CN104950110A - 激酶活性测定方法、atp衍生物及其用途及制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供激酶活性的测定方法，其包括：使激酶、底物和含DNP基的ATP衍生物反应而向上述底物导入DNP基的工序，混合含有DNP基的底物和抗DNP抗体的工序，及检测形成的复合物而测定激酶的活性的工序，其中上述ATP衍生物是二硝基苯基经接头与ATP的γ位的磷酸基结合的化合物。

Description

激酶活性测定方法、ATP衍生物及其用途及制造方法
【技术领域】
本发明涉及测定样品中的激酶的活性的方法、ATP衍生物、含ATP衍生物的试剂盒及制造ATP衍生物的方法。
【背景技术】
作为激酶活性的测定方法，例如，有人提议作为磷酸基供体代替使用腺苷三磷酸(以下也称为“ATP”)而使用腺苷5’-O-(3-硫代三磷酸)(以下也称为“ATPγS”)的细胞周期蛋白依赖性激酶的活性的测定方法(参照美国专利公开No.2002/0164673)。
US专利公开No.2002/0164673中记载的方法如下进行。首先，在细胞周期蛋白依赖性激酶/细胞周期蛋白复合物的存在下，使底物蛋白质和ATPγS反应，向所述底物蛋白质的丝氨酸残基或苏氨酸残基导入ATPγS来源的单硫代磷酸基。接下来，使标记荧光物质或标记酶结合于导入的单硫代磷酸基的硫原子，得到标记的底物蛋白质。其后，由所述标记的底物蛋白质的标记荧光物质来源的荧光量或标记酶的反应发生的生成物的量算出细胞周期蛋白依赖性激酶的活性值。
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
但是，期望可以更高灵敏度测定激酶活性的方法。
本发明的目的是，鉴于上述以往技术的实际情况，提供以更高灵敏度测定激酶活性的方法、ATP衍生物、含其的试剂盒、及ATP衍生物制造方法。
【解决课题的技术方案】
本发明提供激酶活性的测定方法。此方法包括以下的工序。
(A)使含激酶的被检样品、上述激酶的底物和含二硝基苯基(DNP)的腺苷三磷酸(ATP)衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物的工序，
(B)将上述工序(A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成的工序，及
(C)通过检测上述复合物来测定上述激酶的活性的工序。
在此方法中，ATP衍生物是DNP基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的化合物。
本发明提供腺苷三磷酸(ATP)衍生物，其为二硝基苯基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的ATP衍生物。
本发明提供制造二硝基苯基经接头结合于腺苷三磷酸(ATP)的γ位的磷酸基的ATP衍生物的方法。此方法包括以下的工序：
使式(II)：
DNP-R2   (II)
(式中，R2表示氨基酸残基，DNP表示二硝基苯基。)所表示的化合物、
具有可与R2连结的第1反应基及可与X2连结的第2反应基的二官能性接头、和
式(III)：
(式中，X2表示反应基(但是，除含DNP的官能团之外))所表示的化合物反应的工序。
【发明效果】
由本发明可以更高灵敏度测定激酶活性。
【附图说明】
【图1】是显示本实施方式中涉及的激酶活性的测定方法的原理的概略说明图。
【图2】(A)显示实施例1中使用的ATPγS的吸光光谱、(B)显示实施例1中使用的DNP-Lys的吸光光谱、(C)显示实施例1中得到的反应生成物的吸光光谱。
【图3】是显示实施例1的结果的图。
【图4】是显示实施例1的结果的图。
【图5】是显示评价实施例2及比较例1各自的测定方法的结果的图。
【实施方式】
接下来参照附图描述本发明的优选的实施方式。
【ATP衍生物】
本实施方式中涉及的ATP衍生物以DNP基经接头与ATP的γ位的磷酸基结合作为特征。本实施方式中涉及的ATP衍生物由ATP部分和DNP基部分构成。
再有，在本说明书中，“激酶”是指，从ATP等的有高能磷酸键的化合物将磷酸基转移到底物而将底物磷酸化的酶。在涉及的激酶中，包含将作为底物的低分子量的化合物磷酸化的低分子量底物型的激酶、将作为底物的有特定的氨基酸序列的蛋白质磷酸化的蛋白激酶等。作为上述低分子量底物型的激酶，可举出肌酸激酶、丙酮酸激酶等，但不特别限定。另外，上述蛋白激酶被大分为丝氨酸/苏氨酸激酶和，酪氨酸激酶。作为上述丝氨酸/苏氨酸激酶，例如，可举出细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、CDK2、CDK4、CDK6等的CDK；Akt1、IKK、PDK1、PK、PKA、PKC、PKN、Rsk1、Rsk2、SGK、KSR、LKB1、MAPK1、MAPK2、PAK3、PKR、PLK1、PRAK、PRK2、Raf、Tak1等，但不特别限定。作为上述酪氨酸激酶，例如，可举出Eck、EGF-R、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、FGF-R、Flt-1、PDGF-R、TrkA、TrkB、TrkC、Tie-2等的受体型酪氨酸激酶；Abl、FAK、Pyk2、Yes、Csk、Fyn、Lck、Tec、Blk、JAK1、JAK2、JAK3、Src、Eck、Hck、Lyn、Tyk2、BTK、Fgr、Syk等的非受体型酪氨酸激酶等，但不特别限定。在这些激酶中，优选为CDK，更优选为CDK1及CDK2。
作为本实施方式中涉及的ATP衍生物，例如，可举出式(I)：
【化1】
(式中，X1表示直接键、氧原子或硫原子、L1表示接头部分、R1表示可与上述L1及上述DNP的双方连结的反应基、DNP表示二硝基苯基)所表示的化合物等，但不特别限定。再有，在本实施方式中，从确保ATP衍生物的制造的容易性的观点来看，R1及X1优选是互相不同的官能团。
在式(I)中，X1是直接键、氧原子或硫原子。在这些X1中，从确保ATP衍生物的制造的容易性的观点来看，优选是硫原子。
在式(I)中，L1是接头部分。上述接头部分是通过使具有可与R1连结的第1反应基和可与X1连结的第2反应基的二官能性接头与R1及X1连结而生成的部分。即，在L1的R1侧末端的官能团是上述第1反应基来源的官能团(以下称为“R1结合基”)。另外，L1的X1侧末端的官能团是上述第2反应基来源的官能团(以下称为“X1结合基”)。
R1结合基可根据R1的种类适宜选择。R1是氨基酸残基时，作为上述R1结合基，例如，可举出羰基、氨基、巯基等，但不特别限定。上述R2结合基可根据X2的种类适宜选择。X1是硫原子时，作为上述X1结合基，例如，可举出马来酰亚胺基、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、二硫基等，但不特别限定。上述接头部分，根据需要，也可在R1结合基和X1结合基之间有间隔物。作为上述间隔物，可举出任选有取代基的碳原子数1～12的亚烷基、任选有取代基的碳原子数2～12的亚烯基、任选有取代基的碳原子数2～12的亚炔基、(聚)氧基亚烷基等，但不特别限定。亚烷基的碳原子数，从抑制ATP衍生物的ATP部分和DNP部分之间的立体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磷酸化反应的观点来看，优选为1以上、更优选为2以上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操作的容易性的观点来看，优选为12以下，更优选为8以下，再优选为6以下。作为碳原子数1～12的亚烷基，例如，可举出亚甲基、亚乙基、n-亚丙基、异亚丙基、n-亚丁基、异亚丁基、仲-亚丁基、叔-亚丁基、n-亚戊基、异亚戊基、NEO亚戊基、亚己基等，但不特别限定。