ES2217604T3 - Derivados de ciclosporina y uso de los mismos. - Google Patents

Derivados de ciclosporina y uso de los mismos.

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ES2217604T3 ES98957903T ES98957903T ES2217604T3 ES 2217604 T3 ES2217604 T3 ES 2217604T3 ES 98957903 T ES98957903 T ES 98957903T ES 98957903 T ES98957903 T ES 98957903T ES 2217604 T3 ES2217604 T3 ES 2217604T3
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Abstract

La Presente invención proporciona nuevos derivados de ciclosporina C (CsC) con conjugabilidad con proteínas y estabilidad hidrolítica mejoradas. La presente invención proporciona además un derivado de CsC conjugado con un vehículo, por ejemplo un soporte sólido. Preferiblemente, el soporte sólido es un látex o una partícula magnética.

Description

Derivados de ciclosporina y uso de los mismos.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a los derivados de ciclosporina novedosos que tienen mejor conjugabilidad de superficie sólida y proteica y estabilidad hidrolítica. Los derivados de ciclosporina de la presente invención son útiles en ensayos de medición de niveles de la ciclosporina A, así como en la producción de inmunógenos de ciclosporina y conjugados de captura.
2. Antecedentes
La ciclosporina A (ciclosporina) es un potente inmunosupresor que se ha usado ampliamente en los Estados Unidos y otros países para evitar el rechazo de órganos trasplantados tal como riñón, corazón, médula ósea e hígado, en los seres humanos.
Se conocen los derivados de la ciclosporina A que están modificados sobre cualquiera de los aminoácidos del esqueleto de la ciclosporina A con un sustituyente que lleva un grupo activable fotoquímicamente a partir del documento WO 90/06763. Además, las ciclosporinas derivatizadas en el nitrógeno amida de los residuos alanina en las posiciones 7 y 8 se describen en el documento EP-A-0 487 289. Finalmente, en el documento EP-A-0 283 801 se describe una amplia gama de derivados de la ciclosporina A modificada en el sitio de la cadena del aminoácido en la posición 1 que lleva una serie de sustituyentes de cadena corta hasta cadena larga, que también se pueden funcionalizar.
Para evitar los rechazos homólogos, se requiere un nivel mínimo de la ciclosporina A en sangre durante la vida del paciente. Dosis crónicas altas pueden dar como resultado lesión renal o hepática. La distribución y metabolismo del fármaco varía grandemente entre los individuos, así como en un único individuo durante el curso de la terapia. De acuerdo con lo anterior, se considera esencial el control de los niveles de ciclosporina en sangre o suero de los receptores homólogos.
Se han desarrollado los procedimientos de laboratorio para la detección de ciclosporina. Estas técnicas típicamente implican cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), radioinmunoensayo (RIA) y no radioinmunoensayo.
Se ha descrito que la CsA, por sí misma no es inmunogénica (Donatsch, P. y col., J. Immuno Assay 1981; 2: 19). Por lo tanto para obtener anticuerpos, es necesario unir la CsA a un vehículo proteico. Sin embargo, la cadena lateral de la CsA, consta en su mayoría de grupos alifáticos, algunos de los grupos funcionales habitualmente usados para unir un hapteno a un vehículo. Los trabajadores previos han elaborados los conjugados proteicos de ciclosporina C (CsC) inmunogénicos debido a que la CsC tiene un residuo treonina en la posición 2. La unión a una proteína fue mediante un engarce de hemisuccinato a través de un grupo éster (patente de Estados Unidos nº 5.169.773). Además, se ha utilizado la química de acoplamiento a hemisuccinato para inmovilizar la CsC a un soporte sólido tal como las partículas de dióxido de cromo estabilizadas (patente de Estados Unidos nº 5.151.348). Debido a numerosos factores que incluyen, por ejemplo, la longitud de la cadena corta del engarce de hemisuccinato, la hidrofobia de la molécula de hemisuccinato de ciclosporina C y la inestabilidad hidrolítica del enlace del éster hemisuccinato, los derivados de hemisuccinato de CsC se conjugan escasamente a la proteína y superficie sólida. Además, los conjugados proteicos de la CsC y la CsC inmovilizada sobre un soporte sólido mediante el acoplamiento de hemisuccinato, son hidrolíticamente inestables. Así que, los inmunoensayos desarrollados usando tales derivados de CsC de hemisuccinato padecen baja sensibilidad y escasa estabilidad del reactivo. Existe un fuerte deseo de reemplazar los radioinmunoensayos ampliamente usados y los procedimientos de HPLC con un inmunoensayo más robusto y sensible para la CsA. De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad en la técnica de derivados de ciclosporina que sean capaces de conjugarse a soportes sólidos y vehículos más eficientemente y establemente.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona derivados de la ciclosporina C (CsC) novedosos que tienen una mejor conjugabilidad proteica y estabilidad hidrolítica. Además la presente invención proporciona un conjugado derivado de CsC a un vehículo, por ejemplo, un soporte sólido. Preferiblemente, el soporte sólido es un látex o una partícula magnética.
