KR101395954B1 - 분석물 농도 측정 어세이에 사용하기 위한 안정화제 및 포획 리간드 - Google Patents

분석물 농도 측정 어세이에 사용하기 위한 안정화제 및 포획 리간드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체액 중의 유리 또는 비결합 분석물 농도를 측정하는 데 유용한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 분석물 농도 어세이의 정확성을 개선하기 위해 포획 리간드 (capture ligand) 및 안정화제를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 사용 방법 및 도구도 개시되어 있다.
포획 리간드, 안정화제, 유리 분석물

Description

분석물 농도 측정 어세이에 사용하기 위한 안정화제 및 포획 리간드{STABILIZING AGENTS AND CAPTURE LIGANDS FOR USE IN ASSAYS MEASURING ANALYTE CONCENTRATIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 60/833,786호 (2006년 7월 28일자 출원)에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문을 본원에서 인용한다.
본 발명은 체액 중의 유리 또는 비결합 분석물 농도를 측정하기 위한 신규하고 유용한 조성물을 교시한다. 본 발명은 분석물 농도 어세이의 정확성을 개선하기 위해 포획 리간드 (capture ligand) 및 안정화제를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 사용 방법 및 도구도 개시되어 있다.
용액 중의 분석물의 농도를 측정하기 위한 각종 어세이가 개발되어 왔다. 예를 들어, 어세이는 분석물을 함유하는 용액을 포획 리간드와 혼합하고, 모든 불순물을 세정 제거한 후, 포획 리간드와 결합된 분석물을 측정하는 것을 포함하여 왔다. 이러한 검출법에는 몇몇 기술적 어려움이 존재한다. 어떤 경우에는, 불순물이 포획 리간드에 의도하지 않게 결합되는 경우가 발생한다. 또한, 어떤 경우에 는 포획 리간드에 대한 분석물의 결합이 안정하지 않아 분석물이 리간드로부터 해리된다. 어떤 경우에는, 용액 중의 분석물이 결합 형태 (예를 들어, 단백질에 결합됨)와 비결합 형태로 존재할 수 있어, 비결합 형태의 농도만을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 어떤 경우에는 분석물 농도의 정확하고 재생가능한 측정값을 얻기 위해서는 결합 형태와 비결합 형태 간의 평형을 안정화시킬 필요가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 베크만 컬터, 인코포레이티드 (Beckman Coulter, Incorporated (BCI), 캘리포니아주 플러톤)는 전통적으로 BCI의 각종 분석물 농도 어세이에 알킬 아민 플루오로-계면활성제 (FC100, 미네소타주, 세인트 폴, 3M 코포레이션 (3M Corporation)에 의해 제조됨)를 사용하여 왔다. FC100은 이의 정확한 화학적 조성에 있어서 실질적으로 롯트 간의 편차를 나타내는 아민 플루오로-계면활성제의 복합 칵테일이다. 3M 코포레이션의 물질 안전 보건 자료 (MSDS, 2000년 2월 8일에 발행됨, 문서 번호 10-3799-3)에 따르면, FC100은 물, 디에틸렌 글리콜 부틸 에테르, 플루오로알킬 설포네이트 나트륨 염, 및 잔류 유기 플루오로 화학 물질의 기업 비밀의 혼합물을 함유한다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 본 발명자는 알킬 아민 플루오로-계면활성제가 평형을 안정화시키고 이에 따라 분석물 농도의 정확한 측정을 가능하게 함으로써 샘플 용액 중에 존재하는 유리 비결합 분석물 대 결합 분석물의 양을 정확하게 측정하는 것을 용이하게 한다고 믿는다.
수 년 전에, 미국 환경 보호국은 잠재적 유해 화합물로서의 특정 플루오로카 본 화합물, 예컨대 플루오로카본 옥탄산 및 이의 유도체에 대하여 우려를 표명하였다. 따라서, 알킬 아민 플루오로-계면활성제를 분석물 농도 측정에서 기능을 할 수 있는 상이한 어세이 조성물로 대체하는 대안에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 신규한 조성물, 및 대상체로부터의 샘플 중의 유리 비결합 분석물을 정확하게 측정하기 위한 어세이에 상기 조성물을 이용하는 방법 및 키트를 제공한다.
[발명의 개요]
본 발명은 상기 언급한 필요성 및 현재 이용가능한 기술이 직면하는 문제점을 해결한다.
본 발명은 유리 분석물의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
(a) 포획 리간드를 용기에 첨가하고;
(b) 안정화제를 용기에 첨가하고;
(c) 유리 분석물을 포함하는 샘플을 용기에 첨가하고;
(d) 검출 시스템을 용기에 첨가하며;
(e) 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정하는
것을 포함한다.
본 발명은 또한 유리 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 유리 분석물에 대한 포획 리간드, 및 안정화제를 포함하며, 단 안정화제는 알킬 아민 플루오로-계면활성제를 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 유리 분석물의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 키트에 관 한 것이고, 상기 키트는
(a) 분석물에 대한 포획 리간드;
(b) 안정화제; 및
(c) 검출 시스템
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 (d) 참조 표준을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 RX를 포함하는 안정화제에 관한 것이고, 식 중 R 및 X는 공유 결합이고, R은 포화 및 불포화 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 알킬아미노알킬, 알킬아미노옥시알킬, 알콕시아미노알킬, 포스포노알킬, 카르복시알킬, 카르복시알콕시알킬, 카르복시알킬아미노알킬, 카르복시알킬아미도알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 헤테로시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 실록산, 또는 카르보실란 (이들 중 임의의 것은 하나 이상의 산소, 질소, 인, 또는 규소 원자가 임의 개재될 수 있음)이고, R 치환기들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있고, X는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설파이트, 타우레이트, 설포석시네이트, 설포베타인, 설폰아미드, 메톡시메타닐아미드, 설파밀, 설페노, 클로라이트, 클로라이드, 요오다이드, 요오데이트, 브로마이드, 브로메이트, 플루오라이드, 플루오레이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트로아민, 아미노, 이미노, 이소시아노토, 이소티오시아노, 아세트아미도, 아세트이미도, 아지도, 디아조, 시아노, 시아나토, 포스페이트, 포스포, 포스포노, 포스피닐, 포스피노, 카르복실레이트, 아크릴레이트, 세바케이트, 프탈레이트, 아세테이트, 옥시드, 보레이트, 퍼옥소보레이트, 테트라보레이트, 보라네이트, 실란, 오르소실리케이트, 메타실리케이트, 또는 금속 실리케이트이며, 단 RX는 알킬 아민 플루오로-계면활성제일 수 없다. 도 1 및 2는 화학식 RX를 포함하는 안정화제를 기술한다.
일부 실시양태에서, R은 알킬, 알킬렌, 알킨, 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 알킬아미노알킬, 알킬아미노옥시알킬, 알콕시아미노알킬, 포스포노알킬, 카르복시알킬, 카르복시알콕시알킬일 수 있고, 이들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된다.
일부 실시양태에서, R은 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 2-메틸 부틸, 2-에틸 부틸, 2-프로필 부틸, 3-메틸 부틸, 3-에틸 부틸, 3-프로필 펜틸, 2-메틸 펜틸, 2-에틸 펜틸, 2-프로필 펜틸, 3-메틸 펜틸, 3-에틸 펜틸, 3-프로필 펜틸, 4-메틸 펜틸, 4-에틸 펜틸, 4-프로필 펜틸, 2-메틸 헥실, 2-에틸 헥실, 2-프로필 헥실, 3-메틸 헥실, 3-에틸 헥실, 3-프로필 헥실, 4-메틸 헥실, 4-에틸 헥실, 4-프로필 헥실, 5-메틸 헥실, 5-에틸 헥실, 5-프로필 헥실, 2- 메틸 헵틸, 2-에틸 헵틸, 2-프로필 헵틸, 3-메틸 헵틸, 3-에틸 헵틸, 3-프로필 헵틸, 4-메틸 헵틸, 4-에틸 헵틸, 4-프로필 헵틸, 5-메틸 헵틸, 5-에틸 헵틸, 5-프로필 헵틸, 6-메틸 헵틸, 6-에틸 헵틸, 6-프로필 헵틸, 2-메틸 옥틸, 2-에틸 옥틸, 2-프로필 옥틸, 3-메틸 옥틸, 3-에틸 옥틸, 3-프로필 옥틸, 4-메틸 옥틸, 4-에틸 옥틸, 4-프로필 옥틸, 5-메틸 옥틸, 5-에틸 옥틸, 5-프로필 옥틸, 6-메틸 옥틸, 6-에틸 옥틸, 6-프로필 옥틸일 수 있고, 이들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, X는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설파이트, 타우레이트, 설포석시네이트, 설포베타인, 설폰아미드, 메톡시메타닐아미드, 설파밀, 또는 설페노, 바람직하게는 설페이트, 설폰산, 설포석시네이트, 또는 타우레이트일 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 C6 -18 알킬이고 X는 설페이트, 설포네이트 또는 설폰산이다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 2-에틸-헥실 설페이트; 1-헥산 설폰산, 또는 이의 염; 1-헵탄 설폰산, 또는 이의 염; 1-옥탄 설폰산, 또는 이의 염; 1-데칸 설폰산, 또는 이의 염; 나트륨 C14 -16 올레핀 설포네이트; 나트륨 도데실 설페이트; 나트륨 디옥틸 설포석시네이트; 나트륨 N-올레일-N-메틸타우레이트; 나트륨 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트; 아민 알킬벤질 설포네이트; 나트륨 에틸-헥실 설페이트; 및 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 2-에틸-헥실 설페이트이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정화제의 염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분석물은 호르몬, 약물, 또는 비타민이다. 일부 실시양태에서, 분석물은 분석물의 단일 거울상이성질체 또는 탈요오드화 형태를 포함한 다.
일부 실시양태에서, 포획 리간드 및 안정화제는 분석될 샘플 중의 유리 분석물 및 결합 분석물 간의 평형을 유지시키는 방식으로 결합된다.
일부 실시양태에서, 안정화제의 부피 분율은 약 0.0001 내지 약 0.1 부피%이다.
