CN107677808A - 一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，其试剂盒包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品及质控品；所述第一试剂为N‑羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，所述混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体；所述第二试剂为碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液。本发明的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其抗体试剂采用N‑羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体，多抗体之间的互补性大大提高临床灵敏度以及线性范围，该试剂盒灵敏度高、特异性强。

Description

一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法和检测 方法

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

甲状腺球蛋白(TG)是一种存在于甲状腺卵泡细胞的大的异源糖蛋白(MW660，000)。甲状腺球蛋白在甲状腺激的生物合成中起着非常重要的作用。在甲状腺卵泡细胞中，甲状腺过氧化酶对甲状腺球蛋白内的酪氨酰基团的碘化反应中起催化剂的作用。TG在血液中的浓度主要由3个因素决定：甲状腺的大小、甲状腺的损伤程度(如活检、外伤、出血、放射线损伤及炎症等)、激素影响(如促甲状腺激素(TSH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)及TSH受体抗体(TRAb)等)。在稳定状态下，甲状腺大小是影响血清TG水平的主要因素。

同时TG是分化型甲状腺癌最关键的血清学指标，协助初诊及确诊，同时监测分化型甲状腺癌(DTC)复发，在抗甲状腺球蛋白抗体阴性的前提下，作为DTC的肿瘤标志物，具有很高的敏感性和特异性。清除甲状腺后，DTC细胞活动释放是TG的唯一来源，此时若在血清中检测有TG，往往提示DTC病灶残留或复发。TG是对DTC进行病程监测、后续效果评估和预后诊断的重要判断依据。

目前用于检测甲状腺球蛋白(TG)的免疫分析方法主要有放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法等。放射免疫分析法存在高放射性、有效期短、给操作者带来的健康隐患等问题。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。

近年来将磁微粒免疫检测技术和化学发光免疫分析技术相结合的磁分离化学发光免疫分析技术得到了快速的发展。磁分离化学发光免疫分析技术综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术——悬浮磁微粒载体技术、化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求。

现有技术，如专利号CN101759804A、公开日为2010-06-30的发明专利公开了一种抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体及应用，包括了一种抗甲状腺球蛋白单克隆抗体，及用这种单克隆抗体研制的检测试剂盒。但是该专利权利要求仅为此一种单克隆抗体，甲状腺球蛋白是一个分子量高达660kd的大分子蛋白，其抗原决定簇有很多，所以针对于这些不同抗原决定簇的甲状腺球蛋白抗体有很多；且该专利中并未描述该抗体应用于甲状腺球蛋白检测试剂盒的方法。又如专利号CN105277717A、公开日为2016-01-27的发明专利公开了一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法，包括：异硫氰酸荧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液，碱性磷酸酶标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和磁分离试剂。但是该专利中的试剂盒的灵敏度仍然较低(0.5ng/mL)，该试剂盒临床样本比对时高值样本例数过少(＞200ng/mL的样本仅6例)，不具有统计学意义，无法证明其与参比试剂贝克曼很好的相关性，且该试剂盒并不能配合全自动仪器使用，手工操作依旧繁琐。又如专利号CN105510593A、公开日为2016-04-20的发明专利公开了一种甲状腺球蛋白(TG)测试试剂盒及其测试方法，包括：标记有鼠抗人TG单克隆抗体的纳米磁性微球，碱性磷酸酶标记的TG抗体，质控品、校准品、清洗液、发光底物等。但是该专利中试剂盒的灵敏度仍然较低仍然较低(0.5ng/mL)，该试剂盒未提供有效的临床样本比对数据，无法证明其临床相关性情况，且该试剂盒并不能配合全自动仪器使用，手工操作依旧繁琐。现有技术中的甲状腺球蛋白检测试剂盒中的抗体试剂多为单一的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液，而本案发明人在研究过程中发现，采用混合抗体溶液可以更加显著地提高检测的灵敏度和线性范围。

发明内容

有鉴于此，为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其抗体试剂采用N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体，多抗体之间的互补性大大提高临床灵敏度以及线性范围。

为了达到上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品及质控品；

所述第一试剂：N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，其浓度为0.1～2.5μg/mL，所述混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体，且抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体的摩尔比为1:0.3-3；

所述第二试剂：碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液，其浓度为0.1～2.5μg/mL。

优选地，所述第一试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体的总摩尔数与所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔数之比为1:18～82。

