JP3027770B2 - イムノアッセイで使用するための干渉除去剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イムノアッセイ用の干渉除去剤としてのア
ビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導
体、ならびにこの干渉除去剤を用いる被検体の検査法に
関するものである。

近年、免疫学的検出方法は非常に重要になってきてい
る。こうした方法は生物学的サンプル中の薬物、ホルモ
ン、タンパク質、感染性生物、とりわけ特異的抗体、の
存在を迅速かつ正確に検出するために用いられる。免疫
学的検出方法ではいつでも、第１の特異的結合相手と、
検出しようとする物質（被検体）と、第２の特異的結合
相手（被検体と特異的に反応するか、またはそれと結合
する）との間で特異的結合反応が起こる。その過程で、
被検体と特異的被検体結合相手（いわゆる特異的結合対
の相手同士）が特異的結合対を形成するのであるが、一
般的には抗原と抗体または抗体断片との複合体を形成す
る。その際、それぞれの反応において１より多い被検体
または結合相手を互いと反応させることが可能である。
これらの特異的結合反応はさまざまな方法で検出でき
る。普通は特異的結合反応の一方の当事者を標識する。
通常の標識方法には放射性同位元素、色素原、蛍光原、
酵素標識、またはその後特異的結合対（例えば、ビオチ
ン／ストレプトアビジン）を形成しうる物質が用いられ
る。不均一イムノアッセイにあっては一方の結合相手を
固相に固定化する。

イムノアッセイを実施するうえで重要となる問題は、
固相のいくつかの状況下において、イムノアッセイの特
異的結合相手とサンプル中に存在する別の成分との間で
望ましくない相互作用や非特異的結合反応が起こりうる
ことである。こうした相互作用はバックグラウンドシグ
ナルの増加に加えて大きなシグナル散乱をも引き起こす
のが常であり、その結果、関係する試験の感度や特異性
を低下させる。さらに、標識された結合相手との非特異
的相互作用から、また、サンプル成分による試験成分の
特異的結合からも、偽陽性の測定結果が生じることがあ
る。すなわち、測定シグナルが誤って増加する結果、被
検体が存在しないときでさえも、それが存在すると見な
されてしまう。

イムノアッセイでのこうした非特異的相互作用を減ら
そうとして多くの試みがなされてきた。これまで、各種
炭水化物成分、各種タンパク質、タンパク質混合物また
はタンパク質画分、およびそれらの加水分解物はイムノ
アッセイにおける試験成分と被検体との非特異的相互作
用を減ずることが知られている（例えば、Robertsonら,
Journal of Immun.Meth.26,1985,195;EP−Ａ−260903;U
S−Ａ−4,931,385参照）。粗製のタンパク質画分や粗製
の加水分解物の使用には、そこに含まれる成分がその後
の試験において他の干渉を引き起こすという欠点があ
る。さらに、酵素法によって生成された加水分解物は、
それらの製造に用いたプロテアーゼで汚染されているこ
とがあり、また、加水分解開裂を制御することが難しい
こともあって均一な晶質のものが得られない。汚染物質
としてのプロテアーゼは試験成分を攻撃して、少量でさ
えも試験官能性および貯蔵安定性を損じる結果となる。

また、イムノアッセイにおける非特異的相互作用の軽
減のために化学修飾されたタンパク質（特に、スクシニ
ル化またはアセチル化タンパク質）を用いることも記述
されている（US−Ａ−5,051,356;EP−Ａ−0 525 91
6）。しかし、これらの物質を用いて血清から抗体を検
査する場合に、多くの偽陽性の結果を避けることはでき
なかった。

EP−Ａ−0 331 068およびWO 91/06559には、リウマチ
因子のごとき特定の干渉因子を減らすために、重合させ
た免疫グロブリン（特にIgG）を用いることが記述され
ている。しかし、それらは全ての干渉相互作用を満足の
ゆく程度になくすことができない。その上、ヒト抗体試
験に非特異的なヒト免疫グロブリン（単量体もしくは重
合体の抗体またはその断片）を加えることはブランク値
の増加につながる。さらに、ヒトまたは動物IgGの生産
には時間と費用がかかる。

従って、本発明の目的は、イムノアッセイにおける非
特異的相互作用による干渉を減らすための、従来技術で
知られているものよりも優れた、新規な干渉除去物質お
よび干渉除去剤を提供することであった。非特異的相互
作用は、測定結果を誤りへと導くような、こうした方法
の諸成分間の全ての相互作用として理解される。この干
渉除去物質は特に抗体検査の際の偽陽性の分析結果を回
避すべきである。とりわけ、イムノアッセイにおいて結
合相手としてアビジンまたはストレプトアビジンを用い
るときの干渉を回避することが意図される。

この目的は干渉除去剤としてのアビジンまたはストレ
プトアビジンまたはそれらの誘導体により達成された。
驚いたことに、これらの物質を用いると、アッセイ、特
に結合相手としてアビジンまたはストレプトアビジンを
用いるアッセイにおいて干渉が取り除かれた。

