CN113686841A - 定量检测甲状腺素结合力试剂盒及其制备方法、检测方法 - Google Patents

定量检测甲状腺素结合力试剂盒及其制备方法、检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明为定量检测甲状腺素结合力试剂盒及其制备方法、检测方法，所述试剂盒包括：甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂和甲状腺素结合力质控品，所述甲状腺素结合力校准品中含有TBG和甲状腺素T4；所述甲状腺素结合力试剂1号包含有生物素标记的T4‑BSA、未标记T4抗原；所述甲状腺素结合力试剂2号含有碱性磷酸酶标记的Anti‑T4抗体；所述甲状腺素结合力磁分离试剂含有链霉亲和素标记的磁微粒。本发明能够以较先进的免疫分析技术制备得到，且能够实现甲状腺素结合力的定量测定。

Description

定量检测甲状腺素结合力试剂盒及其制备方法、检测方法
技术领域
本发明涉及医用诊断试剂技术领域，特别是涉及一种用于检测人体中甲状腺素结合力的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法、检测方法。
背景技术
甲状腺素结合力(T-uptake)测定可了解甲状腺素的结合位点数。由总甲状腺素T4和TBI(甲状腺素结合指数，＝T-uptake测定结果)的商得出的游离甲状腺素指数(FT4I)，反映了运载蛋白质含量和甲状腺素含量这两种变化因素。测定甲状腺素含量是鉴别甲状腺功能正常与否的重要手段，大部分甲状腺素与其运载蛋白结合，结合部分和游离部分处于平衡状态。很多情况下，尽管游离的甲状腺素在正常范围，但运载蛋白质含量的变化可导致总甲状腺素测定值的改变，只有在T-uptake正常的情况下，测定总甲状腺素才能提供准确的信息。因此，在结合力正常的情况下，甲状腺素和游离甲状腺素检测结果能反应出检测样本的真实情况，而当结合力存在不饱和或者过饱和的情况时，甲状腺素和游离甲状腺素的检测结果是失真的，偏移的方向及幅度与结合力的大小相关，对于甲状腺结合力的测定相当重要。
磁微粒化学发光免疫分析技术目前在国内被广泛应用，检测系统将化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合，但目前，国内使用磁微粒化学发光分析法在甲状腺素结合力免疫分析产品的应用仍未见报道。
发明内容
本发明旨在提供一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒及制备方法、检测方法，其能够以较先进的免疫分析技术制备得到，且能够实现甲状腺素结合力的定量测定。
基于上述目的，本发明是通过如下技术方案来实现：
一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒，所述试剂盒包括：甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂和甲状腺素结合力质控品，其特征在于：
所述甲状腺素结合力校准品中含有TBG和甲状腺素T4；
所述甲状腺素结合力试剂1号包含有生物素标记的T4-BSA、未标记T4抗原；
所述甲状腺素结合力试剂2号含有碱性磷酸酶标记的Anti-T4抗体；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂含有链霉亲和素标记的磁微粒。
甲状腺素结合力试剂1号中未标记T4的含量与校准品中TBG的浓度相关，未标记T4与校准品中TBG的摩尔浓度比值在(8-24)范围内，TBG的浓度与设定的溯源值相关。
所述甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂和甲状腺素结合力质控品用的稀释液中均含有PC950。
所述甲状腺素结合力校准品和甲状腺素结合力试剂1号的稀释液的防腐剂包括BND和PC950(ProClin 950)，二者的质量浓度比为PC950：BND＝(8-12):1。
甲状腺素结合力试剂2号的稀释液的防腐剂包括甲基异噻唑啉酮、BND和PC950，每1L稀释液中含0.2‰-0.5‰甲基异噻唑啉酮、0.8‰-1.2‰PC950、0.1‰-0.5‰BND。
所述试剂盒检测原理为：将待测样本、甲状腺素结合力试剂1号混合温育，样本中的甲状腺素结合球蛋白TBG与甲状腺激素T4形成TBG-T4复合物，再加入所述甲状腺素结合力试剂2号，TBG-T4复合物与生物素标记的T4-BSA竞争甲状腺素结合力试剂2号中的Anti-T4-ALP形成免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合的抗体和杂质；加入化学发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度RLU；在一定范围内RLU与样本中TBG浓度呈正比，与T4浓度成反比，通过RLU就能从标准曲线上计算出T4/TBG的比值。
所述试剂盒检测过程用试剂包括：甲状腺素结合力试剂盒、清洗液、化学发光底物液。
所述甲状腺素结合力校准品包括6个冻干校准瓶，所述冻干校准瓶内目标浓度：0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0，1.0mL纯化水复溶后，各点TBG浓度：200ng/mL；甲状腺素T4浓度：0、40、80、160、320、400ng/mL含硫酸庆大霉素的磷酸盐缓冲液；
所述甲状腺素结合力试剂1号为1个容积为7mL的含有生物素标记的T4-BSA(甲状腺素T4与牛血清白蛋白复合物)、未标记T4和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的塑料瓶；
所述甲状腺素结合力试剂2号为1个容积为7mL的含有碱性磷酸酶标记的Anti-T4抗体(Anti-T4-ALP)和牛IgG(免疫球蛋白)的Tris缓冲液的塑料瓶；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂为1个容积为7mL的含有链霉亲和素标记的磁微粒和动物血清的Tris缓冲液塑料瓶；
