JPH09510289A - イムノアッセイで使用するための干渉除去剤 - Google Patents
イムノアッセイで使用するための干渉除去剤Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はイムノアッセイにおいて非特異的相互作用を避けるための干渉除去剤に関し、該干渉除去剤としてアビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体を用いることを特徴とする。
Description
【発明の詳細な説明】
イムノアッセイで使用するための干渉除去剤
本発明は、イムノアッセイ用の干渉除去剤としてのアビジンまたはストレプト
アビジンまたはそれらの誘導体、ならびにこの干渉除去剤を用いる被検体の検査
法に関するものである。
近年、免疫学的検出方法は非常に重要になってきている。こうした方法は生物
学的サンプル中の薬物、ホルモン、タンパク質、感染性生物、とりわけ特異的抗
体、の存在を迅速かつ正確に検出するために用いられる。免疫学的検出方法では
いつでも、第１の特異的結合相手と、検出しようとする物質（被検体）と、第２
の特異的結合相手（被検体と特異的に反応するか、またはそれと結合する）との
間で特異的結合反応が起こる。その過程で、被検体と特異的被検体結合相手（い
わゆる特異的結合対の相手同士）が特異的結合対を形成するのであるが、一般的
には抗原と抗体または抗体断片との複合体を形成する。その際、それぞれの反応
において１より多い被検体または結合相手を互いと反応させることが可能である
。これらの特異的結合反応はさまざまな方法で検出できる。普通は特異的結合反
応の一方の当事者を標識する。通常の標識方法には放射性同位元素、色素原、蛍
光原、酵素標識、またはその後特異的結合対（例えば、ビオチン／ストレプトア
ビジン）を形成しうる物質が用いられる。不均一イムノアッセイにあっては一方
の結合相手を固相に固定化する。
イムノアッセイを実施するうえで重要となる問題は、固相のいくつかの状況下
において、イムノアッセイの特異的結合相手とサンプル中に存在する別の成分と
の間で望ましくない相互作用や非特異的結合反応が起こりうることである。こう
した相互作用はバックグラウンドシグナルの増加に加えて大きなシグナル散乱を
も引き起こすのが常であり、その結果、関係する試験の感度や特異性を低下させ
る。さらに、標識された結合相手との非特異的相互作用から、また、サンプル成
分による試験成分の特異的結合からも、偽陽性の測定結果が生じることがある。
すなわち、測定シグナルが誤って増加する結果、被検体が存在しないときでさえ
も、それが存在すると見なされてしまう。
イムノアッセイでのこうした非特異的相互作用を減らそうとして多くの試みが
なされてきた。これまで、各種炭水化物成分、各種タンパク質、タンパク質混合
物またはタンパク質画分、およびそれらの加水分解物はイムノアッセイにおける
試験成分と被検体との非特異的相互作用を減ずることが知られている（例えば、
Robertson ら，Journal of Immun．Meth．26，1985，195; EP-A-260903; US-A-4
,931,385参照）。粗製のタンパク質画分や粗製の加水分解物の使用には、そこに
含まれる成分がその後の試験において他の干渉を引き起こすという欠点がある。
さらに、酵素法によって生成された加水分解物は、それらの製造に用いたプロテ
アーゼで汚染されていることがあり、また、加水分解開裂を制御することが難し
いこともあって均一な品質のものが得られない。汚染物質としてのプロテアーゼ
は試験成分を攻撃して、少量でさえも試験官能性および貯蔵安定性を損じる結果
となる。
また、イムノアッセイにおける非特異的相互作用の軽減のために化学修飾され
たタンパク質（特に、スクシニル化またはアセチル化タンパク質）を用いること
も記述されている（US-A-5,051,356; EP-A-0 525 916）。しかし、これらの物質
を用いて血清から抗体を検査する場合に、多くの偽陽性の結果を避けることはで
きなかった。
EP-A-0 331 068およびWO 91/06559 には、リウマチ因子のごとき特定の干渉因
子を減らすために、重合させた免疫グロブリン（特にＩｇＧ）を用いることが記
述されている。しかし、それらは全ての干渉相互作用を満足のゆく程度になくす
ことができない。その上、ヒト抗体試験に非特異的なヒト免疫グロブリン（単量
体もしくは重合体の抗体またはその断片）を加えることはブランク値の増加につ
ながる。さらに、ヒトまたは動物ＩｇＧの生産には時間と費用がかかる。
従って、本発明の目的は、イムノアッセイにおける非特異的相互作用による干
渉を減らすための、従来技術で知られているものよりも優れた、新規な干渉除去
物質および干渉除去剤を提供することであった。非特異的相互作用は、測定結果
を誤りへと導くような、こうした方法の諸成分間の全ての相互作用として理解さ
れる。この干渉除去物質は特に抗体検査の際の偽陽性の分析結果を回避すべきで
