania) en 200 ml de tampón borato 5 mM, pH 8,4, y se sonicaron
(VibraCell 600 W, sonda de 1,5 cm, Soniced Materials, Danebury,
Connecticut, Estados Unidos) en un baño de hielo durante 3 x 5
minutos al 100% de amplitud y con pulsos de 9,9 + 2 segundos.
Conjugado de partículas de carbono (R*):
Se mezclaron 35 \mug/ml de Fab'2 de anticuerpo monoclonal
anti-IgE (dirigido contra el dominio 3 en IgE) y
una suspensión de partículas de carbono (250 \mug/ml) durante 3
horas. Se añadió albúmina de suero bovino (BSA) al 1% y las
partículas se mezclaron durante otros 30 minutos y después se
lavaron mediante centrifugación en BSA al 1% (tampón borato 0,1 M,
pH 8,5, NaN_{3} al 0,05%) y se diluyeron a 0,8 mg de carbono/ml
en el tampón de lavado. El conjugado de partículas de carbono
preparado se almacenó a +4ºC en el tampón de lavado.
Preparación del complejo entre IgE e IgG:
Se hicieron reaccionar 1 mg de IgE (ND)/ml y 5 mg/ml de anticuerpo
monoclonal de ratón anti-IgE (de clase IgG y
dirigido contra el dominio 2) en tampón fosfato 50 mM, pH 7,5,
durante 2,75 horas a temperatura ambiente. Se separó la mezcla de
muestra (0,35 ml) en Superdex^{TM} 200 prep grade 16/60 (Amerxham
Pharmacia Biotech AB, Suecia). La separación dio dos picos de
complejos discernibles, un pico se correspondía con
IgE-IgG y otro pico se correspondía con
IgG-IgE-IgG.
Membrana de separación 1 (Ligando =
anti-IgG de ratón): Se marcaron anticuerpo de
ratón anti-IgE (contra el dominio 2 de IgE) e IgE
con ^{125}I (Cloramina T) hasta un grado de marcado de 0,03 para
anticuerpo anti-IgE y de 1,5 para IgE. Las
proteínas marcadas se diluyeron en BSA al 6% (tampón fosfato 50 mM,
pH 7,5): anticuerpo anti-IgE a aproximadamente 2,4
\mug/ml e IgE a 0,06 \mug/ml. Se mezcló anticuerpo
^{125}I-anti-IgE (dominio 2) con
anticuerpo anti-IgE no marcado (contra el dominio 2)
para medir niveles mayores de anticuerpo anti-IgE.
Se unió una membrana absorbente (0,5 cm x 2 cm, GB004, Schleicher
and Schuell, Dassel, Alemania) con cinta adhesiva a un extremo de
un trozo de membrana de separación 1 (0,5 cm x 4 cm) con anticuerpo
de oveja anti-IgG(Fc) de ratón adsorbido. Se
aplicaron 10 \mul de tampón borato 0,1 M, pH 8,5 (BSA al 6%,
NaN_{3} al 0,05%), seguido de 10 \mul de una solución de
^{125}I-proteína en el extremo libre de la
membrana de separación. Después, se inició el flujo lateral
mediante la adición de 4 x 10 \mul de tampón borato 0,1 M, pH 8,5
(BSA al 1%, NaN_{3} al 0,05%) en el extremo libre. Después de que
todo el líquido hubiera migrado hacia la membrana, se cortó en
trocitos para medir la radiactividad en las diferentes zonas de la
lámina (zonas de separación y de transporte). Se realizó la
medición en un contador gamma, y se calculó la proporción de
^{125}I-proteína (anticuerpo
anti-IgE marcado e IgE marcada, respectivamente) que
había sido capturada en diferentes zonas, después de realizar la
corrección para la cantidad de iodina radiactiva libre. No se unió
más IgE a las zonas de separación en las que el ligando era el
anticuerpo anti-IgG que a las zonas de transporte
intermedias. Más del 85% de la IgE pasó a través de la membrana.