それゆえ、本発明は、アビジンまたはストレプトアビ
ジンまたはそれらの誘導体を含むアッセイで非特異的相
互作用を避けるための干渉除去剤、ならびにこうした干
渉除去剤のアッセイでの使用に関するものである。アビ
ジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体は
本発明に従って可溶性形態で用いられる。それらは固相
にも酵素のようなマーカー基にも結合したり、カップリ
ングしたりしていない。本発明による干渉除去剤は常に
検査に必要な試薬類のほかに用いられるもので、試験反
応中に形成される、検出すべき被検体と特異的結合相手
からなる複合体の一成分とはなり得ない。本発明による
干渉除去剤は免疫学的試験（イムノアッセイ）において
使用することが好ましい。しかし、核酸試験のような他
の相互作用をベースとした試験でも用いることができ
る。好ましくは、免疫学的試験や核酸試験の場合は、一
つの試験成分がアビジンまたはストレプトアビジンで被
覆された固相のごときアビジンまたはストレプトアビジ
ンに結合される試験において干渉除去剤が用いられる。
アビジンまたはストレプトアビジンは天然に存在する精
製タンパク質または組換え体のアビジンまたはストレプ
トアビジンとして理解される。アビジンまたはストレプ
トアビジンの誘導体は修飾されたアビジンまたはストレ
プトアビジン分子として理解される。この修飾は、第一
に、個々のアビジンまたはストレプトアビジン分子を架
橋させて、いわゆるポリSAまたは均一に架橋されたSAを
形成することにより実施される。以後、SAは常にアビジ
ンまたはストレプトアビジンを指す。SAの架橋または重
合方法は当業者に公知である。特に、加熱処理による架
橋や２官能性もしくは多官能性化合物による架橋が適し
ている。２官能性もしくは多官能性化合物は同一でも異
なっていてもよい少なくとも２個の官能基を有する分子
として理解され、これら官能基によってSAの官能基（例
えば、ある種のアミノ酸残基または炭水化物残基）と反
応できるものである。本発明の範囲内の適当なリンカー
の代表例を以下の表１に掲げておく。表１ 略号 化学組成 SPDP Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）一プロピオネート EADP エチル４−アジドヘニル−1,4−ジチ
オブチルイミデート・HC1 FNPA ４−フルオロ−３−ニトロフェニルア
ジド HSAB Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４
−アジドベンゾエート MABI メチル−４−アジドベンゾイミデート
・HC1 MBS ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル NHS−ASA Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４
−アジドサリチル酸 MHS マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル PNP−DTP ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−3,
3,3−トリフルオロプロピオネート SADP Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフ
ェニル）1,3′−ジチオプロピオネート SAND スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−
アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル−1,3′−ジ
チオプロピオネート SANPAH Ｎ−スクシンイミジル−６（４′アジ
ド−２′−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート SASD スルホスクシンイミジル２−（ｐ−ア
ジドサリチルアミド）エチル−1,3′−ジチオプロピオ
ネート SIAB Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードア
セチル）アミノベンゾエート SMCC スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイ
ンイミドエチル）シクロヘキサシ−１−カルボキシレー
ト SMPB スクシンイミジル−４−（Ｐ−マレイ
ンイミドフェニル）ブチレート DSS ジスクシンイミジルスベレート DMS ジメチルスベルイミデート Traut′試薬 ２−イミノチオラン2,4,6−トリクロ
ロ−ｓ−トリアジン SAMBA Ｓ′−アセチル−メルカプト−コハク
酸無水物 SATP Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル
チオプロピオネート SATA Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル
チオアセテート 第二に、この修飾は他の高分子量分子、特にイムノア
ッセイで干渉を減らすためにしばしば用いられるウシ血
清アルブミン（BSA）または免疫グロブリンのようなタ
ンパク質、へのカップリングでありうる。この架橋では
いわゆる不均一に架橋されたSAが得られる。この方法に
続いてこの複合体中のSAおよび／またはタンパク質を重
合させることができる。これらの分子にSAをカップリン
グする方法は当業者に公知である。DSS、SAMBA、SATP、
MHS、SATAによるカップリングが特に適しているとわか
った。BSAとSAまたはポリSAとの複合体は干渉除去剤と
して特に好ましいものである。重合BSAをSAやポリSAに
カップリングするときには、さらに良好な成果が得られ
る。BSAの重合または架橋は上述したSAの架橋法により
実施できる。EP−A 0331127に記載されるような加熱処
理による重合が最も適している。

第三に、SAの修飾は活性中心、すなわちビオチン結合
部位、の不活性化でありうる。これはいわゆる不活性化
SAを形成させる。不活性化はビオチンまたはビオチン誘
導体（アビジンまたはストレプトアビジンと結合するも
の）を用いて結合部位を単に飽和させることにより実施
できる。ビオチンに対するSAの親和力は非常に高いの
で、イムノアッセイで使用するとき、結果的に干渉を起
こすようなビオチンの放出はほとんどない。好ましく
は、活性中心が共有結合的に修飾される。その場合に
は、SAの活性中心にある１個または複数個のアミノ酸残
基を誘導体化して、ビオチンへの結合を大幅に低下させ
るか、または完全に阻止するようにする。SAのビオチン
結合部位を不活性化する方法は、Gitlinら,Biochem.J.2
69（1990）527−530に記載されて、知られている。好ま
しくは、SAの活性中心にあるチロシン残基をフッ化ｐ−
ニトロベンゼンスルホニルで修飾する。SAのビオチン結
合部位を不活性化する別の方法は、その結合部位にビオ
チンを共有結合させることである。SAの活性中心へのビ
オチンの結合方法は当業者に公知である。光活性化可能
な新規なビオチン誘導体を用いてSAにビオチンを結合さ
せる新しい方法が特に有利であると判明した。光活性化
可能なビオチン誘導体は知られている。EP−Ａ−015585
4およびEP−Ａ−0187323にはアジド置換フェニル類／ニ
トロフェニル類が記載されており、これらをアミン含有
リンカーでビオチンに結合させる。好ましくは、ビオチ
ン誘導体としてビオチンーDADOO−AB（ビオチン−［８
−（４−アジドベンゾイル）−アミノ−3,6−ジオキサ
オクチル］アミド）を用いる。その他のビオチン誘導体
は、Boehringer Mannheim Biochemicacatalogue order
no.1292633および1292641に記載されている。SAのビオ
チン結合部位をビオチン誘導体で飽和させた後で光反応
を開始させると、ビオチンが活性中心に共有結合で固定
される。この不活性化SAにおいては、ビオチンが活性中
心に結合され、さらに活性中心の外側に共有結合で結合
される。この方法により得られるSAビオチン生成物は本
発明の主題でもある。

