JP4437003B2 - Ｅｖｈ１ドメインまたはｅｖｈ１ドメインを有するタンパク質とｅｖｈ１結合ドメインまたはｅｖｈ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する化合物をスクリーニングする方法およびその相互作用を検出する方法 - Google Patents
Ｅｖｈ１ドメインまたはｅｖｈ１ドメインを有するタンパク質とｅｖｈ１結合ドメインまたはｅｖｈ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する化合物をスクリーニングする方法およびその相互作用を検出する方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体とジキシンまたはジキシン誘導体との間の相互作用を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）し得る化合物を同定する方法、ならびにその相互作用を検出する方法に關する。
【０００２】
ＥＶＨ１ドメインとＥＶＨ１結合ドメインを介したタンパク質の相互作用は、特に組織表面に対する細胞の接着および細胞の運動性に関与するシグナル導入経路、細胞の形態変化および細胞の凝集、特に血小板およびリンパ球の活性化に重要な役割を果たしている。このようなプロセスは、多くの疾病、特に、例えば、炎症性疾患、血管、心血管系およびその器官の疾患の場合、または例えば癌のような新生細胞および組織変化の場合での疾病の発病および進行の原因となっているであろう。
【０００３】
多くのタンパク質がＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを含有している。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は例えばジキシンであり、これに対して例えばＶＡＳＰはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質である。タンパク質のドメインは、タンパク質の三次元領域であるか、または多数のペプチド鎖のセクションで構成されていて、また独立して折りたたまれているコンパクト領域としてのタンパク質表面である。ＥＶＨ１（Ｅｎａ−ＶＡＳＰ相同）ドメインは、Ｅｎａ−ＶＡＳＰファミリーの全てのタンパク質に存在し、また、それぞれのＥＶＨ１結合タンパク質との相互作用によって、正確な細胞配置のもとになっている長さが約１１５個のアミノ酸の高度な保存配列セクションに基づくものである。ＥＶＨ１ドメインは、７個のβ−プリーツシートおよびＣ−末端α−ヘリックスからなり、これらは折りたたまれて独特のβ−バレル構造を形成している。これらはプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、またホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインに対して高度な構造類似性を有している。種々のＥＶＨ１結合タンパク質において、Ｅｎａ／ＶＡＳＰタンパク質ファミリーのＥＶＨ１ドメインは、タイプIIのポリプロリンヘリックスの形態で折りたたまれているＦＰＰＰＰコアモチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）を有するプロリンリッチなペプチド配列を認識するものである。このようなＦＰＰＰＰ配列モチーフを有するＥＶＨ１結合タンパク質は、例えば細胞骨格会合タンパク質ジキシンおよびビンキュリンまたは通性細胞内細菌リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）単球遺伝子の表面タンパク質ＡｃｔＡである。ＶＡＳＰのＥＶＨ１ドメインとジキシンのＥＶＨ１結合ドメイン中のＦＰＰＰＰモチーフとの相互作用によって、ジキシンとＶＡＳＰとの間に相互作用が存在する。略号ＶＡＳＰとは「血管拡張刺激リンタンパク質」（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。ＶＡＳＰは、ほとんど全ての哺乳動物の細胞でみられ、そこでは、このものはｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼの基質である。ＶＡＳＰに相同のタンパク質およびＶＡＳＰは一緒になってＥｎａ／ＶＡＳＰタンパク質ファミリーを形成し、そしてこれらは例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＥｎａタンパク質およびマウスのＭｅｎａおよびＥｖｌタンパク質で検出できた。ヒトでは、心血管細胞、特に血小板、内皮細胞、平滑筋細胞および新生内膜細胞（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｃｅｌｌｓ）で特に高濃度のＶＡＳＰが存在する。培養細胞では、ＶＡＳＰは、細胞−マトリックス接触部位（フォーカルアドヒージョンポイント）、細胞−細胞接触、アクチンフィラメント系およびダイナミック膜構造、例えば運動性細胞のリーディングエッジと関連があることが見出されている。多数の実験データから、ＶＡＳＰはアダプター分子としてプロフィラクチンを細胞骨格タンパク質ジキシンおよびビンキュリンを有するか、またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種で感染させた細胞中の表面タンパク質ＡｃｔＡを有する部位に供給することが確認された。タンパク質ジキシン、ビンキュリンおよびＡｃｔＡ中のＦＰＰＰＰモチーフを結合しているＥＶＨ１ドメインおよびＶＡＳＰ中のＥＶＨ１ドメインは機能的にまたＮＭＲ構造解析により構造的にも特徴付けされている。機能的研究により、ＶＡＳＰはアクチンフィラメントの局在的な形成を増進させる決定的な因子であり、また細胞接着および細胞運動性を調節する重要な因子であることが確認されている。ここでは、ＶＡＳＰは例えばジキシン、ビンキュリンまたはプロフィリンのようなその他のタンパク質と直接相互作用する。これは例えばＶＡＳＰ−ジキシン相互作用の結合モチーフを含有するペプチドのマイクロインジェクションによって実証された［この分野の総説は以下の文献にみられる：Reinhard M, Jarchau T, Reinhard K, and Walter U. (1999)VASP:Guidebook to the Cytoskeletal and Motor Proteins (Eds., Kreis, T., and Vale, R.), Oxford University Press, Oxford, pp. 168-171］。これらの理由から、ＶＡＳＰとジキシンとの複合体は新規な可能性のある標的構造体であるものと考えられ、このものは、この相互作用を調節するのに適切な医薬を開発することによって、細胞接着および細胞運動性における病理学的変化を伴う疾患、例えば動脈硬化症および血液凝固疾患および関連する心血管系疾患に好ましい影響を与えるのに使用し得る。従って、ＶＡＳＰおよびジキシンまたは互いに相互作用をするこれらのタンパク質の同族体または誘導体は、就中、心血管系疾患を治療するための治療上有効な化合物として使用し得る化学物質を同定するのに使用し得る。
【０００４】
ＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインとＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインとの間の相互作用を、放射性標識されたＶＡＳＰによる放射性固相アッセイまたはオーバーレイアッセイ（ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓａｙ）（この場合、事前のゲル電気泳動分離を伴うかまたは伴わずして固相に移送され、次いでジキシンが検出される）を使用して検出する方法が知られている（Reinhard等、PNAS 92, 7956-7960, 1995；Reinhard等、FEBS Lett. 399, 103-107, 1996）。そのフォーマットおよび放射性検出のために、この方法は大量迅速処理スクリーニング（ＨＴＳ）による検出方法には適していない。使用される放射性標識方法はその使用範囲が限定され、また、複雑な分離工程のために、ゲル電気泳動分離法は自動化スクリーニング方法に使用することができず、さらには検出の特異性に関して問題がある。
【０００５】
ＷＯ ９８／０１７５５には、ヒト以外のＶＡＳＰ様タンパク質（Ｍｅｎａ，Ｅｖｌ）が開示されている。これらのタンパク質は、スクリーニングモデルを構築するための適合性に制約がある。その理由は、これらのタンパク質は、医薬スクリーニングのために構築されるべき、好ましくはヒトの成分の、標的構造をある程度までしか示していないからである。
【０００６】
蛍光標識としてのランタニドキレートの使用、および例えばＨＴＳ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のためのこれらの蛍光標識を使用する時間分解蛍光測定法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）の使用は、ＷＯ ９７／２９３７３およびＷＯ ９８／１５８３０にＷａｌｌａｃ Ｏｙ（フィンランド）によって開示されている。特にスクリーニング方法に使用するのに適当であるＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインとＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインとの間の相互作用を分析するための蛍光標識の使用については、これまでには結果が何も公表されていない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を開発するところにある。このスクリーニング方法は大量迅速処理スクリーニングに適したものでなければならず、また自動的に操作しても安全で、迅速で、極めて特異的で、かつ信頼性がなければならない。さらには、このスクリーニング方法では、好ましくはヒトの成分を用いる医薬のスクリーニングに適切な標的構成体が構築されなければならない。
【０００８】
本発明は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節し得る化合物を同定する方法に関し、この方法は以下のプロセス工程からなるものである：
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と試験すべき化合物の存在下に接触させ［ここで、「接触させる」とは、支持体をドメインでコーティングし、ブロックし／洗浄し、他のドメインを加え（試験物質と共にまたはなしで）、洗浄に至るまでインキュベーションし、および洗浄を包含するインキュベーションをする工程順序を特に意味するものと解すべきである］；
ｂ）ａ）による混合物を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質に特異的に結合する抗体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されているかまたは化学的に結合されている抗原を有する抗体と共に、インキュベーションするのに使用し；
ｃ）ｂ）による混合物を、混合物ｂ）からの抗体と特異的に結合することができ、かつ生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識を付けた抗体と共に、インキュベーションするのに使用し；
ｄ）ｃ）に従ってインキュベーションした後、ｃ）からの抗体上の標識を生化学的にまたは物理化学的に検出する。
【０００９】
相互作用の調節は、結合パートナーの結合をさらに強くするかまたはこの結合を弱める結果をもたらすことになる。結合パートナーの結合がさらに強くなるのは、例えば関与するドメインまたはタンパク質の親和性が相互に増大することから明らかである。親和性の増大は、関与する結合パートナーの親和定数の低減によって認められる。親和定数は生化学での標準的な方法を使用して測定することができる。このような方法は例えば以下のような文献に開示されている：「Pingoud, A., Urbanke, K., Arbeitsmethoden der Biochemie；1997；Gruyter Lehrbuch」または「Wilson, K., Goulding, K. H., Methoden der Biochemie；1991；Thieme flexible Taschenbucher」。このことは結合パートナーの結合が弱くなることにも同様に適用される。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質はＥＶＨ１結合ドメインを含有するタンパク質である。同様に、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質はＥＶＨ１ドメインを含有するタンパク質である。
【００１０】
