CN103134934A

CN103134934A - 可以同时检测尿液和血清样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒

Info

Publication number: CN103134934A
Application number: CN2013100612234A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 方亮; 刘献文; 周海滨
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Meikang biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: CN103134934B

Abstract

本发明提供了一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为含有具有促进凝聚作用的多聚物缓冲液，所述试剂R2是含有乳胶-抗体交联物的缓冲液，其中乳胶-抗体交联物是标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒和标记有抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒。本发明试剂盒采用了复合的单克隆、多克隆抗体致敏的胶乳增强免疫检测方法，可以同时满足特异性好、灵敏度高和线性范围宽的要求，且抗体的用量小，降低了成本，可同时应用于临床上人血液、尿液中RBP的检测。

Description

可以同时检测尿液和血清样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种可以同时检测尿液和血清样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒。

背景技术

视黄醇结合蛋白（Retinol-Binding protein,RBP）是血液中的视黄醇（维生素A）的转运蛋白，参与血清和细胞内视黄醇/酸的转运，它是主要在肝脏中合成，并释放入血液而进入各种组织，通过与视黄醇、前白蛋白及细胞表面受体相互作用，在维生素A的储存、代谢、转运到周围靶器官中具有重要功能。在血液中，RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。RBP功能障碍会导致维生素A的储存、转运、分布及代谢异常，进而引发各种疾病，并影响上皮和骨组织的生长、分化、繁殖与胚胎发育等，因此RBP在肾功能检查中，作为早期肾病的诊断指标，在门诊、健康诊断等领域中被广泛使用。

目前临床上广泛使用的RBP检测方法是免疫比浊法。但普通免疫比浊法检测方法由于采用单一多克隆抗体，导致其具有特异性好但灵敏度差或者灵敏度好但特异性差的特点，无法同时满足特异性和灵敏度要求。其中中国国家知识产权局网站上公开了一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，采用单克隆抗体和多克隆抗体混合普通免疫比浊法，可以同时满足特异性和灵敏度的要求，但采用普通免疫比浊法，其抗体用量较大，而且单克隆抗体成本较高，限制了其临床应用。中国国家知识产权局网站上还公开了一种基于胶乳粒子包被视黄醇结合蛋白检测试剂盒，采用多克隆抗体胶乳增强法，大大减少了抗体用量，降低了成本，但其检测线性范围较窄，无法同时用于血清中RBP和尿液中RBP的测定。中国国家知识产权局网站上还公开了一种双抗体乳胶增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒，采用两种单克隆抗体胶乳增强法，其线性范围较宽，但灵敏度低，仍然无法同时用于血清中RBP和尿液中RBP的测定。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足而提出一种具有高灵敏度、宽线性、特异性好且抗体用量少、降低了成本且可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为含有具有促进凝聚作用的多聚物缓冲液，所述试剂R2是含有乳胶-抗体交联物的缓冲液，其中乳胶-抗体交联物是标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒和标记有抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒。

作为优选，所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体；所述抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体。

进一步地，所述大胶乳颗粒为粒径在120～400nm之间的聚苯乙烯胶乳，大胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.01～0.1％。

进一步地，所述小胶乳颗粒为粒径在30～150nm之间的聚苯乙烯胶乳，小胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1～0.5％。

进一步地，所述大胶乳颗粒为粒径在160～300nm之间的聚苯乙烯胶乳，大胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.02～0.05％。

进一步地，所述小胶乳颗粒为粒径在60～120nm之间的聚苯乙烯胶乳，小胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1～0.3％。

更进一步地，所述试剂R2中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1︰4～14。

本发明采用复合的单克隆、多克隆抗体致敏的胶乳增强免疫检测方法，开发出可同时检测血清和尿液中RBP的检测试剂盒。复合的单克隆、多克隆抗体致敏的胶乳增强免疫检测方法的反应原理是：将包被了高特异性的抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒和高特异性的抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒混合于稀释液，与样本中相应的RBP抗原发生特异性结合，形成不溶性的抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的RBP抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测RBP的含量。

本发明中，选取的检测波长为340～800nm，优选600nm。

采用本发明所述的试剂盒测定血清或尿液中RBP时，先将样本与试剂R1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂R2，立即读取第一点吸光度值（A1），计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值(A2)，计算两点吸光度差值，根据校准曲线得到样本中RBP的含量。