SAの活性中心を不活性化する他の方法は、遺伝子工学
的操作により結合部位を修飾することである。SAの活性
中心は個々のアミノ酸残基の、または短いアミノ酸残基
の断片の置換、欠失または挿入により修飾し不活性化す
ることができる。好ましくは、活性中心にあるチロシン
残基のような個々のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され
る。しかし、結合部位が一部または全部存在しないSAを
製造することも可能である。遺伝子工学的操作を用いて
SAを修飾および製造する方法は当業者に知られている。
例えば、組換えストレプトアビジンの製造はEP−Ａ−01
98015に記載されている。

第四に、この修飾はSAの断片化によって実施できる。
SA断片は化学的もしくは酵素的開裂により、または組換
え体生産により得ることができる。その場合、特にビオ
チン結合部位が上述したように不在でありうる。断片化
の利点は生成物の溶解度が向上することである。好まし
くは、アビジンまたはストレプトアビジンから化学的ま
たは酵素的開裂により得られた全ての断片を混合物とし
て用いて、SAの全てのまたはほぼ全ての部分が存在する
ようにする。

このようにして不活性化または断片化されたSAは、SA
を修飾するための上記の第一または第二の方法において
使用できる。すなわち、不活性化SAを続いて重合させた
り、BSAやポリBSAのような他の分子と架橋させたりする
ことが可能である。SAを修飾するにあたって上記方法の
少なくとも２つの組合せを用いて製造された干渉除去剤
が特に有利であるとわかった。

上記方法の１つによるSAの修飾が完了した後で、残存
しているビオチン結合活性、アビジンまたはストレプト
アビジンの活性中心に結合されないで表面に共有結合さ
れたビオチン、または遊離のビオチンを、アビジンまた
はストレプトアビジン誘導体の適当な精製法により除く
ことが可能である。例えば、これは固相に結合させたビ
オチンおよび／またはSAへの吸着により実施できる。

かくして、本発明はさらに、上記の修飾方法の１つを
行い、続いて、好ましくは固相に結合させたビオチンお
よび／またはSAへの吸着により、精製を行って残存して
いるビオチン結合活性、アビジンまたはストレプトアビ
ジンの活性中心に結合されないで表面に共有結合された
ビオチン、または遊離のビオチンを除去することによっ
て得られるアビジンまたはストレプトアビジンの誘導体
に関する。

さらに、本発明は、上記の３方法のうちの少なくとも
１つによりSAを修飾し、その後場合により、上記のごと
く精製して残存しているビオチン結合能、表面に共有結
合されたビオチン、または遊離のビオチンを除去するこ
とを含んでなる、本発明による干渉除去剤の製造方法に
関する。

アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘
導体を用いて、あらゆる一般的なイムノアッセイまたは
核酸アッセイにおいて干渉を軽減させることができる。
それらは特に、アビジンまたはストレプトアビジンが一
結合成分として用いられるイムノアッセイまたは核酸ア
ッセイで干渉を減らすのに適している。こうしたイムノ
アッセイは例えば、Guesdonら,J.Histochem. Cytochem.
27（1979）1131−1139およびBayer and Wilchek,Analyt
ical Biochemistry 171（1988）１−32により知られて
いる。干渉は、例えば、ヒトの血清中に時おり存在する
アビジンまたはストレプトアビジンに対する抗体によっ
て引き起こされる。しかしながら、本発明による干渉除
去剤はアビジンやストレプトアビジンを用いないイムノ
アッセイにおいても顕著な効果を奏する。こうしたイム
ノアッセイでは、BSAやポリBSAのような別の分子に結合
されたSA（上記の第二の修飾方法に相当する）を用いる
ことが特に有利であると分かった。本発明の干渉除去剤
は、常に、検査に必要とされる試薬類のほかに用いられ
るもので、SA被覆固相や酵素−SA結合体のような、検査
に含まれる可能性があるアビジンまたはストレプトアビ
ジン成分と同一ではない。これらのSA試薬類とは対照的
に、本発明の干渉除去剤は被検体と特異的結合相手から
なる検出すべき複合体中に取り込まれることはない。

本発明はさらに、 （１）サンプルを （ａ）アビジンまたはストレプトアビジンまたはその誘
導体 （ｂ）被検体の１種または数種の特異的結合相手 と接触させ、そして （２）被検体と特異的結合相手から形成された複合体
を、該被検体の存在の指標として測定する、 ことによるサンプル中の被検体の測定方法に関する。

被検体は、ハプテン、抗原、抗体、核酸などの少なく
とも１つの特異的結合相手と複合体を形成すべく反応す
るあらゆる物質であり得る。本発明による方法は抗体、
とりわけ自己抗体、を検出するのに特に適している。

一般には、サンプルは血液、血漿、血清、唾液、尿と
いった体液であり得る。

被検体と特異的に結合して複合体を形成し得る特異的
結合相手として、どのような生物学的または化学的結合
相手を使用してもよい。こうしたものには抗体、抗体断
片、抗原、ハプテン、ホルモン、アビジン、ビオチン、
核酸、オリゴヌクレオチド、またはそれらの誘導体が挙
げられる。本発明においては、抗体もしくは抗原または
それらの断片を被検体の結合相手として用いることが好
ましい。

