JP2015192635A - キナーゼ活性の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)キナーゼを含む被検試料と、前記キナーゼの基質と、ジニトロフェニル基(以下、「DNP基」という)を含むATP誘導体とを反応させ、前記基質にDNP基が導入されたDNP基含有基質を含む混合物を得る工程、
(B)前記工程(A)で得られた混合物と、前記DNP基に結合する抗体とを混合し、前記DNP基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
(C)前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ATP誘導体は、ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してDNP基が結合している化合物である、
キナーゼ活性の測定方法を提供する。
本実施形態に係るATP誘導体は、リンカーを介してDNP基がATPのγ位のリン酸基に結合していることを特徴とする。本実施形態に係るATP誘導体は、ATP部分と、DNP基部分とから構成されている。
(式中、X1は、直接結合、酸素原子または硫黄原子、L1はリンカー部分、R1は前記L1および前記DNPの双方に連結可能な反応基、DNPはジニトロフェニル基を示す)
で表わされる化合物などが挙げられるが、特に限定されない。なお、本実施形態においては、ATP誘導体の製造の容易性を確保する観点から、R1およびX1は、互いに異なる官能基であることが好ましい。
などが挙げられるが、特に限定されない。前記R2結合基は、X2の種類に応じて適宜選択することができる。X1が硫黄原子である場合、前記X1結合基としては、例えば、マレイミド基、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド基、ジスルフィド基などが挙げられるが、特に限定されない。前記リンカー部分は、必要に応じ、R1結合基とX1結合基との間にスペーサーを有していてもよい。前記スペーサーとしては、置換基を有していてもよい炭素数1〜12のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数2〜12のアルケニレン基、置換基を有していてもよい炭素数2〜12のアルキニレン基、(ポリ)オキシアルキレン基などが挙げられるが、特に限定されない。アルキレン基の炭素数は、ATP誘導体のATP部分とDNP部分との間の立体障害を抑制してATPの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは1以上、より好ましくは2以上であり、ATP誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは12以下、より好ましくは8以下、さらに好ましくは6以下である。炭素数1〜12のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、n−プロピレン基、イソプロピレン基、n−ブチレン基、イソブチレン基、sec−ブチレン基、tert−ブチレン基、n−ペンチレン基、イソペンチレン基、ネオペンチレン基、ヘキシレン基などが挙げられるが、特に限定されない。アルケニレン基およびアルキニレン基それぞれの炭素数は、ATP誘導体のATP部分とDNP部分との間の立体障害を抑制してATPの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは2以上、より好ましくは3以上であり、ATP誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは12以下、より好ましくは8以下、さらに好ましくは6以下である。炭素数2〜12のアルケニレン基としては、ビニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基、ペンテニレン基などが挙げられるが、特に限定されない。炭素数2〜12のアルキニレン基としては、例えば、エチニレン基、プロピニレン基、ブチニレン基、ヘキセニレン基などが挙げられるが、特に限定されない。前記置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基などが挙げられるが、特に限定されない。(ポリ)オキシアルキレン基としては、例えば、オキシアルキレン基の炭素数1〜12であり、オキシアルキレン基の付加モル数が1〜8である(ポリ)オキシアルキレン基などが挙げられるが、特に限定されない。オキシアルキレン基の炭素数は、ATP誘導体のATP部分とDNP部分との間の立体障害を抑制してATPの機能を十分に発揮させ、リン酸化反応を効率よく行なう観点から、好ましくは1以上、より好ましくは2以上であり、ATP誘導体の水溶性を確保して操作の容易性を確保する観点から、好ましくは12以下、より好ましくは8以下、さらに好ましくは6以下である。炭素数1〜12のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシメチレン基、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基などが挙げられるが、特に限定されない。
本実施形態に係るATP誘導体は、例えば、式(II):
DNP−R2 (II)
(式中、R2は、アミノ酸残基を示し、DNPは前記と同じ。)