所述甲状腺素结合力质控品包括2个容积为3mL的冻干质控瓶，按要求复溶后，所述质控瓶内的浓度的范围分别为：0.42-0.78和1.05-1.95(测值为比值，无单位)。
本发明采取的又一技术方案是：一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
步骤1.制备所述甲状腺素结合力校准品包括：甲状腺素结合力校准品稀释液配制步骤和甲状腺素结合力校准品配制步骤：
所述甲状腺素结合力校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水、NaH2PO4 2.59g、Na2HPO4 0.36g、KCl 11.67g和5g的硫酸庆大霉素和0.2g的BND到容器中，搅拌混合均匀，再加1.5mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为6.5-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力校准品的配制步骤包括：
用甲状腺素结合力校准品稀释液将TBG和T4按照下述的浓度配制，共六个浓度点；
Figure BDA0003240913670000031
步骤2.制备所述甲状腺素结合力试剂1号包括：甲状腺素结合力试剂1号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂1号配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂1号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1mL的PC950和0.2g的BND，搅拌至完全溶解，将pH值调为6.0-8.0，再加入9.86g的牛血清白蛋白，加0.986g的酪蛋白，搅拌至完全溶解，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的甲状腺素结合力试剂1号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂1号的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照T4-BSA与生物素溶液质量比为10:1的比例在T4-BSA抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成T4-BSA-生物素连接物的反应液，将得到的T4-BSA-生物素连接物的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到T4-BSA-生物素连接物，分装后，-20℃冻存，备用；再用甲状腺素结合力试剂1号稀释液将T4-BSA-生物素连接物稀释到0.04-0.09μg/mL，形成连接物稀释液，将未标记的T4抗原稀释到连接物稀释液中，未标记的T4抗原浓度在0.02-0.05μg/mL范围内，得到甲状腺素结合力试剂1号；
步骤3.制备所述甲状腺素结合力试剂2号包括：甲状腺素结合力试剂2号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂2号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g Tris和0.2g的甲基异噻唑啉酮和0.2g的BND到容器中，拌混合均匀，再加2mL的PC950、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2搅拌至完全溶解，将pH值调为5.5-6.5，再加入5g的牛IgG，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的试剂2号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
将1mg的抗甲状腺素抗体(Anti-T4)和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后Anti-T4抗体，将活化后的抗体保存在2-8℃备用；取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用；再将活化的Anti-T4抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置10-16h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存，将Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.05-0.3μg/mL，得到甲状腺素结合力试剂2号；
步骤4.制备所述甲状腺素结合力磁分离试剂包括：甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤和甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
所述甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.6g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、30mL的新生牛血清10mL的特级马血清、10mL的山羊血清、10g的鱼皮凝胶和2mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.6-8.4，用纯化水定容至1L，使用0.22μm滤器过滤，将获得的磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.1mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁分离试剂稀释液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述甲状腺素结合力磁分离试剂；