被検体と特異的結合相手とからなる複合体を検出する
には、当業者に知られたあらゆる方法を用いることがで
きる。結合相手が全て可溶性形態で存在する均一系の方
法、例えば、形成された複合体の濁度測定やネフェロメ
トリー（比濁分析）による沈殿法、またはCEDIA、EMIT
もしくはFPIA原理に基づくイムノアッセイが利用可能で
ある。また、少なくとも１つの試薬が固相に結合されて
いる不均一系の方法も適している。その例としては、結
合対の一方の相手が例えばラテックスに結合されている
凝集試験、サンドイッチアッセイ、特異的抗体（例え
ば、HIV、HCV、風疹ウイルス、トキソプラズマ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼまたはチログロブリンに対す
る抗体）を検出するためのELISA、RIAまたはイムノメト
リックアッセイがある。沈殿法は別として、これらの全
ての方法では、特異的結合相手の１つが標識される。そ
の標識には測定可能なシグナルを直接発生するものがあ
り、例えば、放射性同位体、化学発光、蛍光もしくは電
気化学発光標識、あるいは金属ゾル粒子や着色または未
着色ラテックスのような着色粒子である。また、この標
識は間接的なシグナルを発生するものであってもよく、
例えば、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの
酵素標識がある。

イムノアッセイは、特に結合相手の１つがSAを介して
固相に結合されている場合、試験片やバイオセンサーを
用いて実施できる。プラズモン共鳴の原理に基づくイム
ノアッセイでも、本発明に従って干渉を軽減しうる。

被検体の検査法では、１つの試薬がアビジンまたはス
トレプトアビジン／ビオチンのような特異的結合対を介
して固相に結合されることが多い。その利点は、いくつ
かの検査法でその固相を普遍的に使用できることにあ
る。また、特異的結合対によってアッセイの一成分に標
識を結合させることもできる。例えば、酵素をアビジン
かストレプトアビジンに結合させ、そして結合相手（例
えば抗体）をビオチン化する。こうした検査法の例は当
業者に公知である。本発明によるアビジンまたはストレ
プトアビジン誘導体は、アビジン／ビオチンまたはスト
レプトアビジン／ビオチンによる反応成分の間接的結合
を利用する検査法において干渉を軽減させるのに特に適
している。

被検体の検査法はワンステップでも数ステップでも実
施できる。すなわち、被検体と個々の試験成分とのイン
キュベーションを同時に行っても逐次行ってもよい。ビ
オチン結合部位が不活性化されていないアビジン、スト
レプトアビジンまたはその誘導体を用いる場合は、結合
成分がアビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／
ビオチンにより結合される方法を実施するに際して、ア
ビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体を添加す
る前にアビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／
ビオチンによる結合成分の結合がすでに完了しているよ
うに注意すべきである。なぜならば、非不活性化ビオチ
ン結合部位がビオチン化結合成分に結合して干渉を起こ
す恐れがあるからである。例えば、アビジンまたはスト
レプトアビジン固相を用いるのであれば、最初に被検体
のビオチン化特異的結合相手を添加し、その後でサンプ
ルをアビジン、ストレプトアビジンまたはその誘導体と
共に加える必要がある。ビオチン結合部位が不活性化さ
れている本発明のアビジンまたはストレプトアビジン誘
導体を用いるときは、ビオチン化試薬がそのアビジンま
たはストレプトアビジン誘導体に結合することはないか
ら、全部の検査試薬を同時にインキュベートすることが
可能である。従って、この不活性化されたアビジンまた
はストレプトアビジン誘導体は考え得るあらゆる検査法
において普遍的に使用でき、それゆえ好ましいものであ
る。

試験混合物中の本発明の干渉除去剤の濃度は0.0001〜
１％（m/v）、好ましくは0.01〜１％（m/v）である。

被検体検査法のそれぞれの反応成分は有利にはテスト
コンビネーションまたはテストキットの形で提供され
る。従って、本発明の別の主題はアビジン、ストレプト
アビジン、またはその誘導体および被検体の少なくとも
１つの特異的結合相手を含んでなる、サンプル中の被検
体の検査法で用いるためのテストコンビネーションであ
る。さらに、このテストコンビネーションはその検査法
を実施するのに必要な他の全ての試薬類、例えば、バッ
ファー、界面活性剤、標識、酵素基質のような標識を検
出するための補助物質、固相などを含んでいてもよい。
本発明の干渉除去剤と被検体の１以上の結合相手とは別
個の容器に収納することが好ましい。ビオチン結合部位
が不活性化されている本発明の干渉除去剤を用いるので
あれば、その干渉除去剤を被検体の結合相手に直接添加
してもよい。

本発明について以下の実施例でさらに詳しく説明する
ことにする。

実施例１ 重合ストレプトアビジンの製造 重合ストレプトアビジンはEP−Ａ−0331127に従って
製造した。

マレイミド−ベキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルによるストレプトアビジンの活性化： 30mgのストレプトアビジンを3mlの30mMリン酸カリウ
ム/100mM塩化ナトリウム（PH7.1）に溶解し、25℃に加
熱した。DMS0中の0.15mlのマレイミドーヘキサノイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MHS）（Boehr
inger Mannheim GmbH）（10mg/ml）を攪拌しながら滴下
した。25℃で１時間反応させた後、溶液を氷浴中で冷却
した。続いて、生成されたMHS−ストレプトアビジンを
１リットルの50mMリン酸カリウム/100mM塩化ナトリウム
（pH5.0）に対して４℃で２回透析した。

Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物によるストレプ
トアビジンの活性化： 30mgのストレプトアビジンを3mlの100mMリン酸カリウ
ム（pH7.8）に溶解し、25℃に加熱した。DMSO中の0.175
mlのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（SAMBA）
（10mg/ml）攪拌しながら滴下した。25℃で３時間反応
させた後、生成されたSAMBA−ストレプトアビジンを１
リットルの50mMリン酸カリウム/2mMEDTA（pH6.5）に対
して４℃で２回透析した。

