FI100276B - Menetelmä analyyttien ei-kilpailevaa määritystä varten - Google Patents

Description

100276

MENETELMÄ ANALYYTTIEN EI-KILPAILEVAA MÄÄRITYSTÄ VARTEN

Tämä keksintö koskee menetelmää analyyttien ei-kilpailevaa määritystä varten.

KEKSINNÖN TAUSTA

Julkaisut ja muu materiaali, joita on käytetty valottamaan 5 keksinnön taustaa, ja erityisesti käytännön yksityiskohtia antavat tapaukset, on sisällytetty viittauksina.

Biospesifisten sitojien käyttö analyyttien määrittämiseksi moniaineksisista näytteistä on tullut laajaan käyttöön in vitro -diagnostiikassa. Nykyisin useimmat näistä määrityk-10 sistä käyttävät vasta-aineita - joko polyklonaalisia tai monoklonaalisia - biospesifisenä sitojana. Vasta-aineita käyttäviä määrityksiä kutsutaan usein immunomäärityksiksi. Immunomääritykset jaetaan usein ei-kilpaileviin ja kilpaileviin, joista ei-kilpailevat käyttävät reagenssien ylimää-15 rää ja kahta biospesifistä sitojaa, jotka sitoutuvat samaan analyyttiin (tämän tyyppistä määritystä kutsutaan yleisesti kaksikerrosmääritykseksi, engl. sandwich assay). Kilpailevat määritykset toisaalta perustuvat leimatun markkerin vapaan ja sitoutuneen muodon suhteen mittaamiseen, joka . 20 suhde muuttuu näytteessä olevan analyytin vaikutuksesta.

• · • « « • 1 · • · « ·

Tavallisessa ei-kilpailevassa immunomäärityksessä näyte, • · « . .·. joka sisältää määritettävän antigeenin, inkuboidaan kiinto- « i « kantajaan immobilisoidun sieppaaja-vasta-aineen kanssa, « < » jota on ylimäärä. Lisätään ylimäärä leimattua vasta-ainet-25 ta, joka on spesifinen toiselle epitoopille samassa-anti- • · · *·**’ geenissä. Muodostuu kaksikerrosrakenne (engl. sandwich), jonka koostumus on sieppaaja-vasta-aine - antigeeni -leimattu vasta-aine. Inkubaation loputtua sitoutumaton ", leimattu vasta-aine poistetaan ja kaksikerrosrakenteessa 30 olevan leiman signaali mitataan. Signaali on suoraan ver- ‘ rannollinen antigeenin pitoisuuteen näytteessä.

* ♦ · 2 100276

Yllämainittu ei-kilpaileva menetelmä ei kuitenkaan ole helposti sovellettavissa pienimolekyylisten analyyttien määrittämiseen. Pienimolekyyliset analyytit ovat liian pieniä sitoutuakseen samanaikaisesti kahteen vasta-ainee-5 seen. Näiden analyyttien immunomääritys suoritetaan siksi normaalisti kilpailevalla määrityksellä. Tyypillisessä kilpailevan immunomäärityksen kokoonpanossa näyte, joka sisältää määritettävän analyytin sekä leimattu analyytin johdannainen lisätään immobilisoituun vasta-aineeseen, joka 10 on spesifinen sanotulle analyytille. Leimaamaton ja leimattu analyytti kilpailevat vasta-aineessa olevista sitoutumiskohdista. Inkubaation loputtua sitoutumattomat analyytit poistetaan ja sitoutuneen leimatun analyytin signaali detektoidaan. Kasvava pitoisuus analyyttiä näytteen joukos-15 sa johtaa siis vähentyneeseen signaaliin. Kun signaalin voimakkuus kuvataan kasvavan analyyttikonsentraation funktiona, saadaan sigmoidinen, laskeva käyrä. Tämän kilpailevan määrityksen herkkyys ei ole yhtä korkea kuin ei-kilpai-levien määritysten, koska signaali on korkeimmalla tasol-20 laan nolla-annoksella. Kuten Ekins ja muut [1,2] ovat osoittaneet, herkkyys voidaan määritellä pienimmäksi annokseksi joka on on erotettavissa nolla-annoksesta. Tavallinen kriteeri tälle eroteltavuudelle on se, että annoksen signaali eroaa nolla-annoksen signaalista yli kaksi keskivir-25 hettä (SD). Kilpailevassa määrityksessä on detektoitava : .· pieni ero kahden suuren signaalin välillä, kun taas ei- • · •J · kilpailevassa määrityksessä täytyy detektoida pieni ero :***: kahden pienen signaalin välillä. Koska alhaisten signaalien • · · : ;*: SDtllä on taipumus olla pienempi kuin korkeiden signaalien • · · 30 SDsllä, ei-kilpaileva määritys pystyy detektoimaan pienem-män signaalieron kuin kilpaileva määritys. Olettaen, että . alhaisten annosten alueella kummankin määrityksen annos- • · · • · · ’** vastekäyrien kulmakertoimilla on sama itseisarvo, ei-kil- \ paileva määritys on herkempi, koska sen kyky detektoida 35 pienemmät erot signaalissa on suorassa suhteessa sen kykyyn detektoida pienemmät erot myös annoksessa.