本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。

本发明所述的试剂盒，用于测定血清或尿液中RBP，与现有技术相比，本发明具有以下优点：采用了复合的单克隆、多克隆抗体致敏的胶乳增强免疫检测方法，可以同时满足特异性好、灵敏度高和线性范围宽的要求，且抗体的用量小，降低了成本，可以同时用于尿液和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测。

附图说明

图1：本发明试剂盒检测血清RBP线性范围；

图2：本发明试剂盒检测血清RBP与用于检测血清中RBP的某进口试剂盒相关性；

图3：本发明试剂盒测尿液中RBP线性范围；

图4：本发明试剂盒测尿液中RBP与用于检测尿液中RBP的某进口试剂盒相关性。

具体实施方式

以下实施例用来详细的说明本发明，但本发明不限于此。

实施例1

RBP检测试剂盒的制备方法：

试剂R1：含200mM tris-HCl缓冲液，2%聚乙二醇（PEG），2%氯化钠。

试剂R2：

（1）标记有抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒的制备：将粒径为90nm的小胶乳颗粒，用50mM pH=6.0MES缓冲液稀释到浓度为1%，加入EDAC1.917mg/10ml和115mg/10ml，室温反应1小时，20000rpm转速下离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MES pH6.0中，超声波分散；再次20000rpm转速下离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MES pH6.0中，使得终浓度为2%，超声波分散。为防止起泡，需边搅拌边加入等体积的50mM MES pH6.0+0.72mg单抗包被液，混合搅拌，室温反应1小时，终浓度为1%。20000rpm转速下离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MESpH6.0中，终浓度为1%，超声分散，加入2%BSA，4℃封闭过夜。离心去上清，用50mM Tris pH7.5+1%BSA+2%蔗糖+0.1%叠氮化钠的分散液溶解胶乳，得到终浓度为0.5%，超声分散。

（2）标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒的制备：将粒径为200nm的大胶乳颗粒，用50mM MES pH6.0稀释胶乳到1%，加入EDAC1.917mg/10ml和115mg/10ml，室温反应1小时，20000转速下离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MES pH6.0中，超声分散；再次60000转速下离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MES pH6.0中，使得终浓度为2%，超声分散。为防止气泡，需边搅拌边加入等体积的50mM MES pH6.0+1mg多抗包被液，混合搅拌，室温反应1小时，终浓度为1%。20000rpm转速离心15min，去上清，沉淀悬浮于50mM MES pH6.0中，终浓度为1%，超声分散，加入2%BSA，4℃封闭过夜。离心去上清，用50mM TrispH7.5+1%BSA+2%蔗糖+0.1%叠氮化钠的分散液溶解胶乳，终浓度为0.5%，超声分散。

（3）R2制备：将终浓度为0.5%标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒和终浓度为0.5%标记有抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒按照1:5比例混合，然后用50mM Tris pH7.5+1%BSA+2%蔗糖+0.1%叠氮化钠的稀释液稀释到适当浓度。使得R2中小胶乳终浓度为0.12%，大胶乳终浓度为0.024%。

实施例2

血清RBP的测定：

测定仪器：日立7060全自动生化分析仪；

分析方法：两点终点法；

分析参数：R1:225ul，R2:75ul，样本：3ul；波长：600nm；

测定步骤：先加入R1和样本，于37℃孵育5分钟后，加入R2，立即读取第一点吸光度值，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值，计算两点吸光度差值。

定标曲线制作：以定标液浓度为横坐标，各浓度定标液对应的吸光度差值为纵坐标，做logit-log（4p）函数曲线。

样本浓度计算方法：根据样本的吸光度值差值，代入定标曲线，计算相对应的浓度值。

实施例3

尿液RBP的测定：

测定仪器：日立7060全自动生化分析仪；

分析方法：两点终点法；

分析参数：R1:225ul，R2:75ul，样本：20ul；波长：600nm；

实施例4：

试剂盒检测血清样本性能试验：

（1）灵敏度试验

以水为空白样本，选取一份低值血清样本进行倍比稀释，配制出不同浓度（0、2.5、5、10、20mg/L）的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表1，从表1可见，本发明试剂盒的对血清RBP的检测灵敏度为2.5mg/L。