步骤5.制备所述甲状腺素结合力质控品包括：甲状腺素结合力质控品基质和甲状腺素结合力质控品配制步骤：
基质选择总蛋白含量大于55mg/L的去激素人血清，调整pH为7.0-8.0，0.1‰-1.0‰的PC950作为防腐剂，保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力质控品配制步骤：将甲状腺功能减低和甲状腺功能亢进的样本分别混合并测试甲状腺素结合力的值，根据测试结果均值稀释到甲状腺素结合力质控品基质中，质控品1用甲状腺功能降低样本配制至0.6±0.12，质控品2用甲状腺功能亢进样本配制至1.5±0.3，得到甲状腺素结合力质控品1和质控品2，连续2天对其进行赋值，根据每个水平测值的±3SD，确定质控范围。
本发明还提供了一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒的检测方法，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：
步骤1.将甲状腺素结合力校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的拟合曲线；
步骤2.将甲状腺素结合力质控品放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的所述质控品的测试发光值和通过步骤1得到的拟合曲线拟合得到甲状腺素结合力质控品的TBI值；
步骤3.将待测样本放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的待测样本的TBI值。
进一步，本发明提供了所述的一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒的检测方法，所述步骤1、步骤2和步骤3均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步骤:
步骤1)加15μL校准品或质控品或待测标本至检测管中；
步骤2)加50μL的甲状腺素结合力试剂1号至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育15min；；
步骤3)加50μL的甲状腺素结合力试剂2号和甲状腺素结合力的磁分离试剂至步骤2)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育5min，进行磁分离，去上清；
步骤4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离去上清；
步骤5)重复步骤4)两遍；
步骤6)加200μL的化学发光底物至检测管中，混匀，检测发光强度。
在一定范围内RLU与甲状腺素浓度呈反比，与TBG浓度呈正比，通过四参数拟合标准曲线，再从标准曲线上读取待测样本的T4与TBG的比值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明试剂盒中使用生物素标记抗原，ALP标记抗体，再以以直径(1-3)μm的偶联有链霉亲和素的超顺磁性微粒作为分离试剂，ALP(碱性磷酸酶)催化底物发光后，通过仪器测量发光强度，将化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合，实现对甲状腺素结合力的定量测定。设置ALP与抗体结合，能够提高检测试剂精度和纯度，甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力标准品、质控品的具体组成使得该试剂盒的使用效期及检测结果的准确性能提供了有力保障。
2、本发明检测方法在传统的T4、FT4测试的基础上，反应了待测样本中TBG的水平，人体中运载蛋白质TBG含量的变化可导致总甲状腺素测定值的改变，因此，只有在甲状腺素结合力正常的情况下，测定总甲状腺素才能提供准确的信息。
3、甲状腺活性水平与未结合或游离激素浓度有关。由于TBG浓度相对稳定,所以总甲状腺素T4通常可以用来表示游离T4量。TBG浓度变化会影响到未被占据的TBG结合位点数,从而影响蛋白结合激素的水平,而激素游离水平可保持不变。在甲状腺机能减退过程中,如果结合蛋白相对不饱和,反映出甲状腺摄取值减小；而在甲状腺机能亢进过程中,如果结合蛋白非常之饱和,则会导致甲状腺摄取值增加。本发明标准品中引入TBG，同时在试剂1号中引入未标记的T4抗原，找到二者一个相适应的浓度结合点，二者的工作浓度相互配合，有助于保证检测结果的准确性，在本发明方法能定量检测甲状腺素结合力下，进而能保证在其正常情况下进行后续的检测。本发明试剂盒中的甲状腺素结合力试剂2号是碱性磷酸酶标记的Anti-T4抗体中，加入的牛IgG起到了一定到封闭作用，能够减弱抗原和抗体相互结合的随机撞击过程，既成功避免了非特异性反应，同时增加了反应体系的稳定性。
4、本发明试剂盒试剂中防腐剂组合使用，在不影响产品稳定性的情况下，完全代替了剧毒品叠氮钠，避免了危险品叠氮钠的操作过程和后期检测废液处理的风险，该试剂盒不会出现光照变色或不稳定的现象，本申请试剂盒稳定性更好。
5、本发明提供了一个新的检测视角，基于人体内蛋白间的相互协同或者相互抑制的情况，确实需要标志物相关蛋白水平进行了解和关注。试剂盒的最小检出量为0.01；线性检测范围，0.2-2.0；(2-8)℃冷藏效期为18个月；校准2品溯源至均值为1.0的血清参考盘。
6、本发明可根据临床大数据样本确定溯源值，能够生产出适用于不同性别、年龄、地域的针对性不同规格甲状腺素结合力试剂盒。该技术继承了以ELISA为代表的传统免疫检测技术无放射性污染、操作简便等优点，同时，由于采用了磁微粒作为分离载体，用ALP作为标记酶，选用高灵敏度发光底物在能级跃迁时的相对光子数作为检测信号，所以该试剂盒在特异性、灵敏度和重复性方面均表现出相对适用的优势。