で表わされるDNP基含有化合物と、式(III):
で表わされるATP化合物と、R2に連結可能な第1の反応基およびX2に連結可能な第2の反応基を有する二官能性リンカーとを反応させることなどによって製造することができる。なお、本実施形態において、式(II)で表わされるDNP基含有化合物と、式(III)で表わされるATP化合物と、前記二官能性リンカーとの反応の順番は、特に限定されない。式(II)で表わされるDNP基含有化合物と、式(III)で表わされるATP化合物と、二官能性リンカーとの反応は、例えば、
(1)式(II)で表わされるDNP基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させた後、得られた製造中間体と式(III)で表わされるATP化合物とを反応させること、
(2)式(III)で表わされるATP化合物と前記二官能性リンカーとを反応させた後、得られた製造中間体と式(II)で表わされるDNP基含有化合物とを反応させること
などによって行なうことができる。
DNP−R1−L2 (IV)
(式中、DNPおよびR1は前記と同じ。L2は二官能性リンカーに由来するリンカー部分である)
で表わされる製造中間体を得る(工程1−1)。工程1−1における反応は、例えば、N,N−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中で行なうことができる。工程1−1における反応に際して、反応温度は、前記DNP基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させるに十分な時間であればよい。前記反応温度は、特に限定されないが、通常、15〜40℃、好ましくは25〜35℃である。また、工程1−1における反応に際して、反応時間は、前記DNP基含有化合物と前記二官能性リンカーとを反応させるに十分な時間であればよい。前記反応時間は、通常、0.5〜3時間、好ましくは0.5〜2時間である。前記反応によって得られた反応生成物には、ATP誘導体の製造中間体が含まれている。前記反応生成物は、逆相高速液体クロマトグラフィーなどで適宜精製し、必要に応じて、さらに濃縮することができる。工程1−1において、式(II)で表わされるDNP基含有化合物1モルあたりの前記二官能性リンカーの量は、前記製造中間体の収率を向上させる観点から、好ましくは0.5モル以上、より好ましくは0.6モル以上であり、次工程での副反応を抑制する観点から、好ましくは2モル以下、より好ましくは1モル以下、さらに好ましくは0.8モル以下である。
本実施形態に係るキナーゼ活性の測定方法は、
(A)キナーゼを含む被検試料と、当該キナーゼの基質と、前述のATP誘導体とを反応させ、前記基質にDNP基が導入されたDNP基含有基質を含む混合物を得る工程、
(B)前記工程(A)で得られた混合物と、前記DNP基に結合する抗体とを混合し、前記DNP基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
(C)前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ATP誘導体は、ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合した化合物であることを特徴としている(以下、「本実施形態の測定法」という)。
Xaa1−Pro−Xaa2−Xaa3 (a1)
(Xaa1はセリン残基またはスレオニン残基、Xaa2は任意のアミノ酸残基、Xaa3はリジン残基またはアルギニン残基を示す。)
で表わされるアミノ酸配列(配列番号:1)を有する基質ペプチドを用いることができる。式(a1)で表わされるアミノ酸配列を有する基質ペプチドとしては、化学的または遺伝子工学的に生成したペプチドであってもよいし、天然に存在するペプチドであってもよい。
本実施形態に係る試薬キットは、前述のキナーゼ活性の測定法に用いるための試薬キットであって、キナーゼの基質と、前述したATP誘導体と、前記ATP誘導体中のDNP基に結合する抗体とを含有するものである。本実施形態に係る試薬キットにおけるキナーゼの基質および抗体は、前述のキナーゼ活性の測定法に用いられるキナーゼの基質および抗体と同様である。なお、前記キナーゼの基質は、固相担体に固定されたものであってもよい。
(1)ATPγDNPの合成
EMCS96mgをDMF3.2mLに溶解させ、1.5当量のDNP−Lysを含む50v/v%DMF溶液と混合し、混合物6mLを得た。得られた混合物6mLを0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.0)で2.5倍に希釈した。得られた希釈物を30℃で1時間静置することにより、EMCSとDNP−Lysとを反応させた。その結果、式(x1)で表わされる製造中間体(化合物1)を含む溶液15mLを得た。
<精製条件>
・検出波長:260nmおよび360nm
・使用カラム:C18逆相カラム
〔テレダインイスコ(Teledyne Isco)社製、
商品名:Redisep Rf C18〕
・カラム温度:室温
・移動相
移動相A: 50mMテトラエチルアンモニウムブロミド含有水溶液
移動相B: 50mMテトラエチルアンモニウムブロミド含有アセトニトリル溶液
移動相AおよびBを用いる濃度勾配
(アセトニトリル濃度:0体積%から40v/v%までの濃度勾配)
・ 流量: 5mL/min