일부 실시양태에서, 안정화제의 농도는 약 5 내지 약 750 마이크로몰이다.
일부 실시양태에서, 2-에틸-헥실 설페이트의 부피 분율은 약 0.004 내지 약 0.015 부피%이다.
일부 실시양태에서, 2-에틸-헥실 설페이트의 농도는 약 75 내지 약 650 마이크로몰이다.
일부 실시양태에서, 포획 리간드는 항체, 항체 단편, 항체 모방체 (mimic), 또는 분석물 특이적 결합 단백질, 예컨대 내인자 또는 엽산 결합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 고체상 상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 분석물 특이적 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 항체이다.
일부 실시양태에서, 분석물은 갑상선 호르몬이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 면역어세이 시스템을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역어세이 시스템은 비오틴 특이적 결합 분자로 코팅된 상자성 입자, 비오티닐화된 분석물 특이적 포획 단백질, 또는 이의 조합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역어세이 시스템은 검출가능한 표지를 포함한다.
도 1은 본 발명에 개시된 안정화제를 형성하는 각종 R 기 (I부터 VIII까지)를 예시하는 차트이다.
도 2는 본 발명에 개시된 안정화제를 형성하는 각종 X 기 (I부터 VIII까지)를 예시하는 차트이다.
도 3은 본 발명에 개시된 안정화제로서 평가된 각종 RX 화합물을 예시하는 차트이다. "작용 농도 V/V%"는 가용성인 시험된 안정화제의 농도를 의미한다.
도 4는 본 발명에 개시된 안정화제로서 평가된 각종 EHS 동족체를 예시하는 차트이다. "작용 농도 V/V%"는 가용성인 시험된 안정화제의 농도를 의미한다.
본 발명은 유리 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이고, 여기서 조성물은 유리 분석물에 대한 포획 리간드 및 안정화제를 포함하며, 단 안정화제는 알킬 아민 플루오로-계면활성제를 포함하지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 단수 형태는 문맥에서 달리 명시적으로 언급하지 않는 한 단수 및 복수에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "안정화제"는 단일 안정화제 뿐만 아니라 배합된 2종 이상의 상이한 안정화제를 포함한다.
용어 "임의 유도체화된"은 대상 분자 또는 분자 잔기가 임의 치환되거나, 임의 개재되거나, 또는 둘 다임을 의미한다. 용어 "임의 치환된"은 대상 분자 또는 분자 잔기 중 수소 또는 탄소 원자가 원자 또는 원자들의 기와의 교환으로 대체됨을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "임의 개재된"은 Si, O, N, S, 또는 P가 탄소 사슬 또는 실록산 사슬의 주쇄에 삽입됨을 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "임의 유도체화된"은 하나 이상의 산소, 질소, 할로겐, 또는 산소, 질소, 또는 할로겐을 포함하는 잔기로 치환 또는 개재됨을 의미한다.
본 발명의 조성물은 유리 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 사용될 수 있다. 조성물은 (i) 유리 분석물에 대한 포획 리간드; 및 (ii) 안정화제를 포함할 수 있고, 여기서 안정화제는 화학식 RX, 또는 이의 염을 포함하고, 식 중 R은 포화 또는 불포화 알킬, 아릴, 또는 규소계 중합체이고, 이들 중 임의의 것은 산소, 질소, 할로겐, 또는 이의 조합물을 함유하는 하나 이상의 잔기로 임의 유도체화되고, X는 황 또는 인의 옥소 음이온 (oxoanion) 또는 옥시드, 또는 질소의 옥소 음이온 또는 카르보닐 유도체, 카르복실레이트, 보레이트, 실리케이트, 또는 할로겐이며, 단 안정화제는 알킬 아민 플루오로-계면활성제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 안정화제는 화학식 RX, 또는 이의 염을 포함하고, 식 중 R은 포화 또는 불포화 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 알킬아미노알킬, 알킬아미노옥시알킬, 알콕시아미노알킬, 포스포노알킬, 카르복시알킬, 카르복시알콕시알킬, 카르복시알킬아미노알킬, 카르복시알킬아미도알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 헤테로시클로알킬알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 실록산, 실리콘, 또는 카르보실란 (이들 중 임의의 것은 하나 이상의 산소, 질소, 인, 또는 규소 원자가 임의 개재될 수 있음)이고, R 치환기들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있고, X는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설파이트, 타우레이트, 설포석시네이트, 설포베타인, 설폰아미드, 메톡시메타닐아미드, 설파밀, 설페노, 클로라이트, 클로라이드, 요오다이드, 요오데이트, 브로마이드, 브로메이트, 플루오라이드, 플루오레이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트로아민, 아미노, 이미노, 이소시아노토, 이소티오시아노, 아세트아미도, 아세트이미도, 아지도, 디아조, 시아노, 시아나토, 포스페이트, 포스포, 포스포노, 포스피닐, 포스피노, 카르복실레이트, 아크릴레이트, 세바케이트, 프탈레이트, 아세테이트, 옥시드, 보레이트, 퍼옥소보레이트, 테트라보레이트, 보라네이트, 실란, 오르소실리케이트, 메타실리케이트, 또는 금속 실리케이트이며, 단 RX는 알킬 아민 플루오로-계면활성제가 아니고, 즉 R은 플루오로 알킬 아민이 아니다.
도 1 및 2는 본 발명의 안정화제의 각종 R 및 X 기를 약술한다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 화학식 RX를 가질 수 있다. 기타 실시양태에서, 안정화제는 RXR', XRX' 및 RXR'X'와 같은 화학식을 가질 수 있다. 본 발명에서, 안정화제가 화학식 RXR', XRX' 및 RXR'X'를 갖는 경우, R 및 R', 또는 X 및 X'는 동일한 대상 분자 또는 분자 잔기일 수 있거나, 또는 임의로 이들은 상이한 대상 분자 또는 분자 잔기일 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 선형 또는 분지형 실록산, 선형 또는 분지형 카르보실란, 선형 또는 분지형 알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 및 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 히드록시, 케토, 카르보닐, 카르복시, 또는 이의 조합물로 임의 치환된 알킬, 아릴, 또는 규소계 중합체이다. 일부 실시양태에서, R은 에테르, 에스테르, 또는 이의 조합물이다. 일부 실시양태에서, R은 폴리옥시프로필렌 또는 폴리옥시에틸렌을 포함한다.
일부 실시양태에서, R은 아민, 아미노, 이민, 이미노, 아미드, 암모늄, 또는 이의 조합물을 포함하는 하나 이상의 질소 함유 잔기로 임의 치환된 알킬, 아릴, 또는 규소계 중합체이다.
일부 실시양태에서, R은 알킬, 알킬렌, 알킨, 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 알킬아미노알킬, 알킬아미노옥시알킬, 알콕시아미노알킬, 포스포노알킬, 카르복시알킬, 카르복시알콕시알킬일 수 있고, 이들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 정의된 R은 알킬 또는 아릴의 히드록시, 카르복시, 아민, 아민 옥시드, 포스페이트, 아세테이트, 카르복실레이트, 암모늄 유도체, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 히드록시, 옥소, 아세테이트, 암모늄, 카르복시, 아미노, 또는 아민 옥시드로 임의 치환된다.
일부 실시양태에서, R은 알킬 또는 아릴이고, 이들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된다. 본 발명의 실시양태는 R이 알킬이고, 알킬은 C1 -30 알킬, C1 -22 알킬, C1 -16 알킬, C1 -12 알킬, C1 -10 알킬, 또는 C1 -8 알킬인 경우를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알킬 잔기는 C4 -30 알킬, C4 -22 알킬, C4 -18 알킬, C4 -16 알킬, C4 -14 알킬, 또는 C4 -12 알킬이다. 일부 실시양태에서, 알킬 잔기는 C6 -30 알킬, C6 -22 알킬, C6 -18 알킬, C6 -16 알킬, C6 -14 알킬, 또는 C6 -12 알킬이다. 일부 실시양태에서, 알킬은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된, C7 -30 알킬, C7 -22 알킬, C7 -18 알킬, C7 -14 알킬, C7 -12 알킬, 또는 C7 -9 알킬이다.
알킬 치환기로서 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 2-메틸 부틸, 2-에틸 부틸, 2-프로필 부틸, 3-메틸 부틸, 3-에틸 부틸, 3-프로필 펜틸, 2-메틸 펜틸, 2-에틸 펜틸, 2-프로필 펜틸, 3-메틸 펜틸, 3-에틸 펜틸, 3-프로필 펜틸, 4-메틸 펜틸, 4-에틸 펜틸, 4-프로필 펜틸, 2-메틸 헥실, 2-에틸 헥실, 2-프로필 헥실, 3-메틸 헥실, 3-에틸 헥실, 3-프로필 헥실, 4-메틸 헥실, 4-에틸 헥실, 4-프로필 헥실, 5-메틸 헥실, 5-에틸 헥실, 5-프로필 헥실, 2-메틸 헵틸, 2-에틸 헵틸, 2-프로필 헵틸, 3-메틸 헵틸, 3-에틸 헵틸, 3-프로필 헵틸, 4-메틸 헵틸, 4-에틸 헵틸, 4-프로필 헵틸, 5-메틸 헵틸, 5-에틸 헵틸, 5-프로필 헵틸, 6-메틸 헵틸, 6-에틸 헵틸, 6-프로필 헵틸, 2-메틸 옥틸, 2-에틸 옥틸, 2-프로필 옥틸, 3-메틸 옥틸, 3-에틸 옥틸, 3-프로필 옥틸, 4-메틸 옥틸, 4-에틸 옥틸, 4-프로필 옥틸, 5-메틸 옥틸, 5-에틸 옥틸, 5-프로필 옥틸, 6-메틸 옥틸, 6-에틸 옥틸, 및 6-프로필 옥틸을 들 수 있고, 이들 중 임의의 것은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 1 개 이상의 불포화 탄소 - 탄소 결합(들)을 갖는, 알킬의 올레핀 동족체일 수 있다. 즉, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 R 치환기들 중 임의의 것은 불포화될 수 있다. R에 대한 불포화 치환기의 비제한적인 예로서 알케닐, 알케녹시, 알케닐옥시알킬, 알케닐옥시알콕시알킬, 알케닐아미노알킬, 알케닐아미노옥시알킬, 알케닐옥시아미노알킬, 포스포노알케닐, 카르복시알케닐, 카르복시알케닐옥시알킬, 카르복시알케닐아미노알킬, 카르복시알케닐아미도알킬을 들 수 있다. 용어 "알케닐"은 C2 -22 알케닐기, 바람직하게는 C4 -18 알케닐, 또는 더 바람직하게는 C6 -18 알케닐 또는 C7 -14 알케닐을 의미한다. 용어 알케닐은 모든 입체이성질체, 즉 시스 및 트란스 이성질체, 뿐만 아니라 E 및 Z 이성질체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 불포화 알킬은 알킨을 포함할 수 있다. 용어 "알킨"은 C2-22 알킨기, 바람직하게는 C4 -18 알킨, 또는 더 바람직하게는 C6 -18 알킨 또는 C7 -14 알킨을 의미하고, 여기서 1 개 이상의 삼중 결합이 알킬 사슬 중에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, R에 대하여 본원에서 정의한 치환기들 중 임의의 것은 포화될 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 알킬 또는 아릴의 시클릭, 폴리시클릭, 또는 헤테로시클릭 유도체일 수 있고, 즉 R은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴이다. 일부 실시양태에서, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 할로겐, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 또는 헤테로아릴은 비시클릭 고리, 또는 트리시클릭 고리를 의미할 수 있다.
