JPH0898682A - アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 アクリジニウム塩で標識された低分子化合物
コンジュゲート試薬で状況に応じた多様な測定手法に適
用することが可能な試薬の提供。 【構成】 アルカリフォスファターゼを低分子化合物に
より標識し同時にアクリジニウム塩で標識し、新規な標
識アルカリフォスファターゼが得られる。この標識アル
カリフォスファターゼを試薬として用いることにより、
特異的結合測定法において、試薬としての安定性が良好
で、その保存性に優れ、信頼性が高い測定系が構築でき
る。このコンジュゲートは、通常繁用されるハプテン−
高分子複合物を免疫原として産生される抗体に対する親
和性が比較的良好で、測定の感度を高めることができ
る。さらに化学発光を利用した免疫測定系にも酵素免疫
測定系などにも応用することができ、一つの試薬で状況
に応じた多様な測定手法に適用することが可能となり、
特に測定の自動化を図るのに優れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、標識として比較的低分
子の化合物と共にアクリジニウム塩を有する標識されて
いる新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に「低
分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」とい
う。）及びその製造法、さらにはその標識されているア
ルカリフォスファターゼを試薬として用いることを特徴
とする特異的結合測定法に関する。本発明の特異的結合
測定法は、比較的低分子の化合物で標識されると共にア
クリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファタ
ーゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジ
ュゲートと、検体中の測定対象物とが、その特異的結合
反応試薬、好ましくは抗体に対して競合的に反応して結
合することを利用する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】生物学
的に活性を持ったり、臨床的に重要な薬物の測定法とし
ては、特異的な結合反応を利用した測定法が開発されて
いる。特に免疫学的な反応を利用する免疫測定法は、高
い感度を有しており、微量の測定が可能であることから
広く普及している。こうした測定において、当初は放射
性の物質が標識として用いられ、測定を容易にするとと
もに高い検出感度を達成するために用いられてきた。し
かしながら、放射性の物質は、それ自体非常に危険であ
るなどのためそれを扱うための特別な施設とか、技術が
要求され、さらに使用済み廃液の処理に於いて環境を汚
染するなど大きな問題を抱えているので、それに代わる
安全でかつ高い感度を実現できる標識の開発が求められ
ている。そうした放射性物質の標識に代えて、酵素標識
とか螢光標識などが開発されてきている。

【０００３】最近では、化学ルミネセント現象を利用し
た特にアクリジニウム塩による標識が注目されてきてい
る。アクリジニウム塩標識は、比較的高い光収量が得ら
れ、さらにインジケーターに結合した抗体などの蛋白質
によってはその化学ルミネセントが損なわれることが少
ないことなど安定していることから、その標識剤として
の開発が盛んに進められている。例えば、特に甲状腺ホ
ルモンの測定法としては、古くはＴＢＰに結合したＴ₄
（またはＴ₃ ）中のヨードを化学的に測定するタンパク
結合ヨード法が用いられていたが、やがて放射性のＴ₄
（またはＴ₃ ）とＴＢＧとの結合を利用した競合タンパ
ク結合分析法が用いられるようになった。さらに抗Ｔ₄
抗体（または抗Ｔ₃ 抗体）を用いるラジオイムノアッセ
イが繁用されている。しかしながら、放射線標識は環境
汚染などの問題があることから、最近では非放射性標識
を用いたイムノアッセイの開発が求められ、酵素標識や
螢光標識を用いたイムノアッセイ法の開発がなされてき
ている。こうした非放射性標識開発の一つとして、化学
発光標識剤であるアクリジニウム基とＴ₄ （またはＴ
₃ ）とを結合した試薬の開発が試みられている。

【０００４】ところが、アクリジニウム塩標識は、水に
難溶性であることから、比較的低分子の化合物であるハ
プテンなどの薬物をアクリジニウム塩で標識すると、得
られたアクリジニウム塩標識薬物である試薬は、水溶性
が非常に劣ることとなり、試薬保存中や測定中に沈殿を
生ずるとか、Ｂ／Ｆ分離の際にフィルターなどに非特異
的に吸着されてしまうとか、測定に使用できるような濃
度のものとすることが困難であったりするなどの問題が
ある。さらに臨床的な測定において普通に採用されるこ
との多いｐＨ域で不安定であるという問題もある。また
感度を高めたり、標識率を高めたり、例えば複数の標識
を導入したりすると、得られた標識試薬の水溶解性が低
下して、試薬として使用に耐えないとか、測定中に特異
的結合反応に悪影響を与える恐れがでる、さらに分離処
理などにおいてフィルターなどに吸着されてしまうなど
の問題もある。

【０００５】例えば、Ｔ₄ （またはＴ₃ ）誘導体とアク
リジニウム塩とを直接結合させたものや、Ｔ₃ （Ｔ₄ ）
誘導体とアクリジニウム塩とを低分子スペーサーを介し
て結合したものでは、 １．得られた結合物が疎水性であるため、非特異的吸着
能が大きく、例えばＢ／Ｆ分離などにグラスフィルター
などを用いるとそれに非特異的に吸着してしまう ２．溶液中での安定性が悪く、保存性が劣るばかりでな
く、試薬としての信頼性に問題がある。例えば、中性〜
弱アルカリ性の溶液中では不安定である。 ３．抗Ｔ₃ （Ｔ₄ ）抗体は、通常Ｔ₃ （Ｔ₄ ）−高分子
複合物を免疫原として産生されるが、こういったＴ₃
（Ｔ₄ ）−高分子複合物により得られる抗Ｔ₃ （Ｔ₄ ）
抗体に対する親和性が低く測定の感度が悪いなどの問題
があった。

【０００６】さらにこうした結合物は、アクリジニウム
標識に基づくアクリジニウム塩の化学発光を利用した免
疫測定系には利用できるがその他の免疫測定系、例え
ば、酵素免疫測定系に応用するなどのことは一切できな
い。特に最近では、その場その場に応じ、酵素標識測定
系とか、化学ルミネセント標識測定系など、一つの試薬
を用いることで様々な角度及び感度などを利用して臨床
測定することが求められたり、自動的に測定機器で測定
処理するにも適したものが求められるが、これまで比較
的低分子化合物からなるアクリジニウム標識を用いた系
では、特にその水溶解性の観点で問題があり、さらに同
時に酵素標識測定系を利用できるものがなかった。