好ましい実施態様では、上記の化合物同定方法は、固体からなる表面で実施される。従って、この方法は固相アッセイとも言われている。好ましい実施態様では、固体の表面を、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１結合ドメインで、またはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質でコーティングする。さらに好ましい実施態様では、固体の表面を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１ドメインで、またはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングする。このようにしてコーティングされた表面を次いで試験する相互作用について不活性な試薬またはタンパク質、例えばウシ血清アルブミンでコーティングする。次に、水性有機溶媒に溶解し得る検査すべき化合物をこのような方法でコーティングされた表面に適用する。固体は様々な材料例えばプラスチック、ガラスまたは金属で作られていてよい。好ましくは、固体は有機ポリマーからなる。さらに他の実施態様では、固体は有機溶媒、酸、塩基または水溶液に対して不溶であるかまたは耐性である化学物質で作られている。固体は様々な形状であってよい。例えば、好ましい変形では、このものはマイクロタイタープレートとして存在し、またＥｐｐｅｎｎｄｏｒｆ容器、ガラス管、フィルムまたはマイクロチップとして存在していてもよい。固体はただ一種の材料または成分からなっていてもよいし、多数の材料または成分からなっていてもよい。ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１結合ドメインで、またはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質で、固体表面をコーティングするのは、固体に直接実施することができる。異なった材料からなる固体の場合、固体ベースとは別個に担体材料をコーティングし、この固体ベースにコーティングした後担体材料を適用し、次いで担体材料と固体ベースとを一緒にして固体を形成させることも可能である。表面のコーティングは最初ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質のみで実施してもよい。次に、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用は、第二の工程で、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質でコーティングされた表面にＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質を添加することによって確立される。さらにその他の実施態様では、表面を最初ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質のみでコーティングする。次に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用は、第二の工程で、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングされた表面にＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質を添加することによって、確立される。固体の表面をＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングするためには、固体の表面をこれらのドメインまたはタンパク質の一種と共にインキュベーションする。同様に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を確立するためには、一つのドメインまたはこのドメインを有するタンパク質をその他のドメインまたはこのその他のドメインを有するタンパク質と共にインキュベーションする。次に、相互作用しないドメインまたはこれらのドメインを有するタンパク質の過剰量を洗浄により除去する。インキュベーションとは、タンパク質および表面が、一定の温度で一定の緩衝液およびイオン濃度で一定時間の間互いに接触されることを意味する。このために、タンパク質は、化学添加物を含む緩衝化された水性媒体に溶解または懸濁されて存在する。
【００１１】
ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。原則的には、ＥＶＨ１結合ドメインを有するいずれのタンパク質も本発明の方法に使用することができる。ＥＶＨ１結合ドメインは、単離ドメインとしてまたはＥＶＨ１結合ペプチドとして、タンパク質のその他の成分から物理的に分離して使用することもできる。使用されるＥＶＨ１結合ドメインは例えばジキシンまたはジキシン誘導体に含まれているとおりのＥＶＨ１結合ドメインであってよい。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体である。原則的には、ＥＶＨ１ドメインを有するいずれのタンパク質も使用することができる。ＥＶＨ１ドメインは、単離ドメインとして、タンパク質のその他の成分から物理的に分離して存在することもできる。使用されるＥＶＨ１ドメインは例えばＶＡＳＰに含まれているとおりのＥＶＨ１ドメインであってよい。
【００１２】
ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種からの対応するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。所要のタンパク質は相当する脊椎動物の組織または細胞例えば血小板から単離することができるし、または宿主細胞または微生物例えば昆虫細胞または大腸菌細胞で遺伝子組換えによって調製し、そして精製することもできる。「Jarchau, T., Mund, T., Reinhard, M., U. Walter(1998), Purification and Assays of Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein. Methods in Enzymology, Vol. 298, 103-113」に詳述されている通り、組換えＶＡＳＰは例えば昆虫細胞からイムノアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製する。「Current Protocols in Molecular Biology, ed.：F. M. Ausubel, Wiley-Interscience (1987)」に詳述されている通り、ＶＡＳＰのＥＶＨ１ドメインまたはジキシンのＥＶＨ１結合ドメインは例えば大腸菌からグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として遺伝子組換えで精製する。
【００１３】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をジキシン誘導体として使用する。好ましい実施態様では、ジキシン誘導体は、そのＣ末端に融合されたジキシンのＮ−末端での最初の１４２個のアミノ酸を有するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質からなる。原則的には、使用されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼはいずれの種のアミノ酸配列であってよい。ヒト、マウス、ラットまたは日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からの配列を使用するのが好ましい。このような配列は例えばＰ０８２６３（ヒト）、Ｐ２４４７２（マウス）、Ｐ０４９０４（ラット）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。ジキシンの最初の１４２個のＣ−末端アミノ酸に適当な融合パートナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに加えて、例えばヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質である。
【００１４】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節する化合物を同定する方法は、上記の通りドメインまたはタンパク質でコーティングし、かつマイクロタイタープレートの一部を形成している固体からなる表面を使用して実施する。
【００１５】
ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質の特異的検出のための本発明の方法を実施するためには、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用することができる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメイン、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されているかまたは化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有していなければならない。
【００１６】
好ましい実施態様では、ＶＡＳＰまたはジキシンに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を本発明の方法を実施するのに使用する。この抗体はハイブリドーマ細胞を使用して合成し、次いで濃縮し、精製することができる。ハイブリドーマ細胞の培養、ハイブリドーマ細胞を用いた抗体の産生、これらの抗体の精製および濃縮は、例えば、「Current Protocols in Immunology, ed.：J. E. Coligan, Wiley-Interscience (1991)」に記載されている通り、標準的な方法で実施される。この文献は抗原に対する結合特異性を測定する方法も教示している。本発明の方法の目的には、使用する抗原は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質例えばジキシンまたはジキシン誘導体であり、そしてＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質例えばＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されている抗原例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質または化学的に結合されている抗原であってよい。
【００１７】
さらに他の好ましい実施態様では、本発明の方法を実施するのに使用される抗体は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質例えばジキシンまたはジキシン誘導体、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質例えばＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合された抗原例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質または化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有するポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製、精製、試験および使用については、「Current Protocols in Immunology, ed.：J. E. Coligan, Wiley-Interscience (1991)」に詳述されている。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施態様では、使用するＶＡＳＰに対して結合特異性を有する抗体はモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５であり、そしてさらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体はｍＡＢ ＩＥ２７３である。
【００１９】
ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメイン、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されている抗原または化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有する本発明の方法での抗体に特異的に結合する抗体は、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識を担持していてよい。生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は、例えば酵素、放射性同位元素または蛍光標識である。好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は、特にアルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼであり、またさらに好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は同位元素例えば放射性同位元素であり、またさらに好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は蛍光標識特にランタニド錯体例えばユウロピウム錯体である。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の方法は上記の如く医薬を同定するのに使用することができる。このような医薬は、就中、心血管系疾患、炎症性疾患、血管の疾患または新生細胞および組織変化例えば癌などを治療するのに使用することができる。