용어 "시클로알킬"은 포화 또는 부분 포화된 고리화 알킬기를 의미한다. 시클로알킬기로서 C3-8 시클로알킬을 들 수 있다. 전형적인 시클로알킬기로서 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로헵틸을 들 수 있다.
용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭"은 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 개재된 시클로알킬의 유도체를 의미한다. 더 구체적으로는, 용어 "헤테로시클릴" 또는 "헤테로시클릭"은 본원에서 탄소 원자, 및 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되는 1 내지 4 개의 헤테로원자로 이루어진 포화 또는 부분 불포화 3 ∼ 7원 모노시클릭, 또는 3 ∼ 14원 비시클릭 고리계를 의미하기 위하여 사용된다. 이의 비제한적인 예로서 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 피라졸리디닐, 디히드로푸라닐, 모르폴리닐, 디히드로아미다졸릴, 디히드로피라닐, 디히드로옥사졸릴, 테트라히드로옥사졸릴, 2-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 옥사지닐, 이속사지닐, 옥사티아지닐 등을 들 수 있다. 헤테로시클릭기는 하나 이상의 메틸, 에틸, 옥소, 할로, 히드록시, 아미노, 알킬아미노, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 히드록시프로필, 메톡시메틸, 카르복시, 또는 이의 조합물로 임의 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "헤테로시클릴"은 고리 중 산소를 함유하는 시클로알킬기, 즉 테트라히드로푸란 또는 테트라히드로피란과 같은 시클릭 에테르를 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "헤테로시클릴"은 고리 중 질소 및 산소를 포함하는 시클로알킬기를 의미한다.
용어 "아릴"은 모든 방향족 탄소 고리 구조, 또는 방향족 특성을 갖는 임의의 탄소 고리 구조를 의미한다. 바람직한 아릴로서 C6 -14 아릴, 특히 C6 -10 아릴, 예컨대 페닐 또는 나프틸, 가장 바람직하게는 탄소수 6의 아릴을 들 수 있다. 아릴기는 하나 이상의 메틸, 에틸, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 할로, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 히드록시프로필, 메톡시메틸, 또는 카르복시로 임의 치환된다. 바람직한 아릴기는 하나 이상의 메틸, 에틸, 할로, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 또는 카르복시로 임의 치환된다.
용어 "헤테로아릴"은 아릴의 유도체를 의미하고, 여기서 아릴 고리는 하나 이상의 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 개재된다. 더 구체적으로는, 용어 "헤테로아릴"은 5 ∼ 14원 헤테로방향족 고리계, 가장 바람직하게는 5 또는 6원 헤테로방향족 고리계를 의미하고, 여기서 고리 구조 중 1 내지 4 개의 원자는 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되는 헤테로원자이다. 이의 비제한적인 예로서 테트라졸릴, 피리디닐, 이미다졸릴, 이속사졸릴, 푸라닐, 옥사졸릴, 티아졸릴, 피롤릴, 티에닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 예를 들어, 1,2,3-트리아졸릴 및 1,2,4-트리아졸릴, 이소티아졸릴, 옥시디아졸릴, 예를 들어, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 및 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사트리아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 예를 들어, 1,2,3-트리아지닐 및 1,2,4-트리아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤즈이미다졸릴, 및 인돌릴을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "헤테로아릴"은 고리 중 산소, 질소, 또는 둘 다를 포함하는 아릴기를 의미한다.
일부 실시양태에서, R은 지방산, 또는 지방산의 동족체이다. 용어 지방산은 히드록시, C1 -4 알킬, 할로, 또는 알콕시로 임의 치환된, 포화 또는 불포화 카르복시알킬, 카르복시알콕시알킬, 카르복시알킬아미노알킬, 카르복시알킬아미도알킬 또는 이의 염 또는 에스테르를 의미한다. 일부 실시양태에서, 카르복시알킬은 하나 이상의 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 임의 개재된, 포화 또는 불포화 C2-30 카르복시알킬, C2-20 카르복시알킬, C2-18 카르복시알킬, C2-16 카르복시알킬, C2-14 카르복시알킬, C2 -10 카르복시알킬, 또는 C2 -8 카르복시알킬이다. 일부 실시양태에서, 용어 카르복시알킬은 하나 이상의 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물로 임의 치환된, C6 -30 카르복시알킬, C6 -20 카르복시알킬, C6 -18 카르복시알킬, C6 -16 카르복시알킬, C6 -14 카르복시알킬, C6 -10 카르복시알킬, 또는 C6 -8 카르복시알킬이다. 일부 실시양태에서, 카르복시알킬은 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 옥타데칸산, 이코산산, 또는 도코산산이다.
일부 실시양태에서, R은 지방산의 에스테르이고, 즉 R은 에스테르가 임의 개재된 카르복시알킬이다. 에스테르가 개재된 카르복시알킬의 비제한적인 예로서 카르복시알콕시알킬 또는 카르복시알콕시알콕시알킬을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, R은 지방산의 알카노아미드 유도체이고, 즉 R은 아미도기가 개재된 카르복시알킬이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 R은 카르복시알킬아미도 또는 카르복시알킬아미도알킬이다. 일부 실시양태에서, R은 옥시에틸화 지방산이다.
본 발명에서, R은 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 임의 개재된 지방산의 유도체일 수 있고, 즉 일부 실시양태에서, R은 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 임의 개재된 카르복시알킬이다. 일부 실시양태에서, R은 할로겐이 임의 치환된 카르복시알킬이다. 일부 실시양태에서, R은 하전된 카르복시알킬이고, 즉 R은 지방산의 음이온성 또는 양이온성 유도체이다.
일부 실시양태에서, R은 알코올 또는 알코올 유도체이다. 예를 들어, R은 알킬페놀, 또는 알코올의 에스테르일 수 있다. 일부 실시양태에서, R은 Si, O, N, P, 또는 이의 조합물이 임의 개재되거나, 할로겐으로 임의 치환되거나, 또는 둘 다인 알코올 또는 페놀이다.
일부 실시양태에서, R은 알킬의 에스테르 또는 폴리에스테르 유도체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R은 포화 또는 불포화 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 또는 알콕시알콕시알콕시알킬, 바람직하게는 C2 -20 알콕시알킬, C2 -20 알콕시알콕시알킬, 또는 C2 -20 알콕시알콕시알콕시알킬; C5 -16 알킬, C5-16 알콕시알킬, C5 -16 알콕시알콕시알킬, C5 -16 알콕시알콕시알콕시알킬; 또는 C7 -14 알콕시알킬, C7 -14 알콕시알콕시알킬, 또는 C7 -14 알콕시알콕시알콕시알킬이고; 이들 중 임의의 것은 1 개 이상의 히드록시로 임의 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 폴리에스테르는 화학식 [(CHq)nCO2Xp]m (식 중, X는 C1 -10 알킬, C1 -10 알케닐, 또는 C1 -10 알콕시알킬이고, p는 0 또는 1이고, q는 1 또는 2이고, n은 1 ∼ 10이고, m은 1 ∼ 100, 바람직하게는 1 ∼ 20 또는 1 ∼ 10임)의 화합물이다. 일부 실시양태에서 알킬의 에스테르 또는 폴리에스테르 유도체는 1 개 이상의 히드록시로 임의 치환된다.
일부 실시양태에서, R은 폴리옥시알킬렌이다. 용어 폴리옥시알킬렌은 2 개 이상의 산소 원자가 개재된 알킬렌 대상 분자 또는 분자 잔기를 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 폴리옥시알킬렌은 C1-21, O1-14 폴리옥시알킬렌, 또는 C1-14, O1-7 폴리옥시알킬렌을 의미한다. 본 발명에 사용하기에 적절한 폴리옥시알킬렌의 비제한적인 예로서 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시부틸렌, 폴리옥시펜틸렌, 폴리옥시헥실렌, 폴리옥시헵틸렌, 또는 폴리옥시옥틸렌을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, R은 2종 이상의 폴리옥시에틸렌기, 폴리옥시프로필렌기, 폴리옥시부틸렌기, 폴리옥시펜틸렌기, 폴리옥시헥실렌기, 폴리옥시헵틸렌기, 또는 폴리옥시옥틸렌기의 공중합체이다. 일부 실시양태에서, R은 기타 유기 또는 무기 잔기와의 옥시에틸화 공중합체이다.