【０００７】例えば、Ｔ₃ （Ｔ₄ ）を測定する場合、そ
の測定は、臨床の分野ではその病気などの治療を進めな
がら行う必要もあり、一つの試薬でその場その場の状況
に応じた多様な測定手法に適用することが可能なものが
求められるにも拘らず、従来はできなかった。そこでこ
うした問題のない化学発光標識剤であるアクリジニウム
塩による標識のなされた比較的低分子の化合物であるハ
プテンなどの薬物からなる試薬を開発することが求めら
れている。

【０００８】

【課題を解決する手段】本発明者等は、特に測定の自動
化を図るには、複数の測定系に利用が可能で、例えば、
化学発光免疫測定法にも使用でき且つ酵素免疫測定法に
も使用できるものが有利であること、及び試薬の安定性
が求められること、さらには機器に使用しているフィル
ター類に非特異的な吸着を起こさないようなものが大切
であるとの認識のもと、特異的結合反応利用測定系にお
いて用いることの出来る比較的低分子化合物などのアク
リジニウム塩による標識でその水溶性に多大の影響をう
けるものに関連した新規な試薬の開発に着手し、鋭意研
究の結果本発明を完成したものである。

【０００９】本発明は、標識として低分子化合物を有す
ると共に標識としてアクリジニウム塩を有する標識され
ている新規なアルカリフォスファターゼ（以下、単に
「低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート」と
いう。）及びその製造法、さらにはその新規な標識アル
カリフォスファターゼ・コンジュゲートからなることを
特徴とする特異的結合測定系用試薬並びにその試薬を用
いることを特徴とする測定対象物の特異的結合測定法に
関する。本発明の測定対象物の特異的結合測定法は、比
較的低分子の化合物であるハプテンなどの薬物から成る
群から選ばれたものを標識として有すると共にアクリジ
ニウム塩を標識として有するところの標識されているア
ルカリフォスファターゼ、すなわち低分子化合物−ＡＬ
Ｐ−Ａｃｒ・コンジュゲートと、検体中の測定対象物と
が、その特異的結合反応試薬、好ましくは抗体に対して
競合的に反応して結合することを利用する。

【００１０】本発明で使用される低分子化合物は、少な
くとも１個のアクリジニウム塩標識の導入により、その
水に対する溶解性に多大の影響を受けるものであり、複
数のアクリジニウム塩標識を導入した場合には、１個の
アクリジニウム塩標識の導入により比較的水に対する溶
解性に於いて影響を受けることの少ないものも、次第に
大きな影響を受けるであろうことは予測しうるところで
ある。本発明では、アクリジニウム塩標識の導入により
測定対象物の特異的結合測定法において何らかの実質的
問題を生ぜしめることを解決しているかぎり、すべて本
発明の対象低分子化合物と判断することができよう。

【００１１】本発明で使用される低分子化合物は、例え
ば抗原、ハプテンなどの薬物を挙げることができ、生物
学的重要性を持つ薬剤、臨床的重要性を持つ薬剤、代謝
物質、ビタミン、ホルモン、ステロイド、核酸、糖類、
毒物、生理活性物質、農薬、化学薬品などが挙げられ
る。薬物としては、例えばホルモン薬、ビタミン剤、抗
生物質、放射線増感剤、放射線防護剤、抗ヒスタミン
薬、うっ血除去薬、抗炎症薬、駆虫薬、局所麻酔薬、抗
真菌薬、抗アメーバ薬、抗トリコモナス薬、抗関節炎
薬、抗喘息薬、抗血液凝固薬、抗糖尿病薬、抗高血圧症
薬、冠血管拡張薬、脳血管拡張薬などの血管拡張薬、抗
狭心症薬、血管新生阻害剤、カルシウム拮抗薬、カルモ
ジュリン阻害剤、中毒治療薬、抗不整脈症薬、筋肉弛緩
薬、抗脂肪血症薬、脳代謝改善薬、脳代謝賦活薬、学習
・記憶障害改善薬、痴呆症薬などの脳機能改善薬、抗神
経病薬、鎮痛薬、鎮静薬、抗不安薬、抗痙攣薬、抗躁う
つ病薬、パーキンソン病治療薬などの中枢神経系作用
薬、副作用軽減剤、酵素、ワクチンコンポーネント、ト
キソイド、抗毒素、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗癌剤効果増強
剤、抗ウイルス剤、免疫増強剤、免疫調節剤、免疫回復
剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１２】比較的低分子の薬物としては、モルフィ
ン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジフェニルヒ
ダントイン、カルバマゼピン、プリミドン、エトスクシ
ミド、バルプロ酸、アセタゾールアミド、プロプラノロ
ール、スルチアム、グルテチミド、クロナゼパム、ニト
ラゼパム、ジアゼパム、ペントバルビタール、セコバル
ビタール、ブピバカイン、メピバカイン、リドカイン、
プロカインアミド、キニジン、ジソピラミド、ジゴキシ
ン、ジキトキシン、テオフィリン、アミトリプチリン、
イミプラミン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマ
イシン、ジブカイン、ストレプトマイシン、セファレキ
シン、スルファメトキサゾール、メソトレキサート、シ
クロスポリン、メチルプレドニゾロン、コルチゾール、
１１−デオキシコルチゾール、テストステロン、１７−
ＯＨ−プロゲステロン、ケモデオキシコール酸、サリチ
ル酸、アセトアミノフェン、インドメタシン、アロプリ
ノール、ハロペリドール、ビタミンＡ、カロチン、ビタ
ミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１
２、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、チロ
キシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ，Ｔ₄ ）、３，５，３’−
トリヨードチロニン（３，５，３’−ｔｒｉｉｏｄｏｔ
ｈｙｒｏｎｉｎｅ，Ｔ₃ ）などが挙げられる。比較的低
分子の薬物としては、特にはＴ₄ やＴ₃ などが挙げられ
る。