亚烯基及亚炔基各自的碳原子数，从抑制ATP衍生物的ATP部分和DNP部分之间的立体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磷酸化反应的观点来看，优选为2以上、更优选为3以上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操作的容易性的观点来看，优选为12以下，更优选为8以下，再优选为6以下。作为碳原子数2～12的亚烯基，可举出亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚戊烯基等，但不特别限定。作为碳原子数2～12的亚炔基，例如，可举出亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚己炔基等，但不特别限定。作为上述取代基，例如，可举出羟基、氨基等，但不特别限定。作为(聚)氧基亚烷基，例如，可举出氧基亚烷基的碳原子数是1～12、氧基亚烷基的附加摩尔数是1～8的(聚)氧基亚烷基等，但不特别限定。氧基亚烷基的碳原子数，从抑制ATP衍生物的ATP部分和DNP部分之间的立体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磷酸化反应的观点来看，优选为1以上、更优选为2以上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操作的容易性的观点来看，优选为12以下，更优选为8以下，再优选为6以下。作为碳原子数1～12的氧基亚烷基，例如，可举出甲醛基、氧乙烯基、氧丙烯基、氧基亚丁基等，但不特别限定。
在式(I)中，R1是可与L1及DNP的双方连结的反应基。作为上述可与L1及DNP的双方连结的反应基，例如，可举出氨基酸残基、烷基的碳原子数是1～4的氨基烷基羧酸等，但不特别限定。作为上述氨基酸残基，例如，可举出丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基等，但不特别限定。再有，R1中的氨基酸残基是指氨基酸来源的2价基。在R1中，从确保反应基的反应性及制造的容易性的观点来看，优选为赖氨酸残基。
【ATP衍生物的制法】
本实施方式中涉及的ATP衍生物，例如，可通过使式(II)：
DNP-R2(II)
(式中，R2表示氨基酸残基，DNP与上述相同)所表示的含有DNP基的化合物和式(III)：
(式中，X2表示反应基(但是除含DNP的官能团之外))所表示的ATP化合物和具有可与R2连结的第1反应基及可与X2连结的第2反应基的二官能性接头反应等而制造。再有，在本实施方式中，式(II)所表示的含有DNP基的化合物、式(III)所表示的ATP化合物和上述二官能性接头的反应的顺序不特别限定。式(II)所表示的含有DNP基的化合物、式(III)所表示的ATP化合物和二官能性接头的反应可通过例如，(1)使式(II)所表示的含有DNP基的化合物和上述二官能性接头反应之后，使得到的制造中间体和式(III)所表示的ATP化合物反应，(2)使式(III)所表示的ATP化合物和上述二官能性接头反应之后，使得到的制造中间体和式(II)所表示的含有DNP基的化合物反应等来进行。
以下，作为例举上述(1)的制法进行说明，但不限于此。首先，使式(II)所表示的含有DNP基的化合物和上述二官能性接头反应，得到式(IV)：
DNP-R1-L2   (IV)
(式中，DNP及R1与上述相同。L2是二官能性接头来源的接头部分)所表示的制造中间体(工序1-1)。在工序1-1的反应，例如，可在N,N-二甲基甲酰胺等的有机溶剂中进行。在工序1-1的反应时，反应温度只要是对于使含有上述DNP基的化合物和上述二官能性接头反应而言充分的时间即可。上述反应温度不特别限定，但通常是15～40℃、优选为25～35℃。另外，在工序1-1的反应时，反应时间只要是对于使含有上述DNP基的化合物和上述二官能性接头反应而言充分的时间即可。上述反应时间通常是0.5～3小时、优选为0.5～2小时。在由上述反应得到的反应生成物中，含ATP衍生物的制造中间体。上述反应生成物用逆相高效液相层析等适宜纯化，可根据需要再浓缩。在工序1-1中，每1摩尔式(II)所表示的含有DNP基的化合物的上述二官能性接头的量，从使上述制造中间体的收率升高的观点来看，优选为0.5摩尔以上、更优选为0.6摩尔以上，从抑制在后续工序的副反应的观点来看，优选为2摩尔以下，更优选为1摩尔以下，再优选为0.8摩尔以下。
在式(II)中，R2是氨基酸残基。作为上述氨基酸残基，例如，可举出丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、缬氨酸残基等，但不特别限定。再有，R2中的氨基酸残基是指氨基酸来源的1价基。在R2中，从确保反应基的反应性及制造的容易性的观点来看，优选为赖氨酸残基。
上述二官能性接头由具有可与R2连结的第1反应基和可与X2连结的第2反应基的二官能性接头组成。上述第1反应基可根据R2的种类适宜选择。R2是氨基酸残基，经所述氨基酸残基的氨基使式(II)所表示的含有DNP基的化合物与二官能性接头连结时，作为上述第1反应基，例如，可举出羰基、异硫代氰基、氯砜基、氯羰基、羧基、琥珀酰亚胺基等，但不特别限定。上述第2反应基可根据X2的种类适宜选择。例如，X2是硫原子时，作为上述第2反应基，例如，可举出马来酰亚胺基、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、二硫基等，但不特别限定。上述接头部分，根据需要，也可在第1反应基和第2反应基之间有间隔物。作为上述间隔物，与前述同样。作为上述二官能性接头，例如，可举出N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(6-马来酰亚胺已酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(8-马来酰亚胺辛酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(11-马来酰亚胺十一酰氧基)琥珀酰亚胺等的烷酰基的碳原子数是1～12的(马来酰亚胺烷酰氧基)琥珀酰亚胺等，但不特别限定。
在式(IV)中，L2是上述二官能性接头来源的接头部分。涉及的L2有可与X1连结的游离的第2反应基。
接下来，使工序1-1中得到的制造中间体和式(III)所表示的ATP化合物反应，得到本实施方式中涉及的ATP衍生物(工序1-2)。工序1-2中的反应，例如，可在磷酸钠缓冲液等的中性水系统溶剂中进行。在工序1-2中的反应时，反应温度只要是与使式(IV)所表示的制造中间体和式(III)所表示的ATP化合物反应相应的温度即可。上述反应温度不特别限定，但通常、15～40℃、优选为25～35℃。另外，在工序1-2中的反应时，反应时间只要是对于使式(IV)所表示的制造中间体和式(III)所表示的ATP化合物反应充分的时间即可。上述反应时间通常是0.5～3小时、优选为0.5～2小时。上述反应，例如，可通过向反应系统添加巯基乙基胺等的反应停止剂来使停止。将得到的含制造中间体的反应生成物用逆相高效液相层析等适宜纯化，根据需要，可再浓缩。在工序1-2中，式(IV)所表示的制造中间体每1摩尔的式(III)所表示的ATP化合物的量，从使收率升高从的观点来看，优选为0.5摩尔以上、更优选为0.6摩尔以上、再优选为0.8摩尔以上，从制造成本的降低及接下来工序的纯化的容易性的观点来看，优选为2摩尔以下，更优选为1.2摩尔以下，再优选为1.0摩尔以下。
在式(III)中，X2是反应基。但是，在式(III)中，除X2是含DNP的官能团的情况之外。作为上述反应基，例如，可举出巯基(-SH)等，但不特别限定。再有，从确保ATP衍生物的制造的容易性的观点来看，X2优选为与式(II)的R2不同的官能团。例如，R2是氨基酸残基时，X2优选为所述氨基酸残基以外的官能团。在这些X2中，从确保ATP衍生物的制造的容易性的观点来看，优选为巯基。