得られた反応生成物を50mMテトラエチルアンモニウムブロミド水溶液で100倍に希釈し、測定試料を得た。得られた測定試料および参照溶液(50mMテトラエチルアンモニウムブロミド水溶液)と、分光光度計〔(株)島津製作所社製、商品名:UV−1800PC〕とを用い、波長220〜420nmの吸光スペクトルを測定した。また、前記反応生成物の代わりに原料であるATPγSまたはDNP−Lysを用いたことを除き、前記と同様の操作を行なうことによりに、吸光スペクトルを測定した。ATPγSの吸光スペクトルを図2(A)、DNP−Lysの吸光スペクトルを図2(B)、反応生成物の吸光スペクトルを図2(C)に示す。
96ウェルフィルタープレート(親水性PVDFメンブレン、ミリポア社製)のウェルに免疫沈降用緩衝液〔0.1質量%ノニデットNP−40と50mMトリス塩酸(pH7.4)とを含む緩衝液〕70μLを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗CDK1抗体(オペロン社製)16μgまたは抗CDK2抗体(オペロン社製)8μgを含む抗体溶液20μLと、プロテインAをコートした20体積%セファロースビーズ(GEヘルスケア社製)30μLとを添加した。
前記(2)で得られた各濾液50μLに0.5v/v%ストレプトアビジン標識磁性ビーズ含有HEPES緩衝液30μLを添加した。得られた各混合物を37℃で10分間振盪しながらインキュベーションすることにより、ビオチン標識CDK基質ペプチドを磁性ビーズ上に捕捉した。その後、各濾液から、ビオチン標識CDK基質ペプチドが捕捉された磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。以下において、混合物Aの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズA」、混合物Bの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズB」、混合物Cの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズC」、混合物Dの反応液から得られた磁性ビーズを「磁性ビーズD」という。
前記(2)および(3)において、抗CDK1抗体または抗CDK2抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンG(IgG)(カルビオケム社製)を用いたことを除き、前記(2)および(3)と同様の操作を行ない、各反応液の発光強度を測定した。ウサギIgGを用いたときの発光強度を「発光強度B」とする。
発光強度A1、発光強度A2および発光強度Bを用い、式(A)または(B):
CDK1活性に基づく特異的発光強度C1=発光強度A1−発光強度B (A)
CDK2活性に基づく特異的発光強度C2=発光強度A2−発光強度B (B)
にしたがって、CDK1活性に基づく特異的発光強度C1およびCDK2活性に基づく特異的発光強度C2を求めた。
(1)ATPγDNPの合成
実施例1と同様の手法により、式(x2)で表わされる化合物2を得た。
96ウェルフィルタープレート(親水性PVDFメンブレン、ミリポア社製)のウェルに免疫沈降用緩衝液〔0.1質量%ノニデットNP−40と50mMトリス塩酸(pH7.4)とを含む緩衝液〕70μLを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗CDK1抗体(オペロン社製)16μgを含む抗体溶液20μLと、プロテインAをコートした20体積%セファロースビーズ(GEヘルスケア社製)30μLとを添加した。
前記(2)で得られた濾液10μLに0.5v/v%ストレプトアビジン標識磁性ビーズ含有HEPES緩衝液30μLを添加した。得られた混合物を振盪させながら37℃で10分間インキュベーションすることにより、ビオチン標識CDK2基質ペプチドを磁性ビーズ上に捕捉した。その後、濾液から、ビオチン標識CDK2基質ペプチドが捕捉された磁性ビーズを磁石によって集めるとともに、上澄みを除去した。
前記(2)および(3)において、抗CDK1抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンG(IgG)(カルビオケム社製)を用いたことを除き、前記(2)および(3)と同様の操作を行ない、反応液の発光強度Bを測定した。
(1)キナーゼ反応(リン酸基転移反応)
96ウェルフィルタープレート(親水性PVDFメンブレン、ミリポア社製)のウェルに免疫沈降用緩衝液〔0.1質量%ノニデットNP−40と50mMトリス塩酸(pH7.4)とを含む緩衝液〕70μLを入れた。その後、ウェル中の免疫沈降用緩衝液に抗CDK1抗体(オペロン社製)16μgを含む抗体溶液20μLと、プロテインAをコートした20体積%セファロースビーズ(GEヘルスケア社製)30μLとを添加した。
前記(1)で得られた濾液10μLに、蛍光標識試薬〔組成:0.4mMの5−ヨードアセトアミドフルオレセイン(5−IAF)〔ライフテクノロジーズ(Life Technologies)社製〕、285mM MOPS−NaOH(pH7.4)、4.8mM EDTAおよび4.9v/v%DMSO〕を添加した。得られた混合物を振盪させながら、遮光下に37℃で10分間インキュベーションし、ビオチン標識CDK2基質ペプチドに導入されたモノチオリン酸基と5−IAFとを反応させた。これにより、ビオチン標識CDK2基質ペプチドに導入されたモノチオリン酸基をフルオレセインで標識した。得られた反応液に、反応停止液〔組成:60mM N−アセチル−L−システインおよび2M MOPS−NaOH(pH7.4)〕添加し、反応を停止させた。