【００２１】
本発明は、さらには、上記の通り本発明の方法で同定されたＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する化合物に關する。このような化合物は、好ましくはペプチド、特に配列ＦＰＰＰＰまたはＷＰＰＰＰを有するペプチド、またはそれらの化学的誘導体およびプロリンリッチな同族体である。このような化合物は例えば心血管系疾患、炎症性疾患、血管の疾患または新生細胞および組織変化例えば癌などを治療するための医薬となり得る。
【００２２】
好ましい実施態様では、本発明は、ＶＡＳＰに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５、およびモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５を産生し得るハイブリドーマ細胞に關する。さらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５を産生し得るハイブリドーマ細胞は菌株ＤＳＭ ＡＣＣ２４４４から由来するものである。さらに他の好ましい実施態様では、本発明は、ＶＡＳＰに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３、およびモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３を産生し得るハイブリドーマ細胞に關する。さらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３を産生し得るハイブリドーマ細胞は菌株ＤＳＭ ＡＣＣ２４４５から由来するものである。
【００２３】
ハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４４およびハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４５はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ ｆuｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ［Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇｎｉｓｍ ｓｔｒａｉｎｓ］に寄託されている。
【００２４】
さらには、本発明は、固体からなり、かつＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質で、またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングされている表面に關する。
【００２５】
ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。さらに、ジキシン誘導体は好ましくはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの融合タンパク質、またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびマルトース結合タンパク質の融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびヘキサヒスチジンの融合タンパク質により形成される。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質またはヘキサヒスチジンの融合タンパク質である。
【００２６】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用する。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質について、この相互作用を確立するには、ジキシンまたは、例えばジキシンまたはジキシンフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびマルトース結合タンパク質の融合タンパク質としてのジキシン誘導体を使用するのが好ましい。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質については、ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質の融合タンパク質が好ましい。
【００２７】
使用されるＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種由来の相当するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。
【００２８】
さらに、本発明はＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質およびＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にジキシン、ジキシン誘導体またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体でコーティングされた表面を含むマイクロタイタープレートに関する。マイクロタイタープレートは様々な数のウエルを有することができる。例えば、マイクロタイタープレートは３、６、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、７６８、１５３６、３０７２またはそれ以上のウエルを有していてよい。好ましい実施態様では、マイクロタイタープレートは３８４のウエルを有し、特に好ましい実施態様では、７６８のウエル、正に特に好ましい実施態様では、１５３６のウエルを有している。また、記載された実施態様では、本発明の表面はその他の装置、容器またはデバイスの構成要素、例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ容器、様々な材料のチューブ、特にプラスチックまたはガラスのチューブの構成要素、チップ様デバイスおよびその他の装置、デバイスまたは容器の構成要素であってもよい。
【００２９】
さらに、本発明は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節し得る化合物を同定する方法に関し、この方法は以下のプロセス工程からなるものである：
【００３０】
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と検査すべき化合物少なくとも一種の存在下で接触させ、ここで、それぞれの場合に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間でエネルギー伝達を可能とする蛍光染料を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質および／またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質にカップリングさせ；
ｂ）ａ）に従ってインキュベーションした後分光測定する。
【００３１】
この方法では、使用する蛍光染料は好ましくはＡＰＣ、Ｃｙ５またはランタニド錯体、ここでは特にユウロピウム錯体である。
この方法では、使用するＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体である。使用するＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。さらに他の好ましい実施態様では、使用するジキシン誘導体はジキシンまたはジキシンフラグメントとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントとマルトース結合タンパク質との融合タンパク質である。
【００３２】
ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体とＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体との相互作用は、ある種の蛍光染料をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングさせたときに、分光法で測定できる。蛍光染料がカップリングしているタンパク質の複合体形成によって、染料が相互に十分に接近した空間的近接位置におかれた場合に、これらの蛍光染料によるエネルギー伝達が可能となる。使用する蛍光染料は、エネルギー供与体およびエネルギー受容体として相互に補完し合う化合物であってよい。特定の波長の電磁波放射を使用すると、エネルギー供与体が励起される。励起エネルギーは、エネルギー供与体と接近した近接位置に存在しているときは、エネルギー受容体に無放射で伝達できる。特定の波長の電磁波放射を放出すると、エネルギー受容体は基底状態にもどる。このエネルギー放出はエネルギー供与体の励起波長とは異なった波長で生じる。エネルギー供与体およびエネルギー受容体を適切に選択すると、エネルギー伝達が、電磁波放射の分光法で検出可能な波長、好ましくは可視光線の範囲内で生じる。エネルギー供与体およびエネルギー受容体がＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングすると、これらのタンパク質またはタンパク質誘導体の相互反応を分光法の手段によって直接検出することができる。ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する試験すべき化合物は、相互作用するタンパク質と接触すると直ちにエネルギー伝達での分光法で検出し得る変化によりそれ自体の本性を示す。使用するエネルギー供与体は、ある種の蛍光染料例えばランタニド錯体、特にユウロピウム錯体であってよい。使用するエネルギー受容体はある種の蛍光染料例えばＡＰＣまたはＣｙ５でよい。各々のエネルギー供与体またはエネルギー受容体を、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングさせることができる。本発明の方法を実施する場合、相互作用するドメインまたは異なったドメインを含有する相互作用するタンパク質は、それぞれの場合、補完し合うエネルギー供与体またはエネルギー受容体が提供される事実に留意すべきである。相互作用を分光法で測定するためには、エネルギー供与体およびエネルギー受容体は、相互作用を調節する分子錯体中に同時に存在していなければならない。エネルギー供与体またはエネルギー受容体のカップリングは各々の場合共有結合を介して直接に生成されるか、または抗体またはビオチン−ストレプトアビジンを介して間接的に生成される。これらの抗体は市販されている。
【００３３】
ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種からの対応するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。
【００３４】
本発明はＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節するための医薬製剤を製造する方法に關し、この方法では本発明の方法の一または二以上を使用して化合物を同定し、そしてこの化合物を医薬賦形剤および／または医薬担体と混合し、次に適宜医薬投与形態とする。
【実施例】
実施例１：固相アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）を使用するＶＡＳＰとジキシンまたはジキシン誘導体との相互作用の測定
固相アッセイにおいて、結合パートナー（ＶＡＳＰまたはジキシン）をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の表面に固定化する（＝コーティング）。プラスチック表面の不飽和結合部位をブロックし、次いで表面をそれぞれの他の結合パートナーと共にインキュベーションする。インキュベーション後に、過剰の未付着タンパク質を洗浄工程で除去する。適当な抗体を使用すると、特異的に結合したタンパク質を検出し、定量化することがここに可能となる。ここでは、抗体に対する蛍光標識としてランタニドキレートを用い、そして時間分解蛍光測定法を使用することによりシグナル−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比をかなり改善することが可能である。