表1

RPB（mg/L）	0	2.5	5	10	20
						平均值	0.26	2.32	5.12	10.23	20.12
SD	0.47	0.22	0.21	0.15	0.17
						CV	180.77%	9.48%	4.10%	1.47%	0.84%

（2）线性范围试验

用RBP纯品配制成浓度为160mg/L的高值血清样本用生理盐水按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的稀释比例进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图1。根据理论值与检测均值求出该浓度的线性偏差，结果表明本发明试剂盒对血清样本RBP的检测上限可达到160mg/L以上。

（3）相关性分析

分别采用实施例1配制的本发明试剂盒和日本某公司的用于检测血清中RBP的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒做相关性实验，使用日立7020型自动生化分析仪对50份新鲜人血清（包含正常和异常样本）进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图2（X、Y轴均为测定值，单位mg/l）。由图2可知，本发明试剂盒和进口的对照试剂盒的相关系数为R²=0.9785，回归方程为y=0.9073x+3.2236。该结果表明本发明试剂盒和进口的对照试剂盒具有很好的相关性、特异性和准确性。

实施例5

试剂盒检测尿液样本性能试验：

（1）灵敏度试验

以水为空白样本，选取一份低值尿液样本进行倍比稀释，配制出不同浓度的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表2和表3。表3为某进口可同时测血和尿液中RBP的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的测尿灵敏度结果。

表2

RPB（mg/L）	0.000	0.025	0.050	0.100	0.200
						平均值	0.003	0.025	0.054	0.105	0.204
SD	0.002	0.004	0.005	0.006	0.006
						CV	78.06%	16.88%	9.44%	5.48%	2.98%

表3

RPB（mg/L）	0.000	0.100	0.200	0.500	1.000
						平均值	0.002	0.149	0.220	0.516	1.012
SD	0.003	0.041	0.019	0.020	0.014
						CV	132.29%	27.48%	8.43%	3.78%	1.33%

从表2可见，本发明试剂盒的对尿液RBP的检测灵敏度为0.05mg/L，而对照试剂盒的检测灵敏度只有0.2mg/L。

（2）线性范围试验

用RBP纯品配制成浓度为10mg/L的高值尿液样本用纯水按照1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的稀释比例进行倍比稀释，每个浓度重复测定3次，计算其均值，将样品的测量值与稀释比例进行相关对比，求出回归方程，并通过回归方程计算样本的理论值，结果见图3。根据理论值与检测均值求出该浓度的线性偏差，结果表明本发明试剂盒对尿液样本RBP的检测上限可达到10mg/L以上。

（3）相关性分析

分别采用实施例1配制的本发明试剂盒和日本某公司的用于检测尿液中RBP的乳胶增强免疫比浊法检测试剂盒做相关性实验，使用日立7020型自动生化分析仪对50份人尿液（包含正常和异常样本）进行测定，按照各自测定方法进行测定，对测定值进行相关分析，结果见图4（X、Y轴均为测定值，单位mg/l）。。由图4可知，本发明试剂和对照试剂的相关系数为R²=0.9957，回归方程为y=1.003x-0.0042)。该结果表明本发明试剂与对照试剂具有很好的相关性、特异性和准确性。

Claims

1.一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为含有具有促进凝聚作用的多聚物缓冲液，其特征在于，所述试剂R2是含有乳胶-抗体交联物的缓冲液，其中乳胶-抗体交联物是标记有抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的大胶乳颗粒和标记有抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体的小胶乳颗粒。

2.根据权利要求1所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，包括兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体；所述抗人视黄醇结合蛋白单克隆抗体为含有功能部位的完整抗体、抗体片段或重组抗体。

3.据权利要求1所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述大胶乳颗粒为粒径在120～400nm之间的聚苯乙烯胶乳，大胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.01～0.1％。

4.据权利要求1所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述小胶乳颗粒为粒径在30～150nm之间的聚苯乙烯胶乳，小胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1～0.5％。

5.根据权利要求3所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述大胶乳颗粒为粒径在160～300nm之间的聚苯乙烯胶乳，大胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.02～0.05％。

6.根据权利要求4所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述小胶乳颗粒为粒径在60～120nm之间的聚苯乙烯胶乳，小胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1～0.3％。

7.根据权利要求1所述的一种可以同时检测尿样本和血清样本中视黄醇结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中大胶乳颗粒和小胶乳颗粒的混合比例为1︰4～14。