La invención también proporciona mejoras en los ensayos para la determinación de los niveles de ciclosporina en una muestra, por ejemplo, sangre entera, sospechosa de contener ciclosporina.
Además, la invención incluye estuches para llevar a cabo un ensayo para la determinación de ciclosporina. La presente invención también proporciona la producción de inmunógenos de ciclosporina y conjugados de captura comprendiendo los derivados de CsC de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a los derivados de ciclosporina C (CsC) que tienen la estructura:
1
en la que
X se selecciona entre:
---O---; 
\hskip0.5cm
---S---; 
\hskip0.5cm
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---;
---NH---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---;
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(CH_{2})_{2}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(CH_{2})_{3}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---;
Y se selecciona entre:
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---
---S---; 
\hskip0.5cm
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---CH_{2}---;
Z se selecciona entre:
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---OH---; 
\hskip0.5cm
---H; 
\hskip0.5cm
---NH_{2}; 
\hskip0.5cm
---OH; 
\hskip0.5cm
2
;
---SH; 
\hskip0.5cm
3
R_{1} y R_{2} son cada uno de ellos un grupo alquilo (C_{1}-C_{8});
R_{3} es un grupo alquilo (C_{0}-C_{8}); y
m es 1-200.
Una realización particular de la presente invención incluye los derivados de CsC que tienen las estructuras siguientes:
4
y
5
Los derivados de CsC de la presente invención se preparan mediante la activación del grupo hidroxi en la posición 2 de la CsC usando carbonato de disuccinimidilo seguido de acoplamiento con los engarces tales como engarces de diamina, por ejemplo, etilenglicol bis(2-aminoetil)éter (DA-10). El siguiente esquema ilustra la aplicación de este procedimiento para la síntesis de los derivados de la CsC de esta invención:
6
Los materiales de partida usados en el esquema descrito anteriormente se conocen bien o están comercialmente disponibles.
Los derivados de la CsC de la presente invención se pueden usar en un inmunoensayo para la medición de los niveles de la ciclosporina A en muestras de sangre entera. Un ejemplo de dicho ensayo comprende las etapas de:
(a)
lisar los glóbulos rojos en una muestra de sangre entera que contiene la ciclosporina A;
(b)
poner en contacto la muestra de la sangre entera lisada con un exceso de anticuerpo anti-ciclosporina marcado, por ejemplo, beta-D-galactosidadsa marcada. Para formar un complejo anticuerpo-ciclosporina A marcado;
(c)
separar el anticuerpo no unido del complejo poniendo en contacto la mezcla formada en la etapa (b) con una fase sólida que comprende un derivado de ciclosporina de la presente invención inmovilizado sobre un soporte sólido; y
(d)
determinar la cantidad del marcador en el complejo como una medida de la ciclosporina A, usando, por ejemplo, un sustrato de -D-galactosidasa beta seleccionado entre rojo de clorofenol beta-D-galactopiranósido (abreviadamente en inglés CPRG) y resorufina-beta-D-galactopiranósido (abreviadamente en inglés ReG) si se usa un marcador de -D-galactosidasa beta.