优选地，所述第一试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体、抗甲状腺球蛋白多克隆抗体以及所述第二试剂中的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的纯度均大于95％，浓度均大于1mg/mL。

优选地，所述第二试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的摩尔数与所述碱性磷酸酶的摩尔数之比为1:0.5～3。

优选地，所述碱性磷酸酶的纯度大于95％，比活性大于1000U/mg，浓度大于5mg/mL。

优选地，所述磁分离试剂为偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液，所述磁微粒悬浮液的浓度为0.1～1.0mg/mL。

进一步优选地，所述磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5～2μm，磁微粒表面的羧基含量不低于0.4mmol/g。

本发明还提供了一种如上所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，所述磁分离试剂的制备方法为：将所述磁微粒用0.01～0.11mol/L、pH4.5～5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为4～20mg/mL；然后加入所述链霉亲和素，在15～40℃下混悬30～60min，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为10～100:1；然后再加入新鲜配制的4～20mg/mL的碳二亚胺水溶液，在15～40℃下混悬2～12h，其中所述2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10～20:1；磁分离，去上清，用含质量比为0.09～1.1％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.005～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述偶联有链霉亲和素的磁微粒中使溶液浓度为0.1～1.0mg/mL，即得所述磁分离试剂；

所述第一试剂的制备方法为：在所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体中分别加入0.005～0.1mol/L、pH为7～7.5的PBS缓冲液，在2～8℃下透析过夜，配制成抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配制成物质的量浓度为4～20mM的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液；将所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液分别加入到所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体溶液中，混合均匀，在15～40℃下放置20～40min；加入0.9～1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15～40℃下放置8～12min，加入0.005～0.1mol/L、pH为7～7.5的PBS缓冲液，在2～8℃下透析过夜可得N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液和N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液；最后将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液与N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液混合，并加入含质量比为0.5～3.2％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.01～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，稀释到混合溶液浓度为0.1～2.5μg/mL，即得所述第一试剂；

所述第二试剂的制备方法为：将抗甲状腺球蛋白单克隆抗体加入到浓度为4～20mg/mL的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25min，加入0.05～0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗甲状腺球蛋白单克隆抗体，2～8℃保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4～5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置25～35min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2～8℃保存备用；将活化后的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12～24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2～8℃保存备用；将所述连接物浓溶液用含质量比为0.1～3％的牛血清白蛋白、pH为7.8～8.0、物质的量浓度为0.01～0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释，使碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液的浓度为0.1～2.5μg/mL，即得所述第二试剂；

所述校准品的制备方法为：将甲状腺球蛋白纯品用pH7～7.5、0.04～0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释到多个浓度，并溯源至国际参考物质BCR-457，即得所述校准品。

本发明还提供了一种如上所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的检测方法，所述试剂盒使用配套全自动化学发光测定仪进行测试，包括以下步骤：

步骤1：所述试剂盒与相应的全自动化学发光测定仪配套使用，将所述试剂盒放入所述全自动化学发光测定仪试剂仓相应位置，试剂盒信息通过条形码扫描仪输入仪器系统，也可通过仪器配套软件设定；

步骤2：将校准品置于仪器样本仓，通过条形码扫描仪识别校准品信息，并在仪器系统中分配校准品位置；

步骤3：将质控物或待测样本置于仪器样本仓，通过仪器配套软件编辑相应检测信息；

步骤4：启动运行程序，所有校准品、质控物或待检样本处理步骤将自动执行。

本发明还提供了一种如上所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的检测方法，所述试剂盒使用手工测试的方法进行测试，包括以下步骤：

步骤1：在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入所述第一试剂和第二试剂，混匀，在36～38℃下温育14～25min，其中所述待测样本原液、第一试剂和第二试剂的体积比为1:0.5～2:0.5～2；

步骤2：然后向步骤1温育后的体系中加入所述磁分离试剂，混匀，在36～38℃下温育3～15min，所述待测样本原液与所述磁分离试剂的体积比为1:0.5～2；

步骤3：添加磁场，使步骤2温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；

步骤4：添加磁场，使步骤3混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其抗体试剂采用N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体，多抗体之间的互补性大大提高临床灵敏度以及线性范围，该试剂盒灵敏度高、特异性强。

