CN103105488B - 一种氨基脲(sem)衍生化试剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种氨基脲衍生化试剂及试剂盒及其在氨基脲的夹心ELISA检测中的应用。所述试剂为带有特异性小分子标记的醛基苯甲酸，所述醛基苯甲酸能通过醛基与氨基脲的氨基反应，形成带有特异性小分子标记的氨基脲-醛基苯甲酸衍生物。本发明的氨基脲衍生化试剂能简化氨基脲衍生物的分离和纯化步骤，免去了氨基脲半抗原的制备和使用，并可实现其夹心ELISA法的检测，从而极大地简化了检测步骤、降低检测时间和操作误差，同时增强检测的稳定性、精密度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于免疫化学检测领域，涉及一种氨基脲衍生化试剂及其在氨基脲的衍生化的方法，以及其衍生物的夹心ELISA检测方法。
背景技术
呋喃西林(nitrofurazone)属于硝基呋喃类药物，是一种广谱抗菌药物，被广泛作治疗药物和饲料添加剂用于禽、畜、水产养殖中控制疾病或疫情。呋喃西林在临床上表现为明显的三致作用(致癌、致畸、致突变)，因此引起各国的高度重视，欧盟早在1995年就禁止呋喃西林用作兽药，澳大利亚、美国也相继在2001年和2002年出台了相关法律，将呋喃西林作为养殖禁用药物。
呋喃西林在动物体内极易降解，短短数小时内即可代谢为呋喃西林代谢物氨基脲(式一)，氨基脲易与蛋白质结合，该结合产物性质较稳定不易分解，可在动物体内存留数周。因此氨基脲常被用作检测呋喃西林原药的标记物，世界上大多数国家都以监测氨基脲来达到对呋喃西林原药监控的目的。
式一氨基脲分子结构
目前对检测呋喃西林残留物氨基脲的方法主要采用液液萃取-高效液相色谱(HPLC)法、固相萃取-高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)法等。这些方法主要存在需要大型仪器，一般实验室不能满足，检测时间长，衍生物萃取纯化过程复杂，检测通量低不能满足现场检测和大样本检测等缺点，已不能满足目前检测的需求。
近几年也建立了一些氨基脲的酶联免疫检测技术，但普遍存在衍生物萃取、纯化效率低以及萃取试剂对抗体的负面影响等问题，这些对于检测的稳定性和精度造成较大影响。而且由于氨基脲是小分子，目前只能采用竞争法进行检测。该方法需要半抗原的合成，由于不同批次的半抗原存在一定的差别，不同批次的产品存在一定差异，因此检测稳定性受到影响。因此，本领域迫切需要开发一种简便、稳定的氨基脲夹心检测方法。
发明内容
针对上述问题，发明人发明了一种氨基脲衍生化试剂以及基于该试剂的试剂盒。本发明的氨基脲衍生化试剂能简化氨基脲衍生物的分离和纯化步骤，免去了氨基脲半抗原的制备和使用，并可实现其夹心ELISA法的检测，从而极大地简化了检测步骤、降低检测时间和操作误差，同时增强检测的稳定性、精密度和灵敏度。
本发明的第一个目的在于提供一种氨基脲衍生化试剂。
该衍生化试剂是带有特异性小分子标记的醛基苯酸衍生物，该分子能通过醛基与氨基脲的氨基反应，形成氨基脲的衍生物。所述的醛基苯酸衍生物包括对醛基苯酸衍生物和邻醛基苯酸衍生物。所述的特异性小分子标记包括生物素(biotin)、地高辛(digoxin)、组氨酸、荧光分子(CY-5，CY-3，FITC，FAM等)。所述的小分子通过一段短臂连接在醛基苯酸的羧基上，所述短臂为任选地掺杂N或O或S或P的2-30个C的直链分子，所述的小分子优选生物素。以生物素修饰为例，其化学结构式如式2。
式2生物素标记的衍生化试剂的分子结构
本发明的第二个目的在于建立一种使用上述衍生化试剂检测氨基脲的夹心ELISA方法。
本发明所述的抗体是采用氨基脲与醛基苯甲酸衍生化后的产物与BSA、KLH、OVA等偶联后的半抗原制备的鼠单抗、兔多抗及相应的针对该衍生物表位的基因工程抗体，所述抗体优选鼠单抗。
本发明所述的衍生化在低PH条件下(PH值为1-5)进行，衍生产物不经过萃取或其他纯化等过程，直接加入或用杂交液稀释后加入到酶标板中，所述PH值优选2。
本专利所述的二抗是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶标记的能与所述特异性小分子结合的蛋白或抗体及其偶联物，例如亲和素/链霉亲和素、地高辛抗体、组氨酸抗体/含Ni亲和分子、荧光分子抗体等。
在本发明所述的夹心ELISA法中，板上包被的抗体通过SEM-醛基苯甲酸分子固定小分子-二抗-HRP复合物(如生物素-链霉亲和素-HRP复合物)，从而实现夹心法对氨基脲的检测。根据氨基脲衍生物的含量即可推算出样品中氨基脲含量。