【００１３】甲状腺ホルモンの過剰は、神経過敏、頻
脈、脈圧増大、基礎代謝亢進、発育の促進、アドレナリ
ンに対する感受性の増大を示すのに対し、その不足は成
長発育の遅延、中枢神経系、精神機能の低下、循環系の
異常をきたし、さらにコレステロール代謝に変化がおこ
るなど重要な生理的な変化をもたらす。したがって、血
中に存在し、これらの生理活性に大きな影響を及ぼして
いる甲状腺ホルモンを正確に測定することは臨床医学上
非常に重要と考えられている。

【００１４】甲状腺ホルモンのうち、血中においてその
生物学的活性などの理由により重要と考えられているの
は、Ｔ₄ と、Ｔ₃ である。これらチロキシン及び３，
５，３’−トリヨードチロニンは、血中ではチロキシン
結合グロブリン（ＴＢＧ）、チロキシン結合プレアルブ
ミン（ＴＢＰＡ）、アルブミンという３種のチロキシン
結合タンパク（ＴＢＰ）と大部分結合して存在してお
り、Ｔ₄ の大部分（９９．９７％以上）はこれらＴＢＰ
と結合し、極く一部（０．０２％程度）が遊離型Ｔ₄
（ｆｒｅｅ Ｔ₄ ）として血中を循環して、実際に生物
学的活性を示すのは、この遊離型Ｔ₄ であるといわれて
いる。こうして血中の総Ｔ₄ 濃度は、甲状腺からのＴ₄
の分泌、血中での代謝、分解などのほか、血中のＴＢＰ
濃度によっても変動しうる。Ｔ₃ もＴＢＰと結合してい
るが、Ｔ₄ よりもその結合はゆるやかで、血中Ｔ₃ の約
９９．７％程度がＴＢＰと結合していると言われ、遊離
型Ｔ₃ は血中Ｔ₃ の約０．２〜０．３％程度と考えられ
ている。Ｔ₃ は、体内で容易にＴ₄ から変換合成されて
いる。

【００１５】甲状腺にはいろいろな疾患があり、血中総
Ｔ₄ （またはＴ₃ ）が上昇するもの（例えば、パセドウ
氏病など）、血中総Ｔ₄ （またはＴ₃ ）が低下するもの
（例えば、粘液水腫、クレチン症など）、血中Ｔ₄ （ま
たはＴ₃ ）濃度は正常なままであるもの（例えば、単純
性甲状腺腫など）など、その血中総Ｔ₄ （またはＴ₃）
量の測定は、これらの診断にあたり重要な検査の一つと
なっている。

【００１６】またクレチン症などでは、早期に発見、治
療するためには全出生児の血中Ｔ₄（またはＴ₃ ）を測
定するなどの予防医学的な分野でも重要視されている。
こうしたＴ₄ （またはＴ₃ ）測定にあたっては、総Ｔ₄
（またはＴ₃ ）はＴＢＧの増加（例えば正常妊婦など）
やＴＢＧの減少（例えばネフローゼなど）でも変化する
ので血中遊離型Ｔ₄ （またはＴ₃ ）を測定することが求
められている。こうした血中遊離型Ｔ₃ （またはＴ₄ ）
は、ＴＢＰと複雑な平衡関係にあり、その量を正確に測
定することは重要である。

【００１７】こうして本発明の好適な一つの具体的態様
は、標識として３，５，３’−トリヨードチロニン、チ
ロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたも
のを有すると共に標識としてアクリジニウム塩を有する
標識されている新規なアルカリフォスファターゼ（以
下、単に「Ｔ₃ （またはＴ₄ ）−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コン
ジュゲート」という。）及びその製造法、さらにはその
新規な標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲート
からなることを特徴とするＴ₃ （またはＴ₄ ）測定系用
試薬並びにその試薬を用いることを特徴とするＴ₃ （ま
たはＴ₄ ）の特異的結合測定法に関する。

【００１８】さらに本発明のＴ₃ （またはＴ₄ ）の特異
的結合測定法は、３，５，３’−トリヨードチロニン、
チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれた
ものを標識として有すると共にアクリジニウム塩を標識
として有するところの標識されているアルカリフォスフ
ァターゼ、すなわちＴ₃ （またはＴ₄ ）−ＡＬＰ−Ａｃ
ｒ・コンジュゲートと、検体中の３，５，３’−トリヨ
ードチロニンあるいはチロキシンとが、その特異的結合
反応試薬、好ましくは抗Ｔ₃ 抗体（または抗Ｔ₄ 抗体）
に対して競合的に反応して結合することを利用する。チ
ロキシン（Ｔ₄ ）は３，５，３’−トリヨードチロニン
よりもチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）への結合能
が約２０倍大きいため、すでに結合しているトリヨード
チロニン（Ｔ₃ ）に大きな影響、例えばそれと置換する
などするし、トリヨードチロニン（Ｔ₃ ）に較べ、チロ
キシン（Ｔ₄ ）はチロキシン結合プレアルブミン（ＴＢ
ＰＡ）の影響をより大きく受けることが知られているか
ら、標識としては、３，５，３’−トリヨードチロニン
の方が好ましく使用できる。

【００１９】本発明で使用されるアルカリフォスファタ
ーゼ（「アルカリ性フォスファターゼ」ともいう）とし
ては、例えばウシ小腸や大腸菌由来のものが挙げられる
が、アルカリフォスファターゼは動物の組織、例えば
骨、腸粘膜、腎臓、乳腺などに広く分布する。こうした
アルカリフォスファターゼは遺伝子組換え技術を利用し
て得られたものであることもできる。ウシ小腸由来アル
カリフォスファターゼ及び大腸菌由来アルカリフォスフ
ァターゼは本発明で好ましく使用される。

【００２０】本発明で使用される低分子化合物でアルカ
リフォスファターゼを標識するにあたっては、当該分野
で汎用されている方法あるいはそれらを修飾改変した方
法を用いることができ、例えば共有結合などの化学的結
合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせて適用し
て行うことができる。共有結合により化学的に結合せし
めるには、通常結合剤を用いる。例えば、Ｔ₃ 又はその
誘導体あるいはＴ₄ 又はその誘導体でアルカリフォスフ
ァターゼを標識するにあたっては、例えば共有結合など
の化学的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わ
せて適用して行うことができる。共有結合により化学的
に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。