附图说明

图1为实施例一的甲状腺球蛋白检测试剂盒中校准品的标准曲线图；

图2为实施例一的甲状腺球蛋白检测试剂盒的相关性评价。

具体实施方式

下面结合附图对本发明优选的实施方式进行详细说明。

实施例一：试剂盒的制备

(一)磁分离试剂的制备：

材料与仪器：

1、磁微粒：表面含羧基(-COOH)活性集团，每克磁微粒(干重)羧基含量为0.4mmol，具有超顺磁性，直径为1μm；

2、链霉亲和素购自Sigma公司；

3、2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和其他试剂均为化学纯；

4、分析天平。

操作步骤：

1、取100mg磁微粒，磁分离去上清，用0.05mol/L、PH4.7的MES缓冲液10mL重悬；

2、加入3mg链霉亲和素，室温混悬50min；

3、加入0.7mL新鲜配制的10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬8h；

4、磁分离，去上清，用含质量比1％的牛血清白蛋白、PH7.4、0.01mol/L的TRIS缓冲液重悬到0.4mg/mL，完成磁分离试剂的制备。

(二)第一试剂的制备：

材料与仪器：

1、抗TG单克隆抗体，抗TG多克隆抗体，均由Medix制备，纯度为95％，浓度为1mg/mL，用磷酸盐缓冲液保存；

2、偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(BNHS)购自THERMO公司，二甲基亚砜(DMSO)，PBS等试剂均为化学纯；

3、分析天平。

操作步骤：

1、将抗TG单克隆抗体和抗TG多克隆抗体分别用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液在4℃下透析过夜，中间换液一次；

2、将BNHS平衡至室温(20℃)，用万分之一分析天平(最大称量200g)称取1.5mgBNHS溶于326μL的DMSO中，配制成10mM的BNHS(现用现配)；

3、按照抗TG抗体与BNHS摩尔比为1:40的比例在步骤1所得的溶液中加入步骤2所得的溶液，混合均匀，室温放置反应30min；

4、向步骤3中加入1M的TRIS缓冲液至终浓度为10mM，终止反应，室温放置10min，再用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液在4℃下透析过夜，中间换液一次，获得生物素标记的抗体浓溶液，即N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液和N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液；

5、将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液与N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液混合，并用含3％牛血清白蛋白、PH7.4、0.05mol/L的TRIS缓冲液稀释到溶液浓度为1.0μg/mL，完成第一试剂的制备。

(三)第二试剂的制备：

材料与仪器：

1、抗TG单克隆抗体，由Medix制备，纯度为95％，浓度为1mg/mL，以磷酸盐缓冲液保存；

2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)纯度为95％，比活性为1000U/mg，浓度为5mg/mL；

3、偶联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，2-亚胺基硫烷盐酸盐(2-IT)购自THERMO公司，TRIS等化学试剂达到化学纯；

4、G-25凝胶柱和Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品；

5、分析天平。

操作步骤：

1、取1mg抗TG单克隆抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT溶液3μL，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

2、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液15μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，4℃保存备用；

3、将活化的抗TG单克隆抗体与活化的ALP混合，4℃条件下静置18h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4℃保存备用。

4、用含0.5％牛血清白蛋白、PH8.0、0.1mol/L的TRIS缓冲液将碱性磷酸酶标记好的抗TG单克隆抗体稀释到0.5μg/mL，完成第二试剂的制备。

(四)甲状腺球蛋白系列校准品的制备：

材料：

1、TG纯品为TG天然纯化抗原，由DIARECT制备，纯度为99％，浓度为1mg/mL，以三羟甲基氨基甲烷缓冲液保存；

2、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和其他试剂均为化学纯。

操作步骤：

1、称取适量的TG纯品，用PH7.4、0.05mol/L的TRIS缓冲液分别稀释到0、1、10、100、250、500ng/mL；

2、用经国际参考物质BCR-457标化的企业校准品对上述新配制校准品进行赋值，以确保新配制校准品能溯源至国际参考物质BCR-457，结果见附图1。

对比例一

本对比例与实施例一制备的试剂盒除了第一试剂不同外，其余成分及制备方法均相同。本对比例中第一试剂的制备如下：

材料与仪器：

1、抗TG单克隆抗体，由Medix制备，纯度为95％，浓度为1mg/mL，用磷酸盐缓冲液保存；

2、偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(BNHS)购自THERMO公司，二甲基亚砜(DMSO)，PBS等试剂均为化学纯；

3、分析天平。

操作步骤：

1、将抗TG单克隆抗体用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液在4℃下透析过夜，中间换液一次；