El inmunoensayo ligado a enzimas de esta invención es útil para medir los niveles de la ciclosporina A en las muestras de sangre entera de los pacientes que reciben la ciclosporina A. El control de los niveles en sangre de la ciclosporina A y el posterior ajuste de la dosificación de la ciclosporina A son necesarios para evitar los efectos tóxicos producidos por los altos niveles en sangre de la ciclosporina A y evitar el rechazo de los órganos producido por los niveles bajos de la ciclosporina A en sangre.
El inmunoensayo de la presente invención se realiza poniendo en contacto una muestra lisada de sangre entera que contiene la ciclosporina A con un exceso de anticuerpo anti-ciclosporina marcado, por ejemplo, -D-galactosidasa beta marcada, para formar una mezcla de reacción que contiene un complejo de la ciclosporina A con anticuerpo marcado y anticuerpo marcado libre, separando el anticuerpo libre de la mezcla de reacción poniendo en contacto la mezcla de reacción con una fase sólida que comprende un derivado de CsC de la presente invención sobre un soporte sólido, por ejemplo, partículas magnéticas que separan la fase sólida de la fase líquida, y midiendo la cantidad del marcador unido en la fase líquida añadiendo, por ejemplo, CRPG o ReG a fase líquida como un sustrato de -D-galactosidasa beta si se usa un marcador de -D-galactosidasa beta.
Específicamente, los glóbulos rojos de una muestra de sangre entera que contiene la ciclosporina A se deben lisar para liberar la ciclosporina A. La lisis de los glóbulos rojos se puede llevar a cabo mediante muchos procedimientos, tales como sonicación, lisis con detergente y lisis con agua destilada. El agente lítico elegido debe ser compatible con el anticuerpo anti-ciclosporina marcado. Aunque algunos detergentes pueden desnaturalizar la -D-galactosidasa beta, se ha encontrado que usando CPRG y ReG como sustratos de la -D-galactosidasa beta, el volumen de la muestra se puede hacer lo suficientemente pequeño para minimizar el efecto desnaturalizante del detergente. El procedimiento de lisis preferido usa detergente
Después de la lisis, se forma una mezcla de reacción poniendo en contacto la muestra lisada de sangre entera con un exceso de anticuerpo anti-ciclosporina marcado e incubando la mezcla de reacción durante un tiempo y a una temperatura suficiente para permitir que el anticuerpo marcado forme un complejo con toda la ciclosporina A en la muestra. Esto habitualmente dura 1-5 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo anti-ciclosporina se puede obtener comercialmente, prepararse mediante procedimientos conocidos, o prepararse usando los derivados de la presente invención. El anticuerpo anti-ciclosporina puede ser policlonal o monoclonal. Se prefiere un anticuerpo anti-ciclosporina monoclonal para la ciclosporina A. El anticuerpo anti-ciclosporina se puede marcar usando las técnicas habituales con cualquier molécula que se pueda detectar, incluyendo, por ejemplo, isótopos radiactivos, un catalizador tal como una enzima (por ejemplo, -D-galactosidasa beta), una coenzima, un cromógeno tal como un fluorescente, tinte o quimioluminiscente, una partícula dispersable que puede ser no magnética o magnética, un soporte sólido, un liposoma, un ligando, un hapteno y así sucesivamente.
El anticuerpo anti-ciclosporina no unido se separa de la mezcla de reacción poniendo en contacto la mezcla de reacción con una fase sólida que comprende un derivado de CsC de la presente invención inmovilizado sobre un soporte sólido durante un tiempo suficiente para que permita que el anticuerpo marcado no unido forme un complejo con el derivado de CsC inmovilizado. Así que habitualmente se produce en aproximadamente un minuto.
La inmovilización del derivado de CsC de la presente invención se puede llevar a cabo mediante numerosas técnicas de inmovilización conocidas. La técnica de inmovilización preferida para los derivados de la presente invención es activar el grupo carboxi terminal, usando por ejemplo, p-tolueno sulfonato de 2-fluoro-1-metilpiridinio (abreviadamente en inglés FMPT), y después acoplar a una proteína, tal como albúmina o globulina, que se puede acoplar covalentemente a un soporte sólido.