得到的ATP衍生物，例如，可溶解于对于使用用途适宜的溶剂而保存。
使式(III)所表示的ATP化合物和上述二官能性接头反应之后，也可通过使式(II)所表示的含有DNP基的化合物反应而合成ATP衍生物。
本实施方式中涉及的ATP衍生物可作为利用激酶的磷酸化反应中的磷酸基供体使用。从而，可在后述的激酶活性的测定方法中适宜地使用。
【激酶活性的测定方法】
本实施方式中涉及的激酶活性的测定方法，其包括：
(A)使含激酶的被检样品和所述激酶的底物和前述的ATP衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物的工序、
(B)将上述工序(A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成的工序、及
(C)通过检测上述复合物来测定上述激酶的活性的工序，
其特征在于，上述ATP衍生物是二硝基苯基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的化合物(以下，称为“本实施方式的测定法”)。
本实施方式的测定法的原理示于图1。再有，在图1中，作为例举出作为激酶之一的CDK1进行说明。图中，“ATPγDNP”表示前述的ATP衍生物、“CDK”表示CDK1、“底物肽”表示有上述CDK1的磷酸化部位的基序序列的肽、“标记物质”表示酶、“底物”表示上述酶的底物、“信号”表示上述酶作用于上述底物而发生的信号。如图1(A)所示，作为CDK1的反应中的磷酸基供体，使用上述ATP衍生物(ATPγDNP)。然后，由CDK1的作用，从上述ATP衍生物(ATPγDNP)将含DNP基的磷酸基转移到底物肽的丝氨酸残基或苏氨酸残基。其后，如图1(B)所示，将含DNP基的底物肽固定于固相载体，分离未反应的ATPγDNP的同时，用抗DNP抗体捕获含DNP基的底物肽的DNP基，通过作为标记物质的酶作用于底物而检测发生的信号。
以下，详述本实施方式的测定法的顺序。在本实施方式的测定法中，首先，使含激酶的被检样品和所述激酶的底物和上述ATP衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物〔工序(A)〕。在本工序(A)中，成为使被检样品中的激酶和激酶的底物和ATP衍生物接触，这些的接触顺序不特别限定。
在本实施方式的测定法中，成为测定对象的激酶是前述的激酶。作为含激酶的被检样品，可使用从活体的细胞或体液等得到的活体来源样品。作为上述活体来源样品，例如，可例示胃、肝脏、乳房、乳腺、肺、胰腺、胰腺、子宫、皮肤食道、喉头、咽头、舌、甲状腺等的细胞、血液、尿、淋巴液等的体液。
再有，在激酶中，有如CDK一样，在细胞质中，与作为在细胞的核内存在的成分的细胞周期蛋白结合而被活化，成为表达酶活性的状态(活化状态)的酶。另外，根据激酶的种类，有在细胞膜的内侧或细胞的核的内部存在，不在细胞的表面呈递的情况。这样，激酶是与细胞内的成分结合而在活化的酶或细胞膜的内侧或细胞的核的内部存在的激酶时，含激酶的被检样品优选通过破坏细胞的细胞膜或核膜，使测定对象的激酶游离而得到的增溶样品。
增溶样品通过对于活体的细胞实施增溶处理而得到。上述增溶处理可通过对活体样品在增溶处理用的缓冲液(以下也称为“增溶剂”)中对细胞实施超声波处理、用移液器吸吐的吸引搅拌等来进行。
增溶剂是含有破坏细胞膜或核膜的物质的缓冲液。上述增溶剂也可再含有抑制激酶的变性或分解的物质、由激酶抑制磷酸化的底物的分解的物质等。
作为破坏细胞膜或核膜的物质，例如，可举出表面活性剂、离液剂等，但不特别限定。上述表面活性剂可在不抑制测定对象的激酶的活性的范围内使用。作为上述表面活性剂，可举出例如，Nonidet P-40(NP-40)、TritonX-100〔Dow Chemical Company的注册商标〕等的聚氧乙烯烷基苯基醚；脱氧胆酸、CHAPS等。上述破坏细胞膜或核膜的物质可单独使用，也可混合2种以上使用。增溶剂中的上述破坏细胞膜或核膜的物质的浓度通常是0.1～2w/v％。
作为抑制激酶的变性或分解的物质，例如，可举出蛋白酶抑制剂等，但不特别限定。作为上述蛋白酶抑制剂，例如，可举出EDTA、EGTA等的金属蛋白酶抑制剂；PMSF、胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂；碘乙酰胺、E-64等的半胱氨酸蛋白酶抑制剂等，但不特别限定。这些抑制激酶的变性或分解的物质可单独使用，也可混合2种以上使用。增溶剂中的上述抑制激酶的变性或分解的物质的浓度，通常在EDTA、EGTA及PMSF的情况中，是0.5～10mM。
作为上述由激酶抑制磷酸化的底物的分解的物质，可举出脱磷酸化酶抑制剂等，但不特别限定。作为上述脱磷酸化酶抑制剂，可举出氟化钠等的丝氨酸/苏氨酸脱磷酸化酶抑制剂；正钒酸钠等的酪氨酸脱磷酸化酶抑制剂等，但不特别限定。上述由激酶抑制磷酸化的底物的分解的物质可单独使用，也可混合2种以上使用。增溶剂中的上述由激酶抑制磷酸化的底物的分解的物质的浓度，通常、氟化钠是25～250mM、正钒酸钠是0.1～1mM。
利用激酶的底物的磷酸化反应在对于使激酶的活性表达适宜的反应用溶液中进行。上述反应用溶液具有对于使激酶的活性表达适宜的pH的缓冲液、激酶的底物、上述ATP衍生物、根据需要，含有对于激酶的活性的表达必要的金属阳离子、例如，镁离子、锰离子等。作为上述缓冲液，例如，可举出Tris盐酸缓冲液、HEPES缓冲液等。上述缓冲液的pH可根据激酶的种类等适宜决定。例如，激酶是CDK时，pH通常是6～8、优选为6.5～7.5。
上述激酶的底物可根据激酶的种类适宜选择。激酶是低分子量底物型的激酶时，作为底物，可使用所述激酶的低分子量底物、例如，肌酸、丙酮酸等，但不特别限定。另外，激酶是蛋白激酶时，作为底物，可使用根据所述蛋白激酶的种类的底物蛋白质、有所述蛋白激酶的磷酸化部位的基序序列的底物肽，但不特别限定。另外，上述激酶的底物的量可根据激酶的种类、激酶的量等适宜设定。上述底物在使后述的工序(B)在固相载体上进行时等，也可根据需要，含如生物素、链霉亲和素等一样，以高的亲和性发生特异性的结合的物质。
在本实施方式的测定法中，上述激酶优选为CDK。此时，作为激酶可使用CDK的底物。上述CDK是正的细胞周期调节因子之一。上述CDK通常在细胞内作为无活性型单体存在于细胞质中，所述CDK自身由磷酸化等被活化，从细胞质移动到核内。另外，在核内，上述CDK与核内存在的细胞周期蛋白结合而形成CDK和细胞周期蛋白的复合物，必要时再受脱磷酸化等而形成活性型CDK。上述活性型CDK，在细胞周期的各种各样的阶段中，将细胞周期的进行调节到正。上述CDK及细胞周期蛋白的表达表征被认为与特定的癌关联。从而，通过由本实施方式的测定法测定上述CDK的活性，期待得到关于特定的癌的信息。作为上述CDK，例如，可举出CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8等，但不特别限定。在激酶是CDK1或CDK2时，作为激酶的底物，可使用组蛋白H1、有式(a1)：
Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3  (a1)
(Xaa1表示丝氨酸残基或苏氨酸残基、Xaa2表示任意的氨基酸残基、Xaa3表示赖氨酸残基或精氨酸残基。)所表示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的底物肽。作为有式(a1)所表示的氨基酸序列的底物肽，可为化学或基因工程学地生成的肽，也可为天然存在的肽。
上述ATP衍生物的量可根据激酶的种类、激酶的量等，适宜设定。
在利用激酶所致的底物的磷酸化反应时，反应温度可根据激酶的种类等适宜设定。上述反应温度通常是30～37℃。另外，反应时间可根据激酶的种类、激酶的量等适宜设定。上述反应时间通常是10～60分钟。
工序(A)中得到的含有DNP基的底物是上述ATP衍生物中的含有DNP基的单磷酸导入底物的磷酸化部位的化合物。从而，通过测定上述含有DNP基的底物的量可测定激酶的活性。