일부 실시양태에서, R은 알킬의 폴리아민, 아민 옥시드, 아민 에톡실레이트 및 기타 아민 유도체일 수 있다. 용어 "폴리아민 유도체"는 알킬 사슬 중 2 개 이상의 탄소 원자가 질소로 대체된 알킬 사슬을 의미한다. 상기 용어는 또한 모노알킬 아민, 뿐만 아니라 디알킬 아민을 포함한다. 용어 "아민 옥시드 유도체"는 알킬 사슬 중 2 개 이상의 탄소 원자가 질소 및 산소로 대체된 알킬 사슬 (즉, -N-O-)을 의미한다. 예를 들어, R은 알킬아미노옥시알킬, 카르복시알킬아미노옥시알킬, 알킬아미노옥시알킬, 또는 알콕시아미노알킬일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리아민 유도체 또는 아민 옥시드 유도체는 에톡실레이트로 임의 치환된다.
일부 실시양태에서, R은 규소계 중합체이다. 용어 "규소계 중합체"는 각 단량체가 1 개 이상의 규소 원자를 포함하는, 결합된 단량체를 의미한다. 예를 들어, 용어 규소계 중합체의 비제한적인 예로서 실록산, 실리콘, 또는 카르보실란을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 규소계 중합체는 비-규소 함유 말단기를 말단 블록으로 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 선형, 분지형, 또는 시클릭 실록산이다. 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 히드록시알킬, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된 실록산이다. 일부 실시양태에서, R은 Si1 -21, O1 -21 실록산, Si3 -14, O3 -14 실록산, 또는 Si5 -10, O5-10 실록산이다. 기타 실시양태에서, R은 카르보실란이다. 용어 카르보실란은 그 주쇄 중 탄소 및 규소를 갖는 중합체를 의미한다. 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 히드록시, 카르보닐, 알킬, 할로겐, 할로알킬, 히드록시알킬, 포스페이트, 아세틸, 암모늄, 또는 이의 조합물로 임의 치환된 카르보실란이다. 일부 실시양태에서, R은 Si1 -21, C1 -21 카르보실란, Si3 -14, C1 -14 카르보실란, 또는 Si5 -10, C5 -1O 카르보실란이다. 일부 실시양태에서, 실록산 또는 카르보실란은 말단 블록을 갖고, 예를 들어, 비닐 또는 실라논을 말단 블록으로 갖는다. 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 알킬, 할로겐, 할로알킬, 히드록시알킬, 또는 이의 조합물로 임의 치환된 실록산 또는 카르보실란이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실록산 또는 카르보실란은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 펜틸, 또는 이의 조합물로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, R은 실리콘과 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리올, 폴리아민, 폴리우레탄, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 기타 중합체 잔기와의 공중합체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, R은 하나 이상의 폴리에스테르, 폴리올, 폴리아민, 폴리우레탄, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 또는 이의 조합물로 임의 치환된 실록산 또는 카르보실란이다. 본 발명의 실록산 또는 카르보실란은 이의 염, 에테르, 및 에스테르를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, R은 하전된 실록산 또는 카르보실란, 예를 들어, 실록산의 양이온성 유도체 또는 음이온성 유도체이다. 일부 실시양태에서, R은 실록산 또는 카르보실란의 염, 예를 들어, 암모늄 염이다. 일부 실시양태에서, R은 장쇄 에스테르, 장쇄 알코올, 장쇄 아민, 또는 이의 조합물로 유도체화된 실리콘을 포함한다.
각종 X 관능기가 본 발명에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 황 또는 인의 옥소 음이온 또는 옥시드, 질소의 옥소 음이온 또는 카르보닐 유도체, 카르복실레이트, 보레이트, 또는 실리케이트이다. 일부 실시양태에서, X는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설파이트, 설폭시드, 타우레이트, 설포석시네이트, 설포베타인, 설파토베타인, 설폰아미드, 포스페이트, 포스포, 포스포노, 포스피닐, 니트레이트, 니트라이트, 아미노, 이미노, 이소시아노, 이소티오시아노, 아세트아미도, 아세트이미도, 아지도, 디아조, 시아노, 시아나토, 알킬카르복실레이트, 아크릴레이트, 세바케이트, 프탈레이트, 보레이트, 테트라보레이트, 오르소실리케이트, 메타실리케이트, 금속 실리케이트, 클로라이트, 클로라이드, 요오다이드, 요오데이트, 브로마이드, 브로메이트, 플루오라이드, 또는 플루오레이트이다. 일부 실시양태에서, X는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설포석시네이트, 또는 타우레이트이다.
일부 실시양태에서, X는 황 원자를 포함하는 관능기이다. 이의 비제한적인 예로서 설페이트, 설포네이트 또는 설폰산을 포함하는 임의의 관능기를 들 수 있다. 용어 "황의 옥소 음이온 또는 옥시드"는 설페이트, 설폰산, 설포네이트, 설파이트, 타우레이트, 설포석시네이트, 설포베타인, 설폰아미드, 메톡시메타닐아미드, 설파밀, 또는 설페노를 의미한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, X는 할로겐을 포함하는 임의의 관능기일 수 있다. 이의 비제한적인 예로서 클로로기, 플루오로기, 브로모기, 요오도기, 또는 이의 조합물을 포함하는 임의의 관능기를 들 수 있다. 일부 실시양태에서, X는 클로라이트, 클로라이드, 요오다이드, 요오데이트, 브로마이드, 브로메이트, 플루오라이드 또는 플루오레이트일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, X는 질소를 포함하는 임의의 관능기일 수 있다. 이의 비제한적인 예로서 니트레이트, 니트라이트, 니트로아민, 아미노, 이미노, 이소시아노토, 이소티오시아노, 아세트아미도, 아세트이미도, 아지도, 디아조, 시아노, 시아나토, 니트로소, 니트로소이미노, 니트라미노, 니트로, 또는 이의 조합물을 포함하는 임의의 관능기를 들 수 있다.
일부 실시양태에서, X는 인을 포함하는 임의의 관능기일 수 있다. 용어 "인의 옥소 음이온 또는 옥시드"는 포스페이트, 포스포, 포스포노, 포스피닐, 또는 포스피노를 의미한다.
일부 실시양태에서, X는 카르복실레이트, 아크릴레이트, 세바케이트, 프탈레이트, 아세테이트, 또는 옥시드이다. 일부 실시양태에서, X는 붕소를 포함하는 임의의 관능기일 수 있다. 이의 비제한적인 예로서 보레이트, 퍼옥소보레이트, 테트라보레이트, 또는 보라네이트를 들 수 있다.
본 발명에서, X는 규소 원자를 포함하는 임의의 관능기일 수 있다. 이의 비제한적인 예로서 실란, 오르소실리케이트, 메타실리케이트, 또는 금속 실리케이트를 들 수 있다.
다수의 안정화제를 선별하여, 존재시, 알킬 아민 플루오로-계면활성제를 대체할 수 있으나 어세이의 정확성에 부정적인 영향을 미치지 않는 지를 측정하였다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 본 발명자는 안정화제가 유리 분석물 및 결합 분석물 간의 샘플 비를 유지시켜, 이에 따라 대상체의 생체액 또는 시험관내 시스템 중에서 관측되는 유리 비결합 분석물 대 결합 분석물 평형의 파괴를 방지하는 것으로 가정한다.
하나의 실시양태에서, 안정화제는 화학식 RX를 포함하고, 식 중 R은 알킬, 아릴, 지방산, 알코올, 에스테르, 에테르, 옥시알킬레이트, 또는 실록산을 포함하는 화학적 기를 포함하고, X는 황을 포함하는 화학적 기를 포함한다. RX가 할로겐을 포함하는 경우, 할로겐 잔기는 임의의 할로겐, 예를 들어, F, Cl, Br, 또는 I일 수 있으나, 단 본 발명은 알킬 아민 플루오로-계면활성제, 예컨대 FC100을 포함하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 안정화제를 알킬 알코올 유도체 화합물, 예를 들어, 2-에틸-헥실 설페이트 (EHS)로서 식별한다. 상기 알킬 알코올 유도체 화합물의 일반적 화학 구조는 CnH2n +1X이고, 식 중 n은 약 6 내지 약 18이고, X는 설페이트 유도체, 예를 들어, 화학 구조 CH3(CH2)3CH(C2H5)CH2OSO3 -Na+을 갖는 2-에틸-헥실 설페이트 나트륨 염의 경우 SO4 -Na+이다. X는 또한 도 2, X 기에 개시된 임의의 황 함유 기일 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 기타 안정화제로서 1-헥산 설폰산, 또는 이의 염 (예를 들어, Na+ 염); 1-헵탄 설폰산, 또는 이의 염 (예를 들어, Na+ 염); 1-옥탄 설폰산, 또는 이의 염 (예를 들어, Na+ 염); 1-데칸 설폰산, 또는 이의 염 (예를 들어, Na+ 염); 나트륨 C14 -16 올레핀 설포네이트 (CAS# 68439-57-6); 나트륨 도데실 설페이트; 나트륨 디옥틸 설포석시네이트; 나트륨 N-올레일-N-메틸타우레이트; 나트륨 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트 (분자량: 346); 아민 알킬벤질 설포네이트 (분자량: 385); 및 나트륨 에틸-헥실 설페이트를 들 수 있다.
본 발명은 체액 중의 유리 또는 비결합 분석물 농도를 진단 측정하는데 사용하기 위한 신규하고 유용한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 생체액 중에 존재한다. 생체액은 혈장 또는 혈청일 수 있다. 이는 또한 정액, 침, 소변, 배설물액, 뇌척수액, 또는 위액으로 이루어질 수 있다. 그러나, 일반적으로는, 생체액은 혈장 또는 혈청이다. 본 발명의 조성물은 또한 세포 배양 상청액 또는 여액을 포함하는 시험관내 시스템에도 사용될 수 있다. 용어 "생체액"은 생물 유기체로부터의 체액, 뿐만 아니라 생물 유기체로부터 유도된 체액, 예를 들어, 분별된 체액, 희석된 체액, 화학적으로 변형된 체액, 또는 이의 조합물을 포함한다.