Por otro lado, todo el anticuerpo anti-IgE marcado
se unió a las dos zonas de separación cuando se añadieron hasta 120
ng de anticuerpo anti-IgE. Cuando se añadieron 1000
ng de anticuerpo anti-IgE, 200 ng se unieron en cada
zona de anti-IgG de ratón (zona de separación) y
500 ng pasaron. Para IgG en suero humano esta capacidad puede ser
suficiente si el suero se diluye 1/100 (aproximadamente 1000 ng de
IgG) y se usa más anticuerpo anti-IgG (contra IgG
humana) como ligando firmemente anclado.
Membrana de separación 2 (Ligando = IgG de
ratón): Se introdujo esta membrana para unir cualquier
anticuerpo anti-IgG de ratón que pudiera haberse
liberado de la membrana de separación 1 y que, de otro modo, se
uniría a la zona de detección dando lugar a una señal de fondo
aumentada (el anticuerpo anti-IgG de ratón tiene dos
partes Fab y puede, por lo tanto, unirse simultáneamente a R* y al
Capturador ya que ambos son IgG de ratón). La cantidad de
anticuerpo de oveja anti-IgG que se liberó pudo
unirse ventajosamente con una zona de separación que contenía IgG
de ratón antes de la zona de detección. Por medio de esta zona de
captura (SZ2), pudo reducirse en más de 6 veces la unión
inespecífica en la zona de detección.
Se aplicaron 20 \mul de tampón de lavado (BSA
al 1%, NaCl al 0,9%, Tween 20 al 1%, tampón borato 0,1 M, pH 8,4,
NaN_{3} al 0,05%) en el borde del extremo libre (ASZ = 11 en la
Figura 3) de la membrana de separación 1 en una tira de combinación
de acuerdo con lo anterior (Secuencia SZ1, SZ2 y DZ). Después, se
añadieron 10 \mul de patrón de IgE (IgE, 4-500
kU/l, 0,01-1,2 \mug/ml) y de muestra (complejo
IgE-IgG con aproximadamente 1 \mug de complejo/ml
y complejo IgG-IgE-IgG con
aproximadamente 1,3 \mug de complejo/ml), respectivamente. Tanto
la muestra como el patrón se diluyeron en tampón fosfato 50 mM, pH
7,5, que contenía BSA al 6% y NaN_{3} al 0,05%. Se inició un
flujo lateral colocando una esponja de celulosa de 0,6 cm x 0,6 cm x
0,3 cm que contenía tampón de lavado, tampón borato 0,1 M, pH 8,4
(BSA al 1%, NaCl al 0,9 %, Tween 20 al 1%, NaN_{3} al 0,05%) en
el extremo libre de la parte de separación de la tira. La solución
de ensayo migró a través de las zonas de separación (22, 23 y 24 en
la Figura 3) y de la zona de detección (12 en la Figura 3) y hacia
la esponja de celulosa absorbente (13 en la Figura 3). Después de 7
minutos de flujo, se añadieron 10 \mul de conjugado (R*) de
partículas de carbono y anticuerpo anti-IgE (0,8 mg
de carbono/ml en tampón borato 0,1 M, pH 8,4 (BSA al 1%, NaN_{3}
al 0,05%) en la posición entre la zona de detección y la parte de
separación (25) de la tira. Después de otros 5 minutos de flujo, se
coloreó la zona de detección de gris a negro. Se leyó el
oscurecimiento en un escáner de láser (Ultroscan, Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), se calculó la intensidad
máxima y se determinó la concentración leyendo con respecto a la
curva patrón de IgE. Cuando mayor la concentración de IgE, más
oscura la señal.
A modo de comparación, se evaluaron de la misma
manera tiras en las que se había reemplazado la zona de separación
1 por nitrocelulosa sin ligando (tanto patrón como muestra).