! . Olemme äskettäin keksineet uuden ei-kilpailevan menetelmän 3 100276 pienimolekyylisten analyyttien, kuten hapteenien, määrittämiseen. Päinvastoin kuin ylläkuvattu tavallisesti käytetty kilpaileva määritys, tämä uusi menetelmä antaa lineaarisen, nousevan käyrän kun signaalin voimakkuus kuvataan kasvavan 5 analyyttikonsentraation funktiona. Tämä uuden menetelmän avainpiirre tekee sen kilpailevaa määritystä herkemmäksi.

YHTEENVETO

Keksinnön kohteena on menetelmä spesifisen sitojan omaavien analyyttien määrittämiseen. Tunnusomaista on, että 10 a) analyyttiä sisältävä näyte tuodaan kosketukseen sitojan kanssa, joka sitoja on spesifinen sanotulle analyytille, b) lisätään salpaaja, joka kykenee inaktivoimaan sanotun sitojan vapaana olevat sitomiskohdat, mutta joka ei kykene inaktivoimaan sanotun sitojan varattuna olevia sitomiskoh- 15 tia, ja poistetaan ylimääräinen salpaaja liuoksesta, c) irrotetaan sitoutunut analyytti sanotusta sitojasta, d) lisätään leimattu markkeri joka kykenee täyttämään sitomispaikat, joista analyytti on irronnut, mutta joka ei kykene täyttämään sitomispaikkoja, jotka salpaaja on inak- 20 tivoinut, missä vaihe d voidaan suorittaa peräkkäin tai samanaikaisesti vaiheen c kanssa, sekä, ·;· e) mitataan signaali leimatusta markkerista, joka on sitou tunut sitojaan.

• · · • ♦ ·

]···* LYHYT KUVAUS PIIRROKSISTA

• · # ♦ · « • · · ’.Y. 25 Kuva IA esittää signaalin voimakkuuden suhteessa 17β-θ3^3- diolin pitoisuuteen välillä 0-0.5 nM, mitattuna tämän keksinnön mukaisella menetelmällä.

• · • · • ·· • « · * Kuva IB esittää signaalin voimakkuuden suhteessa 17β-θ3^3- : diolin pitoisuuteen välillä 0-2 nM, mitattuna tämän 30 keksinnön mukaisella menetelmällä.

‘ Kummassakin kuvassa umpinaiset neliöt edustavat 10 minuutin ·. .· korvautumisaikaa ja avoimet neliöt edustavat 5 minuutin 4 100276 korvautumisaikaa.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Tämän keksinnön asiayhteydessä termi “analyytti" tarkoittaa mitä tahansa molekyyliä, jolle on olemassa spesifinen 5 sitoja. Tämä keksintö on erittäin sovelias pienten analyyt-tien määrittämiseen (molekyylipaino on alle 5000 Daltonia). Sellaiset analyytit ovat yleisiä eräissä ryhmissä kuten steroidit, vitamiinit, prostaglandiinit, astmalääkkeet, rytmihäiriöiden lääkkeet, antineoplastiset lääkkeet, pa-10 hoinvointilääkkeet, antibiootit, niveltulehduslääkkeet, masennuslääkkeet, päihteet kuten kokaiini, morfiini, heroiini, amfetamiini, metafetamiini, kannabinoidit ja sellaiset, ja ympäristöä saastuttavat aineet ja myrkyt.

“Spesifinen sitoja”, tai lyhyemmin, “sitoja”, määritellään 15 entiteetiksi, jolla on riittävä affiniteetti ja spesifi-teetti analyyttiä kohtaan. Tyypilliset sitojat ovat makromolekyylejä, kuten proteiineja tai nukleiinihappoja.