前記(1)および(2)において、抗CDK1抗体の代わりに、対照としてウサギ免疫グロブリンG(IgG)(カルビオケム社製)を用いたことを除き、前記(1)および(2)と同様の操作を行ない、反応液の発光強度Bを測定した。
実施例2で得られた発光強度A1およびBを用い、S/N比〔発光強度A1/発光強度B〕を求めた。同様に、比較例1で得られた発光強度A1およびBを用い、S/N比〔発光強度A1/発光強度B〕を求めた。実施例2および比較例1それぞれの測定法を評価した結果を図5に示す。図中、線グラフ(a)は実施例2および比較例1それぞれの測定法のS/N比を示す。レーン1は比較例1の測定法の評価結果、レーン2は実施例2の測定法の評価結果を示す。白抜きのバーはCDK1活性に基づく発光強度A1、黒色のバーはバックグラウンドの発光強度Bを示す。
SM(PEG)2 100mgをDMF1mLに溶解させて、得られた溶液0.11mLを取り、1.5当量のDNP−Lysを含む50v/v%DMF溶液と混合し、混合物0.49mLを得た。得られた混合物0.49mLを0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.0)で3.9倍に希釈した。得られた希釈物を30℃で1時間静置することにより、SM(PEG)2とDNP−Lysとを反応させた。その結果、式(y1)で表わされる製造中間体(化合物3)を含む溶液1.88mLを得た。
<精製条件>
・検出波長:260nmおよび360nm
・使用カラム:C18逆相カラム
〔テレダインイスコ(Teledyne Isco)社製、
商品名:Redisep Rf C18〕
・カラム温度:室温
・移動相A: 50mMテトラエチルアンモニウムブロミド含有水溶液
・移動相B: 50mMテトラエチルアンモニウムブロミド含有アセトニトリル溶液
移動相AおよびBを用いるアセトニトリル濃度0体積%から40v/v%までの濃度勾配
・流量:5mL/min
配列番号:2は、ビオチン標識CDK2基質ペプチドの配列である。1位のXaaは、ヒスチジン残基がアミノヘキサン酸(アミノカプロン酸)を介してビオチンで標識されたビオチン標識ヒスチジン残基である。
Claims (11)
- (A)キナーゼを含む被検試料と、前記キナーゼの基質と、ジニトロフェニル(DNP)基を含むアデノシン三リン酸(ATP)誘導体とを反応させ、前記基質にDNP基が導入されたDNP基含有基質を含む混合物を得る工程、
(B)前記工程(A)で得られた混合物と、前記DNP基に結合する抗体とを混合し、前記DNP基含有基質と前記抗体とを含む複合体を形成させる工程、および
(C)前記複合体を検出することによって前記キナーゼの活性を測定する工程
を含み、
前記ATP誘導体は、ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してDNP基が結合した化合物である、
キナーゼ活性の測定方法。 - 前記工程(B)において、前記複合体が、固相担体上に形成される、請求項1記載の方法。
- 前記工程(B)において、前記複合体の形成が溶液中で行われ、
前記工程(B)および(C)の間に、前記複合体が形成された固相担体と、前記溶液とを分離する工程
をさらに含む、請求項2記載の方法。 - 前記固相担体が、磁性粒子である、請求項2または3に記載の方法。
- 前記キナーゼが、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記キナーゼが、CDK1またはCDK2である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記基質が、式(a1):
Xaa1−Pro−Xaa2−Xaa3 (a1)
(Xaa1はセリン残基またはスレオニン残基、Xaa2は任意のアミノ酸残基、Xaa3はリジン残基またはアルギニン残基を示す。)
で表わされるアミノ酸配列(配列番号:1)を有する基質ペプチドである、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記抗体が、標識物質を含む標識抗体であり、
前記工程(C)において、前記複合体中の標識物質を検出することによって前記活性を測定する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - アデノシン三リン酸(ATP)誘導体であって、
ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合している、ATP誘導体。 - 請求項1〜8いずれかに記載のキナーゼ活性の測定方法に用いるためのアデノシン三リン酸(ATP)誘導体であって、
ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してジニトロフェニル基が結合している、ATP誘導体。 - 請求項1〜8いずれかに記載のキナーゼ活性の測定方法に用いるための試薬キットであって、
キナーゼの基質と、
ジニトロフェニル(DNP)基を含むアデノシン三リン酸(ATP)誘導体と、
前記DNP基に結合する抗体と
を含有してなり、
前記DNP基を含むATP誘導体が、ATPのγ位のリン酸基にリンカーを介してDNP基が結合している化合物である、試薬キット。
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