Los patrones (IgE) dieron la misma intensidad en
la curva de oscurecimiento en ambos sistemas de medición. Se
detectaron los complejos (IgE-IgG e
IgG-IgE-IgG) mediante una fuerte
señal negra en DZ cuando SZ 1 se había reemplazado por
nitrocelulosa sin ligando. Cuando SZ1 contenía
anti-IgG de ratón como ligando, no pudo detectarse
señal alguna en DZ para los complejos.
La zona de separación con
anti-IgG de ratón capturó, por lo tanto, más del 97%
de los complejos.
Membrana de separación que tiene propiedades
de intercambio aniónico: Se colocó una lámina de membrana de
nitrocelulosa (5 \mum, nitrocelulosa sobre poliéster, Whatman
International Ltd, England) en una solución de polietilenimina al
0,1% (PEI, Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) en agua ultrapura
(Milli Q, Millipore Corp., Berford, MA, Estados Unidos). Se agitó
la solución durante 3 horas y después de colocó en Tween 20 al 0,1%
durante 30 minutos, se secó al aire y después se almacenó en una
bolsa de plástico a +4ºC. Se revisó el grado de modificación de la
membrana con azul de bromofenol (pK = 4,1).
La función de membranas modificadas de
interactuar con proteínas cargadas se confirmó transportando
proteínas marcadas con ^{125}I (albúmina de suero bovino,
tetrasialo- y asialo-transferrina que se habían
marcado por el método de cloramina T) en un flujo lateral de
líquido en tiras de la lámina. La proteína que tenía el pI más alto
tenía la mayor tendencia a migrar con el flujo de líquido. Si el
líquido, en ensayos diferentes, contenía una concentración
creciente de NaCl (0-1000 mM), afectaba más al
índice de migración de las proteínas que tenían los menores pI.
Estos dos controles de función apoyan el hecho de que se hayan
introducido grupos cargados positivamente en el tratamiento con
polietilenimina, y que estos grupos pueden funcionar como grupos de
intercambio iónico con respecto a proteína y NaCl.
Membrana de detección: Se asociaron
anticuerpos monoclonales anti-transferrina con
partículas de aldehído de poliestireno (0,29 \mum de diámetro,
IDC, Portland, Oregon, Estados Unidos) mezclando 1,3 mg/ml de
anticuerpo y 22 mg/ml de partículas de aldehído de poliestireno en
tampón fosfato 25 mM, pH 6,6 a +4ºC durante 18 horas. Se lavaron
las partículas en tampón borato 20 mM, pH 8,4 y se hicieron
reaccionar con 5 mg de NaCNBH_{3} (Sigma-Aldrich
Chemie, GmbH, Steinheim, Alemania) por 40 mg de partículas por ml
durante 18 horas. Las partículas se lavaron en tampón borato 20 mM,
pH 8,6, y se diluyeron en tampón borato 20 mM que contenía trehalosa
al 6% a 14 mg de partículas/ml. La suspensión diluida se pulverizó
sobre tiras (20 cm x 4 cm) de membranas de nitrocelulosa (5 \mum,
nitrocelulosa sobre refuerzo de poliéster, Whatman International
Ltd, Inglaterra) en una línea de 1,4 mm de ancho en el centro de la
tira y en paralelo con el lado largo de la tira. El equipo de
pulverización era el mismo que en el Ejemplo 1 y ahora se
depositaron 14 \mug de partículas de poliestireno/cm. Las
membranas se secaron a temperatura ambiente y se almacenaron en una
bolsa de plástico a +4ºC.