ストレプトアビジンの均一架橋： 3mlの活性化SAMBA−ストレプトアビジン溶液（10mg/m
l）を25℃に加熱し、50μｌの1Mヒドロキシルアミン（p
H6.5）と混合した。25℃で30分後、この溶液に15mlの50
mMリン酸カリウム/100mM塩化ナトリウム/1mM EDTA（pH
6.5）を添加して希釈した。3mlの活性化MHS−ストレプ
トアビジン（10mg/ml）を添加することによりストレプ
トアビジンの均一架橋を開始させた。注意深く攪拌しな
がら25℃で２時間反応させた後、0.2mlの100mMシステイ
ン/HClを添加して反応を停止させた。25℃で30分インキ
ュベートした後、この溶液のpH値を1Mリン酸水素二カリ
ウムの添加により7.5に調整した。0.2mlの500mMヨード
アセトアミドの添加後、25℃でさらに１時間インキュベ
ートした。次いで、これを３リットルの50mMリン酸カリ
ウム/100mM塩化ナトリウム（PH7.5）に対して４℃で２
回透析した。透析後、このコンジュゲートを限外濾過に
より濃縮し、スクロース（８％）を添加した後に凍結乾
燥した。

実施例２ サーモ−BSA−SAの製造 サーモ−BSA−SA（thermo−BSA streptavidin）はEP
−Ａ−0331127に従って製造した。

BSAの架橋によるサーモ−BSAの製造： 1.0gのBSAを100mlの20mMリン酸カリウムバッファー
（pH7.0）に溶解し、70℃の温度で５時間保った。続い
てそれを20℃に冷却して、100mMリン酸カリウムバッフ
ァー（pH7.8）に対して透析した。

SAMBAによるサーモ−BSAの活性化： 68mgのサーモ−BSAを2mlの0.1Mリン酸カリウムバッフ
ァー（pH7.8）に溶解し、それを0.38mlのSAMBA（DMSO中
10mg/ml）と徐々に混合した。25℃で3.5時間反応させた
後、１リットルの50mMリン酸カリウムバッファー（pH6.
5）に対して４℃で透析した。

サーモ−BSA−SAコンジュゲートの製造： ストレプトアビジンとサーモ−BSAとの不均一な架橋
は実施例１に記載した均一架橋と同様に行った。この方
法では、60mgの活性化MHS−ストレプトアビジン（実施
例１に従って製造）を68mgのSAMBA一サーモ−BSAと反応
させた。反応生成物をゲル濾過（SuPerose6調製用グレ
ード）で精製し、限外濾過により濃縮した。得られた生
成物をその後凍結乾燥した。

実施例３ 遊離のビオチンによるサーモ−BSA−SAの飽和 6.0m1の100mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）に
溶解した60mgのサーモ−BSA−SAを、0.5mlの10mMリン酸
カリウムバッファー（PH7.8）に溶解した2mgのＤ−ビオ
チンと混合し、１時間攪拌した。

遊離のビオチンをゲル濾過（Superose6 ）により分
離した。高分子タンパク質画分を10mMリン酸カリウムバ
ッファー（pH7.0）に対して透析し、８％スクロースの
添加後に凍結乾燥した。

実施例４ 共有結合的に修飾されたストレプトアビジンの製造 ストレプトアビジン／アビジンの活性中心にあるチロ
シン残基を、G.Gitlin,E.A.Bayer,M.Wilchek:Studies o
n the biotin−binding sites of Avidin and Streptav
idin（アビジンとストレプトアビジンのビオチン結合部
位に関する研究）;Biochem.J.（1990）,269,527−530に
従ってフッ化ｐ−ニトロベンゼンスルホニルを用いて誘
導体化した。

0.1Mトリス−HClバッファー（pH7.9）中に10mg/mlの
タンパク質濃度で溶解した1gのストレプトアビジンに、
ストレプトアビジンサブユニットに対して200倍モル過
剰量のフッ化ｐ−ニトロベンゼンスルホニルを添加し
た。添加後、この混合物を25℃でさらに18〜20時間攪拌
した。次いで、未反応の誘導体化試薬を分離するため
に、生成物を500倍容量以上のPBSバッファー（PH7.5）
に対して透析した（４℃で16〜18時間）。

実施例５ 光活性化可能なビオチンの製造 ビオチン−［８−（４−アジドベンゾイル）アミノ−3,
6−ジオキサオクチル］アミド（ビオチン−DADOO−AB）
の合成： 蒸留直後の50mlのDMFに、攪拌しながら、1.50g（4mmo
l）のビオチノイル−1,8−ジアミノ−3,6−ジオキサオ
クタン（ビオチン−DADOO,Boehringer Mannheim GmbH）
を溶解した。この溶液に、1.04g（4mmol）のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミジル−（４−アジドベンゾエート）
（HSAB,Boehringer Mannheim GmbH）および0.55ml（4mm
ol）のトリエチルアミンを順次加え、20℃で２時間攪拌
した。続いてロータリーエバポレーターでオイルポンプ
減圧下に溶媒を除去し、残留する粗生成物をシリカゲル
でクロマトグラフィーにより精製した。そのために、粗
生成物をできる限り少量のクロロホルム／メタノール2/
1（v/v）中に約40℃へわずかに加熱しながら溶解し、シ
リカゲル60（Merck社，ドイツ）カラム（4x60cm）にか
けた。これをクロロホルム／メタノール2/1（v/v）で溶
出し、50mlの画分をプールした。純粋な生成物を含む画
分をTLC（下記のシステム）で調べ、プールした。溶媒
をロータリーエバポレーターで除去し、半固体の残留物
を約50mlのジイソプロピルエーテルでダイジェスト（di
gest）した。微細な結晶質の、無色の生成物を吸引濾過
し、減圧乾燥器（0.1〜0.15バール/40℃）に入れて一夜
乾燥させた。