2、将BNHS平衡至室温(20℃)，用万分之一分析天平(最大称量200g)称取1.5mgBNHS溶于326μL DMSO中，配制成10mM的BNHS(现用现配)；

3、按照抗TG抗体与BNHS摩尔比分别为1:10、1:100的比例在步骤1所得的溶液中加入步骤2所得的溶液，混合均匀，室温放置反应30min；

4、向步骤3中加入1M的TRIS缓冲液至终浓度为10mM，终止反应，室温放置反应10min，再用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液在4℃下透析过夜，中间换液一次，即获得生物素标记的抗体浓溶液；

5、将该溶液用含3％牛血清白蛋白、PH7.4、0.05mol/L的TRIS缓冲液稀释到1.0μg/mL，完成第一试剂的制备。

实施例二：试剂盒的检测以及检测效果的评价

材料与仪器：

1、由实施例一和对比例一制备得到的试剂盒；

2、化学发光底物、清洗液均购自苏州浩欧博生物医药有限公司。

检测方法：

下述检测步骤由全自动化学发光测定仪自动完成，也可手工操作完成。

1、在检测管中加入30μL待测样本(血清)原液，然后加入50μL第一试剂，再加入50μL第二试剂，混匀，37±1℃条件下温育20min；

2、加入50μL磁分离试剂，混匀，37±1℃条件下温育5min；

3、使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入300μL的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；重复此操作，共操作5次；

4、将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入200μL的发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值(RLU)。

(一)第一试剂的评价

比对对比例一中两种标记工艺制备的第一试剂与实施例一中标记工艺制备的第一试剂的差别，本实验仅第一试剂不同，其余试剂通用实施例一中所制备的试剂。

(1)实施例一、对比例一中第一试剂原料的三种标记工艺，抗TG抗体与BNHS摩尔比分别为1:10、1:40、1:100时校准品效价及各校准品点之间的梯度(Ratio)，结果参见表1和表2。

表1校准品效价

表2各校准品点之间的梯度值

Ratio	1:10	1:40	1:100
				S1/S0	10.02	9.21	3.01
S2/S1	6.02	8.64	8.33
				S3/S2	9.07	9.32	9.65
S4/S3	2.07	2.01	1.94
				S5/S4	1.26	1.68	1.41

实验结果表明，对比例一中的标记工艺抗TG抗体与BNHS摩尔比为1:10时，本底低，S1/S0Ratio大，能使灵敏度提升，但高值区分不开，且整体效价低；抗TG抗体与BNHS摩尔比为1:100时，本底高，S1/S0Ratio小，灵敏度低，且高值区分不开；而实施例一中抗TG抗体与BNHS摩尔比为1:40时，能得到最优的效果。

(二)灵敏度评价

使用实施例一中制备的试剂盒，检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于0.02ng/mL。

(1)A点发光值，结果参见表3。

表3 A点发光值

A点发光均值X＝14480

SD＝825

X+2SD＝16129

(2)B点发光值，结果参见表4。

表4 B点发光值

B点发光均值X＝138893

(3)灵敏度＝0.013ng/mL

(4)对第一试剂中仅加单克隆抗体或仅加多克隆抗体以及第一试剂中同时加入抗TG的单克隆抗体和多克隆抗体进行发光强度检测，结果见下表。

表5发光强度值对比

由上表可知，第一试剂中仅加单克隆抗体或仅加多克隆抗体时，灵敏度降低，第一试剂中同时加入抗TG的单克隆抗体和多克隆抗体时，可显著提高灵敏度。

(三)精密度评价

(1)分析内精密度

将实施例一中制备的试剂盒，分别测定从低到高四种不同浓度的血清，10孔平行测定，结果参见表6。

表6分析内CV

测定血清浓度(ng/mL)	测定次数	分析内CV(％)
			1.23	10	1.61
12.49	10	1.79
			125.18	10	2.52
317.53	10	4.15

从上表可以看出，实施例一的试剂盒的批内变异系数为1.61％～4.15％。

(2)分析间精密度

将实施例一中制备的试剂盒测定从低到高四种不同浓度的血清，每次测试4孔平行，每天进行两次测试，连续测试10天，共计80个测试，结果见表7。

表7分析间CV

测定血清浓度(ng/mL)	测定次数	分析间CV(％)
			1.23	80	2.87
12.49	80	2.55
			125.18	80	3.61
317.53	80	5.85