【００３５】
固相アッセイについては、まず、最善のコーティングおよびインキュベーション条件の特徴を定めた。ジキシン成分（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)またはジキシン(１−１４２)）が、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）をコーティングするのに非常に適していることがわかった。固定化したジキシンに特異的に結合したＶＡＳＰを検出するためには、マウスＩｇＧｓに対するランタニド標識抗体を使用してそれらの部分について検出できるＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体を使用することができる（Ｗａｌｌａｃ：ＤＥＬＦＩＡ抗マウス−Ｅｕ(Ｎ１)）。
【００３６】
現行のアッセイプロトコールはインキュベーション工程五工程および洗浄工程三工程からなる：
１．空のＭＴＰをＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)（コーティング）と共にインキュベーションする
２．ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックする
３．ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄する
４．ＶＡＳＰ（リガンド）と共に（試験物質と共にまたはなしで）インキュベーションする
５．ＰＢＳで洗浄する
６．検出ミックス：α−ＶＡＳＰ（モノクローナル抗ＶＡＳＰ抗体）＋α−マウス−Ｅｕ（＝Ｗａｌｌａｃからのユウロピウム標識抗マウス抗体）と共にインキュベーションする
７．ＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で洗浄する
８．結合ランタニド錯体を遊離させ、蛍光定量測定する。
【００３７】
試薬／タンパク質が選択されると、昆虫細胞（バキュロＶＡＳＰ）から得られた完全アミノ酸配列を有する組換えヒトＶＡＳＰタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、そこから得られたＶＡＳＰまたはＶＡＳＰドメインよりも、顕著に一層優れたシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を有することがわかった。
【００３８】
実施例２：ＶＡＳＰ−ジキシン固相（ＤＥＬＦＩＡ）アッセイの特性
コーティング（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)）およびリガンドインキュベーション（ＶＡＳＰ）の最適条件を試薬の滴定により定めた。ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）によるＭＴＰの飽和コーティングは５μｇ／ｍｌのコーティング溶液濃度で達成される（図１ａ）。使用する容量／ウエルは選択されたＭＴＰ形式（９６ウエルプレートに対して５０μｌまたは１００μｌ、３８４ウエルプレートに対して２０μｌ）に左右される。使用するリガンドがＶＡＳＰである場合のインキュベーションについては、５μｌ／ｍｌの濃度が同様に最善のＳ／Ｎ比を有する数値であることがわかった（図１ｂ）。
【００３９】
実施例３：検出
アッセイをさらに最適化する過程で、モノクローナル抗体の選択が結合ＶＡＳＰの検出にとって非常に重要であることがわかった。抗ＶＡＳＰ抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５と比較して、抗体ＩＥ２７３を使用した場合は、マグニチュード約１オーダでの一層よいＳ／Ｎ比が得られた。ＩＥ２７３抗体の使用量を最適化すると、この量は先に使用したＶＡＳＰの量に左右されることがわかった。最適Ｓ／Ｎ比はＩＥ２７３対ＶＡＳＰ１：１６のモル比（質量比１：４）であることがわかった。ＶＡＳＰ５μｇ／ｍｌの濃度でのインキュベーションについて、検出をＩＥ２７３の１.２５μｇ／ｍｌを使用して実施すると、最良のシグナルが結果として得られた。このことはまた洗浄工程の最適化または減少に関連して重要なことである。それは、ＶＡＳＰとのインキュベーションと検出との間の洗浄工程が重要であり、省略してはならないことがわかったからである。
【００４０】
実施例４：ペプチド作用性阻害剤による競合実験
これまでは、ＶＡＳＰ／ジキシン相互作用の非ペプチド作用性阻害剤は知られていない。可能性のある阻害剤の作用を刺激するために、ジキシンのＶＡＳＰ結合モチーフ(ｍｏｔｉｖｅ)（ＦＰＰＰＰ）を含んだ競合ペプチドを使用して阻害試験を実施した。初期の研究（Ｎｉｅｂｕｈｒ ｅｔ ａｌ.（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，５４３３）では，このモチーフでの突然変異およびＶＡＳＰ／ＡｃｔＡ相互作用（同様にＡｃｔＡでのＦＰＰＰＰモチーフに対するＶＡＳＰの結合に基づく）の阻害に対するそれらの効果が検討されていた。野生型配列ＦＰＰＰＰと比較して、ＡＰＰＰＰモチーフを有するペプチドはかなり劣る阻害を示したのに対して、ＷＰＰＰＰモチーフを有するペプチドは野生型モチーフよりもさらに良い阻害を示すことがわかった（阻害：ＷＰＰＰＰ＞ＦＰＰＰＰ＞ＡＰＰＰＰ）。相当する突然変異を有するジキシンペプチドを使用してＶＡＳＰ／ジキシン相互作用と競合させた。ペプチドの見掛けの阻害定数については、ＶＡＳＰ／ＡｃｔＡ相互作用についての順列と同じ順列がみられた（図２）：ＷＰＰＰＰ＞ＦＰＰＰＰ＞ＡＰＰＰＰ。
【００４１】
このことから、競合物質の使用そしてまたおそらくは異なったタイプの阻害剤の使用により、記載したアッセイによって検出し得るＶＡＳＰ／ジキシン相互作用に影響を及ぼし得ることを示している。
【００４２】
実施例５：溶剤耐性
このアッセイがＨＴＳに使用しうることを確実にするために、このアッセイは物質ライブラリーの標準溶剤に対して十分耐性でなければならない。一般には、これらの標準溶剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノールである。これらの二種の溶剤に対するアッセイの耐性を試験するために、メタノールおよびＤＭＳＯの濃度を増加させてインキュベーション（一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での）を実施した。２５％の濃度まで、メタノールは実際のところアッセイに対して効果がなく（図３ａ）、これに対してＤＭＳＯ２５％ではシグナルはほぼ半分に減少した（図３ｂ）ことがわかった。しかしながら、通常スクリーニングに使用されている１〜５％のＤＭＳＯ濃度では、シグナルの減少は僅か１５％までであり、これはＨＴＳアッセイに許容し得るものである。
【００４３】
実施例６：小型化
上記の方法で、アッセイを最初９６ウエルプレートで実施した。ここで、アッセイ容量を１００μｌ／ウエルから５０μｌ／ウエルに低減することができた。ＨＴＳで使用するためにアッセイをさらに小型化するのに、アッセイを３８４ウエルプレートに適合させた。このために、異なった表面および色を有する様々な製造業者の３８４ウエルプレートを試験した。試験したプレートのうち、Ｇｒｅｉｎｅｒからの３８４ウエルプレートについて最も良い数値が見られた。ここで、黒色のプレートのバックグラウンドが特に低くても、白色および黒色のプレートは極めて類似した様式で作動する。試験した表面（低度の結合、未処理、高度の結合）のうち、未処理表面で最も良い結果が得られた。
【００４４】
３８４ウエルプレートを使用することにより、アッセイ容量をさらに２０μｌ／ウエルに減少させることができた。幸いにも、小型化の追加の効果として、Ｓ／Ｎ比が約１００にさらに改善された。
【００４５】
実施例７：チャート：アッセイプロトコール（３８４ウエルプレートについて）
【表１】
【００４６】
実施例８：蛍光標識したＶＡＳＰおよびジキシンまたはジキシン誘導体のエネルギー伝達を使用する均一なアッセイ：
均一なアッセイのために、昆虫細胞から単離した、完全なアミノ酸配列を有するヒトのＶＡＳＰ（ＳＦ２１）を使用し、特異的抗体を介して間接的に蛍光標識を付けた。使用した結合パートナーは、初めは、結合されたビオチンを介して、エネルギー伝達のために他の発蛍光団に同様に結合し得るＶＡＳＰ結合モチーフＦＰＰＰＰを有するペプチドであった（ストレプトアビジンーＡＰＣ）。しかしながら、次の実験では、使用したＶＡＳＰ結合パートナーは、ペプチドに代わって、これらのＦＰＰＰＰモチーフを数個含有しているジキシンのＮ−末端とのＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)）であった。この目的には、ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）を大腸菌で発現し、精製しそしてビオチンで共有結合修飾した。それで、蛍光標識した結合パートナー間のエネルギーの伝達を測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）によるＭＴＰのコーティング：飽和は５μｇ／ｍｌのコーティング溶液濃度で達成される。
【図１ｂ】 ＶＡＳＰによるＭＴＰのコーティング：使用するリガンドがＶＡＳＰである場合のインキュベーションについては、５μｇ／ｍｌの濃度が最も良いＳ／Ｎ比を生じることがわかった。
【図２】 ＡＰＰＰＰ、ＦＰＰＰＰまたはＷＰＰＰＰモチーフを含有するペプチドを競合させることによるＶＡＳＰ／ジキシン相互作用の抑制。
【図３ａ】 メタノール耐性の測定：一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での増加メタノール濃度によるインキュベーション；２５％の濃度まで、メタノールは実質的にはアッセイに効果を有していない。
【図３ｂ】 ＤＭＳＯ耐性の測定：一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での増加ＤＭＳＯ濃度によるインキュベーション；ＤＭＳＯは２５％でシグナルをほぼ半分までに低減させる。
本発明は、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体とジキシンまたはジキシン誘導体との間の相互作用を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）し得る化合物を同定する方法、ならびにその相互作用を検出する方法に關する。
【０００２】
ＥＶＨ１ドメインとＥＶＨ１結合ドメインを介したタンパク質の相互作用は、特に組織表面に対する細胞の接着および細胞の運動性に関与するシグナル導入経路、細胞の形態変化および細胞の凝集、特に血小板およびリンパ球の活性化に重要な役割を果たしている。このようなプロセスは、多くの疾病、特に、例えば、炎症性疾患、血管、心血管系およびその器官の疾患の場合、または例えば癌のような新生細胞および組織変化の場合での疾病の発病および進行の原因となっているであろう。
【０００３】
多くのタンパク質がＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを含有している。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は例えばジキシンであり、これに対して例えばＶＡＳＰはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質である。タンパク質のドメインは、タンパク質の三次元領域であるか、または多数のペプチド鎖のセクションで構成されていて、また独立して折りたたまれているコンパクト領域としてのタンパク質表面である。ＥＶＨ１（Ｅｎａ−ＶＡＳＰ相同）ドメインは、Ｅｎａ−ＶＡＳＰファミリーの全てのタンパク質に存在し、また、それぞれのＥＶＨ１結合タンパク質との相互作用によって、正確な細胞配置のもとになっている長さが約１１５個のアミノ酸の高度な保存配列セクションに基づくものである。ＥＶＨ１ドメインは、７個のβ−プリーツシートおよびＣ−末端α−ヘリックスからなり、これらは折りたたまれて独特のβ−バレル構造を形成している。これらはプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、またホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインに対して高度な構造類似性を有している。種々のＥＶＨ１結合タンパク質において、Ｅｎａ／ＶＡＳＰタンパク質ファミリーのＥＶＨ１ドメインは、タイプIIのポリプロリンヘリックスの形態で折りたたまれているＦＰＰＰＰコアモチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）を有するプロリンリッチなペプチド配列を認識するものである。このようなＦＰＰＰＰ配列モチーフを有するＥＶＨ１結合タンパク質は、例えば細胞骨格会合タンパク質ジキシンおよびビンキュリンまたは通性細胞内細菌リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）単球遺伝子の表面タンパク質ＡｃｔＡである。ＶＡＳＰのＥＶＨ１ドメインとジキシンのＥＶＨ１結合ドメイン中のＦＰＰＰＰモチーフとの相互作用によって、ジキシンとＶＡＳＰとの間に相互作用が存在する。