附图说明
图1为本发明试剂盒的甲状腺素结合力校准品拟合曲线示意图；
图2为本发明所述的甲状腺素结合力的试剂盒线性范围评价的曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步解释本发明，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。
实施例1
一种使用磁微粒化学发光定量检测甲状腺素结合力的试剂盒，该试剂盒包括：甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂、甲状腺素结合力质控品和清洗浓缩液。
步骤1.制备所述甲状腺素结合力校准品包括：甲状腺素结合力校准品稀释液配制步骤和甲状腺素结合力校准品配制步骤：
所述甲状腺素结合力校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水、NaH2PO4 2.59g、Na2HPO4 0.36g、KCl 11.67g和5g的硫酸庆大霉素和0.2g的BND到容器中，搅拌混合均匀，再加0.5mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力校准品的配制步骤包括：
用甲状腺素结合力校准品稀释液将TBG和T4按照下述的浓度配制，共六个浓度点；
Figure BDA0003240913670000071
获得的校准品的标准曲线参见图1。
步骤2.制备所述甲状腺素结合力试剂1号包括：甲状腺素结合力试剂1号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂1号配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂1号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1mL的PC950和0.2g的BND，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.5，再加入9.86g的牛血清白蛋白，加0.986g的牛酪蛋白，搅拌至完全溶解，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的甲状腺素结合力试剂1号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂1号的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照T4-BSA与生物素溶液质量比为10:1的比例在T4-BSA抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成T4-BSA-生物素连接物的反应液，将得到的T4-BSA-生物素连接物的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到T4-BSA-生物素连接物，分装后，-20℃冻存，备用；再用甲状腺素结合力试剂1号稀释液将T4-BSA-生物素连接物稀释到0.06μg/mL，形成连接物稀释液，将未标记的T4抗原稀释到连接物稀释液中，未标记的T4抗原浓度在0.04μg/mL范围内，得到甲状腺素结合力试剂1号；
步骤3.制备所述甲状腺素结合力试剂2号包括：甲状腺素结合力试剂2号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂2号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g Tris和0.2g的甲基异噻唑啉酮和0.2g的
Figure BDA0003240913670000081
BND到容器中，拌混合均匀，再加2mL的PC950、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2搅拌至完全溶解，将pH值调为6.0，再加入5g的牛IgG，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的试剂2号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
将1mg的抗甲状腺素抗体(Anti-T4)和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后Anti-T4抗体，将活化后的抗体保存在2-8℃备用；取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用；再将活化的Anti-T4抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置12h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存，将Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.2μg/mL，得到甲状腺素结合力试剂2号；
步骤4.制备所述甲状腺素结合力磁分离试剂包括：甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤和甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
所述甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.6g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、30mL的新生牛血清10mL的特级马血清、10mL的山羊血清、10g的鱼皮凝胶和2mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为8.0，用纯化水定容至1L，使用0.22μm滤器过滤，将获得的磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.1mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁分离试剂稀释液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述甲状腺素结合力磁分离试剂；