El derivado de CsC se puede inmovilizar sobre una diversidad de soportes sólidos tales como dextrano, agarosa de perlas, poliacrilamida, o vidrio. Un soporte sólido preferido útil en el inmunoensayo de la invención se describe en las patentes de Estados Unidos números 5.151.348 y 5.302.532.
El soporte sólido preferido comprende partículas de dióxido de cromo estabilizadas que tienen la ciclosporina unida a sus superficies. La partícula de dióxido de cromo estabilizadas útiles en el soporte sólido preferido son las descritas en la patente de Estados Unidos nº 4.661.408. Estas partículas constan de un núcleo de dióxido de cromo, rutilo, al que se le ha reducido la superficie en gran manera, recubierto con alúmina, además recubierto con sílice que contiene borato e incluso revestido adicionalmente con un silano al que se une conjugado proteico de ciclosporina, tal como la gammaglobulina bovina. Estas partículas tienen grandes áreas de superficie, 40-100 m^{2}/g, son estables en solución acuosa y se pueden acoplar fácilmente al conjugado de ciclosporina.
El soporte también puede ser un material insoluble en agua poroso o no poroso. El soporte puede ser hidrófilo o capaz de hacerse hidrófilo e incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio, y alúmina: materiales poliméricos naturales, particularmente los materiales celulósicos y los materiales derivados de celulosa, tales como papeles que contienen fibras, por ejemplo, papel de filtro, papel cromatográfico; polímeros de origen natural sintéticos o modificados, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli (cloruro de vinilo), poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli (4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli (tereftalano de etileno), nylon, poli (butirato de vinilo); bien usados ellos mismos o junto con otros materiales; vidrio, cerámicas y metal.
La fase sólida se separa de la fase líquida mediante técnicas de separación habituales. La técnica de separación preferida es usar un imán para separar por sedimentación la partícula magnética de la fase líquida.
La cantidad de la ciclosporina A se determina midiendo la cantidad del marcador unido en la fase líquida. Por ejemplo, la cantidad de -D-galactosidasa beta unida se determina añadiendo a la fase líquida bien CPRG o ReG como sustrato de -D-galactosidasa beta y midiendo espectrofotométricamente la cantidad de cromóforo producido a 577 nm.
El inmunoensayo de esta invención se puede realizar manualmente o se puede adaptar a una diversidad de instrumentación automática o semiautomática, tal como el Dimension® RxL (analizador clínico discreto, un a marca comercial registrada de Dade International Inc. Deerfield, Illinois). Al realizar el ensayo sobre un Dimension® RxL, se lisa primero una muestra de sangre entera y se preincuba con exceso de anticuerpo anti-ciclosporina marcado con -D-galatosidasa beta en una cubeta sobre el instrumento. Una cantidad conocida de partículas de dióxido de cromo estabilizadas inmovilizadas con derivado de CsC de la presente invención se transfiere a la cubeta y se incuba durante cierta cantidad de tiempo, se usa el imán para separar las partículas magnéticas de la fase líquida. La fase líquida del sobrenadante contiene anticuerpo anti-ciclosporina marcado con -D-galactosidasa beta formando un complejo con la ciclosporina A de la muestra de la sangre entera. Una fracción del sobrenadante se pipetea y se transfiere a otra cubeta con la adición de CPRG o ReG inmediatamente antes de las mediciones de la absorbancia a 577 nm.
La presente invención además proporciona un conjugado derivado de CsC a un vehículo, que generalmente es un compuesto de peso molecular mayor que 5.000 o un marcador. Los vehículos incluyen poliaminoácidos, lipopolisacáridos, y partículas. El conjugado de CsC se puede usar en muchas aplicaciones que incluyen un conjugado de captura en un ensayo o como un inmunógeno. El vehículo puede ser inmunogénico, es decir un vehículo inmunogénico.
Los poli (aminoácidos) generalmente variarán entre 5.000 de peso molecular, no teniendo límite superior de peso molecular, normalmente siendo menor que 10.000.000, habitualmente no más de 600.000 daltons.
Se han empleado diversos tipos de proteínas como material inmunogénico poli (aminoácido). Estos tipos incluyen albúminas, proteínas séricas, por ejemplo, globulinas, proteínas de las lentes oculares, lipoproteínas. Las proteínas ilustrativas incluyen albúmina sérica bovina, hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina de huevo, gammaglobulina bovina. Como alternativa, se pueden utilizar los poli (aminoácidos) sintéticos.