【００２１】化学的な結合剤としては、通常の当業者に
知られたものの中から選択することができるが、例え
ば、グルタルアルデヒド、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジル
ジチオ）プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−
アセチルメルカプトアセテート、Ｎ−スクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイ
ミドヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル４−ヨード
アセチルアミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル
３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンネート、Ｎ
−スクシンイミジル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ
−スクシンイミジル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−
スクシンイミジル （ｐ−マレイミドフェニル）アセテ
ート、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）ブチレートなどが挙げられ、さらに６−マレイミ
ドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、コハ
ク酸等の活性エステル、トリアジンの活性エステル、ス
ルホン酸エステル誘導体等が挙げられるが、これらに限
定されるものではない。

【００２２】標識するにあたっては、本発明で使用され
る低分子化合物とアルカリフォスファターゼとの間に、
スペーサーを導入することもできる。例えば、Ｔ₃ 又は
Ｔ₄とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサー
を導入することもできる。スペーサーとしては、炭素数
１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１
２の直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、
アミド基などが挙げられる。このほか目的に応じ当該分
野で広く知られたものの中から適宜選択して用いること
ができる。一つの具体的な態様では、低分子化合物をコ
ハク酸イミドなど活性化酸イミドなどで活性化した誘導
体とした後、この活性化誘導体をアルカリフォスファタ
ーゼと反応させて標識することができる。なお、低分子
化合物は必要に応じ保護基で保護されていることができ
る。

【００２３】例えば、Ｔ₃ 誘導体をＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＨＳ）などで活性化し、次にアルカリフ
ォスファターゼと反応させて標識できる。反応にあたっ
ては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）などの共存下にその処
理を行うことができる。Ｔ₃ の誘導体あるいはＴ₄ の誘
導体としては、アセチル基などのアシル基でアミノ基が
保護されたもの、Ｔ₃ 又はＴ₄ にスペーサー残基の結合
せしめられているものなど、Ｔ₃ 又はＴ₄ のうちに共有
結合を可能にせしめる基を導入してあるものなどが挙げ
られる。

【００２４】標識アルカリフォスファターゼ中の標識低
分子化合物の数は、通常１個以上で十分である。これら
の数は、通常平均値として示される。例えば低分子化合
物標識は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度ま
で導入することができるが、その導入数が多いと、例え
ば抗体などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎ
る場合もある。好ましくは標識低分子化合物の数は、標
識アルカリフォスファターゼ中に約１〜２個である。代
表的な例では、標識アルカリフォスファターゼ中の標識
Ｔ₃ 又はＴ₄ の数は、通常１個以上で十分である。これ
らの数は、通常平均値として示される。例えば標識Ｔ₃
は標識アルカリフォスファターゼ中に６個程度まで導入
することができるが、その導入数が多いと、例えば抗体
などの特異的結合体との反応性が大きくなりすぎる場合
もある。好ましくは標識Ｔ₃ の数は、標識アルカリフォ
スファターゼ中に約１〜２個である。

【００２５】アクリジニウム塩でアルカリフォスファタ
ーゼを標識するにあたっては、当該分野で汎用されてい
る方法を用いることができ、例えば共有結合などの化学
的結合のうちから好適な方法を必要に応じ組合わせてそ
れを適用して行うことができる。共有結合により化学的
に結合せしめるには、通常結合剤を用いる。化学的な結
合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選
択することができ、例えば、上記低分子化合物でアルカ
リフォスファターゼを標識するにあたって用いられるも
の等が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。例えば１０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カル
ボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド塩
をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などで活性
化し、活性化アクリジニウムエステルとし、次にアルカ
リフォスファターゼと緩衝液中で反応させるなどして標
識できる。反応にあたっては、ＥＤＣなどの共存下にそ
の処理を行うことができる。

【００２６】標識アルカリフォスファターゼ中の標識ア
クリジニウム塩の数は、通常１個以上で十分である。こ
れらの数は、通常平均値として示される。典型的な例で
は標識アクリジニウム塩は標識アルカリフォスファター
ゼ中に１０個程度まで導入することができるが、その導
入数を増加させても、標識に基づくカウント数は増加す
るものの、非特異的吸着の増加は小さいことから、より
高い感度を達成しうる。標識アクリジニウム塩の数は、
標識アルカリフォスファターゼ中に約５個程度までで
は、例えば標識Ｔ₃ などの導入に不利な点はなく、適宜
測定感度の高いものを選ぶことが可能である。

【００２７】標識するにあたっては、アクリジニウム基
とアルカリフォスファターゼとの間に、スペーサーを導
入することもできる。スペーサーとしては、炭素数１〜
６の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、炭素数２〜１２の
直鎖又は分岐鎖のアルキレンオキシアルキレン基、アミ
ド基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい脂環式
基、炭素数６〜２０の置換されていてもよい芳香族基な
どが挙げられる。このほか目的に応じ当該分野で広く知
られたものの中から適宜選択して用いることができる。
本発明のコンジュゲートを製造するにあたっては、先ず
アルカリフォスファターゼをアクリジニウム塩で標識
し、つぎに得られたアクリジニウム塩で標識されている
アルカリフォスファターゼ（以下、単に「ＡＬＰ−Ａｃ
ｒ・コンジュゲート」という。）を低分子化合物で標識
し、低分子化合物−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを
得ることができる。標識の順序は任意に選択することが
でき、例えば低分子化合物でアルカリフォスファターゼ
を標識し、つぎに得られた標識アルカリフォスファター
ゼをアクリジニウム塩で標識し、低分子化合物−ＡＬＰ
−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。