収量:1.24g（理論量の60％） TLC:シリカゲル60（Merck）F₂₅₄，クロロホルム／メタ
ノール2/1（v/v）； Rf＝0.71¹ H−NMR（100MHz/d6−DMSO）：δ（ppm）＝1.20−1.65
（m,6H）;2.07（tr,2H）;2.60−3.65（m,15H）;4.05−
4.20（m,2H）;6.38（d,br,2H）;7.20（d,2H）;7.62（t
r,br,1H）;7.91（d,2H）;8.53（tr,br,1H） UV（CH₃0H）：λ（max）＝267nm IR（KBr）：υ＝2125cm_-1 ビオチン−DAD00−ABの合成経路を図１に示す。

実施例６ （光活性化）ビオチン／ストレプトアビジンの製造 ストレプトアビジンを光活性化可能なビオチン誘導体
（例：ビオチン−DADOO−AB）と反応させ、未結合の遊
離のビオチンを除くため透析を行った。Hg蒸気ランプ
（350〜700nm）で照射して光反応を開始させ、ビオチン
をストレプトアビジンの結合中心に共有結合で固定させ
た。

PBSバッファー（pH7.5）中に20mg/mlのタンパク質濃
度で溶解した1gのストレプトアビジンに、10倍モル過剰
量のビオチン−DADOO−AB試薬（DMSO中の25mg/mlビオチ
ン−DADOO−ABのストック溶液3.5ml）を加えた。添加
後、光を遮断して25℃で２時間攪拌した。

光を遮断して500倍容量以上のPBSバッファー（pH7.
5）に対して４℃で20時間透析することにより、未結合
の遊離のビオチン誘導体を完全に分離した（もはや検出
不能）。次いで、この混合物を攪拌しながらHg蒸気ラン
プ（350〜700nm）を使って溶液の経路長＜5cmで20分間
照射し、続いて500倍容量以上のPBSバッファー（pH7.
5）に対して４℃で16〜18時間透析した。

実施例７ 不活性化ストレプトアビジン、サーモBSA−SA、並びに
それらの誘導体および断片の精製 BSA−ビオチン吸着剤の製造： PBSバッファー（pH8.5）中に10mg/mlのタンパク質濃
度で溶解した1gのBSAに、10倍モル過剰量のＤ−ビオチ
ノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（Boehringer Mannheim GmbH）を加え
た。

添加後、この混合物を25℃で２時間攪拌し、次いでリ
シンを10mMの最終濃度となるまで加えて反応を停止させ
た。500倍容量以上のPBSバッファー（pH7.5）に対して
４℃で16〜18時間透析することにより、未結合の遊離の
ビオチン誘導体を完全に分離した（もはや検出不能）。

40gのアミノ−Spherosil （Boehringer Mannheim Gm
bH）に300mlのグルタルジアルデヒド（10％）を加え、
この混合物を回転させながらpH3.7、55℃で２時間攪拌
した。この懸濁物を７倍Spherosil 容量以上の再蒸留
水および５倍Spherosil 容量のPBSバッファ−（pH8.
0）で洗った。続いてこの活性化Spherosil をBSA−ビ
オチン（タンパク質供給量５〜10mg/ml Spherosil）と
室温で20時間振とう下に反応させた。

未反応のタンパク質溶液をガラス吸引濾過器で分離
し、吸着剤物質を10倍Spherosil 容量の0.9％NaCl溶液
で洗い、５倍Spherosil 容量のエタノールアミン溶液
とともに１時間インキュベートした。

次に吸着剤物質を５倍Spherosil 容量の0.9％NaCl溶
液で洗い、３倍Spherosil 容量の1Mプロピオン酸およ
びpH6.5とするのに十分な30mM NaCl溶液で洗った。この
吸着剤をPBSバッファー（pH7.5）で適度に平衡化した。

ストレプトアビジン−Spherosil吸着剤の製造： 40gのアミノ−Spherosil（B0ehringer Mannheim Gmb
H）に300mlのグルタルジアルデヒド（10％）を加え、こ
の混合物を回転させながらpH3.7、55℃で２時間攪拌し
た。この懸濁物を７倍Spherosil容量以上の再蒸留水お
よび５倍Spherosil容量のPBSバッファー（pH8.0）で洗
った。続いてこの活性化Spherosilをストレプトアビジ
ン（タンパク質供給量５〜10mg/ml Spherosil）と室温
で20時間振とう下に反応させた。

未反応のタンパク質溶液をガラス吸引濾過器で分離
し、吸着剤物質を10倍Spherosil容量の0.9％NaCl溶液で
洗い、５倍Spherosil容量のエタノールアミン溶液とと
もに１時間インキュベートした。次に吸着剤物質を５倍
Spherosil容量の0.9％NaCl溶液、３倍Spherosil容量の1
Mプロピオン酸およびpH6.5とするのに十分な30mM NaCl
溶液で洗った。この吸着剤をPBSバッファー（pH7.5）で
適度に平衡化した。

Spherosilをベースとしたウシ血清アルブミン（BSA）
−ビオチンおよび／またはストレプトアビジン吸着剤で
のクロマトグラフィーを用いて、実施例３、４または６
による残留活性（ビオチン結合性）を有するストレプト
アビジン、残留する遊離のビオチン、または（結合ポケ
ットに固定化されたビオチンとは対照的に）表面に共有
結合で接近可能なビオチンを有するストレプトアビジン
から不活性化ストレプトアビジンを精製した。

PBSバッファー（pH7.5）で平衡化した1mlのストレプ
トアビシン−Spherosil吸着剤を10mgのタンパク質につ
き反応混合物に加え、25℃で２時間攪拌した。

次に懸濁物をカラムに移し、カラム材料をPBSバッフ
ァー（PH7.5）で洗った。この方法では、UVモニターを
使ってA_280nmでカラムの出口にてタンパク質含量を監視
した。タンパク質が含まれなくなるまで洗った。タンパ
ク質を含む溶出物を一画分として回収した。