El vehículo inmunogénico puede ser también un polisacárido, que es un polímero de alto peso molecular construido mediante condensaciones repetidas de monosacáridos. Los ejemplos de polisacáridos son almidones, glicógeno, celulosa, gomas de carbohidratos, tales como goma arábiga, agar. Los polisacáridos también pueden contener residuos de poliaminoácidos y/o residuos de lípidos.
El vehículo inmunogénico también puede ser un ácido nucleico bien solo o conjugado a uno de los poli (aminoácidos) anteriormente mencionados o polisacáridos.
El vehículo también puede ser una partícula. Las partículas son generalmente al menos de 0,02 \mum y no más de 100 \mum, habitualmente al menos 0,05 \mum y menos de 20 \mum, preferiblemente entre 0,3 y 10 \mum de diámetro. La partícula puede ser orgánica e inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad próxima a la del agua, generalmente entre 0,7 y 1,5 g/ml, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos tal como células y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus, E. coli, virus. Las partículas también pueden ser partículas que comprenden polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, partículas de látex, vesículas de fosfolípidos, quilomicriones, lipoproteínas y cromo.
Las partículas se pueden derivar de materiales de origen natural, materiales de origen natural que se modifican sintéticamente y materiales sintéticos. Entre los polímeros orgánicos de particular interés están los polisacáridos, particularmente los polisacáridos reticulados, tales como la agarosa, que está disponible como sefarosa, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa, almidón, polímeros de adición, tal como poliestireno, alcohol polivinílico, homopolímeros y copolímeros de derivados de acrilato y metacrilato, particularmente los ésteres y las amidas que tienen funcionalidades de hidroxilos libres.
Las partículas serán habitualmente polifuncionales y se encontrarán o serán capaces de unirse a los derivados de CsC. Están disponibles una amplia diversidad de grupos funcionales o se pueden incorporar. Los grupos funcionales incluyen ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, grupos mercapto. La manera de unir una amplia variedad de compuestos a partículas se conoce bien y se ilustra ampliamente en la bibliografía. Véase por ejemplo, Cautrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245: 3059.
El vehículo puede ser una enzima que es parte de un sistema productor de señal. La función del sistema productor de señal es producir un producto que proporcione una señal detectable relativa a la cantidad de marcador unido o no unido. Cuando se emplean enzimas, las reacciones implicadas serán, la mayor parte de las veces, reacciones de hidrólisis o redox. Dichas enzimas que pueden encontrar uso son hidrolasas, transferasas, liasas, isomerasas, ligasas o sintetasas y oxidorreductasas, preferiblemente hidrolasas. Como alternativa, se pueden usar luciferasas tales como la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana.
Un marcador puede ser cualquier molécula conjugada a un analito o anticuerpo, o a otra molécula. En la invención sujeto, el marcador puede ser un miembro del sistema productor de señal que incluye un medio productor de señal. El marcador puede ser isotópico o no isotópico, preferiblemente no isotópica. A modo de ejemplo y sin limitación, el marcador puede ser un catalizador tal como una enzima, una coenzima, un cromógeno tal como un fluorescente, tinte o quimioluminiscente, una partícula dispersable que puede ser no magnética o magnética, un soporte sólido, un liposoma, un ligando, un hapteno.
El sistema productor de señal puede tener uno o más componentes, siendo al menos un componente un marcador. El sistema productor de señal incluye todos los reactivos requeridos para producir una señal medible que incluye un medio productor de señal capaz de interactuar con el marcador para producir una señal.
El sistema productor de señal proporciona una señal detectable mediante medios externos, normalmente mediante la medición de la radiación electromagnética, deseablemente mediante examen visual. La mayoría de las veces, el sistema productor de señal incluye un sustrato cromóforo y una enzima, cuando los sustratos cromóforos se convierten enzimáticamente en tientes que absorben la luz en la región ultravioleta o visible, fosforescentes o fluorescentes.