Proteiineja, jotka ovat erityisen sopivia sitojiksi, ovat vasta-aineet ja reseptorit. Vasta-aineita voidaan tuottaa 20 eläimissä [3] tai niitä voidaan valikoida rekombinanttikir- jastoista [4]. Tärkeille analyyteille spesifisiä vasta- : V aineita on kaupallisesti saatavana eri lähteistä. Resepto- • · ·.· * reita on luonnostaan ihmisessä ja muissa organismeissa, ja niitä voidaan eristää näistä lähteistä. Vaihtoehtoisesti : :*· 25 reseptoria koodittavat geenit voidaan kloonata yhdistelmä- • ·· DNA-teknologialla [5], siirtää sopivaan isäntäorganismiin ja ilmentää siellä kiinostuksen kohteena olevan reseptorin # #.# tuottamiseksi [5,6]. Muita luonnossa esiintyviä proteiine- • · · **' ja, jotka voivat olla sopivia sitojia, ovat erilaiset 30 kantaja- ja kuljettajaproteiinit, esim. sex hormone binding globulin (SHBG) . Jos sopivaa sitojaa ei löydy luonnossa esiintyvien proteiinien joukossa, sellainen voidaan luoda Λ proteiinimuokkauksella, joko de novo tai käyttäen olemassa- . olevaa proteiinia lähtömateriaalina. Sellainen prote- 5 100276 iinirauokkaus voisi sisältää joko geenimuokkausta tai proteiinin kemiallista modifiointia tai molempia.

Termi “salpaaja” tarkoittaa mitä tahansa ainetta joka estää vapaata sitojaa sitomasta leimattua markkeria, mutta joka 5 ei estä varattua sitojaa luovuttamasta sitomaansa analyyt-tiä ja sen jälkeen sitomasta leimattua markkeria.

Mieluusti salpaaja on molekyyli, jolla on sama tai samanlainen epitooppi kuin määritettävällä analyytillä, johtaen salpaajan ja analyytin toisensa poissulkevaan sitoutumiseen 10 sitojaan. Salpaaja on siten mieluusti, mutta ei välttämättä, analyytin johdannainen.

Salpaaja voi myös olla vasta-aine joka sitoutuu sitojaan vain silloin kun analyytti ei ole sitoutunut sitojaan, ja joka vasta-aine, ollessaan sitoutuneena sitojaan, estää 15 leimatun markkerin sitoutumasta sitojaan.

Salpaaja voi myös olla nukleiinihappo (DNA tai RNA) joka sitoutuu sitojaan vain silloin kun analyytti ei ole sitoutunut sitojaan, ja joka nukleiinihappo, ollessaan sitoutuneena sitojaan, estää leimatun markkerin sitoutumasta , 20 sitojaan.

« < 4 • Edelleen, salpaaja voi myös olla aine joka modifioi vapaan • · *.: · sitojan sellaisella tavalla että se (vapaa sitoja) ei enää • · · ί,.,ϊ kykene sitomaan leimattua markkeria, mutta joka aine ei : modifioi varattua sitojaa sellaisella tavalla, että se 25 (varattu sitoja) ei kykenisi luovuttamaan sitomaansa ana- lyyttiä ja sen jälkeen sitomaan leimattua markkeria. Modi- . fioiva aine voi olla kemiallinen yhdiste tai entsyymi.

* · · ··· • * I » « «

Salpaaja joka on kemiallinen yhdiste voi modifioida sitojan reagoimalla sitojassa olevan spesifisen tähteen kanssa.

: : 30 Sellaisia reaktioita ovat esimerkiksi vapaan kysteiinitäh- teen alkylointi maleimidijohdoksella tai jodoetikkahappo- .'t ; johdoksella, tyrosiinitähteen nitraatio tetranitrometaanil- » 6 100276 la, tryptofaanitähteen brominaatio N-bromosukkinimidilla tai tryptofaanitähteen jodiointi jodilla. Nämä esimerkit kemiallisesta modifioinnista ovat hyvin tunnettuja alan asiantuntijoille, ja niitä on laajasti kuvattu alan kirjal-5 lisuudessa. Yleinen, mutta ei tyhjentävä kuvaus näistä tekniikoista on esitetty viitteessä [7]. Edelleen, kemiallinen yhdiste voi olla analyytin reaktiivinen johdannainen, kuten aryylijohdannainen [7], joka sitoutuu sitojaan ensin biospesifisen tunnistuksen avulla ja myöhemmin muodostaa 10 kovalenttisen sidoksen reaktiivisen ryhmänsä avulla. Jos reaktiivinen ryhmä on aryyliatsidi, kovalenttisen sidoksen muodostumista voidaan säädellä fotoaktivaatiolla ultraviolettivalon tai näkyvän valon avulla [8].