在本实施方式中涉及的测定法中，接下来，将工序(A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成〔工序(B)〕。
上述与DNP基结合的抗体，从使上述复合物的检测容易的观点来看，优选含标记物质的被标记抗体。上述与DNP基结合的抗体，例如，可由Current Protocols in Immunology中记载的方法〔John E.Coligan编、John Wiely&Sons公司、1992年发行〕等中记载的惯用的方法，通过使用含DNP基的化合物免疫动物容易地制作。另外，由标记物质的抗体的标记可在根据标记物质的种类的方法中容易地进行。再有，在本实施方式中，也可代替上述抗体而纯化所述抗体后，通过由肽酶等处理来使用得到的抗体片段。
上述标记物质可为酶，也可为荧光物质。
作为上述荧光物质，例如，可举出碘乙酰-异硫氰酸荧光素、5-(溴甲基)荧光素、荧光素-5-马来酰亚胺、5-碘乙酰胺荧光素、6-碘乙酰胺荧光素等的荧光素衍生物；4-溴甲基-7-甲氧基香豆素等的香豆素衍生物；伊红-5-马来酰亚胺、伊红-5-碘乙酰胺等的伊红衍生物；N-(1,10-菲咯啉-5-基)溴乙酰胺等的菲咯啉衍生物；1-芘丁酰氯、N-(1-芘乙基)碘乙酰胺、N-(1-芘甲基)碘乙酰胺、1-芘甲基碘乙酸盐等的芘衍生物；若丹明红C2马来酰亚胺等的若丹明衍生物等，但不特别限定。作为上述酶，可举出β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶等，但不特别限定。
含上述含有DNP基的底物和上述抗体的复合物优选在固相载体上形成。这是因为，在后的工序中，可以简便的操作进行所述复合物的回收，可有效进行所述复合物的检测。作为上述固相载体，例如，可举出磁性珠、微平板等，但不特别限定。作为固相载体使用磁性珠时，作为所述磁性珠，例如，可使用链霉亲和素固定磁性珠、生物素固定磁性珠等。使用链霉亲和素固定珠或生物素固定磁性珠时，作为上述含有DNP基的底物，使用含与固定于磁性珠的物质结合的物质的底物。例如，使用链霉亲和素固定珠时，作为上述含有DNP基的底物，通过使用含有生物素标记DNP基的底物，可使复合物在磁性珠上形成。另外，使用生物素固定珠时，作为上述含有DNP基的底物，通过使用含有链霉亲和素标记DNP基的底物，可使复合物在磁性珠上形成。
上述复合物的形成可在溶液中进行。上述溶液只要是对于使复合物形成适宜的溶液即可。上述溶液含有Tris盐酸缓冲液、HEPES缓冲液等的缓冲液；氯化钠等的盐；牛血清白蛋白(BSA)等的封闭剂等。上述溶液的pH只要是维持上述含有DNP基的底物及抗体的功能的范围即可。上述溶液的pH通常是6～8、优选为6.5～7.5。
上述复合物的形成在溶液中进行时，在上述工序(B)及后述的(C)之间，可进行分离上述复合物形成的固相载体和上述溶液的工序。由此，可抑制非特异性的夹杂物质等的混入，使复合物的检测精度升高。上述固相载体和上述溶液的分离，例如，作为固相载体使用磁性珠时，通过用磁石集合上述磁性珠，可分离上述形成了复合物的固相载体和上述溶液。另外，上述固相载体和上述溶液的分离也可由离心分离等进行。再者，从抑制非特异性的夹杂物质等的混入，使复合物的检测精度升高从的观点来看，也可根据需要，将上述形成了复合物的固相载体用固相载体清洗用的清洗液清洗。
接下来，通过检测上述工序(B)中得到的复合物测定上述激酶的活性〔工序(C)〕。
上述复合物的检测，在上述抗体是含标记物质的被标记抗体时，可通过检测上述复合物中的标记物质来测定上述活性。具体而言，上述标记物质是荧光物质时，通过照射根据所述荧光物质的激发光而使作为信号的荧光发生。通过测定此荧光的量(强度)，可测定结合抗体的含有DNP基的底物(反应生成物)的量。此时，使用由已知量的含有DNP基的底物和荧光的量(强度)制成的标准曲线，从荧光的量(强度)的测定值算出含有DNP基的底物的量。由此，算出的含有DNP基的底物的量可作为被检样品中含的激酶的活性值而得到。
另外，上述标记物质是酶时，通过使上述酶作用于由与所述酶的反应而发生发光的酶底物使发光发生。通过检测此发光的量(强度)，可测定抗体结合的反应生成物(含有DNP基的底物)的量。此时，使用由已知量的含有DNP基的底物和发光的量(强度)制成的标准曲线，从发光的量(强度)的测定值算出含有DNP基的底物的量。由此，算出的含有DNP基的底物的量可作为被检样品中含的激酶的活性值而得到。
【试剂盒】
本实施方式中涉及的试剂盒是用于在前述的激酶活性的测定法中使用的试剂盒，含有激酶的底物、前述的ATP衍生物和与上述ATP衍生物中的DNP基结合的抗体。本实施方式中涉及的试剂盒中的激酶的底物及抗体与前述的激酶活性的测定法中使用的激酶的底物及抗体同样。再有，上述激酶的底物也可固定于固相载体。
本实施方式中涉及的试剂盒也可为激酶的底物、上述ATP衍生物及抗体各自收容于不同的容器中的试剂盒，也可为激酶的底物、上述ATP衍生物及抗体收容于相同的容器中的试剂盒。另外，本实施方式的试剂盒也可根据激酶的种类，在磷酸化反应时再含有必要的物质、例如，含金属阳离子等的溶液等。另外，在上述抗体是有作为标记物质的酶的被标记抗体时，也可再含对所述酶的酶底物、所述酶的反应液等。
【实施例】
以下，由实施例等详细地说明本发明，但本发明不限于这些。再有，在以下中，“ATPγDNP”表示本实施方式中涉及的含二硝基苯基的ATP衍生物、“ATPγS”表示腺苷5’-(γ-硫代三磷酸)〔5’-O-(二羟基硫代亚膦酰氧基膦酰氧基膦酰)腺苷、Merck公司制〕、“EMCS”表示N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺〔同仁化学(株)制〕、“DNP-Lys”表示N-(2,4-二硝基苯基)-L-赖氨酸〔东京化成工业(株)制〕、“DMF”表示N,N-二甲基甲酰胺、“SM(PEG)2”表示琥珀酰亚胺基-([N-马来酰亚胺丙酰胺]-二乙二醇)酯〔Thermo Scientific公司制〕。
【实施例1】
【(1)ATPγDNP的合成】
使EMCS96mg溶解于DMF3.2mL，与含1.5当量的DNP-Lys的50v/v％DMF溶液混合，得到混合物6mL。将得到的混合物6mL用0.1M磷酸钠(pH7.0)稀释2.5倍。通过使得到的稀释物于30℃静置1小时，使EMCS和DNP-Lys反应。结果，得到含式(x1)所表示的制造中间体(化合物1)的溶液15mL。
【化2】
使与上述DNP-Lys的反应中使用的EMCS和等摩尔数的ATPγS溶解于超纯水0.7mL，添加到含上述制造中间体(化合物1)的溶液14.5mL。其后，通过使得到的混合物于30℃静置1小时，使上述制造中间体(化合物1)和ATPγS反应。向得到的溶液15.2mL添加所述溶液的体积的1/20的量的1M巯基乙基胺溶液，通过使得到的混合物于30℃静置5分钟而使反应停止。
对得到的含反应生成物的溶液进行逆相层析而进行纯化。纯化条件如下。对得到的级分进行离心浓缩，得到反应生成物。
<纯化条件>
·检测波长：260nm及360nm
·使用柱：C18逆相柱〔Teledyne Isco公司制、商品名：RedisepRfC18〕
·柱温度：室温－移动相
移动相A：含有50mM四乙基铵溴化物的水溶液
移动相B：含有50mM四乙基铵溴化物的乙腈溶液
使用移动相A及B的浓度梯度(乙腈浓度：0体积％～40v/v％的浓度梯度)
·流量：5mL/min
【(2)反应生成物的鉴定】
将得到的反应生成物用50mM四乙基铵溴化物水溶液稀释100倍，得到测定样品。使用得到的测定样品及参照溶液(50mM四乙基铵溴化物水溶液)和分光光度计〔(株)岛津制作所公司制、商品名：UV-1800PC〕，测定波长220～420nm处的吸光光谱。另外，除代替上述反应生成物而使用作为原料的ATPγS或DNP-Lys之外，通过进行与上述同样的操作，测定吸光光谱。ATPγS的吸光光谱示于图2(A)、DNP-Lys的吸光光谱示于图2(B)、反应生成物的吸光光谱示于图2(C)。