El medio productor de señal es capaz de interactuar con el marcador para producir una señal detectable. Dicho medio incluye, por ejemplo, radiación electromagnética, calor, reactivos químicos. Cuando se emplean reactivos químicos, algunos de los reactivos químicos pueden estar incluidos como parte de una solución reveladora. Los reactivos químicos pueden incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, segundas enzimas, activadores, cofactores, inhibidores, depuradores, iones metálicos, sustancias aglomerantes específicas requeridas para unir las sustancias generadoras de señal.
Algunos de los reactivos químicos tales como coenzimas, sustratos que reaccionan con productos enzimáticos, otras enzimas y catalizadores se pueden unir a otras moléculas a un soporte.
El sistema productor de señal que incluye el marcador puede incluir una o más partículas, que son partículas insolubles de al menos 50 nm y no más de 50 \mum, habitualmente al menos 100 nm y menos de 25 \mum, preferiblemente entre 0,2 y 5 \mum de diámetro. La partícula puede ser orgánica e inorgánica, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad próxima a la del agua, generalmente entre 0,7 y 1,5 g/ml, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco.
El marcador también puede ser fluorescente bien directamente o debido a compuestos fluorescentes o fluorescentes unidos a una partícula de formas convencionales. Los serán fluorescentes habitualmente serán capaces de, o funcionalizarse para hacerlos capaces de, unirse al derivado de CsC o a la partícula.
Los derivados de CsC de la presente invención se pueden utilizar para preparar conjugados usando las reacciones descritas anteriormente y expuesta en los ejemplos.
Otro aspecto de la presente invención incluye un procedimiento para preparar anticuerpos contra el derivado de CsC definido anteriormente conjugado a un vehículo inmunogénico. Además, la presente invención incluye los conjugados tales como anticuerpos y un marcador.
Un anticuerpo es una inmunoglobulina que se une específicamente y por lo tanto se define complementariamente con una organización particular espacial y polar de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y se puede preparar mediante las técnicas que se conocen bien en la técnica tales como inmunización de un hospedador y recogida del suero a partir del que se pueden separar la inmunoglobulina mediante técnicas conocidas (policlonal) o mediante la preparación de estirpes celulares hibridas continuas y recogiendo la proteína secretada (mnoclonal). Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, dichas inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isótopos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM. Los fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab'.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante el procedimiento descrito por Milstein y Kohler y reseñados en Nature, 256: 495-497, 1975.
Los anticuerpos de la presente invención reconocen las ciclosporinas que incluyen la ciclosporina A y los derivados y los metabolitos de las ciclosporinas.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en la determinación de ciclosporina en una muestra sospechosa de contener ciclosporina. El ensayo puede comprender las etapas de poner en contacto la muestra con los anticuerpos para ciclosporina y detectar bien directa o indirectamente los complejos inmunes de los anticuerpos y ciclosporina. La mejora proporcionada en la presente invención es la utilización de los presentes anticuerpos como los anticuerpos para ciclosporina. Los complejos inmunes se detectan directamente, por ejemplo, cuando los anticuerpos empleados se conjugan a un marcador. El complejo inmune se detecta indirectamente examinando el efecto de la formación del complejo inmune en un medio de ensayo sobre un sistema productor de señal o empleando un anticuerpo marcado que específicamente se une a un anticuerpo de la invención.
En otra configuración de un ensayo para la determinación de ciclosporina en una muestra sospechosa de contener ciclosporina, la muestra se pone en contacto con los anticuerpos para ciclosporina y un conjugado de esta invención reconocido por los anticuerpos. El procedimiento además incluye la detección bien directa o indirectamente de los complejos inmunes del conjugado y los anticuerpos. La mejora proporcionada en la presente invención se emplea como el derivado de CsC conjugado a un marcador.