Salpaaja joka on entsyymi voi modifioida sitojan esimerkik-15 si digestoimalla, lisäämällä fosfaatin, poistamalla fosfaatin, glykosyloimalla tai deglykosyloimalla. Entsyymit jotka digestoivat sitojaa voivat olla esimerkiksi proteaaseja, kuten trypsiini, pepsiini, papaiini, faktori Xa, V8 tai enterokinaasi. Edelleen, entsyymit, jotka sigestoivat 20 sitojaa voivat myös olla nukleaaseja, jos sitoja tai sen osa on nukleiinihappo (DNA tai RNA). Sellaisia nukleaaseja ovat esimerkiksi tyypin II restriktioendonukleaasit, ek-sonukleaasi III, DNAasi I, ja RNAasit. Entsyymeitä, jotka lisäävät fosfaatin, ovat esimerkiksi kinaasit, kuten ty-i .· 25 rosiinikinaasi tai seriinikinaasi. Entsyymeitä, jotka !J · poistavat fosfaatin, ovat esimerkiksi fosfataasit, kuten LAR-proteiinityrosiinifosfataasi . Entsyymeitä, jotka lisää- : ;*· vät tai poistavat glykosyyliryhmän ovat esimerkiksi gly- * · · j*;·. kosylaasit tai glykosidaasit.

30 Jos salpaaja on molekyyli, joka sitoutuu ei-kovalenttisesti • · m ?** sitojaan, sen dissosiaationopeuden sitojasta on oltava pienempi kuin analyytin (vähintään viisi kertaa niin pieni, mieluusti enemmän kuin sata kertaa niin pieni, mieluiten enemmän kuin tuhat kertaa niin pieni).

! . 35 Jos salpaaja on kemiallinen yhdiste tai entsyymi, sen 7 100276 täytyy kyetä modifioimaan useimmat vapaat sitojat (vähintään 90%, mieluusti enemmän kuin 95%, tyypillisesti enemmän kuin 99%, mieluiten enemmän kuin 99.8%).

Termi “inaktivoida” tarkoittaa mitä tahansa edellälueteltua 5 mekanismia, jolla salpaaja estää vapaan sitojan sitomasta leimattua markkeria.

“Markkeri” on molekyyli joka kykenee sitoutumaan sitojaan vain silloin kun sitoja ei ole analyytin varaama eikä se (sitoja) ole salpaajan inaktivoima. Mieluusti, mutta ei 10 välttämättä, markkeri ja analyytti sitoutuvat toisensa poissulkien samaan sitoutumiskohtaan sitojassa. Markkeri leimataan joko ennen korvautumisreaktiota tai se leimataan korvautumisreaktion jälkeen. Leima voi olla radioisotooppi, entsyymi tai fluoresoiva, fosforoiva tai luminisoiva mole-15 kyyli.

Suositeltavat suoritusmuodot

Keksinnön mukaisen suositeltavan suoritusmuodon päävaiheet on kuvattu kaaviossa 1.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on erityisen sopiva 20 mittaamaan 170-estradiolia. Eräässä sellaisessa sovellutuk-i V sessa analyyttinä on 173-estradioli, sitojana on esimerkik- 4 ·,· · si monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen 17β- • * s ϊ : estradiolille, salpaajana on esimerkiksi 17β-β3^30χο1ΐ-6- i karboksimetyylioksiimi ja leimattuna markkerina on esimer- .‘i‘. 25 kiksi europium-leimattu 17β-estradioli-6-karboksimetyyliok- siimi.

• • at • · a

Vaikka allaolevissa esimerkeissä on käytetty kiintokanta-jaan sidottua vasta-ainetta, tämä keksintö ei rajoitu sen ,1’ kaltaiseen suoritusmuotoon. Yhtä hyvin voidaan suunnitella : 30 suoritusmuotoja, joissa analyytin ja sitojan inkubaatio tapahtuu liuoksessa.

8 100276

Keksintöä valottavat seuraavat esimerkit.

Esimerkki 1

Europium-leimatun 17p-estradioli-6-karboksimetyylioksiimin valmistus.

5 Yhdisteen 4-[ 2-( 4-aminof enyyli )etynyyli ]-2,6-bis{ [N,iibis (karboksimetyyli)-amino]metyyli}pyridiini europium-kelaatti saatiin lahjoituksena H. Mikolalta Wallac Oy:stä, Turku, Suomi. Se on syntetoitu Takalon ja muiden menetelmällä [9,10]. 6-oksoetradioli-6[0-(6-aminoheksyyli)oksiimi] 10 (lyhennettynä 6-AHO) saatiin lahjana H. Mikolalta Wallac Oy:stä. Se valmistettiin Mikolan ja Hännisen menetelmällä [11] . Europium-leimattu estradioli saatiin lahjana H. Mikolalta Wallac Oy:stä. Se syntetoitiin lähtöaineista 6-AHO ja yhdisteen 4-[2-(4-aminofenyyli)etynyyli]-2,6-bis- 15 {[N,N-bis(karboksimetyyli)-amino]metyyli>pyridiini euro- pium-kelaatti, käyttäen vesiliuokoista karbodiimidiä kon-desointiaineena puskuri-dioksaani-liuoksessa ja puhdistettiin geelifiltraatiopylväällä käyttäen Mikolan ja Miettisen [12] sekä Mikolan ja muiden [13] menetelmiä.

