CN107543931A - 基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒及其制备方法，解决了现有技术中的试剂盒在保证试剂性能的同时所需要的抗体的量较大，成本相对较高的问题。本发明包括试剂1和试剂2；所述试剂2包括以下终浓度的组分：粒径为50‑100nm的聚苯乙烯胶乳颗粒：20ml/L‑30ml/L，粒径为200‑300nm的聚苯乙烯胶乳颗粒：10ml/L‑15ml/L，缓冲液：50mmol/L‑100mmol/L，叠氮钠：1g/L‑3g/L，甘氨酸：5g/L‑20g/L，EDC：0.1g/L‑0.2g/L，乳糖：50g/L‑100g/L，cTNI抗体：110mg/L‑330mg/L。本发明在保证试剂性能的同时，有效降低抗体的使用量，节约试剂成本，同时具有线性范围宽、灵敏度高以及反应性能显著等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒及其制备方法，具体涉及基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌钙蛋白，由T、C、I三亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白能在血液中保持很长时间6-10天。肌钙蛋白I具有高度心肌特异性和灵敏度，所以肌钙蛋白已成为目前最理想的心肌梗死标志物。
目前测定cTnI的常用方法有：酶联免疫吸附法、化学发光法、酶联荧光分析法、免疫比浊法等。其中酶联免疫吸附法操作繁琐，操作耗时；电化学发光法与荧光分析法，对于仪器设备的要求较高，价格昂贵，难以普及；因此开发一个准确可靠的免疫比浊试剂，对于临床上的常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测是非常简单高效的。
现有技术中也公开了各种肌钙蛋白I的检测试剂盒，包括有独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，但现有试剂盒的在保证试剂性能的同时，检测需要的抗体的量较大，成本相对较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有技术中的试剂盒在保证试剂性能的同时所需要的抗体的量较大，成本相对较高的问题，目的在于提供了基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，其通过试剂成分的调整、不同粒径聚苯乙烯胶乳颗粒的配合，在保证试剂性能的同时，有效降低抗体的使用量，节约试剂成本。
本发明通过下述技术方案实现：
基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，包括：试剂1和试剂2；
所述试剂2包括以下终浓度的组分：
小粒径胶乳颗粒：20ml/L-30ml/L，
大粒径胶乳颗粒：10ml/L-15ml/L，
缓冲液：50mmol/L-100mmol/L，
叠氮钠：1g/L-3g/L，
甘氨酸：5g/L-20g/L，
EDC：0.1g/L-0.2g/L，
乳糖：50g/L-100g/L，
cTNI抗体：110mg/L-330mg/L；
其中，小粒径胶乳颗粒和大粒径胶乳颗粒均为聚苯乙烯胶乳颗粒，小粒径胶乳颗粒的粒径为50-100nm，大粒径胶乳颗粒的粒径为200-300nm。
本发明通过上述配比的优化设置，即可有效在保证试剂性能的同时，有效达到降低抗体的使用量，节约试剂成本的优点。
进一步，为了达到最佳的线性范围和检测灵敏度，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径分别为80-100nm和200-250nm。所述cTNI抗体包括浓度为100mg/L-300mg/L的cTNI多克隆抗体和浓度为10mg/L-30mg/L的cTNI单克隆抗体。根据表1-表3的数据对比可知：通过上述优化设置，本发明可以得到最优的反应曲线以及显著的反应性能。
优选地，所述试剂1包括以下终浓度的组分：
缓冲液：10mmol/L-50mmol/L，
Triton X-100：10mL/L，
聚乙二醇4000：10g/L-50g/L，
叠氮钠：1g/L-3g/L。
优选地，所述试剂1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液，所述试剂2中的缓冲液为HEPES缓冲液。
基于胶乳增强免疫比浊法检测cTnI的试剂盒的制备方法，包括试剂1的制备方法和试剂2的制备方法；所述试剂2的制备方法包括：
(1)取聚苯乙烯胶乳颗粒加入到部分缓冲液中，然后加入EDC活化聚苯乙烯胶乳颗粒的表面羧基后制成混合液一；另取剩余的缓冲液，加入cTNI抗体混合均匀后制成混合液二；
(2)将混合液二倒入混合液一中进行反应；
(3)反应完成后加入甘氨酸进行封闭；
(4)封闭完成后加入乳糖和叠氮钠溶解后即制成试剂2。
进一步，所述步骤(1)中的活化时间为30min。
进一步，所述步骤(2)中的反应时间为5h。
进一步，所述步骤(3)中的封闭时间为1h。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明能在保证试剂性能的同时，有效降低抗体的使用量，节约试剂成本；
2、本发明具有线性范围宽、灵敏度高以及反应性能显著等优点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，包括试剂1和试剂2，其中，
试剂1包括：甘氨酸缓冲液，Triton X-100，聚乙二醇4000，叠氮钠；将上述TritonX-100，聚乙二醇4000，叠氮钠加入甘氨酸缓冲液中即制成试剂1。试剂1中各组分的终浓度分别为：甘氨酸缓冲液：30mmol/L，Triton X-100：10mL/L，聚乙二醇4000：30g/L，叠氮钠：1g/L。