通过该方法能有效检测样品中的氨基脲，该方法灵敏度为0.07ng/mL，样本添加回收率达95％以上。
本发明的第三个目的在于提供基于本发明的氨基脲衍生化试剂，用于氨基脲的夹心ELISA检测的试剂盒。
综上所述，本发明是将特异性小分子标记修饰的醛基苯甲酸应用于氨基脲的衍生化，实现氨基脲衍生产物的简便、高效处理，并建立了基于夹心ELISA的小分子定量检测方法。该方法适合于动物组织及各种食品中氨基脲的快速检测，具有高特异性、高灵敏度、高精度、高稳定性等特点，最低检测线为0.07ng/mL，具有良好的应用前景和经济及社会效益。
附图说明
图1是使用SEM标准样品的吸光度(3次检测平均值)为纵坐标，以标准样品浓度为横坐标绘制的氨基脲检测灵敏度曲线。插图是以SEM标准样品的吸光度(3次检测平均值)为纵坐标，以标准样品浓度(半对数)为横坐标绘制的曲线以及根据曲线求出的直线方程。
图2是对以标准样品的回收率为纵坐标，以标准样品浓度为横坐标绘制的样品回收率分布图。
具体实施方式
实施例
以生物素修饰的对醛基苯甲酸为例进行说明：
(1)酶标板包被
将按照现有技术的方法(Gao，A.；Chen，Q.；Cheng，Y.；Lei，J.；Zeng，L.，Preparationofmonoclonalantibodiesagainstaderivativeofsemicarbazideasametabolictargetofnitrofurazone.AnalyticaChimicaActa2007，592，(1)，58-63.)制备的氨基脲-对醛基苯甲酸衍生物与BSA的偶联物的鼠单抗用常规碳酸缓冲包被液(pH9.6，2.93mg/mLNaHCO3，)稀释到15μg/mL，100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。其后用含1％BSA的10mMPBS，200μL/孔封闭，37℃，2小时。PBST洗3次后37℃烘干，4℃储存备用。
(2)动物组织样品前处理
将小鼠肌肉组织破碎，用组织匀浆器匀浆，准确称取1g均质后的组织样本，用8mL超纯水稀释，混匀后加入10μL1M的HCl，混匀后加入100μL式2中的生物素修饰的对醛基苯甲酸(参考Sabatino，G.；Chinol，M.；Paganelli，G.；Papi，S.；Chelli，M.；Leone，G.；Papini，A.M.；DeLuca，A.；Ginanneschi，M.，Anewbiotinderivative-DOTAconjugateasacandidateforpretargeteddiagnosisandtherapyoftumors.JMedChem2003，46，(14)，3170-3合成)的甲醇溶液(10mg/mL)混匀后37℃震荡4小时。其后5000rpm离心后取上清检测。
(3)夹心ELISA检测
将50μL上清杂交稀释液(30mM，PH＝7.5，VPBS∶VTris＝1∶1)加入所述包被的酶标板，37℃孵育30min，其后PBST洗3次。然后加入100μL市售HRP标记的链霉亲和素(1∶8000)，37℃孵育20min，其后PBST洗3次。
采用常规TMB酶标底物法进行显色和终止。反应终止后用酶标仪测量吸光度。
(4)数据分析
将多个浓度(参见图1横坐标)的氨基脲标准样品按照上文(2)和(3)所述的方法进行检测，结果见图1。并以氨基脲标准样品的吸光度(3次检测平均值)为纵坐标，标准品浓度(半对数)为横坐标绘制曲线，求出直线方程(图1中的插图)。将要测样品的检测结果代入方程，即可得出要测样品中的氨基脲的含量。
检测结果用Originpro8.5软件进行数据分析，对氨基脲检测的线性范围为0-37.5ng/mL，检测限为0.07ng/mL，样品回收率为96％-113％(图2)，从衍生化到结果获取只要5个半小时。
Claims (22)
1.一种氨基脲衍生化试剂，其特征在于所述的氨基脲衍生化试剂为带有特异性小分子标记的醛基苯甲酸，所述醛基苯甲酸能通过醛基与氨基脲的氨基反应，形成带有特异性小分子标记的氨基脲-醛基苯甲酸衍生物，所述的特异性小分子标记通过一段短臂连接在醛基苯甲酸的羧基上，短臂为任选地掺杂N或O或S或P的2-30个C的直链分子；所述的特异性小分子标记是能够与特异性蛋白结合的小分子：生物素、地高辛、组氨酸或荧光分子；所述荧光分子为CY-5、CY-3、FITC或FAM；其中氨基脲与醛基苯甲酸的衍生化是在pH值为1-5下进行。