【００２８】より具体的な態様では、本発明のコンジュ
ゲートを製造するにあたっては、先ずアルカリフォスフ
ァターゼをアクリジニウム塩で標識し、つぎに得られた
アクリジニウム塩で標識されているアルカリフォスファ
ターゼ（ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート）をＴ₃ 又は
その誘導体あるいはＴ₄ 又はその誘導体で標識し、Ｔ₃
−ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ₄ −ＡＬＰ
−Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。同様に
標識の順序は任意に選択することができ、例えばＴ₃ 又
はその誘導体あるいはＴ₄ 又はその誘導体でアルカリフ
ォスファターゼを標識し、つぎに得られた標識アルカリ
フォスファターゼをアクリジニウム塩で標識し、Ｔ₃ −
ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートまたはＴ₄ −ＡＬＰ−
Ａｃｒ・コンジュゲートを得ることができる。

【００２９】本発明においては特異的結合反応にあずか
る特異的結合反応体としては、例えば抗体などが挙げら
れるが、特異的結合反応することのできるものであれば
特に制限はない。抗体は常法により得ることができ、例
えば村松繁、他編、実験生物学講座１４、免疫生物学、
丸善株式会社、昭和６０年、日本生化学会編、続生化学
実験講座５、免疫生化学研究法、東京化学同人、１９８
６年、日本生化学会編、新生化学実験講座１２、分子免
疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補体、東京化学同人、１９９
２年などに記載の方法に準じて、例えばウマ、ウシ、ヒ
ツジ、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスなどを免疫するな
どして得たり、モノクローナル抗体であることもでき、
これらは単独でもあるいはこれらを組合せて用いること
も任意にできる。これら抗体は、必要なら、ペプシン、
パパインなどの酵素で消化して、Ｆ（ａｂ’）₂ 、Ｆａ
ｂとして使用してもよい。抗Ｔ₃ モノクローナル抗体ま
たは抗Ｔ₄ モノクローナル抗体としては、好ましくはマ
ウスミエローマ細胞を用いて細胞融合技術を利用して得
られたモノクローナル抗体であってもよいことはいうま
でもない。本発明で用いられる抗体としては、抗Ｔ₃ 抗
体または抗Ｔ₄ 抗体を好ましく用いることができるが、
測定対象に合わせて各種の抗体が特に限定されることな
く用いることができる。抗Ｔ₃ 抗体または抗Ｔ₄ 抗体
は、好ましくは、Ｔ₃ またはＴ₄ を適当なキャリア・タ
ンパク質、例えばアルブミン、ＴＢＧなどとコンジュゲ
ートを形成したものを抗原として用いて免疫することに
より得られる。

【００３０】特異的結合反応試薬は、Ｂ／Ｆ分離を容易
にするために、固相化することができる。本発明におい
て特異的結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応
体は、必要に応じて、固定化用担体に固定しておき、こ
の固相化担体を、分析対象としての試料と接触させ、こ
うして固定担体に固定された特異的結合をなす該反応体
と、分析試料中の標識低分子化合物等とを特異的に結合
反応せしめ、この特異的に結合した標識低分子化合物を
検知することにより行うことができる。例えば、特異的
結合反応にあずかる抗体などの特異的結合反応体は、必
要に応じて、固定化用担体に固定しておき、この固相化
担体を、分析対象としての甲状腺ホルモンを含有する試
料と接触させ、こうして固定担体に固定された抗Ｔ₃ 抗
体または抗Ｔ₄ 抗体あるいは該反応体と、分析試料中の
標識Ｔ₃ またはＴ₄ 等とを特異的に結合反応せしめ、こ
の特異的に結合した標識Ｔ₃ またはＴ₄ を検知すること
により行うことができる。

【００３１】ここで用いることが出来る不溶性又は固体
の担体としては、固相化用担体として広く知られたもの
が挙げられ、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化
ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、テフ
ロン、ポリアセタール、ポリアクリルアミド、ポリメタ
クリレート、ポリアクリレート、スチレン−メタクリレ
ート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロ
レイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体
等のポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエ
ポキシ樹脂など合成樹脂、寒天、アガロース、架橋アガ
ロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、紙、セルロー
ス、ニトロセルロース、カルボキシルセルロースなどの
セルロースエステルあるいは混合セルロースエステル、
デキストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿な
ど、重合アミノ酸、多糖等の天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素などの高分
子、それらの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガ
ラス、シリカゲル、アルミナ、カオリン、タルク、シリ
カ−アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸バリウム、
硫酸マグネシウムなどから選ばれたものであり、粒子、
微粒子、膜、ビーズ、チューブ、プレート、マイクロプ
レート、マイクロタイター・ウェル、マイクロチュー
ブ、ストリップ等の形状のものがある。さらには赤血
球、ラテックス粒子、乳剤などが挙げられる。

【００３２】固相化の方法としては、当該分野で汎用さ
れている方法を用いることができ、例えばイオン相互作
用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学的
結合あるいはそれらを組み合わせて適用して行うことが
できる。化学的な結合剤としては、通常の当業者に知ら
れたものの中から選択することができるが、例えば、上
記標識化に用いられる結合剤などが挙げられる。

【００３３】本発明においては、酵素免疫測定系などを
利用する場合、例えば、検知用試薬として、ウンベリフ
ェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフェート、Ｎ
ＡＤＰ、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン誘導体など
を用いることができる。また化学発光免疫測定法では、
測定時に発光反応剤、例えば過酸化水素、例えば約０．
０１％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナ
トリウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナ
トリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターなどを
用いて測定を行うことができる。

【００３４】アクリジニウム塩としては、当該分野で汎
用されていたり、通常の当業者に知られたものの中から
選択することができ、例えば特開昭６２−３９５９８号
公報、特開昭６２−６１９６９号公報、特開昭６３−５
７５７２号公報、特開昭６３−１０１３６８号公報、特
開昭６３−１１２５６４号公報、特開平１−２６１４６
１号公報、英国特許明細書第１，４６１，８７７号、米
国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載のアク
リジニウム塩などが挙げられる。特に、特開昭６３−１
１２５６４号公報、米国特許明細書第３，５３９，５７
４号などに記載の１０−アルキルまたは１０−（３−ス
ルフォプロピル）−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ
−トシル−９−アクリジニウム−９−カルボキサミド塩
などは代表的な化学発光標識として挙げられる。