분석물은 임의의 작은 분자, 비제한적인 예로서, 호르몬, 약물, 또는 비타민일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석물은 유리 비결합 상태 및 결합 상태 (예를 들어, 단백질 결합) 간의 평형 상태로 존재한다. 예를 들어, 분석물은 갑상선 호르몬 또는 비타민 B12일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적절한 기타 분석물로서 하기 종류의 척추동물 호르몬을 들 수 있다:
ㆍ아민 호르몬:
a. 티로신 유래 (단일 방향족 고리)
- 카테콜아민 (예를 들어, 아드레날린, 노르아드레날린, 도파민). - 갑상선 호르몬 (예를 들어, T4, 또는 T3, T2, 및 T1의 이성질체).
b. 트립토판 유래 (폴리시클릭 및 헤테로시클릭 방향족 화합물)
- 멜라토닌, 세로토닌.
ㆍ펩티드 호르몬:
a. 작은 펩티드, 예를 들어,
- 앤지오텐신 IV는 6 개의 아미노산 잔기를 갖고, 앤지오텐신 III 및 앤지오텐신 II는 각각 7 및 8 개의 아미노산을 갖는다. 작은 분자 크 기로 인하여, 상기 펩티드는 혈장 운반체 분자, 예컨대 단백질과 결합 되기 쉽다.
- 뇌 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), 32 개 아미노산. 기타 나트륨 이뇨 펩티드 호르몬으로서 심방 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP) 및 C-형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP)를 들 수 있다.
- 칼시토닌, 32 개 아미노산 펩티드, 전구체인, 프로칼시토닌 유래.
- 부신 피질 자극 호르몬 (ACTH)은 39 개의 아미노산을 가짐.
- 인슐린은 51 개의 아미노산 펩티드를 가짐.
- 부갑상선 호르몬 (PTH), 84 개 아미노산. PTH는 또한 상이한 임상 적 용도를 갖는 몇몇 상이한 단편 (완전 PTH; N-말단 PTH; 분자 중간 의 PTH; 및 C-말단 PTH)으로 존재할 수 있음.
b. 큰 펩티드 (큰 펩티드는 단백질 다합체의 분리 이후 또는 분절 이 후 더 작은 단백질 분자를 제공함. 이들 더 작은 분자는 운반체 분자 와 평형 상태로 순환할 수 있음), 예를 들어:
- 여포 자극 호르몬 (FSH).
- 황체 형성 호르몬 (LH).
- 갑상선 자극 호르몬 (TSH).
- 융모성 성선 자극 호르몬 (예를 들어, hCG).
- 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH).
- 프로락틴 (PRL).
- 에리스로포이에틴 (EPO).
ㆍ스테로이드 또는 스테롤 호르몬: 본 발명은 혈장 운반체 분자, 예컨대 단백질과 결합된 형태와 평형 상태에 있는 유리 형태를 갖는 스테로이드 또 는 스테롤 호르몬에 유용하다. 상기 유래 형태는 생물학적 활성이고 임상적 유용성을 갖는다.
a. 스테로이드 호르몬, 예를 들어:
- 코르티솔: 순환하는 코르티솔의 약 4%는 유리되어 있고 따라서 수용 체에 이용가능하다. 나머지는 코르티코스테로이드 결합 글로불린 (CBG) 및 알부민을 비롯한 단백질에 결합되어 있다.
- 테스토스테론: 순환하는 테스토스테론의 약 2 ∼ 3%는 유리되어 있 고; 나머지는 성 호르몬 결합 글로불린 (SHBG, 약 44%) 및 코르티솔 결합 글로불린 (CBG, 약 3.5%), 뿐만 아니라 알부민 (약 50%)을 비롯 한 테스토스테론 결합 단백질에 결합되어 있다.
- 디히드로에피안드로스테론 (DHEA). DHEA의 대부분은 성 스테로이 드 결합 글로불린에 강하게 결합되어 있고 코르티코스테로이드 결합 글로불린 및 알부민에 약하게 결합되어 있으나, 이의 작은 비율은 유리 형태로서 나타난다.
- 프로게스테론: 프로게스테론의 대부분은 코르티솔 결합 글로불린 및 알부민에 결합되어 있으나, 이의 작은 비율은 유리 형태로서 나타난 다.
- 에스트리올: 에스트리올은 유리 형태로서 나타나거나 또는 성 호르 몬 결합 글로불린에 결합되어 있다.
- 에스트라디올: 순환하는 호르몬의 약 1 ∼ 3%는 유리되어 있는 한편 나머지는 에스트로겐 결합 글로불린에 강하게 결합되어 있다.
b. 스테롤 호르몬:
- 비타민 D 유도체
- 칼시트리올
용어 갑상선 호르몬은 티록신 (T4), 트리요오드티로닌 (T3), 디요오드티로닌 (T2), 모노요오드티로닌 (T1), 및 이의 조합물을 의미한다. 갑상선 호로몬은 이의 염, 이의 L- 또는 D-거울상이성질체, 또는 이의 탈요오드화 형태 및 이성질체 형태로 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 목적상, 용어 "분석물"은 그 특정 분석물의 모든 거울상이성질체 및 이성질체를 혼합물 또는 균일한 환경으로 포함함이 이해될 것이다. 생체액 중의 분석물의 경우, 분석물은 외인성 또는 내인성 유래일 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석물은 영장류, 예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 비비, 긴팔원숭이, 및 침팬지; 갯과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예컨대 고양이, 사자, 및 호랑이; 에퀴드 (equid), 예컨대 말, 당나귀, 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대 소, 돼지, 및 양; 및 토끼, 마우스, 래트, 기니피그, 및 페럿으로부터의 생체액 중에 존재할 수 있다. 분석물은 또한 모델 동물, 예를 들어, 질환 모델 동물, 예컨대 마우스, 래트, 또는 기타 실험실 동물; 생태적으로 중요한 동물, 예를 들어, 생태적으로 중요한 종축, 경주용 동물, 관람용 동물 (show animal), 상속 동물 (heirloom animal), 희귀 또는 멸종 위기에 있는 동물, 또는 반려 동물로부터의 체액 중에 존재할 수 있다. 특히, 분석물은 인간으로부터의 생체액 중에 존재한다. 본원에서 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간을 비롯한 임의의 포유동물, 비제한적인 예로서, 가축 및 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 및 애완동물을 의미한다.
안정화제는 시약 완충제, 또는 세정 완충제, 또는 둘 다에 도입될 수 있다. 또한 이는 포획 리간드와 함께 혼합될 수 있다. 기타 실시양태에서, 이는 별개의 용액으로 존재할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 사용하기 위한 조성물, 일부 실시양태에서는 유리 분석물에 관한 것이고, 조성물은 포획 리간드 및 안정화제를 포함한다.
포획 리간드는 분석물 특이적이고 관심을 갖는 유리 분석물과 선택적으로 결합될 수 있는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 포획 리간드의 비제한적인 예로서 항체, 항체 단편, 항체 모방체, 또는 분석물 특이적 결합 단백질, 예컨대 내인자 또는 엽산 결합 단백질, 및 이의 조합물을 들 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 모든 형태, 비제한적인 예로서 다클론, 단클론, 정제된 IgG, 정제된 IgM, 정제된 IgA, 또는 이의 조합물; 단쇄 항체 (미국 특허 제 4,946,778호), 키메라 또는 인간화 항체 (문헌 [Morrison 등, 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851]; [Neuberger 등, 1984, Nature 81:6851]) 및 상보적 결정 부위 (CDR; 문헌 [Verhoeyen 및 Windust, in Molecular Immunology 2ed., by B. D. Hames 및 D. M. Glover, IRL Press, Oxoford University Press, 1996, at pp. 283-325] 참고)를 포함하기 위한 것이다. 용어 "항체 단편"의 비제한적인 예로서 Fv, 단쇄 Fv (scFv), F(ab')2, 및 Fab 단편과 같은 단편을 들 수 있다 (문헌 [Harlow 및 Leon, 1988, Antibody, Cold Spring Harbor]). 본 발명의 항체 및 항체 단편은 임의의 통상의 방법, 비제한적인 예로서, 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는 문헌 [Antibodies : A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기술된 방법에 의해 수득될 수 있다.
용어 "항체 모방체"는 항체의 기능을 모방하는 화학 물질을 의미한다. 항체 모방체는 일반적으로 크기가 작아서, 이것이 면역원성 반응을 일으키는 것을 피하게 한다. 이들 항체 모방체의 구조 및 제조에 대한 몇몇 접근법, 예컨대 대안적 단백질 구조; RNA를 포함하는 구조; 비천연 올리고머, 예컨대 벤조디아제핀, 베타-회전 모방체, 프로테아제 억제제 및 퓨린 유도체; 비천연 생체중합체, 예컨대 올리고카르바메이트, 올리고우레아 및 올리고설폰; 및 잔텐 및 쿠반과 같은 주쇄에 대한 각종 치환기의 결합 (문헌 [Hsieh-Wilson, 등, (1996) Acc . Chem Res . 29:164-170], 및 미국 특허 제 5,770,380호에 기술됨)이 존재한다.
용어 "내인자"는 비타민 B12의 흡수에 필요한 당단백질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 용어 "내인자"는 인간 내인자를 의미한다.
용어 "분석물 특이적 결합 단백질"은 분석물에 특이적으로 결합되는 임의의 비-항체 단백질을 포함할 수 있다. 분석물 및 이의 분석물 특이적 결합 단백질의 비제한적인 예로서 티록신/티록신 결합 글로불린; 효소 억제제, 조효소 또는 보조 인자/효소; 코르티솔/코르티솔 결합 단백질; 비타민 B12/내인자; 및 엽산/엽산 결합 단백질을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석물 특이적 결합 단백질은 포획 단백질이다. 일부 실시양태에서, 분석물 특이적 결합 단백질은 엽산 결합 단백질 또는 내인자이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 포획 리간드, 안정화제를 포함할 수 있고, 암모늄 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 아연 염, 클로라이드 염, 카르복실레이트 염, 포스페이트 염, 무기 설페이트 염, 또는 이의 조합물과 같은 염을 더 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 분석물은 유리 분석물 및 결합 분석물로서 존재하고, 본 발명은 유리 분석물의 농도를 측정하는 어세이에 관한 것이다. 용어 "유리 분석물"은 포획 리간드 이외의 기타 분자 종류, 예컨대 단백질에 특이적으로 또는 비특이적으로 결합되지 않은 분석물을 의미한다. 따라서, 유리 분석물은 체액 중의 기타 분자 종류와 결합되지 않는다. 용어 "결합 분석물"은 포획 리간드 이외의 기타 분자 종류, 예컨대 단백질에 특이적으로 또는 비특이적으로 결합된 분석물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 유리 분석물 대 결합 분석물의 비를 안정화시키기 위하여, 본 발명은 화학식 RX를 포함하는 1종 이상의 안정화제를 이용한다.