Membrana de combinación: Véase la Figura
1. Se montó el extremo de una tira de la membrana de separación (0,5
cm x 3 cm) (= SZ = 5 en la Figura 1) mediante cinta adhesiva en el
lado inferior del extremo de una tira de la membrana de detección
que se había acortado en 0,5 cm (0,5 cm x 3,5 cm., la línea con
anticuerpo = DZ = 4 en la Figura 1). El espacio entre los extremos
se cubrió superponiendo un trozo de membrana de nitrocelulosa (0,3
cm x 0,5 cm, A100, 12 \mum, Schleicher and Schuell, Dassel,
Alemania) que se mantuvo unido con cinta adhesiva. Se montó una
membrana absorbente (9 en la Figura 1), un filtro de celulosa (0,5
cm x 2 cm, GB 004, Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania)
mediante cinta adhesiva de manera que solapaba con el extremo libre
de la tira derivada de la membrana detección.
Suspensión de carbono (solución madre):
Se suspendieron 2 g de partículas de carbono (sp 4, Degussa,
Alemania) en 100 ml de tampón borato 5 mM, pH 8,4, y se sonicaron
con el mismo equipo que en el Ejemplo 1 en un baño de hielo durante
5 minutos al 100% de amplitud y con pulsos de 5 + 5 segundos.
Conjugado de partículas de carbono: Se
mezclaron 100 \mug/ml de anticuerpo monoclonal
anti-transferrina y suspensión de carbono (250
\mug/ml) durante 2 horas. Se añadió BSA al 1% y se mezclaron las
partículas durante otros 30 minutos y después se lavaron mediante
centrifugación en tampón borato 0,1 M, pH 8,5 (que contenía BSA al
1% y NaN_{3} al 0,05%) y se diluyeron a 1,9 mg de carbono/ml con
tampón de lavado. Se almacenó el conjugado de partícula de carbono
preparado a +4ºC en tampón de lavado.
Tetrasialo-transferrrina:
Se aisló tetrasialo-transferrina a partir de una
preparación de transferrina humana saturada con hierro
(principalmente tetrasialo-transferrina) por
cromatografía de intercambio iónico en Mono Q (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Suecia).
Asialo-transferrina: Se
trató una preparación de transferrina saturada con hierro (Sigma, St
Louis, MO, Estados Unidos) con neuramidasa (Behringwerke, Marburg,
Alemania), después de lo cual se aisló la
asialo-transferrina por cromatografía de
intercambio iónico en Mono Q (Amersham Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Suecia).
Puntos isoeléctricos (pI): Estos valores
se determinaron para la preparación de isoforma respectiva y para
BSA mediante enfoque isoeléctrico en Phast System (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Forma asialo pI = 5,7,
forma tetrasialo pI = 5,3 y albúmina de suero bovino pI = 4,7.
Patrón de transferrina: Se preparó asialo
transferrina como anteriormente diluyendo en
BIS-TRIS 20 mM a pH 6,3 que contenía BSA al 0,2%,
Tween 20 al 0,1%, citrato de Fe^{3+} 0,1 mM, NaHCO_{3} 1 mM y
NaN_{3} al 0,05% a concentraciones de 0,07-16,6
\mug de transferrina/ml y se usó como patrón.
Muestras de suero: Se diluyeron 11
muestras de suero y 6 controles de suero 1/50 en
BIS-TRIS 20 mM a pH 6,3 que contenía gammaglobulina
bovina al 0,1% (Sigma, St. Louis, Estados Unidos), Tween 20 al 0,1%,
citrato de Fe^{3+} 0,1 mM, NaHCO_{3} 1 mM y NaN_{3} al 0,05%.
Se analizaron previamente las muestras de suero con respecto a CDT
mediante CDTect (Pharmacia & Upjohn Diagnostics AB, Uppsala,
Suecia). CDTect mide CD-transferrina.