【００３５】本発明の測定法においては、緩衝剤、希釈
液又は希釈剤、さらには界面活性剤などを共存させるな
どして用いることもでき、それに用いる測定用試薬は保
存剤などを加えて保存されてあるものであることができ
る。緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、リン酸緩
衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒ
ｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナトリウム
液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−
（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラジ
ン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＢ
ＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１−プロパ
ンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プロ
パンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−
ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（Ｂ
ＥＳ）液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２
−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＡ）液、Ｎ−（２−ア
セトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥ
Ａ）液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独で
用いることができるし、任意に二種以上を配合しても用
いることができる。

【００３６】保存剤としては、例えばナトリウムアジ
ド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明
の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清
アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ
血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例
えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー
蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドンなどからなる群から選ばれたものを添加することが
できる。これらは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／
ｖの範囲で添加することができる。

【００３７】本発明においては、試薬は単一の容器ある
いは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて
用いるようになっていてもよい。本発明の測定では、好
ましくは上記のようにして製造されたＴ₃ 又はその誘導
体あるいはＴ₄ 又はその誘導体で標識され且つアクリジ
ニウム塩で標識されたアルカリフォスファターゼと抗Ｔ
₃ 抗体または抗Ｔ₄ 抗体とを用いて、被検体試料中の遊
離のＴ₃ またはＴ₄ を測定する。さらには、被検体試料
をフロセミド〔４−クロロ−Ｎ−（２−フリルメチル）
−５−スルファモイルアントラニル酸〕、８−アニリノ
−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）などで前処理
し、ＴＢＰとの結合を解離することにより、総Ｔ₃ また
はＴ₄ の測定も可能である。ＡＮＳと同様な目的で使用
されるものとしては、３−（４−アニリノ−１−ナフチ
ルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（ＡＮＮＤ
Ｓ）、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｔ
ＮＢＳ）、ナフタレンスルホン酸、チメロサール、５，
５−ジフェニル−２−チオヒダントイン、ジアゼパム、
サリチル酸ナトリウム、プロクロルペラジンなどが挙げ
られる。測定方法は、例えば、被検体試料を抗Ｔ₃ 抗体
または抗Ｔ₄ 抗体と反応せしめ、次に一定量の標識アル
カリフォスファターゼを添加し、抗体に結合した標識ア
ルカリフォスファターゼ量、又は遊離の標識アルカリフ
ォスファターゼの量を、化学発光を利用した免疫測定検
知法あるいは酵素免疫測定検知法を適用して測定すれば
よい。

【００３８】本発明の測定にあたり、抗体、被検体試
料、標識アルカリフォスファターゼの添加順序には特に
制限はなく、被検体試料を抗体と標識アルカリフォスフ
ァターゼのどちらと先に反応させるか、あるいは同時に
反応させるか、また途中でＢ／Ｆ分離を行うか否かな
ど、適宜必要に応じ行うことが出来る。本発明で用いら
れる測定対象試料検体としては、特に全血、血清、血漿
などを好適に用いることが出来、特には血清、血漿が好
ましく使用される。

【００３９】

【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明する。特に本実施例では低分子化合物の一つとして
Ｔ₃ 又はＴ₄ を取り上げ、Ｔ₃ 又はＴ₄ 特異的結合測定
について本発明の理解を助けるべく説明するが、本発明
はこれに限定されることのないのは言うまでもない。 実施例１ ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造 １０−メチル−Ｎ−トシル−Ｎ−（２−カルボキシエチ
ル）−９−アクリジニウムカルボキサミド２ｍｇをジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）中でＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド５．７５ｍｇ及び９．６ｍｇの１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エス
テルのＤＭＦ液５μｌを、０．１％の３−〔（３−コラ
ミドプロピル）−ジメチルジメチルアミノ〕−１−プロ
パン−スルホン酸（ＣＨＡＰＳ）含有の０．１Ｍのリン
酸塩緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）ｐＨ８．０中
のウシ小腸アルカリフォスファターゼと反応させた。室
温で約１０分間攪拌後、セントリコン−３０（Ｃｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ−３０；アミコン社製）を使用して濃縮洗浄
を行い、そして１０ｍＭのＰＢＳ（０．１％ＣＨＡＰ
Ｓ、ｐＨ６．３）緩衝液に交換した。その後セファデッ
クスＧ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマ
シア社製）で精製を行った後、再びセントリコン−３０
を使用して濃縮を行い、シリカゲルを担体とした高速液
体クロマトグラフィーで精製し、ＡＬＰ−Ａｃｒ・コン
ジュゲートを得た。この時高速液体クロマトグラフィー
精製を行わなくともほとんど不純物は存在しない。

【００４０】実施例２ Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの製造 ２０ｍｇのＮ−アセチル−Ｔ₃ をＤＭＦ中でＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド４ｍｇ及び８ｍｇの１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
（ＥＤＣ）のＤＭＦ液と反応させ、得られた活性化エス
テルのＤＭＦ液１２μｌを、５０ｍＭのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン−塩酸液（ｐＨ７．４）中の
実施例１で得られたＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート及
びトリエチルアミン、ＤＭＦを含む反応液に添加し、室
温で１８時間反応させた。得られた液をセファデックス
Ｇ−２５Ｍ（Ｃｏｌｕｍｎ ＰＤ−１０；ファルマシア
社製）で精製した後、シリカゲルを担体とした高速液体
クロマトグラフィーで精製し、Ｎ−アセチル−Ｔ₃ −Ａ
ＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートを得た。なお、高速液体
クロマトグラフィーでの精製をしていないものも、使用
することは可能である。

【００４１】実施例３ Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートの安定性 実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃ
ｒ・コンジュゲートについて安定性を見た。比較として
Ｔ₃ 標識アクリジニウム（Ｔ₃ −Ａｃｒ・コンジュゲー
ト）を用いた。Ｎ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・
コンジュゲート及び対照Ｔ₃ −Ａｃｒ・コンジュゲート
は、以下の希釈用緩衝液で希釈した。 希釈用緩衝液Ａ：０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａ
Ｎ₃ 、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ₂ 及
び３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５０
ｍＭＰＢＳ（ｐＨ６．３） 希釈用緩衝液Ｂ：０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａ
Ｎ₃ 、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．１ｍＭのＺｎＣｌ₂ 及
び３％のＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４） 標識試料の希釈液を約２〜８℃及び約４５℃に２日間及
び８日間保存し、ついでグラスファイバーメンブラン
（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐ
ａｎｙ製）に添加付着させ、次に発光反応剤、例えば約
０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリ
ウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて測
定する。結果を第１表に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】本発明のＴ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュ
ゲートは、溶液中での安定性が改善されていることが確
かめられた。