步骤5.制备所述甲状腺素结合力质控品包括：甲状腺素结合力质控品基质和甲状腺素结合力质控品配制步骤：
基质选择总蛋白含量大于55mg/L的去激素人血清，调整pH为7.5，0.1‰-1.0‰的PC950作为防腐剂，保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力质控品配制步骤：将甲状腺功能减低和甲状腺功能亢进的样本分别混合并测试甲状腺素结合力的值，根据测试结果均值稀释到甲状腺素结合力质控品基质中，质控品1用甲状腺功能降低样本配制至0.6±0.12，质控品2用甲状腺功能亢进样本配制至1.5±0.3，得到甲状腺素结合力质控品1和质控品2，连续2天对其进行赋值，根据每个水平测值的±3SD，确定质控范围，本实施例两个质控范围分别是QC1：0.44-0.72；QC2：1.2-1.9。
本发明所述试剂盒的分析性能评价：
1)最低检出量
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU，RLU为相对发光值，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品A与相邻校准品B之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD所对应的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限。本方法的空白限不大于0.01。具体数据参见表1，A、B点拟合曲线。
表1 最低检出量评价
Figure BDA0003240913670000101
2)线性范围评价
将接近线性范围上限为2的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每一浓度的样本均重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，本方法的测量范围为0.2-2.0，相关系数r应≥0.9900。数据参见表2。
表2 线性范围评价
Figure BDA0003240913670000102
3)重复性评价
取本实施例中的试剂盒重复检测浓度为0.4、1.0和1.6的样本各10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数CV，本方法变异系数(CV)不大于8％。数据参见表3。
CV＝SD/M×100％......(2)
式中：CV—变异系数；SD—10次测量结果的标准差；M—10次测量结果的平均值。
表3 重复性评价
测定血清浓度(ng/mL) 测定次数 CV
0.4 10 6.06％
1.0 10 3.44％
1.6 10 1.29％
4)稳定性评价
取所述试剂盒分别进行(2-8)℃20个月稳定性实验，结果表明试剂盒标准品最低检出量、线性、重复性和质控品测值等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达18个月，数据见表4。
表4 试剂盒(2-8)℃稳定性评价结果
Figure BDA0003240913670000111
本发明提供的甲状腺素结合力(磁微粒化学发光)检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
对524例不同甲状腺功能状态的受试者的甲状腺摄取率(99mTc pertechnetalethyroid uptake，CTU)与其血清甲状腺激素水平相关性研究结果表明，CTU和血清甲状腺激素水平呈显著正相关。由于亚甲炎99mTc摄取与血清甲状腺激素水平呈“分离现象”，本研究也证实CTU和血清甲状腺激素水平呈显著负相关。故在排除亚甲炎患者后，479例甲状腺CTU和血清甲状腺激素水平的直线相关分析结果也显示两者呈显著正相关，提示甲状腺显像不仅能显示甲状腺的位置、形态和大小，通过全自动定量测定CTU，能反映甲状腺的功能状态和严重程度。由于定量测定CTU具有快速、简便、重复性好的优点，故本发明有较大的临床实用价值。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (10)

1.一种定量检测甲状腺素结合力的试剂盒，所述试剂盒包括：甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂和甲状腺素结合力质控品，其特征在于：
所述甲状腺素结合力校准品中含有TBG和甲状腺素T4；
所述甲状腺素结合力试剂1号包含有生物素标记的T4-BSA、未标记T4抗原；
所述甲状腺素结合力试剂2号含有碱性磷酸酶标记的Anti-T4抗体；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂含有链霉亲和素标记的磁微粒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，甲状腺素结合力试剂1号中未标记T4的含量与校准品中TBG的浓度相关，TBG的浓度与设定的溯源值相关；优选未标记T4与校准品中TBG的摩尔浓度比值为8-24。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲状腺素结合力校准品、甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号、甲状腺素结合力磁分离试剂和甲状腺素结合力质控品用的稀释液中均含有PC950。