略号ＶＡＳＰとは「血管拡張刺激リンタンパク質」（ｖａｓｏｄｉｌａｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。ＶＡＳＰは、ほとんど全ての哺乳動物の細胞でみられ、そこでは、このものはｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼの基質である。ＶＡＳＰに相同のタンパク質およびＶＡＳＰは一緒になってＥｎａ／ＶＡＳＰタンパク質ファミリーを形成し、そしてこれらは例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＥｎａタンパク質およびマウスのＭｅｎａおよびＥｖｌタンパク質で検出できた。ヒトでは、心血管細胞、特に血小板、内皮細胞、平滑筋細胞および新生内膜細胞（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ ｃｅｌｌｓ）で特に高濃度のＶＡＳＰが存在する。培養細胞では、ＶＡＳＰは、細胞−マトリックス接触部位（フォーカルアドヒージョンポイント）、細胞−細胞接触、アクチンフィラメント系およびダイナミック膜構造、例えば運動性細胞のリーディングエッジと関連があることが見出されている。多数の実験データから、ＶＡＳＰはアダプター分子としてプロフィラクチンを細胞骨格タンパク質ジキシンおよびビンキュリンを有するか、またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種で感染させた細胞中の表面タンパク質ＡｃｔＡを有する部位に供給することが確認された。タンパク質ジキシン、ビンキュリンおよびＡｃｔＡ中のＦＰＰＰＰモチーフを結合しているＥＶＨ１ドメインおよびＶＡＳＰ中のＥＶＨ１ドメインは機能的にまたＮＭＲ構造解析により構造的にも特徴付けされている。機能的研究により、ＶＡＳＰはアクチンフィラメントの局在的な形成を増進させる決定的な因子であり、また細胞接着および細胞運動性を調節する重要な因子であることが確認されている。ここでは、ＶＡＳＰは例えばジキシン、ビンキュリンまたはプロフィリンのようなその他のタンパク質と直接相互作用する。これは例えばＶＡＳＰ−ジキシン相互作用の結合モチーフを含有するペプチドのマイクロインジェクションによって実証された［この分野の総説は以下の文献にみられる：Reinhard M, Jarchau T, Reinhard K, and Walter U. (1999)VASP:Guidebook to the Cytoskeletal and Motor Proteins (Eds., Kreis, T., and Vale, R.), Oxford University Press, Oxford, pp. 168-171］。これらの理由から、ＶＡＳＰとジキシンとの複合体は新規な可能性のある標的構造体であるものと考えられ、このものは、この相互作用を調節するのに適切な医薬を開発することによって、細胞接着および細胞運動性における病理学的変化を伴う疾患、例えば動脈硬化症および血液凝固疾患および関連する心血管系疾患に好ましい影響を与えるのに使用し得る。従って、ＶＡＳＰおよびジキシンまたは互いに相互作用をするこれらのタンパク質の同族体または誘導体は、就中、心血管系疾患を治療するための治療上有効な化合物として使用し得る化学物質を同定するのに使用し得る。
【０００４】
ＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインとＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインとの間の相互作用を、放射性標識されたＶＡＳＰによる放射性固相アッセイまたはオーバーレイアッセイ（ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓａｙ）（この場合、事前のゲル電気泳動分離を伴うかまたは伴わずして固相に移送され、次いでジキシンが検出される）を使用して検出する方法が知られている（Reinhard等、PNAS 92, 7956-7960, 1995；Reinhard等、FEBS Lett. 399, 103-107, 1996）。そのフォーマットおよび放射性検出のために、この方法は大量迅速処理スクリーニング（ＨＴＳ）による検出方法には適していない。使用される放射性標識方法はその使用範囲が限定され、また、複雑な分離工程のために、ゲル電気泳動分離法は自動化スクリーニング方法に使用することができず、さらには検出の特異性に関して問題がある。
【０００５】
ＷＯ ９８／０１７５５には、ヒト以外のＶＡＳＰ様タンパク質（Ｍｅｎａ，Ｅｖｌ）が開示されている。これらのタンパク質は、スクリーニングモデルを構築するための適合性に制約がある。その理由は、これらのタンパク質は、医薬スクリーニングのために構築されるべき、好ましくはヒトの成分の、標的構造をある程度までしか示していないからである。
【０００６】
蛍光標識としてのランタニドキレートの使用、および例えばＨＴＳ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のためのこれらの蛍光標識を使用する時間分解蛍光測定法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）の使用は、ＷＯ ９７／２９３７３およびＷＯ ９８／１５８３０にＷａｌｌａｃ Ｏｙ（フィンランド）によって開示されている。特にスクリーニング方法に使用するのに適当であるＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインとＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインとの間の相互作用を分析するための蛍光標識の使用については、これまでには結果が何も公表されていない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＥＶＨ１結合ドメイン例えばジキシンに含まれる結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメイン例えばＶＡＳＰに含まれるドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を開発するところにある。このスクリーニング方法は大量迅速処理スクリーニングに適したものでなければならず、また自動的に操作しても安全で、迅速で、極めて特異的で、かつ信頼性がなければならない。さらには、このスクリーニング方法では、好ましくはヒトの成分を用いる医薬のスクリーニングに適切な標的構成体が構築されなければならない。
【０００８】
本発明は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節し得る化合物を同定する方法に関し、この方法は以下のプロセス工程からなるものである：
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と試験すべき化合物の存在下に接触させ［ここで、「接触させる」とは、支持体をドメインでコーティングし、ブロックし／洗浄し、他のドメインを加え（試験物質と共にまたはなしで）、洗浄に至るまでインキュベーションし、および洗浄を包含するインキュベーションをする工程順序を特に意味するものと解すべきである］；
ｂ）ａ）による混合物を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質に特異的に結合する抗体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されているかまたは化学的に結合されている抗原を有する抗体と共に、インキュベーションするのに使用し；
ｃ）ｂ）による混合物を、混合物ｂ）からの抗体と特異的に結合することができ、かつ生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識を付けた抗体と共に、インキュベーションするのに使用し；
ｄ）ｃ）に従ってインキュベーションした後、ｃ）からの抗体上の標識を生化学的にまたは物理化学的に検出する。
【０００９】
相互作用の調節は、結合パートナーの結合をさらに強くするかまたはこの結合を弱める結果をもたらすことになる。結合パートナーの結合がさらに強くなるのは、例えば関与するドメインまたはタンパク質の親和性が相互に増大することから明らかである。親和性の増大は、関与する結合パートナーの親和定数の低減によって認められる。親和定数は生化学での標準的な方法を使用して測定することができる。このような方法は例えば以下のような文献に開示されている：「Pingoud, A., Urbanke, K., Arbeitsmethoden der Biochemie；1997；Gruyter Lehrbuch」または「Wilson, K., Goulding, K. H., Methoden der Biochemie；1991；Thieme flexible Taschenbucher」。このことは結合パートナーの結合が弱くなることにも同様に適用される。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質はＥＶＨ１結合ドメインを含有するタンパク質である。同様に、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質はＥＶＨ１ドメインを含有するタンパク質である。
【００１０】
好ましい実施態様では、上記の化合物同定方法は、固体からなる表面で実施される。従って、この方法は固相アッセイとも言われている。好ましい実施態様では、固体の表面を、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１結合ドメインで、またはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質でコーティングする。さらに好ましい実施態様では、固体の表面を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１ドメインで、またはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングする。このようにしてコーティングされた表面を次いで試験する相互作用について不活性な試薬またはタンパク質、例えばウシ血清アルブミンでコーティングする。次に、水性有機溶媒に溶解し得る検査すべき化合物をこのような方法でコーティングされた表面に適用する。固体は様々な材料例えばプラスチック、ガラスまたは金属で作られていてよい。好ましくは、固体は有機ポリマーからなる。さらに他の実施態様では、固体は有機溶媒、酸、塩基または水溶液に対して不溶であるかまたは耐性である化学物質で作られている。固体は様々な形状であってよい。例えば、好ましい変形では、このものはマイクロタイタープレートとして存在し、またＥｐｐｅｎｎｄｏｒｆ容器、ガラス管、フィルムまたはマイクロチップとして存在していてもよい。固体はただ一種の材料または成分からなっていてもよいし、多数の材料または成分からなっていてもよい。ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用するＥＶＨ１結合ドメインで、またはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質で、固体表面をコーティングするのは、固体に直接実施することができる。異なった材料からなる固体の場合、固体ベースとは別個に担体材料をコーティングし、この固体ベースにコーティングした後担体材料を適用し、次いで担体材料と固体ベースとを一緒にして固体を形成させることも可能である。表面のコーティングは最初ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質のみで実施してもよい。次に、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用は、第二の工程で、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質でコーティングされた表面にＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質を添加することによって確立される。さらにその他の実施態様では、表面を最初ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質のみでコーティングする。次に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用は、第二の工程で、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングされた表面にＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質を添加することによって、確立される。固体の表面をＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングするためには、固体の表面をこれらのドメインまたはタンパク質の一種と共にインキュベーションする。同様に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を確立するためには、一つのドメインまたはこのドメインを有するタンパク質をその他のドメインまたはこのその他のドメインを有するタンパク質と共にインキュベーションする。次に、相互作用しないドメインまたはこれらのドメインを有するタンパク質の過剰量を洗浄により除去する。インキュベーションとは、タンパク質および表面が、一定の温度で一定の緩衝液およびイオン濃度で一定時間の間互いに接触されることを意味する。このために、タンパク質は、化学添加物を含む緩衝化された水性媒体に溶解または懸濁されて存在する。