20 Esimerkki 2 . .·. Af f initeettivakion (Ka) määritys erilaisista monoklonaa- • · · *···] leista vasta-aineista europium-leimatulle 173-estradioli-6- • · karboksimetyylioksiimille.

• · « * · · «M • · · *·" ’ Kolme kaupallisesti saatavaa monoklonaalista vasta-ainetta 25 testattiin. Nämä kaikki vasta-aineet oli tuotettu 17β- estradiolin 6-aseman johdannaisia vastaan. Käytetyt mono- • « · · klonaalit vasta-aineet olivat 069-A5406A (BiosPacifie,

Kalifornia), 10-E15 (Fitzgerald Industries International Inc., Massachusetts) sekä 2F9 (InterPharm Laboratories 30 Ltd., Israel) ja ne oli tuotettu seuraavia immunogeeneja V vastaan: 9 100276

Vasta-aine_Iimnunogeeni (Valmistajan mukaan) 069-A5406A Estradioli-6-Naudan seerumin albu miini 10-E15 Estradioli-6-karboksimetyylioksii- 5 mi-kantaja 2F9 Estradioli-6-karboksimetyylioksii- mi-Naudan seerumin albumiini

Monoklonaalien vasta-aineiden 069-A5406A, 10-E15 sekä 2F9 10 affiniteettivakiot europium-leimatulle 17β-estradioli-6-karboksimetyylioksiimille määritettiin seuraavasti:

Kaikki inkubaatiot tehtiin 22°C:ssa. Vasta-aineet laimennettiin määrityspuskuriin [50 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.9%

NaCl, 0,05% NaN3, 0.01% Tween 40, 0.05 % naudan gammaglobu-15 liini, 20 μΜ dietyleenitriamiinipentaetikkahappo, 0.5% naudan seerumin albumiini, 20 μg/ml Cherry Red] pitoisuuteen 10 ng/ml. Laimennetut vasta-aineet laitettiin kanin anti-hiiri-IgG-vasta-aineella päällystettyjen mikrotiitte-ristrippien (Wallac) kuoppiin, 200 μΐ kuoppaa kohden, ja 20 strippejä ravisteltiin levyravistelijassa, 600 kierrosta minuutissa, 2 tunnin ajan. Inkubaatioiden aikana europium-leimatusta estradiolista tehtiin laimennossarja. Inkubaati-:.·* oiden jälkeen stripit pestiin neljästi pesuliuoksella [0.9%

NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.005% Tween]. 200 μΐ kutakin : 25 europium-leimatun estradiolin laimennosta lisättiin erilli- • · · ;‘l*; siin kuoppiin ja strippejä ravisteltiin levyravisteli jassa, 600 kierrosta minuutissa, 2 tunnin ajan. Stripit pestiin . e #·. neljästi pesuliuoksella, minkä jälkeen lisättiin 200 μΐ « · · III Delfia Enhancement solution -kehitysliuosta (Wallac). 30 . 30 minuutin inkubaation jälkeen luettiin aikaerotteiset fluo- resenssisignaalit Plate fluorometer-laitteella (Wallac).

: Tiedot esitettiin kuvaajana, jossa sitoutuneen ja vapaan • europium-leimatun estradiolin suhde esitettiin sitoutuneen ! . europium-leimatun estradiolin funktiona. Affiniteettivakiot 10 100276 laskettiin kuvaajien kulmakertoimista Scatcherdin menetelmällä [ 14 ] .

Tulokset:

Affiniteettivakiot (Ka (L/mol)) komplekseille Eu-leimatun 5 17£-estradioli-6-karboksimetyylioksiimin ja erilaisten monoklonaalisten vasta-aineiden välillä.

Vasta-aine_Ka_ 069-A5406A 6.7 x 1010 10-E15 2.5 x 1010 10 2F9 9.4 x 1010

Esimerkki 3

Puoliintumisajan määrittäminen komplekseille monoklonaalisten vasta-aineiden ja 170-estradiolin, 170-estradioli-6-15 karboksimetyylioksiimin tai 17P-estradioli-6-aminoheksyy-lioksiimin välillä.