在上述(1)中，在制造中间体(化合物1)和ATPγS反应时，认为制造中间体(化合物1)的马来酰亚胺基和ATPγS的巯基形成交联。另外，从图2所示的结果知，反应生成物的吸光光谱在波长260nm附近的ATPγS有特征性的峰及在波长360nm附近的DNP-Lys有特征性的峰。从而提示，反应生成物是式(x2)：
【化3】
所表示的化合物2。再有，式(x2)所表示的化合物2是本实施方式中涉及的ATP衍生物之一(ATPγDNP)。
【(2)激酶反应(磷酸基转移反应)】
向96孔滤器板(亲水性PVDF膜、Millipore公司制)的孔放入免疫沉降用缓冲液〔含0.1质量％Nonidet NP-40和50mMTris盐酸(pH7.4)的缓冲液〕70μL。其后，向孔中的免疫沉降用缓冲液添加含抗CDK1抗体(操纵子公司制)16μg或抗CDK2抗体(操纵子公司制)8μg的抗体溶液20μL和包被蛋白A的20体积％琼脂糖珠(GEHEALTHCARE公司制)30μL。
接下来，将K562细胞在增溶剂〔组成：0.1w/v％表面活性剂NP-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、1×浓度的蛋白酶抑制剂〔Roche公司制、商品名：Complete〕、50mM氟化钠、1mM正钒酸钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕中，通过由微量移液器的吸吐搅拌增溶，得到细胞破碎物。将得到的细胞破碎物以18000×g离心分离5分钟而回收上清，得到10.2mg/mL的K562增溶样品。将上述K562增溶样品用上述增溶剂稀释40倍、160倍、640倍或2560倍(稀释物中的增溶样品的浓度依次是2.5％、4.14％、1.03％或0.04％)。将得到的各稀释物30μL添加到各孔。其后，通过将添加各稀释物后的96孔滤器板振荡着于4℃温育2小时来进行CDK1和抗CDK1抗体的反应或CDK2和抗CDK2抗体的反应。
反应结束后，将珠从反应液回收到每孔。在以下，为方便起见、将从自40倍的稀释物的反应液再回收的珠称为“琼脂糖珠A”、将从自160倍的稀释物的反应液再回收的珠称为“琼脂糖珠B”、将从自640倍的稀释物的反应液再回收的珠称为“琼脂糖珠C”、将从自2560倍的稀释物的反应液再回收的珠称为“琼脂糖珠D”。将琼脂糖珠A～D各自用珠清洗液A〔组成：1w/v％NP-40及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗2次。
接下来，将清洗后的琼脂糖珠A～D各自用珠清洗液B〔组成：300mM氯化钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。其后，将上述琼脂糖珠A～D各自用珠清洗液C〔组成：50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。
接下来，向清洗后的琼脂糖珠A～D各自添加CDK底物溶液〔组成：100ng/μL生物素标记CDK2底物肽〔Enzo公司制、商品名：CDK2底物(生物素化的)〕、式(x2)所表示的化合物2、54mMTris盐酸(pH7.4)及20mM氯化镁〕50μL，得到混合物A～D。化合物2的浓度是在362nm的吸光度成为2的浓度。此吸光度与实施例1(2)同样地测定。生物素标记CDK2底物肽的结构如下：生物素-Ahx-His-His-Ala-Ser-Pro-Arg-Lys(SEQ ID NO:2)。再有，“Biotin”表示生物素、“Ahx”表示氨基己酸(氨基己酸)。
通过将得到的混合物A～D各自振荡着于37℃温育20分钟来进行由激酶的磷酸基转移反应。通过进行涉及的反应，向生物素标记底物肽导入DNP基。磷酸化反应结束后，将各反应液以760×g离心分离5分钟，回收各滤液。
【(3)使用化学发光的激酶的活性的检测】
向上述(2)中得到的各滤液50μL添加含有0.5v/v％链霉亲和素标记磁性珠的HEPES缓冲液30μL。通过将得到的各混合物于37℃振荡着温育10分钟，在磁性珠上捕获生物素标记CDK底物肽。其后，从各滤液，由磁石集合生物素标记CDK底物肽捕获的磁性珠的同时，除去上清。在以下中，将从混合物A的反应液得到的磁性珠称为“磁性珠A”、将从混合物B的反应液得到的磁性珠称为“磁性珠B”、将从混合物C的反应液得到的磁性珠称为“磁性珠C”、将从混合物D的反应液得到的磁性珠称为“磁性珠D”。
将得到的磁性珠A～D各自用磁性珠清洗液〔组成：0.1w/v％吐温(Tween)20及20mMTris盐酸(pH7.4)及138mM氯化钠〕清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠A～D添加含碱性磷酸酶(ALP)标记抗DNP抗体的溶液(抗体量：作为ALP活性1单位)100μL。将得到的各混合物振荡着于37℃温育20分钟，使DNP和ALP标记抗DNP抗体反应。再有，作为上述ALP标记抗DNP抗体，使用使ORIENTAL酵母公司制的ALP经氨基结合于ORIENTAL酵母公司制的小鼠来源抗DNP抗体的被标记抗体。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠A～D的同时，除去上清。
将得到的磁性珠A～D用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠A～D添加含化学发光底物2-氯-5-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(Disodium2-chloro-5-(methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2’-(5’-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)phenylphosphate)〔Applied Biosystems公司制、商品名：CDP-star〕的底物溶液150μL。通过将得到的各混合物振荡着于37℃温育5分钟，进行由ALP的磷酸酯水解反应。
反应结束后，将得到的反应液移到黑色96孔板。其后，将放入反应液的黑色96孔板放到发光计〔BMGLABTECH公司制〕中，测定各反应液的发光强度。将使用抗CDK1抗体之时的发光强度称为“发光强度A1”、将使用抗CDK2抗体之时的发光强度称为“发光强度A2”。
【(4)背景的发光强度的测定】
在上述(2)及(3)中，除代替抗CDK1抗体或抗CDK2抗体而作为对照使用兔免疫球蛋白G(IgG)(Calbiochem公司制)之外，进行与上述(2)及(3)同样的操作，测定各反应液的发光强度。将使用兔IgG之时的发光强度称为“发光强度B”。
【(5)本实施方式中涉及的测定法的定量性的探讨】
使用发光强度A1、发光强度A2及发光强度B，根据式(A)或(B)：
式(A)：基于CDK1活性的特异性发光强度C1＝发光强度A1-发光强度B(A)
式(B)：基于CDK2活性的特异性发光强度C2＝发光强度A2-发光强度B
，求出基于CDK1活性的特异性发光强度C1及基于CDK2活性的特异性发光强度C2。
通过研究混合物A～D各自中的CDK1或CDK2的浓度(增溶样品浓度)和使用混合物A～D得到的各反应液的与特异性发光强度C1或特异性发光强度C2的关系，评价本实施方式中涉及的测定法的定量性。在实施例1中，研究增溶样品浓度(CDK1浓度)和基于CDK1活性的特异性发光强度的关系的结果示于图3。在实施例1中，研究增溶样品浓度(CDK2浓度)和基于CDK2活性的特异性发光强度的关系的结果示于图4。
从图3所示的结果知，伴随CDK1浓度的增加(增溶样品浓度的增加)而基于CDK1活性的特异性发光强度增加。另外，从图4所示的结果知，伴随CDK2浓度的增加(增溶样品浓度的增加)而基于CDK2活性的特异性发光强度增加。从这些的结果知，由本实施方式中涉及的测定法可定量测定CDK1、CDK2等的激酶的活性。