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲状腺素结合力校准品和甲状腺素结合力试剂1号的稀释液的防腐剂包括BND和PC950，二者的质量浓度比为PC950：BND＝(8-12):1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，甲状腺素结合力试剂2号的稀释液的防腐剂包括甲基异噻唑啉酮、BND和PC950，每1L稀释液中含0.2‰-0.5‰甲基异噻唑啉酮、0.8‰-1.2‰PC950、0.1‰-0.5‰BND。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测原理为：将待测样本、甲状腺素结合力试剂1号混合温育，样本中的甲状腺素结合球蛋白TBG与甲状腺激素T4形成TBG-T4复合物，再加入所述甲状腺素结合力试剂2号，TBG-T4复合物与生物素标记的T4-BSA竞争甲状腺素结合力试剂2号中的Anti-T4-ALP形成免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合的抗体和杂质；加入化学发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度RLU；在一定范围内RLU与样本中TBG浓度呈正比，与T4浓度成反比，通过RLU就能从标准曲线上计算出T4/TBG的比值。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲状腺素结合力校准品包括6个冻干校准瓶，所述冻干校准瓶内目标浓度：0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0，1.0mL纯化水复溶后，各点TBG浓度：200ng/mL；甲状腺素T4浓度：0、40、80、160、320、400ng/mL含硫酸庆大霉素的磷酸盐缓冲液；
所述甲状腺素结合力试剂1号含有生物素标记的T4-BSA、未标记T4和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
所述甲状腺素结合力试剂2号含有碱性磷酸酶标记的Anti-T4和牛IgG的Tris缓冲液；为1个容积为7mL的
所述甲状腺素结合力磁分离试剂含有链霉亲和素标记的磁微粒和动物血清的Tris缓冲液；
甲状腺素结合力试剂1号、甲状腺素结合力试剂2号和甲状腺素结合力磁分离试剂分别装在一个容积为7mL塑料瓶中；
所述甲状腺素结合力质控品包括2个容积为3mL的冻干质控瓶，所述质控瓶内的甲状腺素结合力浓度的范围分别为：0.42-0.78和1.05-1.95。
8.一种权利要求1所述的定量检测甲状腺素结合力的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
步骤1.制备所述甲状腺素结合力校准品包括：甲状腺素结合力校准品稀释液配制步骤和甲状腺素结合力校准品配制步骤：
所述甲状腺素结合力校准品稀释液的配制步骤包括：
加800mL纯化水、NaH2PO42.59g、Na2HPO40.36g、KCl 11.67g和5g的硫酸庆大霉素和0.2g的BND到容器中，搅拌混合均匀，再加0.5mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为6.5-8.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的校准品稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力校准品的配制步骤包括：
用甲状腺素结合力校准品稀释液将TBG和T4按照下述的浓度配制，共六个浓度点；
Figure FDA0003240913660000021
步骤2.制备所述甲状腺素结合力试剂1号包括：甲状腺素结合力试剂1号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂1号配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂1号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、6.05g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入1mL的PC950和0.2g的BND，搅拌至完全溶解，将pH值调为6.0-8.0，再加入9.86g的牛血清白蛋白，加0.986g的牛酪蛋白，搅拌至完全溶解，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的甲状腺素结合力试剂1号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂1号的配制步骤：
用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照T4-BSA与生物素溶液质量比为10:1的比例在T4-BSA抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成T4-BSA-生物素连接物的反应液，将得到的T4-BSA-生物素连接物的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到T4-BSA-生物素连接物，分装后，-20℃冻存，备用；再用甲状腺素结合力试剂1号稀释液将T4-BSA-生物素连接物稀释到0.04-0.09μg/mL，形成连接物稀释液，将未标记的T4抗原稀释到连接物稀释液中，未标记的T4抗原浓度在0.02-0.05μg/mL范围内，得到甲状腺素结合力试剂1号；
步骤3.制备所述甲状腺素结合力试剂2号包括：甲状腺素结合力试剂2号稀释液配制步骤和甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
所述甲状腺素结合力试剂2号稀释液的配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g Tris和0.2g的甲基异噻唑啉酮和0.2g的