Kompleksien puoliintumisajät monoklonaalisten vasta-aineiden (069-A5406A, 10-E15 tai 2F9) ja 170-estradiolin (Sigma : Chemical Company), 17P-estradioli-6-karboksimetyylioksiimin 20 (lyhennettynä 6-CMO; Sigma Chemical Company) tai 170-estra-: dioli-6-aminoheksyylioksiimin (lyhennettynä 6-AHO, katso ΓΓ: Esimerkki 1) välillä mitattiin seuraavasti: m . Kaikki inkubaatiot tehtiin 22°C:ssa; kaikki laimennokset • · · β·|·. tehtiin määrityspuskuriin [50 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.9% 25 NaCl, 0,05% NaN3, 0.01% Tween 40, 0.05 % naudan gammaglobuliini, 20 μΜ dietyleenitriamiinipentaetikkahappo, 0.5 % naudan seerumin albumiini, 20 μ9/ιη1 Cherry Red]. Laimenne-tut vasta-aineet (10 ng/ml) laitettiin kanin anti-hiiri-: IgG-vasta-aineella päällystettyjen mikrotiitteristrippien 11 100276 (Wallac) kuoppiin, 200 μΐ kuoppaa kohden, ja strippejä ravisteltiin levyravistelijassa, 600 kierrosta minuutissa, 2 tunnin ajan. Stripit pestiin neljästi pesuliuoksella [0.9% NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.005% Tween], minkä 5 jälkeen kuoppiin lisättiin 200 μΐ joko 100 nM 173-estra-diolia, 10 nM 6-CMO:ta tai 10 nM 6-AHO:a ja strippejä ravisteltiin levyravistelijassa, 600 kierrosta minuutissa, 60 minuutin ajan. Stripit pestiin neljästi pesuliuoksella, minkä jälkeen lisättiin 200 μΐ 10 nM europium-leimattua 10 17p-estradiolia. Strippejä ravisteltiin jälleen levyravis-telijassa, 600 kierrosta minuutissa, vaihtelevian aikoja. Stripit otettiin ravistelijasta yksi kerrallaan ja pestiin neljästi pesulioksella, minkä jälkeen lisättiin 200 μΐ Delfia Enhancement solution -kehitysliuosta (Wallac).

15 Kehitysliuoksen lisäämisen jälkeen kutakin strippiä inku-boitiin 30 min ennenkuin aikaerotteiset fluoresenssisignaa-lit luettiin Plate fluorometer-laitteella (Wallac). Tiedot esitettiin kuvaajana, jossa signaalin (cps; iskua sekunnissa) luonnollinen logaritmi esitettiin kuluneen ajan (min; 20 mitattuna europium-leimatun estradiolin lisäyksestä pesujen alkuun) funktiona. Puoliintumisajät laskettiin kuvaajien kulmakertoimista seuraavan kaavan mukaisesti: I;1 Puoliintumisaika (min) = [ln(2)]/-k, missä k on kuvaajan kulmakerroin.

• · · • · · « · · · .·1·. 25 Tulokset: • « • · · • · · • · · X; Puoliintumisajät (minuuttia) Mab-antigeeni-komplekseille t · « ’ antigeenien ollessa 17P-estradioli, 6-CMO ja 6-AHO.

· · ^^^^^^________________^_____ *·“" Vasta-aine Antigeeni • · · . _17fi-estradioli 6-CMO_6-AHO_ ..'I' 30 069-A5406A 15 47 64 10-E15 9 127 93 ._ 2F9_44_51_154_ 12 100276

Monoklonaali vasta-aine 10-E15 näytti lupaavimmalta tämän keksinnön käyttötarkoitukseen, koska sillä on 14-kertainen ero kompleksien puoliintumisajoissa estradiolille (9 min) ja 6-CMO:lie (127 min).

5 Esimerkki 4

Inkubaatio, salpaus- ja korvautumisreaktiot.

Kaikki inkubaatiot tehtiin 22°C:ssa; kaikki laimennokset tehtiin määrityspuskuriin [50 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.9% NaCl, 0,05% NaN3, 0.01% Tween 40, 0.05 % naudan gammaglobuliini, 20 10 μΜ dietyleenitriamiinipentaetikkahappo, 0.5% naudan seerumin albumiini, 20 μg/ml Cherry Red]. Monoklonaali vasta-aine 10-E15 (Fitzgerald Industries International Inc., Massachusetts) kiinnitettiin kanin anti-hiiri-IgG-vasta-aineella päällystettyjen mikrotiitteristrippien (Wallac) kuoppiin, lisäämällä 15 sata mikrolitraa kuoppaa kohden vasta-ainelaimennosta (100 ng/ml), ravistelemalla levyravistelijassa, 600 kierrosta minuutissa, tunnin ajan, ja pesemällä neljästi pesuliuoksella [0.9% NaCl, 5 mM Tris-HCl pH 7.75, 0.005% Tween]. 17β-β3^3-diolistandardeja (100 μΐ kuoppaa kohden), pitoisuudeltaan 0, 20 0.025, 0.050, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5 ja 2 nM, lisättiin kuop piin, joihin oli kiinnitetty vasta-aine, minkä jälkeen strip-pejä ravisteltiin levyravistelijassa, 600 kierrosta minuutis- • .·. sa, 2 tunnin ajan. Salpausreaktiot aloitettiin lisäämällä 100 • · · μΐ kuoppaa kohden 10 μΜ 17β-estradioli-6-karboksimetyylioksii- • · *** 25 mia (Sigma Chemical Company). Strippejä ravisteltiin edelleen • * · **”* 5 min, minkä jälkeen ne pestiin neljästi pesuliuoksella.