ある。とりわけ、イムノアッセイにおいて結合相手としてアビジンまたはストレ
プトアビジンを用いるときの干渉を回避することが意図される。
この目的は干渉除去剤としてのアビジンまたはストレプトアビジンまたはそれ
らの誘導体により達成された。驚いたことに、これらの物質を用いると、アッセ
イ、特に結合相手としてアビジンまたはストレプトアビジンを用いるアッセイに
おいて干渉が取り除かれた。
それゆえ、本発明は、アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導
体を含むアッセイで非特異的相互作用を避けるための干渉除去剤、ならびにこう
した干渉除去剤のアッセイでの使用に関するものである。アビジンまたはストレ
プトアビジンまたはそれらの誘導体は本発明に従って可溶性形態で用いられる。
それらは固相にも酵素のようなマーカー基にも結合したり、カップリングしたり
していない。本発明による干渉除去剤は常に検査に必要な試薬類のほかに用いら
れるもので、試験反応中に形成される、検出すべき被検体と特異的結合相手から
なる複合体の一成分とはなり得ない。本発明による干渉除去剤は免疫学的試験（
イムノアッセイ）において使用することが好ましい。しかし、核酸試験のような
他の相互作用をベースとした試験でも用いることができる。好ましくは、免疫学
的試験や核酸試験の場合は、一つの試験成分がアビジンまたはストレプトアビジ
ンで被覆された固相のごときアビジンまたはストレプトアビジンに結合される試
験において干渉除去剤が用いられる。アビジンまたはストレプトアビジンは天然
に存在する精製タンパク質または組換え体のアビジンまたはストレプトアビジン
として理解される。アビジンまたはストレプトアビジンの誘導体は修飾されたア
ビジンまたはストレプトアビジン分子として理解される。この修飾は、第一に、
個々のアビジンまたはストレプトアビジン分子を架橋させて、いわゆるポリＳＡ
または均一に架橋されたＳＡを形成することにより実施される。以後、ＳＡは常
にアビジンまたはストレプトアビジンを指す。ＳＡの架橋または重合方法は当業
者に公知である。特に、加熱処理による架橋や２官能性もしくは多官能性化合物
による架橋が適している。２官能性もしくは多官能性化合物は同一でも異なって
いてもよい少なくとも２個の官能基を有する分子として理解され、これら官能基
によってＳＡの官能基（例えば、ある種のアミノ酸残基または炭水化物残基）と
反応できるものである。本発明の範囲内の適当なリンカーの代表例を以下の表１
に掲げておく。
第二に、この修飾は他の高分子量分子、特にイムノアッセイで干渉を減らすた
めにしばしば用いられるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または免疫グロブリンの
ようなタンパク質、へのカップリングでありうる。この架橋ではいわゆる不均一
に架橋されたＳＡが得られる。この方法に続いてこの複合体中のＳＡおよび／ま
たはタンパク質を重合させることができる。これらの分子にＳＡをカップリング
する方法は当業者に公知である。ＤＳＳ、ＳＡＭＢＡ、ＳＡＴＰ、ＭＨＳ、ＳＡ
ＴＡによるカップリングが特に適しているとわかった。ＢＳＡとＳＡまたはポリ
ＳＡとの複合体は干渉除去剤として特に好ましいものである。重合ＢＳＡをＳＡ
やポリＳＡにカップリングするときには、さらに良好な成果が得られる。ＢＳＡ
の重合または架橋は上述したＳＡの架橋法により実施できる。EP-A 0331 127 に
記載されるような加熱処理による重合が最も適している。
第三に、ＳＡの修飾は活性中心、すなわちビオチン結合部位、の不活性化であ
りうる。これはいわゆる不活性化ＳＡを形成させる。不活性化はビオチンまたは
ビオチン誘導体（アビジンまたはストレプトアビジンと結合するもの）を用いて
結合部位を単に飽和させることにより実施できる。ビオチンに対するＳＡの親和
力は非常に高いので、イムノアッセイで使用するとき、結果的に干渉を起こすよ
うなビオチンの放出はほとんどない。好ましくは、活性中心が共有結合的に修飾
される。その場合には、ＳＡの活性中心にある１個または複数個のアミノ酸残基
を誘導体化して、ビオチンへの結合を大幅に低下させるか、または完全に阻止す
るようにする。ＳＡのビオチン結合部位を不活性化する方法は、Gitlinら，Bioc
hem．J．269（1990）527-530に記載されて、知られている。好ましくは、ＳＡの
活性中心にあるチロシン残基をフッ化ｐ−ニトロベンゼンスルホニルで修飾する
。ＳＡのビオチン結合部位を不活性化する別の方法は、その結合部位にビオチン
を共有結合させることである。ＳＡの活性中心へのビオチンの結合方法は当業者
に公知である。光活性化可能な新規なビオチン誘導体を用いてＳＡにビオチンを
結合させる新しい方法が特に有利であると判明した。光活性化可能なビオチン誘
導体は知られている。EP-A-0 155 854およびEP-A-0 187 323にはアジド置換フェ
ニル類／ニトロフェニル類が記載されており、これらをアミン含有リンカーでビ