【００４４】実施例４ Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲートのグラスファイ
バーメンブラン上への非特異的吸着性試験及び抗Ｔ₃ 抗
体または抗Ｔ₄ 抗体との反応性試験 グラスファイバーメンブラン（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒ
ｔｈ ＆ ＶｏｓｅＣｏｍｐａｎｙ製）にそれぞれ実施
例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・
コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、５０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、
約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナト
リウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用いて
測定する。比較としてＴ₃ −Ａｃｒ・コンジュゲートを
用いた。こうして非特異的吸着反応量（ＮＳＢ）を求め
た。

【００４５】次にＴ₃ 又はＴ₄ とウシチログロブリンと
の共有結合体で免疫したヤギから得られた抗Ｔ₃ 血清又
はヒツジから得られた抗Ｔ₄ 血清をラテックス微粒子に
結合させ、固相化抗Ｔ₃ 抗体粒子又は固相化抗Ｔ₄ 抗体
粒子試薬とした。この固相化抗Ｔ₃ 抗体粒子又は固相化
抗Ｔ₄ 抗体粒子をグラスファイバーメンブラン上に添加
し、次いでそれぞれ実施例２で得られたＮ−アセチル−
Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液３
０μｌを添加し約３８℃で２０分間反応させた後、５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した
後、約０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化
ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターを用
いて測定する。比較としてＴ₃ −Ａｃｒ・コンジュゲー
トを用いた。こうして抗体との反応性を求めた。得られ
た結果を、グラスファイバーメンブラン上に標識試料の
希釈液３０μｌに約０．４％過酸化水素を含む約０．２
５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加えた時に得られる値
（トータル・カウント）と比較した。 非特異的吸着反応率（ＮＳＢ％）＝ＮＳＢ／トータル・
カウント 反応率（％）＝抗体との反応性／トータル・カウント 結果を表２に示す。

【００４６】

【表２】

【００４７】本発明のＴ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・コンジュ
ゲートは、疎水性物質であるグラスファイバーメンブラ
ンとの間で非特異的吸着反応が減少し、抗Ｔ₃ 抗体や抗
Ｔ₄抗体に対し優れた親和力を有することが確かめられ
た。

【００４８】実施例５ 遊離Ｔ₃ 又はＴ₄ の化学発光免疫測定法 遊離Ｔ₃ を含有するヒト血漿５０μｌにそれぞれ実施例
４の固相化抗Ｔ₃ 抗体粒子溶液３０μｌを添加し、約３
８℃で約２０分間インキュベーション処理し、次に実施
例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃｒ・
コンジュゲート試料の希釈液３０μｌを添加し、約３８
℃で約１０分間インキュベーション処理する。５０ｍＭ
のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、約
０．４％過酸化水素を含む約０．２５Ｎの水酸化ナトリ
ウム水溶液５０μｌを添加処理しながら、ルミノメータ
ーを用いて測定する。同様に遊離Ｔ₄ を含有するヒト血
清に実施例４の固相化抗Ｔ₄ 抗体粒子溶液を添加して測
定する。結果を表３に示す。

【００４９】

【表３】

【００５０】実施例６ 遊離Ｔ₃ 又はＴ₄ の酵素免疫測定法 遊離Ｔ₃ を含有するヒト血漿７５μｌにそれぞれ実施例
４の固相化抗Ｔ₃ 抗体粒子溶液５０μｌを添加し、５０
ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１２５μｌを
加え、約３４℃で約３０分間インキュベーション処理
し、次に実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬ
Ｐ−Ａｃｒ・コンジュゲート試料の希釈液６０μｌを添
加し、約３４℃で約３分間インキュベーション処理す
る。５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗
浄した後、０．１ｍＭの４−メチルウベリフェリルホス
フェートを含む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）５０μｌを添加処理してから、約３４℃で約１
０分間インキュベーション処理する。酵素反応を停止
後、励起を３６０ｎｍの波長で行い、４５０ｎｍの波長
で測定をおこなった。