【实施例2】
【(1)ATPγDNP的合成】
由与实施例1同样的方法，得到式(x2)所表示的化合物2。
【(2)激酶反应(磷酸基转移反应)】
向96孔滤器板(亲水性PVDF膜、Millipore公司制)的孔放入免疫沉降用缓冲液〔含0.1质量％Nonidet NP-40和50mMTris盐酸(pH7.4)的缓冲液〕70μL。其后，向孔中的免疫沉降用缓冲液添加含抗CDK1抗体(Operon公司制)16μg的抗体溶液20μL和包被蛋白A的20体积％琼脂糖珠(GE HEALTHCARE公司制)30μL。
接下来，将K562细胞增溶剂〔组成：0.1w/v％表面活性剂NP-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、1×浓度的蛋白酶抑制剂〔Roche公司制、(商品名：Complete)〕、在50mM氟化钠、1mM正钒酸钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕中，通过由微量移液器的吸吐搅拌增溶，得到细胞破碎物。将得到的细胞破碎物以18000×g离心分离5分钟而回收上清，得到7.58mg/mL的K562增溶样品。将上述K562增溶样品用上述增溶剂稀释86倍。将得到的稀释物30μL添加到各孔。其后，通过使添加稀释物之后的96孔滤器板振荡着于4℃温育2小时来使CDK1和抗CDK1抗体反应。
反应结束后，从得到的反应液回收珠。将回收的珠用珠清洗液A〔组成：1w/v％NP-40及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗2次。接下来，将清洗后的珠用珠清洗液B〔组成：300mM氯化钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。再者，将清洗后的珠用珠清洗液C〔组成：50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。
接下来，向清洗后的珠添加CDK底物溶液〔组成：100ng/μL生物素标记CDK2底物肽(Enzo公司制)、式(x2)所表示的化合物2、54mMTris盐酸(pH7.4)及20mM氯化镁〕50μL，得到混合物。化合物2的浓度是在362nm处的吸光度成为2的浓度。此吸光度与实施例1(2)同样地测定。
通过使得到的混合物振荡着于37℃温育20分钟来进行由激酶的磷酸基转移反应。通过进行涉及的反应，向生物素标记底物肽导入DNP基。磷酸化反应结束后，将得到的反应液以760×g(2000rpm)离心分离5分钟，回收滤液。
【(3)使用化学发光的激酶的活性的测定】
向上述(2)中得到的滤液10μL添加0.5v/v％含有链霉亲和素标记磁性珠的HEPES缓冲液30μL。通过使得到的混合物振荡着于37℃温育10分钟，在磁性珠上捕获生物素标记CDK2底物肽。其后，从滤液，由磁石集合生物素标记CDK2底物肽捕获的磁性珠的同时，除去上清。
将得到的磁性珠用磁性珠清洗液〔组成：0.1w/v％吐温(Tween)20及20mMTris盐酸(pH7.4)及138mM氯化钠〕清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含抗DNP抗体(小鼠来源抗DNP抗体、ORIENTAL酵母公司制)的溶液(抗体量：0.1ng/μL)100μL。使得到的混合物振荡着于37℃温育20分钟，使DNP和抗DNP抗体反应。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠的同时，除去上清。
将得到的磁性珠用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含辣根过氧化物酶(以下也称为“HRP”)标记抗小鼠IgG抗体(MBL公司制)的溶液(抗体量：1000倍稀释)100μL。使得到的混合物振荡着于37℃温育60分钟，使抗DNP抗体的IgG和HRP标记抗小鼠IgG抗体反应。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠的同时，除去上清。
将得到的磁性珠用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含化学发光底物〔Pierce公司制、商品名：SuperSignalELISAFemto〕的底物溶液120μL。使得到的混合物振荡着于37℃温育5分钟。
温育结束后，将得到的反应液移到黑色96孔板。其后，将放入反应液的黑色96孔板放入发光计〔BMGLABTECH公司制〕中，测定反应液的发光强度A1。
【(4)背景的发光强度的测定】
在上述(2)及(3)中，除代替抗CDK1抗体而作为对照使用兔免疫球蛋白G(IgG)(Calbiochem公司制)之外，进行与上述(2)及(3)同样的操作，测定反应液的发光强度B。
【比较例1】
【(1)激酶反应(磷酸基转移反应)】
向96孔滤器板(亲水性PVDF膜、Millipore公司制)的孔放入免疫沉降用缓冲液〔含0.1质量％Nonidet NP-40和50mMTris盐酸(pH7.4)的缓冲液〕70μL。其后，向孔中的免疫沉降用缓冲液添加含抗CDK1抗体(操纵子公司制)16μg的抗体溶液20μL和包被蛋白A的20体积％琼脂糖珠(GE HEALTHCARE公司制)30μL。
接下来，将K562细胞在增溶剂〔组成：0.1w/v％表面活性剂NP-40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)、1×浓度的蛋白酶抑制剂〔Roche公司制、商品名：Complete〕、50mM氟化钠、1mM正钒酸钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕中，通过由微量移液器的吸吐搅拌增溶，得到细胞破碎物。将得到的细胞破碎物以18,000×g离心分离5分钟而回收上清，得到10.2mg/mL的K562增溶样品。将上述K562增溶样品用上述增溶剂稀释86倍。将得到的稀释物30μL添加到各孔。其后，通过使添加稀释物之后的96孔滤器板振荡着于4℃温育2小时而使CDK1和抗CDK1抗体反应。
反应结束后，从得到的反应液回收珠。将回收的珠用珠清洗液A〔组成：1w/v％NP-40及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗2次。接下来，将清洗后的珠用珠清洗液B〔组成：300mM氯化钠及50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。再将清洗后的珠用珠清洗液C〔组成：50mMTris盐酸(pH7.4)〕清洗1次。
接下来，向清洗后的珠添加CDK底物溶液〔组成：100ng/μL生物素标记CDK2底物肽(Enzo公司制)、作为磷酸基供体的2mMATPγS(Merck公司制)、54mMTris盐酸(pH7.4)及20mM氯化镁〕50μL，得到混合物。
通过使得到的混合物振荡着于37℃温育60分钟来进行由激酶的磷酸基转移反应。通过进行涉及的反应，向生物素标记底物肽导入单硫代磷酸基。磷酸化反应结束后，将得到的反应液以760×g(2000rpm)离心分离5分钟而回收滤液。
【(2)使用化学发光的激酶的活性的测定】
向上述(1)中得到的滤液10μL添加荧光标记试剂〔组成：0.4mM的5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF)〔Life Technologies公司制〕、285mMMOPS-NaOH(pH7.4)、4.8mMEDTA及4.9v/v％DMSO〕。使得到的混合物振荡着在遮光下于37℃温育10分钟，使导入生物素标记CDK2底物肽的单硫代磷酸基和5-IAF反应。由此，将向生物素标记CDK2底物肽导入的单硫代磷酸基用荧光素标记。向得到的反应液添加反应停止液〔组成：60mMN-乙酰-L-半胱氨酸及2MMOPS-NaOH(pH7.4)〕，使反应停止。