PBSバッファー（pH7.5）で平衡化した1mlのウシ血清
アルブミン−ビオチン（BSA−Bi）−Spherosil吸着剤
を、タンパク質を含むストレプトアビジン吸着剤の溶出
物に10mgのタンパク質につき加え、それを室温で２時間
攪拌した。

この懸濁物をカラムに移し、PBSバッファー（pH7.5）
で洗った。この方法では、UVモニターを使ってA_280nmで
カラムの出口にてタンパク質含量を監視した。タンパク
質を含む溶出物が生成物を含むものであり、一画分とし
て回収した。生成物（不活性化（ポリ）ストレプトアビ
ジンまたはサーモ−BSA−SAまたはそれらの誘導体もし
くは断片）を20mg/mlのタンパク質濃度に濃縮し、小分
けした後で凍結乾燥した。

実施例８ ビオチン化抗原およびサンプルに関しての逐次試験法で
のGAD抗体検査の実施 サーモ−BSA−ストレプトアビジンをプレコーティン
グしたマイクロタイタープレートの各ウェルに、それぞ
れのバッチにつき最適濃度（Boehringer Mannheim Enzy
mun Test Anti−HIV 1＋２からのインキュベーション
バッファー中１〜３μg/ml）で、ブタ脳から単離してビ
オチン化したグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）1
00μｌをピペットで分注し、室温で30分インキュベート
した。その後プレートを0.1％（w/v）CHAPSO（３−［３
−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒ
ドロキシ−１−プロパンスルホネート）を毎回添加した
50mmol/lリン酸カリウム（PH7.0）350μ１で３回洗っ
た。ヒト血清をEnzymun Test Anti−HIV 1＋２からの
インキュベーションバッファーで１＋25に希釈し、これ
にそれぞれの量のサーモ−BSA−ストレプトアビジン
（未処理または不活性化）またはストレプトアビジン単
量体またはストレプトアビジン重合体（未処理または不
活性化）を加えた。このように希釈したサンプルをマイ
クロタイタープレート中で100μl/ウェルの容量にて振
とうしながら室温で１時間インキュベートした。続いて
サンプルを吸引し、プレートを上記のように３回洗っ
た。ヒトIgGに対して結合特異性を有するヒツジ由来のP
OD−結合検出抗体をEnzymun Test Anti−HIV 1＋２か
らのコンジュゲートバッファーで75mU/mlの濃度に希釈
し、この希釈溶液100μ１を各ウェル中で振とうしなが
ら室温で１時間インキュベートした。液体を吸引し、プ
レートを再度上記のように３回洗った。色素ABTS をEn
zymun Test 基質バッファー中に1mg/mlの濃度で溶解
し、100μl/ウェルを振とうせずに室温でインキュベー
トした。約30分後、マイクロタイタープレートフォトメ
ーターで吸光度を読み取った。測定波長は405nm、基準
波長は492nmとした。ブランクは基質／色素溶液のみを
含む２つの未処理ウェルであった。２つのブランクウェ
ルの吸光度の平均値を他の全ての吸光度から差し引い
た。

２ウェルから反復測定されたサンプルの平均値を表
２、３および４に吸光度として示す。

＊測定シグナルが低いため不適当であるので示してな
い。

MlCA:GADに対するモノクローナル抗体 表３ ストレプトアビジン単量体または重合体の添加による干渉除去サンプル 無添加 1%(w/v)SA 1%(w/v)ポリSA バッファー 0.008 0.006 0.009 正常血清 0.106 0.144 0.108 干渉血清 1.390 0.108 0.087 陽性対照（MICA） 0.950 1.588 1.033 陽性血清 0.940 1.416 0.950 実施例９ （光活性化）ビオチン−SAを用いた抗HCV検査における
干渉除去 検査原理： ストレプトアビジン固相を用いる２ステップサンドイ
ッチアッセイ（Boehringer Mannheim Enzymun Test an
ti−HIV 1＋２と同様の検査手順および試薬） 第１ステップ：ビオチン化ペプチド＋サンプル 第２ステップ：壁面結合抗体と抗ヒトIgG−PODコンジュ
ゲートとの反応 第３ステップ:ABTS基質との指示薬反応 バッファー： ａ）Enzymun Test anti−HlV 1＋２からのインキュベ
ーションバッファーコア、NS4およびNS5領域由来のHCV
ペプチド±実施例６および７により製造された不活性化
ストレプトアビジン ｂ）Enzymm Test ant−HIV 1＋２からのコンジュゲー
トバッファー インキュベーション時間： 第１ステップ:1時間（サンプル＋インキュベーションバ
ッファー） 第２ステップ:1時間（十コンジュゲートバッファー） 第３ステップ:1時間（ABTSとの基質反応） サンプル： ３つの陰性血清サンプル（基準１） ６つの偽陽性抗HCV陰性サンプル ３つの陽性抗HCVサンプル（基準２） 容量： サンプル 20μｌ 他の全ての試薬 各500μ１ 検査手順： Enzymun Test anti−HIV 1＋２の検査説明書に従い2
5℃でES600にて実施。

基質測定： ES600（Boehringer Mannheim GmbH）を用いて422nmで
基質溶液を測定。吸光度を表５に示す。

＊記載せず、測定シグナルが低いため適当でない。

フロントページの続き (72)発明者 ヴィードマン，ミッシェル ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペ ンツベルグ，イン デア アウ 11番地 (56)参考文献 特開 昭60−7362（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−25552（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/53 G01N 33/543