【００１１】
ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。原則的には、ＥＶＨ１結合ドメインを有するいずれのタンパク質も本発明の方法に使用することができる。ＥＶＨ１結合ドメインは、単離ドメインとしてまたはＥＶＨ１結合ペプチドとして、タンパク質のその他の成分から物理的に分離して使用することもできる。使用されるＥＶＨ１結合ドメインは例えばジキシンまたはジキシン誘導体に含まれているとおりのＥＶＨ１結合ドメインであってよい。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体である。原則的には、ＥＶＨ１ドメインを有するいずれのタンパク質も使用することができる。ＥＶＨ１ドメインは、単離ドメインとして、タンパク質のその他の成分から物理的に分離して存在することもできる。使用されるＥＶＨ１ドメインは例えばＶＡＳＰに含まれているとおりのＥＶＨ１ドメインであってよい。
【００１２】
ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種からの対応するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。所要のタンパク質は相当する脊椎動物の組織または細胞例えば血小板から単離することができるし、または宿主細胞または微生物例えば昆虫細胞または大腸菌細胞で遺伝子組換えによって調製し、そして精製することもできる。「Jarchau, T., Mund, T., Reinhard, M., U. Walter(1998), Purification and Assays of Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein. Methods in Enzymology, Vol. 298, 103-113」に詳述されている通り、組換えＶＡＳＰは例えば昆虫細胞からイムノアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製する。「Current Protocols in Molecular Biology, ed.：F. M. Ausubel, Wiley-Interscience (1987)」に詳述されている通り、ＶＡＳＰのＥＶＨ１ドメインまたはジキシンのＥＶＨ１結合ドメインは例えば大腸菌からグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として遺伝子組換えで精製する。
【００１３】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をジキシン誘導体として使用する。好ましい実施態様では、ジキシン誘導体は、そのＣ末端に融合されたジキシンのＮ−末端での最初の１４２個のアミノ酸を有するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質からなる。原則的には、使用されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼはいずれの種のアミノ酸配列であってよい。ヒト、マウス、ラットまたは日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）からの配列を使用するのが好ましい。このような配列は例えばＰ０８２６３（ヒト）、Ｐ２４４７２（マウス）、Ｐ０４９０４（ラット）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。ジキシンの最初の１４２個のＣ−末端アミノ酸に適当な融合パートナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに加えて、例えばヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質である。
【００１４】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節する化合物を同定する方法は、上記の通りドメインまたはタンパク質でコーティングし、かつマイクロタイタープレートの一部を形成している固体からなる表面を使用して実施する。
【００１５】
ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質の特異的検出のための本発明の方法を実施するためには、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用することができる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメイン、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されているかまたは化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有していなければならない。
【００１６】
好ましい実施態様では、ＶＡＳＰまたはジキシンに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を本発明の方法を実施するのに使用する。この抗体はハイブリドーマ細胞を使用して合成し、次いで濃縮し、精製することができる。ハイブリドーマ細胞の培養、ハイブリドーマ細胞を用いた抗体の産生、これらの抗体の精製および濃縮は、例えば、「Current Protocols in Immunology, ed.：J. E. Coligan, Wiley-Interscience (1991)」に記載されている通り、標準的な方法で実施される。この文献は抗原に対する結合特異性を測定する方法も教示している。本発明の方法の目的には、使用する抗原は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質例えばジキシンまたはジキシン誘導体であり、そしてＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質例えばＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されている抗原例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質または化学的に結合されている抗原であってよい。
【００１７】
さらに他の好ましい実施態様では、本発明の方法を実施するのに使用される抗体は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質例えばジキシンまたはジキシン誘導体、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質例えばＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合された抗原例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質または化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有するポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製、精製、試験および使用については、「Current Protocols in Immunology, ed.：J. E. Coligan, Wiley-Interscience (1991)」に詳述されている。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施態様では、使用するＶＡＳＰに対して結合特異性を有する抗体はモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５であり、そしてさらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体はｍＡＢ ＩＥ２７３である。
【００１９】
ＥＶＨ１結合ドメイン、ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、ＥＶＨ１ドメイン、ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、またはこれらのドメインまたはタンパク質と融合されている抗原または化学的に結合されている抗原に対して結合特異性を有する本発明の方法での抗体に特異的に結合する抗体は、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識を担持していてよい。生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は、例えば酵素、放射性同位元素または蛍光標識である。好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は、特にアルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼであり、またさらに好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は同位元素例えば放射性同位元素であり、またさらに好ましい実施態様では、生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識は蛍光標識特にランタニド錯体例えばユウロピウム錯体である。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の方法は上記の如く医薬を同定するのに使用することができる。このような医薬は、就中、心血管系疾患、炎症性疾患、血管の疾患または新生細胞および組織変化例えば癌などを治療するのに使用することができる。
【００２１】
本発明は、さらには、上記の通り本発明の方法で同定されたＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する化合物に關する。このような化合物は、好ましくはペプチド、特に配列ＦＰＰＰＰまたはＷＰＰＰＰを有するペプチド、またはそれらの化学的誘導体およびプロリンリッチな同族体である。このような化合物は例えば心血管系疾患、炎症性疾患、血管の疾患または新生細胞および組織変化例えば癌などを治療するための医薬となり得る。
【００２２】
好ましい実施態様では、本発明は、ＶＡＳＰに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５、およびモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５を産生し得るハイブリドーマ細胞に關する。さらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５を産生し得るハイブリドーマ細胞は菌株ＤＳＭ ＡＣＣ２４４４から由来するものである。さらに他の好ましい実施態様では、本発明は、ＶＡＳＰに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３、およびモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３を産生し得るハイブリドーマ細胞に關する。さらに他の好ましい実施態様では、モノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３を産生し得るハイブリドーマ細胞は菌株ＤＳＭ ＡＣＣ２４４５から由来するものである。
【００２３】
ハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４４およびハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４５はＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ ｆuｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ［Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇｎｉｓｍ ｓｔｒａｉｎｓ］に寄託されている。
【００２４】