试剂2包括：聚苯乙烯胶乳颗粒，HEPES缓冲液，叠氮钠，甘氨酸，EDC，乳糖，cTNI抗体；其中，聚苯乙烯胶乳颗粒包括粒径为50-100nm的聚苯乙烯胶乳颗粒和粒径为200-300nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，cTNI抗体包括cTNI多克隆抗体和cTNI单克隆抗体。上述试剂2的具体制备方法如下：
(1)取80-100nm的聚苯乙烯胶乳颗粒25ml、200-250nm的聚苯乙烯胶乳颗粒12.5ml加入500ml HEPES缓冲液中；
(2)加入0.15g EDC活化聚苯乙烯胶乳颗粒的微球表面羧基，反应时间30分钟；
(3)另取500ml HEPES缓冲液，加入cTNI多克隆抗体200mg、cTNI单克隆抗体20mg，充分混匀；
(4)将溶解cTNI抗体的500ml HEPES缓冲液倒入溶解聚苯乙烯胶乳颗粒的500mlHEPES缓冲液中，反应5小时；
(5)加入甘氨酸10g封闭反应1小时；
(6)加入乳糖50g、叠氮钠1g充分溶解即制成试剂2。
采用本发明的试剂1和试剂2对cTnI进行检测，检测的反应强度如表1所示。同时，本实施例还提供了不同的两种粒径范围混合后制成的试剂2对TnI进行检测的反应强度，检测结果如表1所示。
表1
通过表1可知，结合线性和灵敏度的要求，采用80-100nm和200-250nm两种粒径的聚苯乙烯胶乳颗粒混合，可以得到最优的反应曲线。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中仅仅cTNI抗体不同，本实施例同时提供了单独使用cTNI多克隆抗体以及单独使用cTNI单克隆抗体分别制备试剂2，采用本实施例的试剂2与实施例1中的试剂1配合后对cTNI进行检测，检测结果如表2所示。
表2
通过上述表2的试验结果可知：采用混合抗体，反应性能显著的优于单一抗体。
实施例3
本实施例为实施例1的对照实施例，本实施例中采用单一粒径的聚苯乙烯胶乳颗粒制成试剂2，并采用该试剂2与试剂1配合后对cTNI进行反应强度的检测，检测结果如表3所示。
表3
通过上述表3和表1对比后可知：本发明采用两种粒径的聚苯乙烯胶乳颗粒能有效满足反应要求，而采用单一聚苯乙烯胶乳颗粒无法满足反应要求。
实施例4
本实施例为不同抗体量的情况下进行检测的检测方式和反应强度结果，如表4所示：
表4
通过上述表4可知，根据灵敏度与线性，同时结合成本，采用220mg/L的抗体量为最优的抗体使用量。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，包括：试剂1和试剂2；其特征在于，
所述试剂2包括以下终浓度的组分：
小粒径胶乳颗粒：20ml/L-30ml/L，
大粒径胶乳颗粒：10ml/L-15ml/L，
缓冲液：50mmol/L-100mmol/L，
叠氮钠：1g/L-3g/L，
甘氨酸：5g/L-20g/L，
EDC：0.1g/L-0.2g/L，
乳糖：50g/L-100g/L，
cTNI抗体：110mg/L-330mg/L；
其中，小粒径胶乳颗粒和大粒径胶乳颗粒均为聚苯乙烯胶乳颗粒，小粒径胶乳颗粒的粒径为50-100nm，大粒径胶乳颗粒的粒径为200-300nm。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径分别为80-100nm和200-250nm。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，其特征在于，所述cTNI抗体包括浓度为100mg/L-300mg/L的cTNI多克隆抗体和浓度为10mg/L-30mg/L的cTNI单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括以下终浓度的组分：
缓冲液：10mmol/L-50mmol/L，
Triton X-100：10mL/L，
聚乙二醇4000：10g/L-50g/L，
叠氮钠：1g/L-3g/L。
5.根据权利要求4所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒，其特征在于，所述试剂1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液，所述试剂2中的缓冲液为HEPES缓冲液。
6.如权利要求1-5任一项所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒的制备方法，包括试剂1的制备方法和试剂2的制备方法；其特征在于，所述试剂2的制备方法包括：
(1)取聚苯乙烯胶乳颗粒加入到部分缓冲液中，然后加入EDC活化聚苯乙烯胶乳颗粒的表面羧基后制成混合液一；另取剩余的缓冲液，加入cTNI抗体混合均匀后制成混合液二；
(2)将混合液二倒入混合液一中进行反应；
(3)反应完成后加入甘氨酸进行封闭；
(4)封闭完成后加入乳糖和叠氮钠溶解后即制成试剂2。
7.根据权利要求6所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化时间为30min。
8.根据权利要求6所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的反应时间为5h。
9.根据权利要求6所述的基于胶乳增强免疫比浊法检测TnI的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的封闭时间为1h。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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