从表7可以得出实施例一中的试剂盒的分析间变异系数为2.87％～5.85％。

(四)准确度评价

用实施例一制备得的试剂盒测试国际参考物质BCR-457配制10，100ng/mL两个浓度，每次测试3个重复，回算浓度，计算其测量偏差，测量偏差＝(回算浓度-理论浓度)/理论浓度×100％。数据参见表8。

表8准确度评价

理论浓度(ng/mL)	实际浓度(ng/mL)	测定次数	偏差(％)
				10	9.6	3	-4.00
100	102.74	3	2.74

(五)试剂盒特异性评价

对实施例一的试剂盒特异性检验是选取与可能对检测结果带来影响的Bilirubin(胆红素)、Hemoglobin(血红蛋白)、Triglyceride(甘油三酯)，HAMA(Human anti-mouseantibody)，RF(rheumatoid factor,类风湿因子)，L-Thyronine(L-甲状腺素)，Ibuprofen(布洛芬)，paracetamol(扑热息痛)、aspirin(阿司匹林)，配制成大于生理浓度的样本，以本方法进行测定，并计算交叉反应率。结果见表9。

表9试剂盒特异性评价数据

干扰物	添加浓度	交叉反应率
			胆红素	20mg/dL	1.75％
血红蛋白	1000mg/dL	0.35％
			甘油三酯	2000mg/dL	-3.41％
HAMA	2000ng/mL	0.30％
			RF	1000IU/mL	-3.90％
L-甲状腺素	0.218mg/dL	-3.92％
			布洛芬	40mg/dL	-3.41％
扑热息痛	20mg/dL	-1.21％
			阿司匹林	50mg/dL	-0.91％

从上表可以看出，实施例一的试剂盒与上述干扰物的交叉反应率均在±5％之间，对检测结果影响很小。

(六)相关性评价

用实施例一制备得的试剂盒和贝克曼公司的DXI-800TG化学发光检测试剂盒对354份人血清样品同时进行检测。以贝克曼试剂盒测定的结果为横坐标，以本发明方法的测的血清TG浓度为纵坐标，作回归分析，相关方程为：y＝0.9991x+0.4458，相关系数为：0.9932，其检测结果见附图2。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

(七)热稳定性评价

对实施例一的试剂盒分别进行4℃、12个月和37℃、7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期达12个月。

经过大量的实验证明，实施例一提供的试剂盒方法学指标如下：

1、检测范围：0～500ng/mL。

2、灵敏度：最低检测限不高于0.02ng/mL。

3、精密度：小于10％。

4、准确性：与国际参考物质偏差小于10％。

5、特异性：与Bilirubin(胆红素)、Hemoglobin(血红蛋白)、Triglyceride(甘油三酯)，HAMA(Human anti-mouse antibody)，RF(rheumatoid factor,类风湿因子)，L-Thyronine(L-甲状腺素)，Ibuprofen(布洛芬)，paracetamol(扑热息痛)、aspirin(阿司匹林)的交叉反应率在±5％之间。

6、稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，试剂盒效期达12个月。

7、相关性：与贝克曼公司的DXI-800化学发光法试剂盒对354份人血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2，以贝克曼试剂盒测定的结果为横坐标，以本发明方法的测的血清TG浓度为纵坐标，作回归分析，相关方程为：y＝0.9991x+0.4458，相关系数为：0.9932。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

本发明试剂盒通过采用偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液、N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液制成的试剂盒，使得灵敏度达到0.02ng/mL，并且该试剂盒与相关干扰物的交叉反应率低，准确性好、精密度高，与进口试剂贝克曼相关试剂盒临床比对好，临床灵敏度高，样本无需预稀释，操作简单省时，能配套全自动化学发光仪进行使用。本发明试剂盒采用生物素链霉亲和素信号放大系统、碱性磷酸酶标记，解决了传统的ELISA灵敏度较低的问题；纳米磁微粒分离系统能达到放射免疫分析(RIA)的高灵敏度，且没有放射性污染，稳定性好。同时，在第一试剂中同时加入抗TG的单克隆抗体和多克隆抗体，能大大提升试剂的灵敏度和临床灵敏度。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，包括第一试剂、第二试剂、磁分离试剂、化学发光底物、校准品及质控品；

所述第一试剂：N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的混合抗体溶液，其浓度为0.1～2.5μg/mL，所述混合抗体溶液包括抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体，且抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体的摩尔比为1:0.3-3；