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アビジンまたはストレプトアビジンまたは
   それらの誘導体を含有する、イムノアッセイにおいて非
   特異的相互作用を避けるための干渉除去剤。
2. 【請求項２】均一に架橋されたアビジンまたはストレプ
   トアビジン分子がアビジンまたはストレプトアビジン誘
   導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去剤。
3. 【請求項３】二官能性または多官能性化合物により架橋
   されたアビジンまたはストレプトアビジン分子がアビジ
   ンまたはストレプトアビジン誘導体として用いられる、
   請求項１に記載の干渉除去剤。
4. 【請求項４】不均一に架橋されたアビジンまたはストレ
   プトアビジン分子がアビジンまたはストレプトアビジン
   誘導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去
   剤。
5. 【請求項５】タンパク質と架橋されたアビジンまたはス
   トレプトアビジン分子が用いられる、請求項４に記載の
   干渉除去剤。
6. 【請求項６】重合タンパク質と架橋されたアビジンまた
   はストレプトアビジン分子が用いられる、請求項５に記
   載の干渉除去剤。
7. 【請求項７】均一に架橋されたアビジンまたはストレプ
   トアビジン分子がアビジンまたはストレプトアビジン分
   子として用いられる、請求項５または６に記載の干渉除
   去剤。
8. 【請求項８】アビジンまたはストレプトアビジンの断片
   または断片の混合物がアビジンまたはストレプトアビジ
   ン誘導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去
   剤。
9. 【請求項９】不活性化されたアビジンまたはストレプト
   アビジンがアビジンまたはストレプトアビジン誘導体と
   して用いられる、請求項１〜８のいずれか１つに記載の
   干渉除去剤。
10. 【請求項１０】アビジンまたはストレプトアビジンの不
    活性化がビオチンまたはビオチン誘導体で飽和すること
    により実施される、請求項９に記載の干渉除去剤。
11. 【請求項１１】不活性化がアビジンまたはストレプトア
    ビジンの活性中心を共有結合的に修飾することにより達
    成される、請求項９に記載の干渉除去剤。
12. 【請求項１２】共有結合修飾のために活性中心の少なく
    とも１つのアミノ酸が誘導体化されるか、またはビオチ
    ンが活性中心に共有結合される、請求項11に記載の干渉
    除去剤。
13. 【請求項１３】ビオチンが光活性化可能なビオチン、例
    えばビオチン−DADOO−AB、によって活性中心に共有結
    合される、請求項12に記載の干渉除去剤。
14. 【請求項１４】活性中心が個々のまたは数個のアミノ酸
    残基の置換、欠失または挿入のような遺伝子工学的手法
    により不活性化される、請求項９に記載の干渉除去剤。
15. 【請求項１５】不活性化されたアビジンまたはストレプ
    トアビジンが固相に結合されたビオチンおよび／または
    アビジンまたはストレプトアビジンでさらに精製された
    ものである、請求項９〜14のずれか１つに記載の干渉除
    去剤。
16. 【請求項１６】イムノアッセイにおいて、請求項１〜15
    のいずれか１つに記載の干渉除去剤を使用する方法。
17. 【請求項１７】アビジンまたはストレプトアビジンが結
    合成分として用いられるイムノアッセイにおいて、請求
    項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤を使用する
    方法。
18. 【請求項１８】（１）サンプルを （ａ）請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤 （ｂ）被検体の１種または数種の特異的結合相手 と接触させ、そして （２）被検体と特異的結合相手から形成された複合体
    を、該被検体の存在の指標として測定する、ことを含ん
    でなるサンプル中の被検体の測定方法。
19. 【請求項１９】前記方法の少なくとも１つの結合成分が
    アビジン／ビオチンまたはストレプトアビジン／ビオチ
    ンによりカップリングされ、そしてこの結合成分のカッ
    プリングが干渉除去剤の添加前に行われる、請求項18に
    記載のサンプル中の被検体の測定方法。
20. 【請求項２０】（１）サンプルを （ａ）請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤 （ｂ）被検体の１種または数種の特異的結合相手 と接触させ、そして （２）被検体と特異的結合相手から形成された複合体
    を、該被検体の存在の指標として測定する、ことを含ん
    でなり、その際、サンプルを（ａ）および（ｂ）と同時
    に接触させることからなるサンプル中の被検体の測定方
    法。
21. 【請求項２１】（１）干渉除去剤としての請求項１〜15
    のいずれか１つに記載のアビジンまたはストレプトアビ
    ジン誘導体、および （２）被検体の少なくとも１つの特異的結合相手を含有
    する、サンプ中の被検体の測定方法に用いるテストコン
    ビネーション。
22. 【請求項２２】前記の方法が測定のために必要とする他
    の全ての試薬をさらに含有する、請求項21に記載のテス
    トコンビネーション。
23. 【請求項２３】アビジンまたはストレプトアビジンを修
    飾し、場合により、固相に結合させたビオチンおよび／
    またはアビジンまたはストレプトアビジンで精製するこ
    とを含んでなる、請求項９〜15のいずれか１つに記載の
    干渉除去剤の製造方法。
24. 【請求項２４】アビジンまたはストレプトアビジン誘導
    体が、アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心を
    ビオチンまたはビオチン誘導体で飽和させるか、または
    該活性中心を共有結合的に修飾し、そして固相に結合さ
    せたビオチンおよび／またはアビジンまたはストレプト
    アビジンで精製することにより得られる、不活性化され
    たアビジンまたはストレプトアビジンである請求項１に
    記載の干渉除去剤。
25. 【請求項２５】アビジンまたはストレプトアビジン誘導
    体が，アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心を
    光活性化可能なビオチン誘導体で飽和させ、続いて光反
    応を開始させてビオチン誘導体を共有結合させることに
    より得られる、ビオチンが該活性中心に結合され、さら
    に該活性中心の外側に共有結合で結合されている、不活
    性化されたアビジンまたはストレプトアビジンである請
    求項１に記載の干渉除去剤。
26. 【請求項２６】ビオチン誘導体がビオチン−DADOO−AB
    である、請求項25に記載の干渉除去剤。