さらには、本発明は、固体からなり、かつＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質で、またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質でコーティングされている表面に關する。
【００２５】
ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。さらに、ジキシン誘導体は好ましくはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの融合タンパク質、またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびマルトース結合タンパク質の融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびヘキサヒスチジンの融合タンパク質により形成される。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質またはヘキサヒスチジンの融合タンパク質である。
【００２６】
好ましい実施態様では、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と相互作用する。ＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質について、この相互作用を確立するには、ジキシンまたは、例えばジキシンまたはジキシンフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントおよびマルトース結合タンパク質の融合タンパク質としてのジキシン誘導体を使用するのが好ましい。ＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質については、ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰフラグメントおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質の融合タンパク質が好ましい。
【００２７】
使用されるＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種由来の相当するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。
【００２８】
さらに、本発明はＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質およびＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にジキシン、ジキシン誘導体またはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体でコーティングされた表面を含むマイクロタイタープレートに関する。マイクロタイタープレートは様々な数のウエルを有することができる。例えば、マイクロタイタープレートは３、６、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４、７６８、１５３６、３０７２またはそれ以上のウエルを有していてよい。好ましい実施態様では、マイクロタイタープレートは３８４のウエルを有し、特に好ましい実施態様では、７６８のウエル、正に特に好ましい実施態様では、１５３６のウエルを有している。また、記載された実施態様では、本発明の表面はその他の装置、容器またはデバイスの構成要素、例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ容器、様々な材料のチューブ、特にプラスチックまたはガラスのチューブの構成要素、チップ様デバイスおよびその他の装置、デバイスまたは容器の構成要素であってもよい。
【００２９】
さらに、本発明は、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間の相互作用を調節し得る化合物を同定する方法に関し、この方法は以下のプロセス工程からなるものである：
【００３０】
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と検査すべき化合物少なくとも一種の存在下で接触させ、ここで、それぞれの場合に、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との間でエネルギー伝達を可能とする蛍光染料を、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質および／またはＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質にカップリングさせ；
ｂ）ａ）に従ってインキュベーションした後分光測定する。
【００３１】
この方法では、使用する蛍光染料は好ましくはＡＰＣ、Ｃｙ５またはランタニド錯体、ここでは特にユウロピウム錯体である。
この方法では、使用するＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質は好ましくはＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体である。使用するＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質は好ましくはジキシンまたはジキシン誘導体である。さらに他の好ましい実施態様では、使用するジキシン誘導体はジキシンまたはジキシンフラグメントとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質またはジキシンまたはジキシンフラグメントとマルトース結合タンパク質との融合タンパク質である。
【００３２】
ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体とＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体との相互作用は、ある種の蛍光染料をＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングさせたときに、分光法で測定できる。蛍光染料がカップリングしているタンパク質の複合体形成によって、染料が相互に十分に接近した空間的近接位置におかれた場合に、これらの蛍光染料によるエネルギー伝達が可能となる。使用する蛍光染料は、エネルギー供与体およびエネルギー受容体として相互に補完し合う化合物であってよい。特定の波長の電磁波放射を使用すると、エネルギー供与体が励起される。励起エネルギーは、エネルギー供与体と接近した近接位置に存在しているときは、エネルギー受容体に無放射で伝達できる。特定の波長の電磁波放射を放出すると、エネルギー受容体は基底状態にもどる。このエネルギー放出はエネルギー供与体の励起波長とは異なった波長で生じる。エネルギー供与体およびエネルギー受容体を適切に選択すると、エネルギー伝達が、電磁波放射の分光法で検出可能な波長、好ましくは可視光線の範囲内で生じる。エネルギー供与体およびエネルギー受容体がＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングすると、これらのタンパク質またはタンパク質誘導体の相互反応を分光法の手段によって直接検出することができる。ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質と、ＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節する試験すべき化合物は、相互作用するタンパク質と接触すると直ちにエネルギー伝達での分光法で検出し得る変化によりそれ自体の本性を示す。使用するエネルギー供与体は、ある種の蛍光染料例えばランタニド錯体、特にユウロピウム錯体であってよい。使用するエネルギー受容体はある種の蛍光染料例えばＡＰＣまたはＣｙ５でよい。各々のエネルギー供与体またはエネルギー受容体を、ＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質、特にＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体と、またＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質、特にジキシンまたはジキシン誘導体とカップリングさせることができる。本発明の方法を実施する場合、相互作用するドメインまたは異なったドメインを含有する相互作用するタンパク質は、それぞれの場合、補完し合うエネルギー供与体またはエネルギー受容体が提供される事実に留意すべきである。相互作用を分光法で測定するためには、エネルギー供与体およびエネルギー受容体は、相互作用を調節する分子錯体中に同時に存在していなければならない。エネルギー供与体またはエネルギー受容体のカップリングは各々の場合共有結合を介して直接に生成されるか、または抗体またはビオチン−ストレプトアビジンを介して間接的に生成される。これらの抗体は市販されている。
【００３３】
ＶＡＳＰまたはＶＡＳＰ誘導体、ジキシンまたはジキシン誘導体は原則的にはいずれの種からの対応するタンパク質またはその一部であってよい。例えばマウスのような脊椎動物のＶＡＳＰおよびジキシンまたはその一部を使用するのが好ましく、ヒトのものが特に好ましい。ＶＡＳＰのアミノ酸配列はＰ５０５５２（ヒト）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに、またＸ９８４７５.１（マウス）でＥＭＢＬに開示されている。ジキシンのアミノ酸配列はＱ１５９４２（ヒト）またＱ６２５２３（マウス）でＳｗｉｓｓｐｒｏｔに開示されている。
【００３４】
本発明はＥＶＨ１結合ドメインまたはＥＶＨ１結合ドメインを有するタンパク質とＥＶＨ１ドメインまたはＥＶＨ１ドメインを有するタンパク質との相互作用を調節するための医薬製剤を製造する方法に關し、この方法では本発明の方法の一または二以上を使用して化合物を同定し、そしてこの化合物を医薬賦形剤および／または医薬担体と混合し、次に適宜医薬投与形態とする。
【実施例】
実施例１：固相アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）を使用するＶＡＳＰとジキシンまたはジキシン誘導体との相互作用の測定
固相アッセイにおいて、結合パートナー（ＶＡＳＰまたはジキシン）をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の表面に固定化する（＝コーティング）。プラスチック表面の不飽和結合部位をブロックし、次いで表面をそれぞれの他の結合パートナーと共にインキュベーションする。インキュベーション後に、過剰の未付着タンパク質を洗浄工程で除去する。適当な抗体を使用すると、特異的に結合したタンパク質を検出し、定量化することがここに可能となる。ここでは、抗体に対する蛍光標識としてランタニドキレートを用い、そして時間分解蛍光測定法を使用することによりシグナル−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比をかなり改善することが可能である。
【００３５】
固相アッセイについては、まず、最善のコーティングおよびインキュベーション条件の特徴を定めた。ジキシン成分（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)またはジキシン(１−１４２)）が、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）をコーティングするのに非常に適していることがわかった。固定化したジキシンに特異的に結合したＶＡＳＰを検出するためには、マウスＩｇＧｓに対するランタニド標識抗体を使用してそれらの部分について検出できるＶＡＳＰに対するモノクローナル抗体を使用することができる（Ｗａｌｌａｃ：ＤＥＬＦＩＡ抗マウス−Ｅｕ(Ｎ１)）。
【００３６】
現行のアッセイプロトコールはインキュベーション工程五工程および洗浄工程三工程からなる：
１．空のＭＴＰをＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)（コーティング）と共にインキュベーションする
２．ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロックする
３．ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄する
４．ＶＡＳＰ（リガンド）と共に（試験物質と共にまたはなしで）インキュベーションする
５．ＰＢＳで洗浄する
６．検出ミックス：α−ＶＡＳＰ（モノクローナル抗ＶＡＳＰ抗体）＋α−マウス−Ｅｕ（＝Ｗａｌｌａｃからのユウロピウム標識抗マウス抗体）と共にインキュベーションする
７．ＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で洗浄する
８．結合ランタニド錯体を遊離させ、蛍光定量測定する。
【００３７】