【００５１】同様に遊離Ｔ₄ を含有するヒト血清２５μ
ｌにそれぞれ実施例４の固相化抗Ｔ₄ 抗体粒子溶液３０
μｌを添加し、トリス−塩酸緩衝液１７０μｌを加え、
約３４℃で約１０分間インキュベーション処理し、次に
実施例２で得られたＮ−アセチル−Ｔ₃ −ＡＬＰ−Ａｃ
ｒ・コンジュゲート試料の希釈液５０μｌを添加し、約
３４℃で約２０分間インキュベーション処理する。同様
に螢光の測定を行う。結果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、得られたコンジュゲー
トは親水性であるため、非特異的吸着性が減少せしめら
れており、例えばＢ／Ｆ分離などに用いられるグラスフ
ィルターなどに非特異的に吸着してしまうことが少な
く、さらに溶液中での安定性が良好で、その保存性に優
れ、試薬としての信頼性が高い。特に例えば、中性〜弱
アルカリ性の溶液中でも比較的安定で優れた測定系を構
築できる。代表的な例では、本発明のコンジュゲート
は、通常繁用されるＴ₃ （Ｔ₄ ）−高分子複合物を免疫
原として産生される抗Ｔ₃ （Ｔ₄ ）抗体に対する親和性
が比較的良好で、測定の感度を高めることができる。さ
らに本発明の試薬は、アクリジニウム標識に基づくアク
リジニウム基の化学発光を利用した免疫測定系にも、酵
素免疫測定系などにも応用することができ、一つの試薬
でその場その場の状況に応じた多様な測定手法に適用す
ることが可能となり、特に測定の自動化を図るのに優れ
ている。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標識として低分子化合物及びアクリジニ
   ウム塩を有するアルカリフォスファターゼ。
2. 【請求項２】 アルカリフォスファターゼにスペーサー
   を介して結合している標識として低分子化合物及びアク
   リジニウム塩を有する請求項１記載のアルカリフォスフ
   ァターゼ。
3. 【請求項３】 （１）アクリジニウム塩をアルカリフォ
   スファターゼと反応させ、得られた標識としてアクリジ
   ニウム塩を有するアルカリフォスファターゼ・コンジュ
   ゲートを、低分子化合物と反応させるか、又は（２）低
   分子化合物とアルカリフォスファターゼと反応させ、得
   られた標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲート
   をアクリジニウム塩と反応させることにより得られた請
   求項１記載のアルカリフォスファターゼ。
4. 【請求項４】 （１）アクリジニウム塩をＮ−ヒドロキ
   シスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３
   −ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤ
   Ｃ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、
   得られたアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォス
   ファターゼ・コンジュゲートを、低分子化合物とＮＨＳ
   及びＥＤＣの存在下で反応させるか、又は（２）低分子
   化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び
   １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
   ルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスファ
   ターゼと反応させ、得られた標識アルカリフォスファタ
   ーゼ・コンジュゲートを、アクリジニウム塩とＮＨＳ及
   びＥＤＣの存在下で反応させることにより得られた請求
   項１記載のアルカリフォスファターゼ。
5. 【請求項５】 標識としての低分子化合物が、３，５，
   ３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘
   導体から成る群から選ばれたものである請求項１記載の
   アルカリフォスファターゼ。
6. 【請求項６】 アルカリフォスファターゼにスペーサー
   を介して結合している標識として３，５，３’−トリヨ
   ードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る
   群から選ばれたもの及びアクリジニウム塩を有する請求
   項１記載のアルカリフォスファターゼ。
7. 【請求項７】 （１）アクリジニウム塩をアルカリフォ
   スファターゼと反応させ、得られた標識としてアクリジ
   ニウム塩を有するアルカリフォスファターゼ・コンジュ
   ゲートを、３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキ
   シン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものと
   反応させるか、又は（２）３，５，３’−トリヨードチ
   ロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から
   選ばれたものとアルカリフォスファターゼと反応させ、
   得られた標識アルカリフォスファターゼ・コンジュゲー
   トをアクリジニウム塩と反応させることにより得られた
   請求項１記載のアルカリフォスファターゼ。
8. 【請求項８】 （１）アクリジニウム塩をＮ−ヒドロキ
   シスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３
   −ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤ
   Ｃ）の存在下でアルカリフォスファターゼと反応させ、
   得られたアクリジニウム塩で標識されたアルカリフォス
   ファターゼ・コンジュゲートを、３，５，３’−トリヨ
   ードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る
   群から選ばれたものとＮＨＳ及びＥＤＣの存在下で反応
   させるか、又は（２）３，５，３’−トリヨードチロニ
   ン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群から選ば
   れたものをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及
   び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
   カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でアルカリフォスフ
   ァターゼと反応させ、得られた標識アルカリフォスファ
   ターゼ・コンジュゲートを、アクリジニウム塩とＮＨＳ
   及びＥＤＣの存在下で反応させることにより得られた請
   求項１記載のアルカリフォスファターゼ。
9. 【請求項９】 （１）標識としてアクリジニウム塩を有
   する標識アルカリフォスファターゼを、低分子化合物で
   標識するか、又は（２）標識として低分子化合物を有す
   る標識アルカリフォスファターゼを、アクリジニウム塩
   で標識することを特徴とする低分子化合物及びアクリジ
   ニウム塩を標識として有する標識アルカリフォスファタ
   ーゼの製造方法。
10. 【請求項１０】 （１）標識としてアクリジニウム塩を
    有する標識アルカリフォスファターゼを、３，５，３’
    −トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘導体
    から成る群から選ばれたもので標識するか、又は（２）
    標識として３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキ
    シン及びそれらの誘導体から成る群から選ばれたものを
    有する標識アルカリフォスファターゼを、アクリジニウ
    ム塩で標識することを特徴とする標識として３，５，
    ３’−トリヨードチロニン、チロキシン及びそれらの誘
    導体から成る群から選ばれたもの及びアクリジニウム塩
    を有する請求項９記載の標識アルカリフォスファターゼ
    の製造方法。
11. 【請求項１１】 標識として低分子化合物及びアクリジ
    ニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼを試薬
    として用いることを特徴とする低分子化合物の特異的結
    合測定試薬。
12. 【請求項１２】 標識として３，５，３’−トリヨード
    チロニン、チロキシン及びそれらの誘導体から成る群か
    ら選ばれたもの及びアクリジニウム塩を有する標識アル
    カリフォスファターゼを試薬として用い、トリヨードチ
    ロニンまたはチロキシンの特異的結合測定試薬であるこ
    とを特徴とする請求項１１記載の低分子化合物の特異的
    結合測定試薬。
13. 【請求項１３】 測定されるべき検体試料中の低分子化
    合物を特異的結合反応を利用して測定する方法におい
    て、検体試料を（１）標識として低分子化合物と共にア
    クリジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ
    及び（２）低分子化合物と特異的に結合反応をする反応
    体と接触せしめ、上記（１）の標識アルカリフォスファ
    ターゼの活性もしくはアクリジニウムの活性を検知して
    測定の指標とすることを特徴とする低分子化合物の特異
    的結合測定方法。
14. 【請求項１４】 測定されるべき検体試料中のトリヨー
    ドチロニンあるいはチロキシンを特異的結合反応を利用
    して測定する方法であって、検体試料を（１）標識とし
    て３，５，３’−トリヨードチロニン、チロキシン及び
    それらの誘導体から成る群から選ばれたものと共にアク
    リジニウム塩を有する標識アルカリフォスファターゼ及
    び（２）トリヨードチロニンあるいはチロキシンと特異
    的に結合反応をする反応体と接触せしめ、上記（１）の
    標識アルカリフォスファターゼの活性もしくはアクリジ
    ニウムの活性を検知して測定の指標とし、かつトリヨー
    ドチロニンまたはチロキシンの特異的結合測定方法であ
    ることを特徴とする請求項１３記載の低分子化合物の特
    異的結合測定方法。