안정화제는 다양한 농도로 존재할 수 있다. 본원에서 안정화제의 농도를 기술하는 경우, 용어 "부피%"는 최종 조성물의 단위 부피당 안정화제의 부피를 의미한다. 용어 "최종 조성물"은 포획 리간드 및 안정화제를 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 1 ㎖의 안정화제가 49 ㎖의 세정 완충제에 첨가되고, 안정화제/세정 완충제가 분석물 및 포획 리간드를 함유하는 용액 50 ㎖ 내에 위치되는 경우, 부피%는 1%의 안정화제 (즉 100 ㎖의 최종 조성물 중의 1 ㎖의 안정화제)일 것이다. 최종 조성물 중의 안정화제의 적절한 부피%의 비제한적인 예로서 약 0.00001 내지 약 0.5 부피%, 약 0.00005 내지 약 0.4 부피%, 약 0.00009 내지 약 0.3 부피%, 약 0.0001 내지 약 0.1 부피%, 약 0.0002 내지 약 0.2 부피%, 또는 약 0.00015 내지 약 0.15 부피%를 들 수 있고, 여기서 상기 부피%는 최종 조성물의 총 부피 기준이다. 분석물 특이적 결합 단백질에 대한 분석물의 결합 친화성이 유리 분석물 형태 및 결합 분석물 형태 간의 평형을 결정하므로, 당업자는 사례별로 특정 분석물에 대한 안정화제의 백분율을 최적화할 수 있다.
안정화제의 농도는 또한 최종 조성물의 ℓ당 안정화제의 몰로 측정될 수 있다. 최종 조성물 중의 안정화제의 농도는 일반적으로 약 1 내지 약 900 마이크로몰, 약 5 내지 약 850 마이크로몰, 약 25 내지 약 800 마이크로몰, 약 40 내지 약 800 마이크로몰, 약 5 내지 약 750 마이크로몰, 약 30 내지 약 700 마이크로몰, 또는 약 25 내지 약 600 마이크로몰일 수 있다.
안정화제가 EHS인 실시양태에 있어서, 최종 조성물 중의 EHS의 부피 분율은 일반적으로 약 0.0001 내지 약 0.05 부피%, 약 0.0005 내지 약 0.04 부피%, 약 0.0009 내지 약 0.03 부피%, 약 0.001 내지 약 0.02 부피%, 약 0.002 내지 약 0.019 부피%, 약 0.004 내지 약 0.015 부피%, 또는 약 0.005 내지 약 0.01 부피%이고, 여기서 상기 부피%는 최종 조성물의 총 부피 기준이다.
안정화제가 EHS인 실시양태에서, 최종 조성물 중의 EHS의 농도는 일반적으로 약 50 내지 약 800 마이크로몰, 약 100 내지 약 750 마이크로몰, 약 150 내지 약 700 마이크로몰, 약 150 내지 약 650 마이크로몰, 약 200 내지 약 600 마이크로몰, 약 250 내지 약 550 마이크로몰, 또는 약 300 내지 약 500 마이크로몰일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 안정화제는 샘플과 분석물 특이적 포획 리간드와의 혼합시 또는 그 직후에 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 안정화제는 샘플과 분석물 특이적 포획 리간드와의 배합 이후 시약 완충제, 세정 완충제, 또는 양쪽의 성분으로서 순차적으로 첨가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 유리 분석물의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
(a) 유리 분석물에 대한 포획 리간드를 용기에 첨가하고;
(b) 안정화제를 용기에 첨가하고;
(c) 유리 분석물을 포함하는 샘플을 용기에 첨가하고;
(d) 검출 시스템을 용기에 첨가하며;
(e) 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정하는
것을 포함한다.
유리 분석물의 농도를 측정하는 방법의 단계들은 다양한 순차적 순서로 수행될 수 있으며, 단 단계 (e)는 최종 단계여야 함이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 단계 (b)는 단계 (a)보다 선행할 수 있거나, 단계 (c)는 단계 (b)보다 선행할 수 있거나, 둘 다이다.
일부 실시양태에서, 용기는 바이알, 튜브, 반응 혼합물에 대한 용기, 마이크로타이터 플레이트 웰, 측방 유동 시스템 내의 막, 또는 액체 유동 시스템의 기타 안정한 성분을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "검출 시스템"은 분석물을 직간접적으로 검출하는 것으로 공지된 시스템의 1종 이상의 성분을 의미한다.
일부 실시양태에서, 검출 시스템은 방사성 면역어세이, 효소 결합 면역흡수 어세이, 효소 면역어세이, 화학발광 면역어세이, 생물발광 면역어세이, 또는 형광 면역어세이의 성분을 포함한다. 상기 검출 시스템은 문헌에서 잘 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 검출 시스템은 포획 리간드 특이적 결합 분자로 코팅된 상자성 입자, 검출가능한 표지, 또는 이의 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드 특이적 결합 분자는 합텐 특이적이고, 포획 리간드는 합텐화된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 합텐은 비오틴이다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드 특이적 결합 분자는 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 특이적 항체, 비오틴 특이적 항체 단편, 및 비오틴 특이적 항체 모방체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 검출 시스템은 검출가능한 표지를 포함한다. 본원에서 사용된 "검출가능한 표지"는 종래 기술에서의 통상의 의미를 갖고, 분자의 존재를 검출하거나 (예를 들어, 물리적 또는 화학적 특성에 의해) 또는 이를 지시하거나, 또는 이것이 공유 결합되어 있거나 또는 이것이 다르게 결합된 또다른 분자의 결합을 나타내는데 사용되거나 사용될 수 있는 원자 (예를 들어, 방사성 핵종), 분자 (예를 들어, 플루오레세인), 또는 착체를 의미한다. 용어 "표지"는 또한 기질에 작용하여 검출가능한 원자, 분자 또는 착체를 생성하는, 공유 결합되거나 또는 다르게 결합된 분자 (예를 들어, 효소와 같은 생체분자)를 의미한다. 본 발명에 사용하기에 적절한 검출가능한 표지로서 분광학적, 광화학적, 방사선학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 들 수 있다.
본 발명에 유용한 표지로서 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드 (Texas red), 로다민, 녹색 형광 단백질, 녹색 형광 증강 단백질, 리사민, 피코에리트린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 플루오르 X, SyBR 녹색 I & II [몰리큘러 프로브스 (Molecular Probes)] 등), 방사성 표지 (예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소 (예를 들어, 히드롤라아제, 특히 알칼리성 포스파타아제, 에스테라아제 및 글리코시다아제와 같은 포스파타아제, 또는 옥시도리덕타아제, 특히 양고추냉이 퍼옥시다아제와 같은 퍼옥시다아제, 및 ELISA에 기타 통상적으로 사용되는 것), 기질, 보조 인자, 억제제, 화학발광기, 발색제, 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 들 수 있다. 상기 표지의 검출 기술도 당 분야에 잘 공지되어 있다.
따라서, 예를 들어, 방사성 표지는 섬광 계수기의 이용으로 검출될 수 있고, 화학발광 표지 및 형광 마커는 방사된 광을 검출하는 광검출기의 이용으로 검출될 수 있다 (예를 들어, 형광 활성화 세포 분리에서와 같이). 효소 표지는 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 전형적으로 검출되고, 비색 표지는 착색된 표지를 간단히 시각화함으로써 검출된다.
따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 방사선학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 표지는 종래 기술에 잘 공지된 방법에 따라 어세이의 목적하는 성분에 직간접적으로 커플링될 수 있다. 비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일부 실시양태에서, 원래 검출가능하거나 또는 신호 발생 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물 (예를 들어, 유리 T4에 대한 경쟁적 면역어세이에서 T4-ALP 또는 T3-ALP)에 공유 결합된 검출가능한 표지는 포획 리간드 (예를 들어, T4 특이적 단클론 항체)에 대한 결합에 대하여 분석물 (예를 들어, 체액 샘플 중의 유리 T4)과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 고체상 상에 직접 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 포획 리간드 특이적 결합 분자, 예컨대 스트렙타비딘 또는 비오틴 특이적 단클론 항체와의 결합을 통한 고체상 상의 간접적 고정을 위해 비오티닐화될 수 있다.