La presente invención de ensayo tiene aplicación para todos los inmunoensayos para ciclosporina. El ensayo se puede realizar bien con separación (homogénea) o con separación (heterogénea) de cualquiera de los componentes de ensayo o productos. Los ejemplos de los ensayos heterogéneos son inmunoensayos ligados a enzimas tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), véase "Enzyme-Immunoassay" por Edward T. Maggio, CRC Press Incorporated, Boca Ratón, Fla. 1980. Los inmunoensayos homogéneos se ejemplifican mediante técnicas de inmunoensayos de enzimas múltiples (por ejemplo, véase, la patente de Estados Unidos nº 3.817.837), los procedimientos de inmunofluorescencia tales como los descritos en la patente de Estados Unidos nº 3.993.345, las técnicas de canalización enzimáticas tales como las descritas en la patente de Estados Unidos nº 4.233.402, y otros inmunoensayos enzimáticos como se ha descrito en Maggio anteriormente.
La presente invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan para ayudar en la comprensión de la invención.
Ejemplo 1 Síntesis de CsA-DA-10
En un matraz de fondo redondo de 25 ml equipado con un agitador magnético, se colocaron 540 mg de CsC y 454 mg de DSC (carbonato de disuccinimilo), después se añadieron 10 ml de acetonitrilo seco y 1000 \mul de trietilamina. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 16-20 horas hasta que no se pudo encontrar CsC sobre TLC (cromatografía en capa fina). Si la reacción no se ha completado después de 16-20 horas, se añadieron 50 mg más de DSC en la solución y la reacción se comprobó otra vez después de 2 horas mediante TLC. (95% de EtOAc y 5% de MeOH se usaron como disolvente de TLC, se utilizó yodo para visualizar las manchas. Después se añadió a la solución 2627 mg de DA-10 (rápidamente) y 1000 \mul de trietilamina. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante otras 24 horas, y después se añadieron 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. La solución de reacción se lavó tres veces con agua. La fase orgánica inferior se separó y se secó con sulfato sódico. El sólido blanco de producto CsC-DA-10 se obtuvo después de retirar todo el disolvente mediante evaporación rotatoria y a vacío.
Ejemplo 2 Síntesis de CsC-DA-10 hemiglutamato (HG)
En un vial de 20 ml, se colocaron aproximadamente 550 mg de CsA-DA-10, 93,75 mg de anhídrido glutárico y 10 ml de CH_{2}Cl_{2}; se añadieron 344 \mul de trietilamina y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Después se añadieron a la reacción 40 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se lavó dos veces con HCl 1 N y dos veces con agua. La fase orgánica se secó con sulfato sódico, y se obtuvo CsA-DA-10-HG sólido después de retirar todo el disolvente.
Ejemplo 3 Conjugación de CsA-DA-10-HG con gammaglobulina bovina (abreviadamente en inglés IgG)
A: 4 mg/ml de solución de gammaglobulina bovina: 500 mg de IgG disueltos en 125 ml de Na_{2}CO_{3} 0,1 M (pH 9,5).
B: activación de CsA-DA-10-HG con p-paratoluenosulfonato de 2-fluoro-1 metilpiridinio (FMPT).
Se pesaron 134,6 mg de CsA-DA-10-HG (0,0894 mmoles) y 38,1 mg de FMPT (0,1345 mmoles). Se añadieron 4800 \mul de CH_{3}CN para disolver los sólidos. Después se añadieron 28,1 \mul de TEA. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
C: Acoplamiento de CsA-DA-10-HG a proteína.
La solución anterior de CsA-DA-10-HG se añadió a la solución de gammaglobulina bovina de 4mg/ml con agitación, dejando dispersar cada gota antes de añadir la siguiente. Después de que se completó la adición, la solución se dejó en agitación suavemente durante 18 horas a temperatura ambiente. La solución se dializó (tubo de diálisis de corte de 12.000 MW) en un habitación fría frente a 6 cambios de solución tampón PBS. La solución dializada se diluyó hasta 2 mg/ml de la concentración de proteína añadiendo tampón PBS de diálisis limpio. Se añadieron 324 mg de bronopol al recipiente y se agitaron hasta que se disolvió completamente y se dispersó uniformemente.
Ejemplo 4 Acoplamiento de conjugado CsA-gammaglobuina bovina a una partícula magnéticas
Se añadieron 40 ml del conjugado CsA-IgG anterior a 40 ml de una solución de dióxido de cromo activado con glutaraldehído. (El procedimiento detallado de preparación de partícula de dióxido de cromo activado se describe en la patente de Estados unidos nº 4.661.408).