所述第二试剂：碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液，其浓度为0.1～2.5μg/mL。

2.根据权利要求1所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体的总摩尔数与所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔数之比为1:18～82。

3.根据权利要求1所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体、抗甲状腺球蛋白多克隆抗体以及所述第二试剂中的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的纯度均大于95％，浓度均大于1mg/mL。

4.根据权利要求1所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂中的所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体的摩尔数与所述碱性磷酸酶的摩尔数之比为1:0.5～3。

5.根据权利要求1所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶的纯度大于95％，比活性大于1000U/mg，浓度大于5mg/mL。

6.根据权利要求1所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂为偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液，所述磁微粒悬浮液的浓度为0.1～1.0mg/mL。

7.根据权利要求6所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5～2μm，磁微粒表面的羧基含量不低于0.4mmol/g。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，

所述磁分离试剂的制备方法为：将磁微粒用0.01～0.11mol/L、pH4.5～5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为4～20mg/mL；然后加入链霉亲和素，在15～40℃下混悬30～60min，其中所述磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为10～100:1；然后再加入新鲜配制的4～20mg/mL的碳二亚胺水溶液，在15～40℃下混悬2～12h，其中所述2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述碳二亚胺水溶液的体积比为10～20:1；磁分离，去上清，用含质量比为0.09～1.1％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.005～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到偶联有链霉亲和素的磁微粒中使溶液浓度为0.1～1.0mg/mL，即得所述磁分离试剂；

所述第一试剂的制备方法为：在所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体中分别加入0.005～0.1mol/L、pH为7～7.5的PBS缓冲液，在2～8℃下透析过夜，配制成抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配制成物质的量浓度为4～20mM的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液；将所述N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液分别加入到所述抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和抗甲状腺球蛋白多克隆抗体溶液中，混合均匀，在15～40℃下放置20～40min；加入0.9～1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15～40℃下放置8～12min，加入0.005～0.1mol/L、pH为7～7.5的PBS缓冲液，在2～8℃下透析过夜可得N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液和N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液；最后将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体母液与N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗甲状腺球蛋白多克隆抗体母液混合，并加入含质量比为0.5～3.2％的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.01～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，稀释到混合溶液浓度为0.1～2.5μg/mL，即得所述第一试剂；

所述第二试剂的制备方法为：将抗甲状腺球蛋白单克隆抗体加入到浓度为4～20mg/mL的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25min，加入0.05～0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗甲状腺球蛋白单克隆抗体，2～8℃保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4～5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置25～35min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2～8℃保存备用；将活化后的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12～24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2～8℃保存备用；将所述连接物浓溶液用含质量比为0.1～3％的牛血清白蛋白、pH为7.8～8.0、物质的量浓度为0.01～0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释，使碱性磷酸酶标记的抗甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液的浓度为0.1～2.5μg/mL，即得所述第二试剂；

所述校准品的制备方法为：将甲状腺球蛋白纯品用pH7～7.5、0.04～0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释到多个浓度，并溯源至国际参考物质BCR-457，即得所述校准品。

9.根据权利要求1至7中任意一项所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述试剂盒使用配套全自动化学发光测定仪进行测试，包括以下步骤：

步骤1：所述试剂盒与相应的全自动化学发光测定仪配套使用，将所述试剂盒放入所述全自动化学发光测定仪试剂仓相应位置，试剂盒信息通过条形码扫描仪输入仪器系统，也可通过仪器配套软件设定；

步骤2：将校准品置于仪器样本仓，通过条形码扫描仪识别校准品信息，并在仪器系统中分配校准品位置；

步骤3：将质控物或待测样本置于仪器样本仓，通过仪器配套软件编辑相应检测信息；

步骤4：启动运行程序，所有校准品、质控物或待检样本处理步骤将自动执行。

10.根据权利要求1至7中任意一项所述的甲状腺球蛋白的定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述试剂盒使用手工测试的方法进行测试，包括以下步骤：

步骤1：在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入所述第一试剂和第二试剂，混匀，在36～38℃下温育14～25min，其中所述待测样本原液、第一试剂和第二试剂的体积比为1:0.5～2:0.5～2；

步骤2：然后向步骤1温育后的体系中加入所述磁分离试剂，混匀，在36～38℃下温育3～15min，所述待测样本原液与所述磁分离试剂的体积比为1:0.5～2；

步骤3：添加磁场，使步骤2温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；

步骤4：添加磁场，使步骤3混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值。