분석물이 천연, 분석물 특이적 결합 분자를 갖는 경우, 상기 분석물은 분석물 또는 분석물의 유사체, 또는 검출 시스템 중의 분석물 특이적 결합 분자의 표지된 형태의 사용에 의해 검출되거나 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드 (예를 들어, 내인자 (IF) 특이적 단클론 항체)는 천연, 분석물 특이적 검출가능한 표지 (예를 들어, 비타민 B12에 대한 경쟁적 면역어세이에서 IF-ALP)에 대한 결합에 대하여 분석물 (예를 들어, 비타민 B12)과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 고체상 상에 직접 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 포획 리간드 특이적 결합 분자, 예컨대 스트렙타비딘 또는 비오틴 특이적 단클론 항체와의 결합을 통한 고체상 상의 간접적 고정을 위해 비오티닐화될 수 있다. 검출가능한 표지는 원래 검출가능하거나 또는 신호 발생 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물에 공유 결합되어 있다. 상기 검출가능한 표지는, 예를 들어, 효소 또는 형광단과의 컨쥬게이션에 의해 신호 발생 화합물에 직접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표지의 검출 기술은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 이의 비제한적인 예로서 화학발광제, 비색제, 에너지 전달제, 효소, 효소 반응의 기질, 형광제, 또는 방사성 동위원소의 사용을 들 수 있다. 효소는 알칼리성 포스파타아제, 아밀라아제, 루시페라아제, 카탈라아제, 베타-갈락토시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 글루코오스-6-디히드로게나아제, 헥소키나아제, 양고추냉이 퍼옥시다아제, 락타마아제, 우레아제 및 말레이트 디히드로게나아제를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 기질은 상기 표지가 그에 작용하는 것으로 공지된 분자 기를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 포획 리간드는 고체상 상에 고정된다. 고체상은, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트, 콜로이드 금속 입자, 산화철 입자, 중합체 비드, 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하는 단백질 커플링 표면으로 이루어질 수 있다. 또한, 고체상은 선별 시스템 (예를 들어, 분별, 침전, 또는 원심분리)에서 고체상으로서 기능하는 화학적 또는 분자 응집체로 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 또한 유리 분석물의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는
(a) 유리 분석물에 대한 포획 리간드;
(b) 안정화제; 및
(c) 검출 시스템
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 (d) 참조 표준을 더 포함한다. 관심을 갖는 분석물에 따라, 각종 참조 표준이 이용될 수 있다. 일반적으로, 참조 표준은 공지된 농도를 갖는 분석물 또는 이의 유사체를 포함하고, 이는 측정될 특정 분석물의 농도 측정에 사용된다. 참조 표준은 정제된 분석물, 재조합, 천연 또는 합성 분석물, 약물, 호르몬 또는 비타민을 포함할 수 있다. 참조 표준 매트릭스의 매트릭스 부분은 측정될 샘플에서의 분석물의 환경에 근접할 수 있는 생물학적 또는 합성 체액을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, 본 발명은 2-에틸-헥실 설페이트 (EHS) 및/또는 관련 화합물을 안정화제로서 사용함으로써, 유리 비-단백질 결합 갑상선 호르몬의 농도를 측정하는 어세이의 정확성을 개선한다. 본 발명은 대상체의 체액 중에 존재하는 갑상선 호르몬의 생체이용가능한 또는 유리된 부분을 측정하는 진단 정확성을 더 개선한다. 농도 측정 정확성에서의 개선은 체액, 예컨대 혈청 또는 혈장 중에 고유한 유리 비-단백질 결합 호르몬 및 단백질 결합 호르몬의 평형을 안정화시킴으로써 일어난다.
상기 실시양태에서, 본 발명은 설폰화 또는 황산화된 작은 분자를 안정화제의 음이온성 염 성분으로서 사용한다. 전통적으로, 설페이트 또는 설포네이트, 예컨대 8-아닐리노 나프탈렌-1-설포네이트 (ANS)는 총 (결합 + 유리) 호르몬을 측정하기 위하여 단백질 결합 분석물을 치환하는 데 사용된다. 따라서, 설포네이트기 또는 설페이트기를 갖는 분자를 안정화제로서 조성물에 포함시키는 것은 유리 호르몬 분율의 인위적 증가 또는 오버 샘플링 (over-sampling) 진단 오류를 야기할 것으로 예상된다. 본 발명은 따라서 예기치 못한 것이다.
상기 실시양태에서, 설포네이트기 또는 설페이트기를 갖는 계면활성제 또는 비계면활성제를 안정화제로서 어세이 반응에 첨가함으로써 면역어세이의 일관성을 개선한다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 유리 갑상선 호르몬의 정확한 농도 측정을 가능하게 하는 메커니즘은 반응의 초기에, EHS, 또는 기타 작은 사슬의 (탄소수 6 내지 18) 음이온성 설페이트 또는 설포네이트의 첨가를 통한 유리 호르몬 대 결합 호르몬 평형의 안정화에 의한 것으로 가정된다. 각종 황산화 또는 설폰화 화학 물질 중, 입체적으로 이용가능한 설페이트 또는 설포네이트를 갖는 것이 적절한 안정화제로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 적절한 안정화제에 중요한 기타 인자는 화학식 RX에 의해 기술되고, 식 중 R은 단쇄 탄화수소 (분자의 한쪽 말단에 소수성을 부여함)를 포함하고, X는 작은 친수성 기, 예를 들어, 1 개 초과의 산소 원자를 포함하는 작은 화학적 기를 포함한다. 도 1 및 2는 결합되어 본 발명의 안정화제를 형성할 수 있는 각종 R 기 및 X 기 중 일부를 비제한적으로 예시한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 분석물은 갑상선 호르몬이다. 하기는 갑상선 호르몬과 관련하여 주목할만한 관심을 갖는 점들이다.
1. 티록신 (T4)은 갑상선에 의해 생성되는 필수 호르몬이다. 트리요오드티로닌 (T3)은 갑상선에서 티로글로불린으로부터 직접적으로 방출될 수 있으나, 대부분의 T3은 티록신의 탈요오드화에 의해 신체의 다른 부위에서 생성된다.
2. 효소 티로퍼옥시다아제와의 반응을 통해, 요오드는 티로글로불린 분자의 티로신 잔기에 공유 결합되어 모노요오드티로신 (MIT) 및 디요오드티로신 (DIT)을 형성한다. 티록신은 DIT의 2 개의 잔기를 결합시킴으로써 생성된다. MIT의 1 개의 분자 및 DIT의 1 개의 분자의 결합은 트리요오드티로닌을 생성한다. MIT 및 DIT는 티로글로불린 상에서 T4 및 T3 호르몬의 불활성 전구체로서 원위치 형성된다. 리소좀의 프로테아제는 요오드화 티로글로불린을 소화시켜, T3 및 T4를 방출한다. MIT 및 DIT는 또한 단백질 가수분해의 생성물이나, 이는 요오드티로신 디할로게나아제에 의해 원위치 분해된다.
3. T4 및 T3 이외의 갑상선의 기타 성분으로서 디요오드티로닌 (T2) 및 모노요오드티로닌 (T1)을 들 수 있다.
4. 티론아민은 갑상선 호르몬 티록신 (T4) 및 3,5,3'-트리요오드티로닌 (T3)의 탈카르복실화 및 탈요오드화된 대사 산물이다.
5. 갑상선의 여포 세포는 요오드 함유 갑상선 호르몬, T4 및 T3을 합성하고; 갑상선의 부여포 세포는 더 큰 폴리펩티드 프로칼시토닌으로부터 절단된 32 개 아미노 펩티드 호르몬인, 칼시토닌을 생성한다.
혈중 티록신 (T4), 트리요오드티로닌 (T3), 디요오드티로닌 (T2), 및 모노요오드티로닌 (T1)은 혈청 단백질에 결합될 수 있고, 따라서 오로지 일부만이 유리 비-단백질 결합 형태로 분포될 수 있고, 이는 생체이용가능한 부분으로서도 공지되어 있다. 상기 유리된 양은 대상체의 갑상선 질환 상태에서 증가하거나 또는 감소한다. 예를 들어, 갑상선 기능저하증에 있어서 혈중 유리 비-단백질 결합 분율은 감소하는 한편, 갑상선 기능항진증에 있어서 비-단백질 결합 분율은 상승한다.
유리 티록신 (FT4) 시험은 갑상선 기능의 직접적인 측정법으로서 이용되고, 내과의사는 통상적으로 이를 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 시험에 대한 후처리로서, 또는 이와 함께 요구하여, 대상체의 갑상선 상태가 정상 갑상선 기능 (건강한 갑상선 기능), 갑상선 기능저하 또는 갑상선 기능항진에 있는지를 측정한다. 그러나, 모든 유리 비-단백질 결합 갑상선 호르몬에 고유한 결합 단백질 결핍 및 유리 대 결합 평형을 변화시킬 수 있는 기타 방해 인자로 인하여, TSH 측정 오류보다 FT4 시험 오류가 더 통상적으로 발생한다. 따라서, 대상체로부터의 샘플을 적절한 갑상선 기능에 대하여 시험하는 경우, 안정화제를 포함시켜 FT4를 안정화시키는 것이 중요하다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 안정화제는 분석물을 함유하는 샘플이 첨가되기 이전에 어세이에 첨가된다. 기타 실시양태에서, 안정화제는 분석물을 함유하는 샘플이 첨가된 이후, 예를 들어, 시약 완충제의 일부로서 어세이에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화제는 포획 리간드 (예를 들어, 분석물 특이적 항체)를 함유하는 시약 키트의 일부이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 안정화제는 분석물 특이적 어세이, 예를 들어, FT4 어세이에 각종 방법으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 안정화제는 바이알 시스템, 완충제 시스템, 또는 팩 시스템에 의해 첨가될 수 있다. 바이알 시스템에 있어서, 안정화제, 예를 들어, 1종 이상의 설폰화 화합물이 바이알로부터 반응 혼합물에 첨가된다. 완충제 시스템에 있어서, 안정화제, 예를 들어, 1종 이상의 설폰화 화합물은 반응 혼합물에 첨가되는 세정 완충제 용액의 일부이다. 팩 시스템에 있어서, 안정화제, 예를 들어, 1종 이상의 설폰화 화합물은 분석물 특이적 항체를 함유하는 시약 팩의 웰로부터 취해져서 반응 혼합물을 함유하는 용기에 첨가된다.
BCI의 액세스 (Access) FT4 어세이 시스템 (캘리포니아주, 플러톤, BCI)은 대상체의 혈청 또는 혈장 중의 유리 비-단백질 결합 티록신의 농도를 측정하는 데 이용된다. 상기 어세이는 최초에 세정액 중 알킬 아민 플루오로-계면활성제의 이용으로 개발되었다. 세정액은 어세이 반응물의 전달 이후 프로브 정화제로서, 및 또한 세정액으로서 사용되었다. 세정액 계면활성제를 더 환경 친화적인 탄화수소 계면활성제로 대체하기 위하여, 본 발명이 개발되었다. 본 발명의 조성물은 혈청 또는 혈장 중의 티록신의 유리 비-단백질 결합 부분 및 단백질 결합 부분의 평형을 심각하게 전복시키지 않는 단백질, 계면활성제, 완충제 이온, 및 염 조성물을 함유할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다. 티록신 결합 단백질은 알부민, 티록신 결합 글로불린, 및 트란스타이레틴으로 이루어진다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, EHS가 안정화제이고, 이는 최적화된 농도 범위, FT4의 경우 최종 반응 조성물 중 약 0.002% 부피/부피 내지 약 0.015% 부피/부피, 바람직하게는 0.004% 부피/부피 (또는 181 마이크로몰)로 적정되어, 유리 대 결합 평형의 유지를 돕는다.