試薬／タンパク質が選択されると、昆虫細胞（バキュロＶＡＳＰ）から得られた完全アミノ酸配列を有する組換えヒトＶＡＳＰタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、そこから得られたＶＡＳＰまたはＶＡＳＰドメインよりも、顕著に一層優れたシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を有することがわかった。
【００３８】
実施例２：ＶＡＳＰ−ジキシン固相（ＤＥＬＦＩＡ）アッセイの特性
コーティング（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)）およびリガンドインキュベーション（ＶＡＳＰ）の最適条件を試薬の滴定により定めた。ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）によるＭＴＰの飽和コーティングは５μｇ／ｍｌのコーティング溶液濃度で達成される（図１ａ）。使用する容量／ウエルは選択されたＭＴＰ形式（９６ウエルプレートに対して５０μｌまたは１００μｌ、３８４ウエルプレートに対して２０μｌ）に左右される。使用するリガンドがＶＡＳＰである場合のインキュベーションについては、５μｌ／ｍｌの濃度が同様に最善のＳ／Ｎ比を有する数値であることがわかった（図１ｂ）。
【００３９】
実施例３：検出
アッセイをさらに最適化する過程で、モノクローナル抗体の選択が結合ＶＡＳＰの検出にとって非常に重要であることがわかった。抗ＶＡＳＰ抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５と比較して、抗体ＩＥ２７３を使用した場合は、マグニチュード約１オーダでの一層よいＳ／Ｎ比が得られた。ＩＥ２７３抗体の使用量を最適化すると、この量は先に使用したＶＡＳＰの量に左右されることがわかった。最適Ｓ／Ｎ比はＩＥ２７３対ＶＡＳＰ１：１６のモル比（質量比１：４）であることがわかった。ＶＡＳＰ５μｇ／ｍｌの濃度でのインキュベーションについて、検出をＩＥ２７３の１.２５μｇ／ｍｌを使用して実施すると、最良のシグナルが結果として得られた。このことはまた洗浄工程の最適化または減少に関連して重要なことである。それは、ＶＡＳＰとのインキュベーションと検出との間の洗浄工程が重要であり、省略してはならないことがわかったからである。
【００４０】
実施例４：ペプチド作用性阻害剤による競合実験
これまでは、ＶＡＳＰ／ジキシン相互作用の非ペプチド作用性阻害剤は知られていない。可能性のある阻害剤の作用を刺激するために、ジキシンのＶＡＳＰ結合モチーフ(ｍｏｔｉｖｅ)（ＦＰＰＰＰ）を含んだ競合ペプチドを使用して阻害試験を実施した。初期の研究（Ｎｉｅｂｕｈｒ ｅｔ ａｌ.（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６，５４３３）では，このモチーフでの突然変異およびＶＡＳＰ／ＡｃｔＡ相互作用（同様にＡｃｔＡでのＦＰＰＰＰモチーフに対するＶＡＳＰの結合に基づく）の阻害に対するそれらの効果が検討されていた。野生型配列ＦＰＰＰＰと比較して、ＡＰＰＰＰモチーフを有するペプチドはかなり劣る阻害を示したのに対して、ＷＰＰＰＰモチーフを有するペプチドは野生型モチーフよりもさらに良い阻害を示すことがわかった（阻害：ＷＰＰＰＰ＞ＦＰＰＰＰ＞ＡＰＰＰＰ）。相当する突然変異を有するジキシンペプチドを使用してＶＡＳＰ／ジキシン相互作用と競合させた。ペプチドの見掛けの阻害定数については、ＶＡＳＰ／ＡｃｔＡ相互作用についての順列と同じ順列がみられた（図２）：ＷＰＰＰＰ＞ＦＰＰＰＰ＞ＡＰＰＰＰ。
【００４１】
このことから、競合物質の使用そしてまたおそらくは異なったタイプの阻害剤の使用により、記載したアッセイによって検出し得るＶＡＳＰ／ジキシン相互作用に影響を及ぼし得ることを示している。
【００４２】
実施例５：溶剤耐性
このアッセイがＨＴＳに使用しうることを確実にするために、このアッセイは物質ライブラリーの標準溶剤に対して十分耐性でなければならない。一般には、これらの標準溶剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメタノールである。これらの二種の溶剤に対するアッセイの耐性を試験するために、メタノールおよびＤＭＳＯの濃度を増加させてインキュベーション（一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での）を実施した。２５％の濃度まで、メタノールは実際のところアッセイに対して効果がなく（図３ａ）、これに対してＤＭＳＯ２５％ではシグナルはほぼ半分に減少した（図３ｂ）ことがわかった。しかしながら、通常スクリーニングに使用されている１〜５％のＤＭＳＯ濃度では、シグナルの減少は僅か１５％までであり、これはＨＴＳアッセイに許容し得るものである。
【００４３】
実施例６：小型化
上記の方法で、アッセイを最初９６ウエルプレートで実施した。ここで、アッセイ容量を１００μｌ／ウエルから５０μｌ／ウエルに低減することができた。ＨＴＳで使用するためにアッセイをさらに小型化するのに、アッセイを３８４ウエルプレートに適合させた。このために、異なった表面および色を有する様々な製造業者の３８４ウエルプレートを試験した。試験したプレートのうち、Ｇｒｅｉｎｅｒからの３８４ウエルプレートについて最も良い数値が見られた。ここで、黒色のプレートのバックグラウンドが特に低くても、白色および黒色のプレートは極めて類似した様式で作動する。試験した表面（低度の結合、未処理、高度の結合）のうち、未処理表面で最も良い結果が得られた。
【００４４】
３８４ウエルプレートを使用することにより、アッセイ容量をさらに２０μｌ／ウエルに減少させることができた。幸いにも、小型化の追加の効果として、Ｓ／Ｎ比が約１００にさらに改善された。
【００４５】
実施例７：チャート：アッセイプロトコール（３８４ウエルプレートについて）
【表１】
実施例８：蛍光標識したＶＡＳＰおよびジキシンまたはジキシン誘導体のエネルギー伝達を使用する均一なアッセイ：
均一なアッセイのために、昆虫細胞から単離した、完全なアミノ酸配列を有するヒトのＶＡＳＰ（ＳＦ２１）を使用し、特異的抗体を介して間接的に蛍光標識を付けた。使用した結合パートナーは、初めは、結合されたビオチンを介して、エネルギー伝達のために他の発蛍光団に同様に結合し得るＶＡＳＰ結合モチーフＦＰＰＰＰを有するペプチドであった（ストレプトアビジンーＡＰＣ）。しかしながら、次の実験では、使用したＶＡＳＰ結合パートナーは、ペプチドに代わって、これらのＦＰＰＰＰモチーフを数個含有しているジキシンのＮ−末端とのＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ジキシン(１−１４２)）であった。この目的には、ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）を大腸菌で発現し、精製しそしてビオチンで共有結合修飾した。それで、蛍光標識した結合パートナー間のエネルギーの伝達を測定することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 ＧＳＴ−ジキシン（１−１４２）によるＭＴＰのコーティング：飽和は５μｇ／ｍｌのコーティング溶液濃度で達成される。
【図１ｂ】 ＶＡＳＰによるＭＴＰのコーティング：使用するリガンドがＶＡＳＰである場合のインキュベーションについては、５μｇ／ｍｌの濃度が最も良いＳ／Ｎ比を生じることがわかった。
【図２】 ＡＰＰＰＰ、ＦＰＰＰＰまたはＷＰＰＰＰモチーフを含有するペプチドを競合させることによるＶＡＳＰ／ジキシン相互作用の抑制。
【図３ａ】 メタノール耐性の測定：一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での増加メタノール濃度によるインキュベーション；２５％の濃度まで、メタノールは実質的にはアッセイに効果を有していない。
【図３ｂ】 ＤＭＳＯ耐性の測定：一定のコーティングおよび一定のリガンド濃度（ＶＡＳＰ）での増加ＤＭＳＯ濃度によるインキュベーション；ＤＭＳＯは２５％でシグナルをほぼ半分までに低減させる。
Claims (14)
- ヒトジキシンまたはその誘導体のＥＶＨ１結合ドメインとヒトＶＡＳＰまたはその誘導体のＥＶＨ１ドメインとの間の相互作用を調節する化合物であって、心血管系疾患、炎症性疾患または血管の疾患の治療に用いられる化合物を同定する方法において、以下のプロセス工程：
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質、および、ＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰを試験すべき化合物とを接触させ；
ｂ）ａ）による混合物を、ＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰに特異的に結合する抗体と共に、インキュベーションに使用し、ここで該抗体はハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４４により産生されるモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２４５、またはハイブリドーマ細胞ＤＳＭ ＡＣＣ２４４５により産生されるモノクローナル抗体ｍＡＢ ＩＥ２７３であり；
ｃ）ｂ）による混合物を、混合物ｂ）からの抗体と特異的に結合することができ、かつ生化学的にまたは物理化学的に検出し得る標識を付けた抗体と共に、インキュベーションに使用し；
ｄ）ｃ）に従ってインキュベーションした後、ｃ）からの抗体上の標識を生化学的にまたは物理化学的に検出する
ことからなる、上記方法。 - プロセス工程ａ）による化合物との接触が、固体からなり、そしてＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質でコーティングされている表面で生じ、ここでこのＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質はＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰと相互作用する、請求項１記載の方法。
- 固体からなる表面がマイクロタイタープレートの一部を形成している請求項２記載の方法。
- 生化学的にまたは物理化学的に検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光染料または酵素である抗体をプロセス工程ｃ）によるインキュベーションに使用する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 酵素がアルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼである抗体を使用する請求項４記載の方法。
- 蛍光染料がランタニド錯体である抗体を使用する請求項４記載の方法。
- 使用するランタニド錯体がユウロピウム錯体である請求項６記載の方法。
- 医薬を同定するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 化合物が、配列ＷＰＰＰＰを有するペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって同定可能な化合物。
- ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質でコーティングされている表面を有する固体。
- ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質がＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰと相互作用する請求項１０に記載の固体。
- マイクロタイタープレートである請求項１０または１１に記載の固体。
- ヒトジキシンまたはその誘導体のＥＶＨ１結合ドメインとヒトＶＡＳＰまたはその誘導体のＥＶＨ１ドメインとの間の相互作用を調節し得る化合物を同定する方法において、以下のプロセス工程：
ａ）ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質をＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰと試験すべき化合物少なくとも一種の存在下で接触させ、ここで、それぞれの場合に、ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質とＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰとの間でエネルギー伝達を可能とする蛍光染料を、ＥＶＨ１結合ドメインを含むヒトジキシン（１−１４２）またはヒトジキシン（１−１４２）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質および／またはＥＶＨ１ドメインを含むヒトＶＡＳＰに結合させ；
ｂ）ａ）に従ってインキュベーションした後に分光測定する
ことからなる上記方法。 - 使用する蛍光染料がＡＰＣ、Ｃｙ５またはランタニド錯体、特にユウロピウム錯体である請求項１３記載の方法。
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