t · ·' * Korvautumisreaktio aloitettiin lisäämällä 100 μΐ kuoppaa kohden 10 nM europium-leimattua 17β-estradiolia, minkä jäi-!.·.· keen strippejä ravisteltiin joko 5 tai 10 minuuttia, ja pes- 30 tiin neljästi pesuliuoksella. 200 μΐ Delfia Enhancement solu-tion -kehitysliuosta (Wallac) lisättiin ja strippejä ravistel-tiin 30 min, minkä jälkeen aikaerotteinen fluoresenssisignaali luettiin Plate fluorometer-laitteella (Wallac).

Annos-vastekäyrät tehtiin X-Y-kuvaajina, joissa signaalit 100276 13 esitettiin standardien konsentraatioden funktiona, katso Kuva IA ja IB. Umpinaiset neliöt edustavat 10 minuutin korvautumis-aikaa ja avoimet neliöt edustavat 5 minuutin korvautumisaikaa. Kuva IA esittää käyrät pitoisuusaluelta 0 - 0.5 nM ja Kuva IB 5 esittää kuvaajat koko mittausalueelta. Jokainen esitetty piste on keskiarvo kolmesta rinnakkaisesta mittauksesta. Virhejanat ulottuvat i 1 keskivirhettä (SD) keskiarvosta kussakin pisteessä .

Pienin erotettavissa oleva annos LDD määriteltiin 170-estra-10 diolin pitoisuudeksi, jota vastaava signaali eroaa 2 keskivirhettä nolla-pitoisuuden signaalista. Tämä arvo laskettiin jakamalla nolla-pitoisuutta vastaavan signaalin keskivirhe (SD) standardikuvaa jän lineaarisen osan kulmakertoimella.

On käsitettävä, että esitetyn keksinnön menetelmät voidaan 15 sovittaa erilaisten ilmentymien muotoon, joista tässä on tuotu esiin vain muutamia. Asiantuntijalle on ilmeistä, että on olemassa muita ilmentymiä, jotka eivät poikkea tämän keksinnön hengestä. Siksi nämä kuvatut ilmentymät ovat vain valaisevia (esimerkkejä), eikä niitä pidä tulkita rajoittaviksi.

• · · • · · · • · · m · • · i : : ♦ t1 • · · • 1 1 • · · · · • · · 14 100276 KAAVIO 1

/K

1. Lisää näyte - A = näytteessä oleva antigeeni y - vasta-ainetta ylimäärin -> A sitoutuu kvantitatiivisesti K — λΛ

2. Lisää salpaaja ^-A

- B = salpaaja = antigeenin A analogi, joka sitoutuu hyvin - B:n ylimäärä täyttää vapaat sitomiskohdat - vapaa B poistetaan pesemällä ^ 3. Lisää leimattu markkeri - A* = leimattu markkeri (antigeeni) y :.. - A*:n ylimäärä korvaa A:n __0 *-··*. - vahvasti sitoutunut B ei korvaudu ^ - vapaa A* poistetaan pesemällä / ”^b X * · ««· «· · : : : : :·: 4. Mittaa signaali y® τ*Γ: - signaali on suoraan verrannollinen näytteen alkuperäiseen A: hän / •;;; - saadaan nouseva standardikäyrä y * ''...: - herkempi kuin kilpaileva määritys 'y —<^ 100276 15

KIRJALLISUUSVIITTEET

1. Ekins, R.P. and Chu, F.W. (1991) Multianalyte microspot assay - microanalytical "compact disk" of the future. Clin. Chem. 37.:1955-67.

5 2. Ekins, R.P. and Dakubu, S. (1985) The development of high sensitivity pulsed light, time-resolved fluoroimmunoassays. Pure & Appi. Chem. 57.: 473-82.

3. Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 10 U.S.A.

4. Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E. and Hoogenboom, H. (1994) Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12,: 433-55.