向得到的反应液10μL添加0.5v/v％含有链霉亲和素标记磁性珠的HEPES缓冲液30μL。通过使得到的混合物振荡着于37℃温育10分钟，在磁性珠上捕获生物素标记CDK2底物肽。其后，从滤液，由磁石集合生物素标记CDK2底物肽捕获的磁性珠的同时，除去上清。
将得到的磁性珠用磁性珠清洗液〔组成：0.1w/v％吐温(Tween)20及20mMTris盐酸(pH7.4)及138mM氯化钠〕清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含抗荧光素抗体〔Acris Antibodies公司制〕的溶液(抗体量：0.4ng/μL)100μL。使得到的混合物振荡着于37℃温育60分钟，使荧光素和抗荧光素抗体反应。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠的同时，除去上清。
将得到的磁性珠用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含化学发光底物〔Pierce公司制、商品名：SuperSignalELISAFemto〕的底物溶液120μL。使得到的混合物振荡着于37℃温育5分钟。
温育结束后，将得到的反应液移到黑色96孔板。其后，将放入反应液的黑色96孔板放入发光计〔BMGLABTECH公司制〕而测定反应液的发光强度A1。
【(3)背景的发光强度的测定】
在上述(1)及(2)中，除代替抗CDK1抗体而作为对照使用兔免疫球蛋白G(IgG)(Calbiochem公司制)之外，进行与上述(1)及(2)同样的操作，测定反应液的发光强度B。
【实施例2及比较例1各自的测定法的评价】
使用实施例2中得到的发光强度A1及B，求出S/N比〔发光强度A1/发光强度B〕。同样地，使用比较例1中得到的发光强度A1及B，求出S/N比〔发光强度A1/发光强度B〕。评价实施例2及比较例1各自的测定法的结果示于图5。图中，线图(a)表示实施例2及比较例1各自的测定法的S/N比。泳道1表示比较例1的测定法的评价结果，泳道2表示实施例2的测定法的评价结果。空白的条表示基于CDK1活性的发光强度A1、黑色的条表示背景的发光强度B。
从图5所示的结果知，与比较例1的测定法的S/N比相比，实施例2的测定法的S/N比显著地更高。从而，从这些的结果知，由本实施方式中涉及的测定法可以高灵敏度测定激酶活性。
【实施例3】
使100mg的SM(PEG)2溶解于DMF1mL，取得到的溶液0.11mL，与含1.5当量的DNP-Lys的50v/v％DMF溶液混合，得到混合物0.49mL。将得到的混合物0.49mL用0.1M磷酸钠(pH7.0)稀释3.9倍。通过使得到的稀释物于30℃静置1小时，使SM(PEG)2和DNP-Lys反应。结果，得到含式(y1)所表示的制造中间体(化合物3)的溶液1.88mL。
【化4】
使与上述DNP-Lys的反应中使用的SM(PEG)2和等摩尔数的ATPγS溶解于超纯水88μL，添加到含上述制造中间体(化合物3)的溶液1.81mL。其后，通过使得到的混合物于30℃静置1小时，使上述制造中间体(化合物3)和ATPγS反应。向得到的溶液1.9mL添加所述溶液的体积的1/20的量的1M巯基乙基胺溶液，通过使得到的混合物于30℃静置5分钟而使反应停止。
对得到的含反应生成物的溶液进行逆相层析而进行纯化。由逆相层析的纯化条件如下。
<纯化条件>
·检测波长：260nm及360nm
·使用柱：C18逆相柱〔Teledyne Isco公司制、商品名：RedisepRfC18〕
·柱温度：室温
·移动相A：含有50mM四乙基铵溴化物的水溶液
·移动相B：含有50mM四乙基铵溴化物的乙腈溶液
使用移动相A及B的乙腈浓度0体积％～40v/v％的浓度梯度
·流量：5mL/min
对得到的纯化物进行离心浓缩，得到式(y2)：
【化5】
所表示的化合物4。
另外，在实施例3中，除代替使用式(x2)所表示的化合物2而使用式(y2)所表示的化合物4之外，与实施例2同样地，测定激酶的活性。结果，使用式(y2)所表示的化合物4时的S/N比与实施例1及2的测定法的S/N比同样地，与比较例1的测定法的S/N比相比，显示更高的倾向。
SEQ ID NO:1是激酶的磷酸化部位的序列。1位的Xaa是Ser(丝氨酸残基)或Thr(苏氨酸残基)。3位的Xaa表示任意的氨基酸残基。4位的Xaa是Lys(赖氨酸残基)或Arg(精氨酸残基)。
SEQ ID NO:2是生物素标记CDK2底物肽的序列。1位的Xaa是组氨酸残基经氨基己酸(氨基己酸)用生物素标记的生物素标记组氨酸残基。

Claims (16)

1.激酶活性的测定方法，其包括：
(A)使含激酶的被检样品、上述激酶的底物和含二硝基苯基(DNP)的腺苷三磷酸(ATP)衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物的工序、
(B)将上述工序(A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成的工序、及
(C)通过检测上述复合物而测定上述激酶的活性的工序，
其中上述ATP衍生物是DNP基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的化合物。
2.权利要求1所述的方法，其中在上述工序(B)中，上述复合物在固相载体上形成。
3.权利要求2所述的方法，其中
在上述工序(B)中，上述复合物的形成在溶液中进行，
在上述工序(B)及(C)之间，还包括分离上述形成了复合物的固相载体和上述溶液的工序。
4.权利要求2所述的方法，其中上述固相载体是磁性粒子。
5.权利要求1所述的方法，其中上述激酶是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。
6.权利要求1所述的方法，其中上述激酶是CDK1或CDK2。
7.权利要求1所述的方法，其中所述底物是具有下式(a1)所表示的氨基酸序列SEQ ID NO:1的底物肽：
Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3   (a1)
其中，
Xaa1表示丝氨酸残基或苏氨酸残基、
Xaa2表示任意的氨基酸残基、
Xaa3表示赖氨酸残基或精氨酸残基。
8.权利要求1所述的方法，其中
上述抗体是含标记物质的被标记抗体，
在上述工序(C)中，通过检测上述复合物中的标记物质来测定上述活性。
9.权利要求1所述的方法，其中上述ATP衍生物由下式(I)所表示：
式中，
X1表示直接键、氧原子或硫原子、
L1表示接头部分、
R1表示可与上述L1及上述DNP的双方连结的反应基、
DNP表示二硝基苯基。
10.腺苷三磷酸(ATP)衍生物，其为二硝基苯基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的ATP衍生物。
11.权利要求10所述的ATP衍生物，其由下式(I)所表示：
式中，
X1表示直接键、氧原子或硫原子、
L1表示接头部分、
R1表示可与上述L1及上述DNP的双方连结的反应基、
DNP表示二硝基苯基。
12.用于在权利要求1～9之任一项所述的激酶活性的测定方法中使用的腺苷三磷酸(ATP)衍生物，其为二硝基苯基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的ATP衍生物。
13.权利要求12所述的ATP衍生物，其由下式(I)所表示：
式中，
X1表示直接键、氧原子或硫原子、
L1表示接头部分、
R1表示可与上述L1及上述DNP的双方连结的反应基、
DNP表示二硝基苯基。
14.用于在权利要求1～9之任一项所述的激酶活性的测定方法中使用的试剂盒，其含有：