Figure FDA0003240913660000031
BND到容器中，拌混合均匀，再加2mL的PC950、0.1g的ZnCl2、0.1g的MgCl2搅拌至完全溶解，将pH值调为5.5-6.5，再加入5g的牛IgG，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的试剂2号稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力试剂2号的配制步骤：
将1mg的抗甲状腺素抗体(Anti-T4)和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后Anti-T4抗体，将活化后的抗体保存在2-8℃备用；取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用；再将活化的Anti-T4抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置10-16h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存，将Anti-T4-碱性磷酸酶连接物浓溶液用试剂2号稀释液稀释到0.05-0.3μg/mL，得到甲状腺素结合力试剂2号；
步骤4.制备所述甲状腺素结合力磁分离试剂包括：甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤和甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
所述甲状腺素结合力磁分离试剂稀释液配制步骤：
加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.6g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、30mL的新生牛血清10mL的特级马血清、10mL的山羊血清、10g的鱼皮凝胶和2mL的PC950，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.6-8.4，用纯化水定容至1L，使用0.22μm滤器过滤，将获得的磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力磁分离试剂配制步骤：
取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.1mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的2-吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁分离试剂稀释液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述甲状腺素结合力磁分离试剂；
步骤5.制备所述甲状腺素结合力质控品包括：甲状腺素结合力质控品基质和甲状腺素结合力质控品配制步骤：
基质选择总蛋白含量大于55mg/L的去激素人血清，调整pH为7.0-8.0，0.1‰-1.0‰的PC950作为防腐剂，保存在2-8℃待用；
所述甲状腺素结合力质控品配制步骤：将甲状腺功能减低和甲状腺功能亢进的样本分别混合并测试甲状腺素结合力的值，根据测试结果均值稀释到甲状腺素结合力质控品基质中，质控品1用甲状腺功能降低样本配制至0.6±0.12，质控品2用甲状腺功能亢进样本配制至1.5±0.3，得到甲状腺素结合力质控品1和质控品2，连续2天对其进行赋值，根据每个水平测值的±3SD，确定质控范围。
9.一种使用权利要求1所述的定量检测甲状腺素结合力的试剂盒的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
步骤1.将甲状腺素结合力校准品放到全自动化学发光免疫分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的拟合曲线；
步骤2.将甲状腺素结合力质控品放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的质控品的测试发光值和通过步骤1得到的拟合曲线拟合得到甲状腺素结合力质控品的TBI值；
步骤3.将待测样本放到上述分析仪测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出的待测样本的TBI值；
所述步骤1、步骤2和步骤3均包括全自动化学发光免疫分析仪的全自动检测步骤：
步骤1)加15μL校准品或质控品或待测标本至检测管中；
步骤2)加50μL的甲状腺素结合力试剂1号至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育15min；
步骤3)加50μL的甲状腺素结合力试剂2号和甲状腺素结合力磁分离试剂至步骤2)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育5min，进行磁分离，去上清；
步骤4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离去上清；
步骤5)重复步骤4)两遍；
步骤6)加200μL的化学发光底物至检测管中，混匀，检测发光强度；
在一定范围内RLU与甲状腺素浓度呈反比，与TBG浓度呈正比，通过四参数拟合标准曲线，再从标准曲线上读取待测样本的T4与TBG的比值。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的最小检出量为0.01；线性检测范围，0.2-2.0；(2-8)℃冷藏效期为18个月；校准品溯源至均值为1.0的血清参考盘。
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