Protocolo convencional para separación
combinada y determinación inmunoquímica: Se aplicaron 2 \mul
de muestra (dilución seriada de transferrina y muestras de suero
diluidas, respectivamente) a 1 cm del borde (ASZ = 3 en la Figura
1) del extremo libre de la parte de membrana con zona de separación
en una tira de combinación de acuerdo con lo anterior. Se inició un
flujo de líquido lateral colocando una esponja de celulosa de 0,6
cm x 0,6 cm x 0,3 cm (8 en la Figura 1) empapada con tampón
BIS-TRIS 20 mM, pH 6,5, que contenía NaCl 15 mM y
Tween 20 al 0,1% en el extremo libre de la zona de separación. En la
zona de separación (5 en la Figura 1), el analito
(CD-transferrina) y sus heteroformas (otras
transferrinas) se atraen por cargas positivas firmemente ancladas
en la zona (Ligando introducido en el tratamiento PEI) de manera que
atraen más a una heteroforma que tiene una carga negativa mayor
(otras transferrinas) que a una heteroforma que tiene una carga
negativa menor (CD-transferrina), es decir, las
CD-transferrinas migran más fácilmente con el flujo
de líquido que las trisialo-, tetrasialo-, pentasialo-, etc.
transferrinas. Durante su migración a través de la combinación
tira/matriz, una cierta proporción de la cantidad total de
transferrina será capaz, por lo tanto, de unirse al anticuerpo
anti-transferrina (Capturador) en la zona de
detección (DZ = 4 en la Figura 1). Después de 4 minutos de flujo,
se añadieron 5 \mul de conjugado (R*) entre partículas de carbono
y anticuerpo anti-transferrina (1,8 mg de
carbono/ml en tampón borato 0,1 M, pH 8,4, que contenía trehalosa al
30%, Tween 20 al 1%, BSA al 1%, NaN_{3} al 0,05%) entre la zona
de separación y la zona de detección (en la zona (6) en la Figura 1
(= AR*Z)). Después de otros 5 minutos, se detuvo el flujo y se leyó
el oscurecimiento en la zona de detección con un escáner de láser
(Ultroscan, Amersham Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Suecia) y se
calculó la concentración leyendo con respecto a los valores de
medición para las diluciones seriadas de
asialo-transferrina. Cuanto mayor es el nivel de
CD-transferrina en la muestra, mayor es la señal de
oscurecimiento.
Los valores de medición obtenidos con el método
de la invención demostraron estar muy en conformidad con los
obtenidos con CDTect (coeficiente de correlación de 0,971). La
invención es considerablemente más rápida y más simple de realizar
que el CDTect.
Membrana de separación: Se activó una
lámina (4 cm x 12 cm) de celulosa (filtro de celulosa 54, Whatman
International Ltd, England) con
ciano-dietil-aminopiridina (CDAP)
(Kohn y Wilchek, Appl. Biochem. Biotechnol. 9 (1984)
285-304). La lámina activada se colocó en una
solución de 0,1 mg/ml de lectina de Sambucus nigra (se une al
ácido siálico que está en la posición terminal de una cadena de
carbono; Vector Laboratories Inc., Burlingame CA. Estados Unidos)
en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,4. La solución se agitó durante 2 horas y
después se colocó la lámina en a) NaHCO_{3} 0,1 M, b) NaCl 0,5 M,
c) agua destilada, d) tampón acetato 0,1 M, pH 4,5, e) NaHCO_{3}
0,1 M, pH 8,4, f) NaCl 0,5 M, g) agua destilada, h) tampón acetato
0,1 M, pH 4,5, i) BIS-TRIS 5 mM, pH 6,4 que
contenía Tween 20 al 0,1%. Entre los diferentes baños, se absorbió
el exceso de líquido mediante papel de cocina. Después del
procedimiento de lavado, se secó al aire la lámina y se almacenó en
una bolsa de plástico a +4ºC.
Antes de usar la lámina, se montó sobre plástico
autoadherente (75 \mum de película de poliéster autoadherente;
Gelman Science Inc, Ann Arbor, MI, Estados Unidos).
Membranas con zona de detección y tira de
combinación: Pueden prepararse estas membranas en analogía con
el Ejemplo 2. Véase también la Figura 1. El ligando en SZ es ahora
lectina.