2.根据权利要求1所述的氨基脲衍生化试剂，其特征在于所述特异性蛋白为抗体。
3.根据权利要求1所述的氨基脲衍生化试剂，其特征在于所述醛基苯甲酸为对醛基苯甲酸或邻醛基苯甲酸。
4.根据权利要求1所述的氨基脲衍生化试剂，其特征在于：所述的衍生化在pH值为2下进行。
5.一种检测样品中氨基脲的方法，包括：
(1)用抗氨基脲-醛基苯甲酸衍生物抗体包被酶标板；
(2)使样品与带有特异性小分子标记的醛基苯甲酸接触，形成带有特异性小分子标记的氨基脲-醛基苯甲酸衍生物，其中氨基脲与醛基苯甲酸的衍生化是在pH值为1-5下进行；
(3)将步骤(2)得到的混合物加入步骤(1)的酶标板中，使所述带有特异性小分子标记的氨基脲-醛基苯甲酸衍生物固定在酶标板上；
(4)再向所述酶标板中加入能与所述特异性小分子标记结合的酶标二抗，使其与所述特异性小分子标记反应；
(5)对步骤(4)中发生的反应进行检测，根据标准曲线计算氨基脲的含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的衍生化在pH值为2下进行。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的带有特异性小分子标记的醛基苯甲酸被溶解于极性溶剂中，所述极性溶剂选自甲醇、水、乙醇、DMSO、DMF及其混合物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的酶标板采用96孔酶标板，并封闭板上未包被抗体的空白孔。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述抗氨基脲-醛基苯甲酸衍生物抗体为鼠单抗、兔多抗及基因工程抗体中的任意一种。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的地高辛抗体、组氨酸抗体或荧光分子抗体。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的亲和素替代所述酶标二抗。
12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的链霉亲和素替代所述酶标二抗。
13.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的含Ni的亲和分子替代所述酶标二抗。
14.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述检测是用酶标仪测量吸光度。
15.一种检测样品中氨基脲的试剂盒，其特征在于包括：
(1)带有特异性小分子标记的醛基苯甲酸，所述的特异性小分子标记通过一段短臂连接在醛基苯甲酸的羧基上，短臂为任选地掺杂N或O或S或P的2-30个C的直链分子；所述的特异性小分子标记是能够与特异性蛋白结合的小分子：生物素、地高辛、组氨酸或荧光分子，所述荧光分子为CY-5、CY-3、FITC或FAM，其中氨基脲与醛基苯甲酸的衍生化是在pH值为1-5下进行；
(2)包被有抗氨基脲-醛基苯甲酸衍生物抗体的酶标板；
(3)酶标二抗。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述特异性蛋白为抗体。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于：所述的衍生化在pH值为2下进行。
18.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于：所述抗氨基脲-醛基苯甲酸衍生物抗体为鼠单抗、兔多抗及基因工程抗体中的任意一种。
19.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的地高辛抗体、组氨酸抗体或荧光分子抗体。
20.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的亲和素替代所述酶标二抗。
21.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的链霉亲和素替代所述酶标二抗。
22.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的、能与所述特异性小分子标记结合的含Ni的亲和分子替代所述酶标二抗。
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