La reacción se hizo girar a 4ºC durante 24 horas. Se añadieron 32 ml de 30% de BSA a la solución, la reacción se hizo girar a temperatura ambiente durante otras 16-20 horas. Se añadieron 112 ml de tampón glicina 2 M a la solución anterior para inactivar la reacción durante 1 hora. Se lavó la solución con agua tres veces y con diluyente de cromo tres veces. La partícula de dióxido de cromo se diluyeron hasta 40 ml con diluyente de cromo.
Diluyente de cromo:
BSA polimerizada (30%) 15,1 g/l
Trehalosa 28,7 g/l
Carbowax 4,8 g/l
Proclina 5 ml/l
Sulfato de neomicina 0,06 g/l

Claims (14)

1. Un compuesto que tiene la estructura:
7
en la que
X se selecciona entre
---O---; 
\hskip0.5cm
---S---; 
\hskip0.5cm
---NH---;
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---;
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(CH_{2})_{2}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---(CH_{2})_{3}---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---;
Y se selecciona entre
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---; 
\hskip0.5cm
---NH---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH; 
\hskip0.5cm
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---NH---
---S---; 
\hskip0.5cm
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---NH---; 
\hskip0.5cm
---O---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---; 
\hskip0.5cm
---CH_{2}---;
Z se selecciona entre
---
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
---OH---; 
\hskip0.5cm
---H; 
\hskip0.5cm
---NH_{2}; 
\hskip0.5cm
---OH; 
\hskip0.5cm
8;
---SH; 
\hskip0.5cm
9
R_{1} y R_{2} son cada uno de ellos un grupo alquilo (C_{1}-C_{8});
R_{3} es un grupo alquilo (C_{0}-C_{8}); y
m es 1-200
2. Un compuesto que tiene la estructura:
10
en la que n es 2-3; m es 2-5 y p es 2-3.
3. Un compuesto que tiene la estructura:
11
en la que n es 2-3; m es 2-5; p es 2-3 y k es 2-3.
4. Un inmunoensayo ligado a enzimas para la medición de los niveles de la ciclosporina A en las muestras de sangre entera que comprende las etapas de:
(a)
lisar los glóbulos rojos en una muestra de sangre entera que contiene la ciclosporina A;
(b)
poner en contacto la muestra de la sangre entera lisada con un exceso de anticuerpo anti-ciclosporina marcado, por ejemplo, -D-galactosidadsa beta marcada, para formar un complejo anticuerpo-ciclosporina A;
(c)
separar el anticuerpo no unido del complejo poniendo en contacto la mezcla formada en la etapa (b) con una fase sólida que comprende un derivado de cicosporina de la presente invención inmovilizado sobre un soporte sólido; y
(d)
determinar la cantidad del marcador en el complejo como una medida de la ciclosporina A.
5. El inmunoensayo de la reivindicación 4, en el que el marcador es -D-galactosidasa \beta.
6. El inmunoensayo de la reivindicación 5, en el que la cantidad de -D-galactosidasa beta en el complejo como una medida de la cislosporina A se determina añadiendo un sustrato de -D-galactosidasa \beta seleccionado entre rojo clorofenol-\beta-D-galactosidasa \beta y resofurina-\beta-D-galatopiranósido \beta.
7. El inmunoensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en el que la fase sólida es una partícula de dióxido de cromo estabilizada.
8. Una composición de materia que comprende los compuestos de las reivindicaciones 1, 2, ó 3 conjugados a un vehículo.
9. La composición de materia de la reivindicación 8, en la que el vehículo es inmunogénico.
10. La composición de materia de la reivindicación 9, en la que el vehículo inmunogénico es una proteína.
11. La composición de materia de la reivindicación 10, en la que la proteína se selecciona entre albúmina sérica bovina, hemocianina de lapa californiana ("Keyhole Limpet") y ovoalbúmina.
12. La composición de materia de la reivindicación 8, en la el vehículo es una partícula.
13. La composición de materia de la reivindicación 12, en la que la partícula es una partícula de dióxido de cromo.
14. Un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-ciclosporina, que comprende la inducción de un anticuerpo contra la composición de la reivindicación 9.
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