5. Sambrook, J. Fritch, E.F. and Maniatis. T. (1989) Molecular 15 cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor

Laboratory Press. Cold Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A.

.][' 6. Walker, J.M. and Gingold, E.B., eds. ( 1993) Molecular biology and biotechnology. 3rd edition. The Bath Press, Bath, ; 20 UK.

• · · · • · · • · • · ·. 7. Imoto, T. and Yamada, H. (1989) Chemical modification. In

Creighton, T.E. (ed.) Protein function. A practical approach.

X · · * IRL press, Oxford, England.

« · · *···* 8. Pierce Catalog and Handbook, Pierce, Rockford, Illinois, • · · T : : 25 U.S.A.

9. Takalo, H., Hänninen, E. and Kankare, J. (1993) Luminescence of Europium (III) chelates with 4-(arylethynyl)pyridines as ligands. Helv. Chim. Acta 76: 877-83.

16 100276 10. Takalo, H., Mukkala, V.-M., Mikola, H., Liitti, P. and Hemmilä, I. (1993) Synthesis of Europium(III) chelates suitable for labeling of bioactive molecules. Bioconjugate Chem. 5: 278-82.

5 11. Mikola, H. and Hänninen, E. (1992) Introduction of aliphatic amino and hydroxy groups to keto steroids using O-substi-tuted hydroxylamines. Bioconjugate Chem. 3: 182-6.

12. Mikola, H. and Miettinen, P. (1991) Preparation of Europium labeled derivatives of cortisol for time-resolved fluo- 10 roimmunoassays. Steroids 56: 17-21.

13. Mikola, H., Sundell, A.-C. and Hänninen, E. (1993) Labeling of estradiol and testosterone alkyloxime derivatives with a europium chelate for time-resolved fluoroimmunoassays. Steroids 58: 17-21.

15 14. Scatchard, G. (1949) The attraction of proteins for small molecules and ions. Ann. NY. Acad Sci. 51:660-672.

15. Mikola, H. and Hänninen, E. (1992) Introduction of aliphatic amino and hydroxy groups to keto steroids using O-substi-tuted hydroxylamines. Bioconjugate Chem. 3.: 182-6.

* · * • · · • ·· · « · » • · « « • « · « : : ♦ ·· • · · : : : • · · • · · • · · « « « « · · » · « < · « · ♦

Claims (9)

100276

1. Menetelmä spesifisen sitojan omaavien analyyttien määrittämiseen tunnettu siitä, että a) analyyttiä sisältävä näyte tuodaan kosketukseen sitojan kanssa, joka sitoja on spesifinen sanotulle analyytille, 5 b) lisätään salpaaja, joka kykenee inaktivoimaan sanotun sitojan vapaana olevat sitomiskohdat, mutta joka ei kykene inaktivoimaan sanotun sitojan varattuna olevia sitomiskohtia, ja poistetaan ylimääräinen salpaaja liuoksesta, c) irrotetaan sitoutunut analyytti sanotusta sitojasta, 10 d) lisätään leimattu markkeri joka kykenee täyttämään sitomis-paikat, joista analyytti on irronnut, mutta joka ei kykene täyttämään sitomispaikkoja, jotka salpaaja on inaktivoinut, missä vaihe d voidaan suorittaa peräkkäin tai samanaikaisesti vaiheen c kanssa, sekä, 15 e) mitataan signaali leimatusta markkerista, joka on sitoutunut sitojaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • että sitoja on vasta-aine. • · · • · · • · • · • · · . 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · · • 1 i 20 että sitoja on kiintokantajassa kiinni. * <

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · • · · että salpaaja on sidottu sitojaan spesifisen molekulaarisen tunnistuksen avulla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 25 että salpaaja on sidottu ei-kovalenttisesti sitojaan, ja "... salpaajan dissosiaationopeus sitojasta on ainakin 5 kertaa 100276 niin pieni kuin analyytin dissosiaationopeus sitojasta.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että salpaaja on sidottu sitojaan kovalenttisesti, salpaajassa olevan reaktiivisen ryhmän ansiosta.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että salpaaja on aine, joka kemiallisesti tai entsymaattisesti modifioi sitojan, täten inaktivoiden sen sitomispaikan.

8. Jonkin edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytti on steroidi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytti on 17£--est.radioli, salpaaja on 17£-estradioli-6-karboksimetyylioksiimi, ja leimattu markkeri on europium-leimattu 17£-estradioli-6-karboksimetyylioksiimi. • · • · · • · · • · · • · · • · • · « · · « « > * · · • ♦ < • <, · • · · • i f m • · • « • « · ««« * * · < « * • · 100276