Conjugado de partículas de carbono (R*) y
proteínas marcadas con ^{125}I. Véase el Ejemplo 2.
Control de membrana de separación mediante
proteínas marcadas con ^{125}I: Se marcaron tetrasialo- y
asialo-transferrina y albúmina de bovino con
^{125}I (cloramina T, grado de marcado 0,08-0,13).
Las proteínas marcadas se diluyeron en BIS-TRIS 10
mM a pH 6,5 que contenía Tween 20 al 0,1%, citrato de Fe^{3+} 0,04
mM y NaN_{3} al 0,05% a aproximadamente 0,3 \mug/ml. Además, se
añadieron 0,4 mg de BSA/ml.
Se juntaron con cinta adhesiva una tira (0,5 cm
x 4 cm) de la membrana de separación y un trozo de una membrana de
celulosa absorbente (0,5 cm x 2 cm, GB004, Schleicher and Schuell,
Dassel, Alemania) por la parte inferior de manera que sus extremos
solapaban algo. Se aplicó 1 \mul de las soluciones de proteínas
marcadas con ^{125}I a 1 cm del extremo libre de una membrana de
separación respectiva. Se inició el flujo lateral colocando una
esponja de celulosa (0,6 cm x 0,6 cm x 0,3 cm) en el extremo libre
de la membrana de separación. La esponja se empapó con tampón
TRIS-HCl 20 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 0,5 M,
CaCl_{2} 1 mM con Tween 20 al 0,1%. Se interrumpió el flujo
retirando la esponja de celulosa después de 2, 4, 6 y 10 minutos,
respectivamente, y se cortaron las membranas a 2 y 3 cm del extremo
libre de la membrana de separación. Se midieron los trozos de
membrana radioactivos en un contador gamma y se calculó la
proporción de ^{125}I-proteína añadida que había
pasado de los 2 y 3 cm. Se muestran en la Tabla 4 los valores para
migración de 1 cm o más.
Conclusión: Parece por los resultados que
la tetrasialo-transferrina se retrasa mucho en la
membrana de separación mediante la lectina Sambucus nigra,
mientras que la asialo-transferrina y la BSA no se
retrasan en el mismo grado. Los resultados indican que puede
combinarse una membrana de separación con lectina de Sambucus
nigra con una membrana de detección en analogía con el Ejemplo 2
y usarse para cuantificar CD-transferrina en
muestras que contienen transferrina con un mayor contenido de ácido
siálico que de CD-transferrina.
Claims (21)
1. Un método para determinar un analito en una
muestra por medio de reacciones de unión, comprendiendo el
método:
i. aplicar la muestra en una zona de aplicación
para muestra (ASZ) en una matriz de flujo en la que puede
producirse un flujo de transporte de componentes presentes en la
muestra, comprendiendo adicionalmente la matriz de flujo:
- a)
- opcionalmente una zona de aplicación (AR*Z) para un reactivo de unión R* que es analíticamente detectable,
- b)
- una zona de detección (DZ) que se localiza corriente abajo de ASZ y comprende un Capturador constituido por otro reactivo de unión firmemente anclado a la matriz y en el que se forma durante el método un complejo de señal que contiene el Capturador y el analito y/o R*, y
ii. detectar el complejo de señal en la zona de
detección, usándose la señal medida para determinar el analito,
caracterizado porque la
matriz de flujo comprende al menos una zona de separación (SZ) entre
ASZ y DZ y porque la zona SZ presenta una estructura de ligando que
tiene capacidad de unión por al menos un componente de muestra
distinto del analito, que se transporta en la matriz y que puede
afectar la señal medible si el componente se transporta hacia DZ,
de manera que dicho al menos un componente sustancialmente no
perturba la detección del analito
DZ.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho componente de muestra es una
heteroforma del analito con respecto a la capacidad de unión por el
Capturador y/o R*.
3. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizado porque el flujo de transporte se impulsa
por fuerzas capilares.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, caracterizado
porque al menos DZ y las partes más adyacentes de la matriz están
en forma de una membrana, y porque el flujo de transporte al menos
hacia dentro y hacia fuera de DZ es lateral.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, caracterizado
porque la zona de separación presenta un Ligando que está cargado y
atrae a dicho componente.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4, caracterizado
porque la zona de separación presenta un Ligando que tiene una
afinidad bioespecífica dirigida hacia dicho componente de
muestra.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-4 y 6, caracterizado
porque la zona de separación presenta un Ligando que tiene afinidad
inmunoquímica contra dicho componente de muestra.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-7, caracterizado
porque la capacidad de unión del ligando es a un sitio de unión
sobre dicho componente de muestra, y porque este sito de unión no
está disponible en el mismo grado en el analito.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, caracterizado
porque el Capturador en la zona de detección presenta capacidad de
unión por un sitio de unión en el analito que también está
disponible en dicho componente de muestra.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-9, caracterizado
porque se usa R* y porque tiene capacidad de unión a un sitio de
unión que está disponible en a) tanto el analito como en dicho
componente de muestra, o b) solamente en el analito.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-10, caracterizado
porque el analito y dicho componente de muestra son heteroformas
que difieren con respecto a la estructura de carbohidratos.
12. Un kit de ensayo para determinar un analito
en una muestra sin otros componentes que perturben la determinación,
comprendiendo el kit
A. una matriz de flujo que en el mismo flujo de
transporte comprende:
- a)
- una zona de aplicación para muestra que contiene el analito (ASZ),
- b)
- una zona de detección (DZ) en la que existe un Capturador que es un reactivo de afinidad bioespecífica que se dirige hacia el analito o hacia un reactivo relacionado con el analito y que está firmemente anclado a la matriz en DZ,
B. opcionalmente, un reactivo analíticamente
detectable R* que tiene afinidad bioespecífica por el analito o por
el Capturador,
caracterizado porque la
matriz de flujo comprende una zona de separación (SZ) entre ASZ y
DZ, presentando dicha zona una estructura de ligando que tiene
capacidad de unión por al menos un componente de muestra
perturbador, siendo SZ capaz de unir sustancialmente todos dichos
componentes de muestra
perturbadores.
13. El kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 12, caracterizado porque al menos DZ y las
partes más adyacentes de la matriz están en forma de una membrana y
porque la dirección del flujo de transporte al menos hacia dentro y
hacia fuera de DZ es lateral.
14. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-13,
caracterizado porque los canales de transporte de la matriz
de flujo tienen dimensiones capilares, es decir, son de tal forma y
carácter de superficie que pueden transportarse medios acuosos por
fuerzas capilares.
15. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-14,
caracterizado porque la estructura (ligando) tiene capacidad
de unión a heteroformas perturbadoras del analito con respecto a
capacidad de unión al Capturador y/o R*.
16. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-15,
caracterizado porque la estructura (ligando) presenta una o
más cargas positivas y/o negativas en las condiciones en las que se
usa la matriz.
17. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-15,
caracterizado porque la estructura de ligando es un reactivo
de afinidad bioespecífica, por ejemplo un anticuerpo o un antígeno o
un hapteno.
18. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-17,
caracterizado porque el Capturador es un reactivo de
afinidad bioespecífica, por ejemplo un anticuerpo o un antígeno o un
hapteno.
19. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 12-18,
caracterizado porque el kit comprende un reactivo
analíticamente detectable R*, porque la matriz de flujo comprende
una zona de aplicación para R* (AR*Z) y porque AR*Z se localiza
corriente arriba y/o corriente abajo de SZ pero siempre corriente
arriba de DZ.
20. El kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado porque AR*Z se localiza
corriente arriba de, corriente abajo de, o coincide con ASZ.
21. El kit de ensayo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 19-20,
caracterizado porque R* se pre-deposita en
AR*Z.
Applications Claiming Priority (2)
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