激酶的底物，
含二硝基苯基(DNP)的腺苷三磷酸(ATP)衍生物，及
与上述DNP基结合的抗体，
其中上述含DNP基的ATP衍生物是DNP基经接头结合于ATP的γ位的磷酸基的化合物。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中上述ATP衍生物由下式(I)所表示：
式中，
X1表示直接键、氧原子或硫原子、
L1表示接头部分、
R1表示可与上述L1及上述DNP的双方连结的反应基、
DNP表示二硝基苯基。
16.制造二硝基苯基经接头结合于腺苷三磷酸(ATP)的γ位的磷酸基的ATP衍生物的方法，其包括使下列(a)～(c)反应的工序：
(a)下式(II)所表示的化合物：
DNP-R2     (II)
式中，R2表示氨基酸残基，DNP表示二硝基苯基，
(b)具有可与R2连结的第1反应基及可与X2连结的第2反应基的二官能性接头，和
(c)下式(III)所表示的化合物：
式中，X2表示反应基，但除含DNP的官能团之外。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7058081B2 (ja) 2017-05-19 2022-04-21 シスメックス株式会社 サイクリン依存性キナーゼ基質
JP2020162420A (ja) 2019-03-28 2020-10-08 シスメックス株式会社 サイクリン依存性キナーゼ４／６阻害剤の感受性を判定するための方法、試薬キット、装置及びコンピュータプログラム

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5258507A (en) * 1990-11-08 1993-11-02 Amoco Corporation Labeling reagents useful for the chemical attachment of nitrophenyl derivative ligands to DNA probes
US6136595A (en) * 1993-07-29 2000-10-24 St. Jude Children's Research Hospital Jak kinases and regulations of cytokine signal transduction
US20020164673A1 (en) * 2001-02-14 2002-11-07 Hideki Ishihara Method for determining activity of cell cycle regulatory factor and method for diagnosing cancer using the same
WO2004043563A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of isolation of active compounds and activated targets
CN1961077A (zh) * 2004-06-01 2007-05-09 希森美康株式会社 酶活性测定方法及酶活性测定用柱
CN101046475A (zh) * 2006-03-31 2007-10-03 希森美康株式会社 激酶活性的测定方法及测定用试剂盒
CN102081018A (zh) * 2009-11-30 2011-06-01 希森美康株式会社 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN142734B (zh) * 1975-04-28 1977-08-20 Miles Lab
JP2002267672A (ja) * 2000-12-28 2002-09-18 Internatl Reagents Corp 新規抗ｄｎｐモノクローナル抗体および超高感度測定法
JP4036655B2 (ja) * 2001-02-14 2008-01-23 シスメックス株式会社 細胞周期調節因子の活性の測定法と該測定法に使用される試薬
JP4318296B2 (ja) * 2001-08-29 2009-08-19 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション 標識ヌクレオシドポリホスフェート
JP4742029B2 (ja) * 2003-04-01 2011-08-10 アクティブクス バイオサイエンシズ、インコーポレイテッド アシル−リン酸及びホスホン酸プローブ並びにその合成方法並びにプロテオーム分析における使用
JP2008029320A (ja) * 2006-03-31 2008-02-14 Sysmex Corp キナーゼの活性測定方法
JP2009089672A (ja) * 2007-10-10 2009-04-30 Sysmex Corp がんの再発リスクの判定方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5258507A (en) * 1990-11-08 1993-11-02 Amoco Corporation Labeling reagents useful for the chemical attachment of nitrophenyl derivative ligands to DNA probes
US6136595A (en) * 1993-07-29 2000-10-24 St. Jude Children's Research Hospital Jak kinases and regulations of cytokine signal transduction
US20020164673A1 (en) * 2001-02-14 2002-11-07 Hideki Ishihara Method for determining activity of cell cycle regulatory factor and method for diagnosing cancer using the same
WO2004043563A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of isolation of active compounds and activated targets
CN1961077A (zh) * 2004-06-01 2007-05-09 希森美康株式会社 酶活性测定方法及酶活性测定用柱
CN101046475A (zh) * 2006-03-31 2007-10-03 希森美康株式会社 激酶活性的测定方法及测定用试剂盒
CN102081018A (zh) * 2009-11-30 2011-06-01 希森美康株式会社 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SARAH E.LEE，ET AL: "Synthesis and reactivity of novel γ-phosphate modified ATP analogues", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 *
TONG-SHINCHANG ET AL: "Regulation of Peroxiredoxin I Activity by Cdc2-mediated Phosphorylation", 《THE JOURNALOF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
晏日强 等: "间接酶标检测经DNP化修饰后的铁传递蛋白", 《上海医科大学学报》 *

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