본 발명의 이용 방법에 대한 하기 실시예는 본 발명자가 고려하는 본 발명의 한 가지 이상, 그러나 전부가 아닌 대표적 실시양태를 제공할 수 있고, 따라서, 본 발명 및 특허청구범위를 어떠한 경우에도 제한하기 위한 것이 아니다.
액세스 프리 (Access Free) T4 어세이 (BCI)는 2 단계 효소 면역어세이이다. 비오틴에 커플링된 단클론 항-티록신 (T4) 항체 (BCI), T4를 함유하는 생물학적 샘 플, 안정화제를 함유하는 완충된 단백질 용액, 및 스트렙타비딘 코팅된 고체상을 반응 용기에 첨가한다. 상기 첫번째 인큐베이션 동안, 비오틴에 커플링된 항-T4 항체는 고체상 및 샘플 중의 유리 T4에 결합된다. 반응 용기 내에서 인큐베이션한 후, 고체상에 결합된 물질을 자기장 내에 유지시키는 한편 비결합 물질을 세정 제거한다. 다음으로, 완충된 단백질 용액 및 트리요오드티로닌 (T3)-알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트를 반응 용기에 첨가한다.
T3-알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트는 비어 있는 항-T4 항체 결합 부위에 결합된다. 반응 용기 내에서 인큐베이션한 후, 고체상에 결합된 물질을 자기장 내에 유지시키는 한편 비결합 물질을 세정 제거한다. 그 후, 화학발광 기질 루미-포스®530 (Lumi-Phos®530) (매사추세츠주, 사우스필드, 루미젠 인코포레이티드 (Lumigen Inc.))을 용기에 첨가하고 반응에 의해 발생한 광을 발광 측정기로 측정한다. 발광은 샘플 중의 유리 T4의 농도에 반비례한다. 샘플 중의 분석물의 양을 저장된, 다중점 보정 곡선으로부터 측정한다. 혈청 및 혈장 (헤파린)이 권고되는 샘플이다.
BCI의 액세스 프리 T4 A33070A 어세이 키트는 액세스 프리 T4 시약 팩 카테고리 번호 33880 (100 회 측정, 2 팩, 50 회 시험/팩)을 포함한다. 이는 즉시 사용할 수 있게 제공된다. 시약 팩은 하기 시약 A부터 E까지 포함한다:
시약 A: 단백질 (조류), 계면활성제, 0.125%의 NaN3, 및 0.125%의 프로클린® (Proclin®) 300 (펜실베이니아주, 필라델피아, 롬 앤드 하스 (Rohm and Haas)로부터 이용가능함)을 갖는 TRIS 완충제 중의 스트렙타비딘으로 코팅된 다이나비즈® (Dynabeads®) 상자성 입자.
시약 B: 단백질 (조류), 계면활성제, < 0.1%의 NaN3, 및 0.1%의 프로클린 300을 갖는 TRIS 완충 염수.
시약 C: 단백질 (조류), 계면활성제, 0.125%의 NaN3, 및 0.125%의 프로클린 300을 갖는 TRIS 완충 염수.
시약 D: 단백질 (조류), 계면활성제, < 0.1%의 NaN3, 및 0.1%의 프로클린 300을 갖는 TRIS 완충제 중의 트리요오드티로닌-알칼리성 포스파타아제 (소) 컨쥬게이트.
시약 E: 단백질 (조류 및 뮤린), 계면활성제 및 안정화제, 0.125%의 NaN3, 및 0.125%의 프로클린® 300을 갖는 TRIS 완충제 중의 비오틴에 커플링된 마우스 단클론 항-티록신 (T4).
다수의 안정화제의 선별에 있어서 편의상 사용되는, 시약 팩 자체의 일부가 아닌 추가의 시약을 바이알 시약 F로서 지칭한다. 바이알 시약 F는 1종 이상의 안정화제 (예를 들어, 도 3 또는 도 4에 언급된 설폰화 계면활성제)를 함유하는 완충제이다.
실시예 1
시약 팩의 시약 E에만 안정화제가 존재함
첫번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
1) 50 ㎕의 시약 E (안정화제, 예를 들어, 0.016%의 EHS를 함유함);
2) 30 ㎕의 분석물 함유 샘플;
3) 30 ㎕의 시스템 세정 완충제 (안정화제를 함유하지 않음);
4) 30 ㎕의 시약 B (안정화제를 함유하지 않음);
5) 50 ㎕의 시약 A.
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 두번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
6) 220 ㎕의 시약 C;
7) 50 ㎕의 시약 D;
8) 80 ㎕의 시스템 세정 완충제 (안정화제를 함유하지 않음).
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정한다.
실시예 2
시약 팩의 시약 B에만 안정화제가 존재함
첫번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
1) 50 ㎕의 시약 E (안정화제를 함유하지 않음);
2) 30 ㎕의 분석물 함유 샘플;
3) 30 ㎕의 시스템 세정 완충제 (안정화제를 함유하지 않음);
4) 30 ㎕의 시약 B (안정화제, 예를 들어 0.016%의 EHS를 함유함);
5) 50 ㎕의 시약 A.
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 두번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
6) 220 ㎕의 시약 C;
7) 50 ㎕의 시약 D;
8) 80 ㎕의 시스템 세정 완충제 (안정화제를 함유하지 않음).
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정한다.
실시예 3
바이알 시스템의 바이알 시약 F에만 안정화제가 존재함
첫번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
1) 50 ㎕의 시약 E (안정화제를 함유하지 않음);
2) 30 ㎕의 분석물 함유 샘플;
3) 30 ㎕의 바이알 시약 F (도 3 또는 도 4에 언급된 1종 이상의 안정화제를 갖는 세정 완충제를 함유함);
4) 30 ㎕의 시약 B (안정화제를 함유하지 않음);
5) 50 ㎕의 시약 A.
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 두번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
6) 220 ㎕의 시약 C;
7) 50 ㎕의 시약 D;
8) 80 ㎕의 바이알 시약 F (도 3 또는 도 4에 언급된 1종 이상의 안정화제를 갖는 세정 완충제를 함유함).
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정한다.
실시예 4
시스템 세정 완충제에만 안정화제가 존재함
첫번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
1) 50 ㎕의 시약 E (안정화제를 함유하지 않음);
2) 30 ㎕의 분석물 함유 샘플;
3) EHS, 또는 도 3 또는 도 4에 언급된 기타 설폰화 계면활성제와 같은 1종 이상의 안정화제를 함유하는, 2O mM의 TRIS, 0.15M의 NaCl, 0.1%의 프로클린 300, 0.1%의 NaN3, pH 8.0과 같은 염 매트릭스 중의 30 ㎕의 시스템 세정 완충제;
4) 30 ㎕의 시약 B (안정화제를 함유하지 않음);
5) 50 ㎕의 시약 A.
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 두번째 반응은 반응 용기에 하기와 같이 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다:
6) 220 ㎕의 시약 C;
7) 50 ㎕의 시약 D;
8) EHS, 또는 도 3 또는 도 4에 언급된 기타 설폰화 계면활성제와 같은 1종 이상의 안정화제를 함유하는, 2O mM의 TRIS, 0.15M의 NaCl, 0.1%의 프로클린 300, 0.1%의 NaN3, pH 8.0과 같은 염 매트릭스 중의 80 ㎕의 시스템 세정 완충제.
반응 용기의 인큐베이션 및 세정 이후, 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 유리 분석물의 농도를 측정한다.
상기 실시예는 본 발명의 가능한 실시양태를 예시한다. 본 발명은 이의 몇몇 실시양태들을 참고로 하여 구체적으로 나타내어지고 기술된 한편, 이들은 제한이 아닌 단지 예로서 제공된 것이며, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항에 있어서 각종 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범위는 상기 기술한 대표적 실시양태 중 어떠한 것에 의해서도 제한되지 않아야 하며, 하기 특허청구범위 및 이의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
출판된 저널 기사 또는 요약, 또는 해당하는 미국 또는 외국 특허 출원을 비 롯한, 본원에서 인용된 모든 문헌, 또는 임의의 기타 문헌은 인용된 문헌에 기재된 모든 데이터, 표, 도면, 및 본문을 포함하여 그 전문을 각각 본원에서 참고로 인용한다.

Claims (32)

  1. (a) 유리 분석물에 대한 포획 리간드 (capture ligand)를 용기에 첨가하고;
    (b) 유리 분석물 및 결합 분석물 간의 평형을 유지시키는, 화학식 RX를 포함하는 안정화제 또는 이의 염을 용기에 첨가하고 (식 중, R은 C6-18 알킬이고, X는 설페이트, 설폰산, 또는 설포네이트임);
    (c) 분석물을 포함하는 샘플을 용기에 첨가하고;
    (d) 포획 리간드 특이적 결합 분자로 코팅된 고체상, 검출가능한 표지, 또는 이의 조합물을 포함하는 검출 시스템을 용기에 첨가하고;
    (e) 검출 시스템을 이용하여 샘플 중의 분석물의 농도를 측정하는
    것을 포함하며, 분석물이 샘플 중에 유리 분석물 및 결합 분석물 간의 평형 상태로 존재하는 것인, 유리 분석물의 농도를 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 안정화제가 2-에틸-헥실 설페이트, 또는 이의 염인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 분석물이 갑상선 호르몬인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 포획 리간드가 분석물 특이적이고, 항체, 항체 단편, 항체 모방체 (mimic), 분석물 특이적 결합 단백질, 및 이의 조합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 분석물 특이적 결합 단백질이 내인자 또는 엽산 결합 단백질인 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 고체상이 상자성 입자인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 포획 리간드 특이적 결합 분자가
    (a) 합텐 특이적이고, 포획 리간드가 합텐화된 것이거나, 또는
    (b) 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴 특이적 항체, 비오틴 특이적 항체 단편, 및 비오틴 특이적 항체 모방체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 포획 리간드가 고체상 상에 고정되는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 합텐이 비오틴인 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
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