オチンに結合させる。好ましくは、ビオチン誘導体としてビオチン-DADOO-
AB（ビオチン-[8-(4-アジドベンゾイル)-アミノ-3,6-ジオキサオクチル]アミド
）を用いる。その他のビオチン誘導体は、Boehringer Mannheim Biochemica cat
alogue order no．1292633および1292641に記載されている。ＳＡのビオチン結
合部位をビオチン誘導体で飽和させた後で光反応を開始させると、ビオチンが活
性中心に共有結合で固定される。この不活性化ＳＡにおいては、ビオチンが活性
中心に結合され、さらに活性中心の外側に共有結合で結合される。この方法によ
り得られるＳＡビオチン生成物は本発明の主題でもある。
ＳＡの活性中心を不活性化する他の方法は、遺伝子工学的操作により結合部位
を修飾することである。ＳＡの活性中心は個々のアミノ酸残基の、または短いア
ミノ酸残基の断片の置換、欠失または挿入により修飾し不活性化することができ
る。好ましくは、活性中心にあるチロシン残基のような個々のアミノ酸が他のア
ミノ酸で置換される。しかし、結合部位が一部または全部存在しないＳＡを製造
することも可能である。遺伝子工学的操作を用いてＳＡを修飾および製造する方
法は当業者に知られている。例えば、組換えストレプトアビジンの製造はEP-A-0
198 015に記載されている。
第四に、この修飾はＳＡの断片化によって実施できる。ＳＡ断片は化学的もし
くは酵素的開裂により、または組換え体生産により得ることができる。その場合
、特にビオチン結合部位が上述したように不在でありうる。断片化の利点は生成
物の溶解度が向上することである。好ましくは、アビジンまたはストレプトアビ
ジンから化学的または酵素的開裂により得られた全ての断片を混合物として用い
て、ＳＡの全てのまたはほぼ全ての部分が存在するようにする。
このようにして不活性化または断片化されたＳＡは、ＳＡを修飾するための上
記の第一または第二の方法において使用できる。すなわち、不活性化ＳＡを続い
て重合させたり、ＢＳＡやポリＢＳＡのような他の分子と架橋させたりすること
が可能である。ＳＡを修飾するにあたって上記方法の少なくとも２つの組合せを
用いて製造された干渉除去剤が特に有利であるとわかった。
上記方法の１つによるＳＡの修飾が完了した後で、残存しているビオチン結合
活性、アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心に結合されないで表面に共
有結合されたビオチン、または遊離のビオチンを、アビジンまたはストレプトア
ビジン誘導体の適当な精製法により除くことが可能である。例えば、これは固相
に結合させたビオチンおよび／またはＳＡへの吸着により実施できる。
かくして、本発明はさらに、上記の修飾方法の１つを行い、続いて、好ましく
は固相に結合させたビオチンおよび／またはＳＡへの吸着により、精製を行って
残存しているビオチン結合活性、アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心
に結合されないで表面に共有結合されたビオチン、または遊離のビオチンを除去
することによって得られるアビジンまたはストレプトアビジンの誘導体に関する
。
さらに、本発明は、上記の３方法のうちの少なくとも１つによりＳＡを修飾し
、その後場合により、上記のごとく精製して残存しているビオチン結合能、表面
に共有結合されたビオチン、または遊離のビオチンを除去することを含んでなる
、本発明による干渉除去剤の製造方法に関する。
アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体を用いて、あらゆる
一般的なイムノアッセイまたは核酸アッセイにおいて干渉を軽減させることがで
きる。それらは特に、アビジンまたはストレプトアビジンが一結合成分として用
いられるイムノアッセイまたは核酸アッセイで干渉を減らすのに適している。こ
うしたイムノアッセイは例えば、Guesdonら，J．Histochem．Cytochem．27（197
9）1131-1139および Bayer and Wilchek，Analytical Biochemistry 171（1988
）1-32により知られている。干渉は、例えば、ヒトの血清中に時おり存在するア
ビジンまたはストレプトアビジンに対する抗体によって引き起こされる。しかし
ながら、本発明による干渉除去剤はアビジンやストレプトアビジンを用いないイ
ムノアッセイにおいても顕著な効果を奏する。こうしたイムノアッセイでは、Ｂ
ＳＡやポリＢＳＡのような別の分子に結合されたＳＡ（上記の第二の修飾方法に
相当する）を用いることが特に有利であると分かった。本発明の干渉除去剤は、
常に、検査に必要とされる試薬類のほかに用いられるもので、ＳＡ被覆固相や酵
素−ＳＡ結合体のような、検査に含まれる可能性があるアビジンまたはストレプ
トアビジン成分と同一ではない。これらのＳＡ試薬類とは対照的に、本発明の干
渉除去剤は被検体と特異的結合相手からなる検出すべき複合体中に取り込まれる
ことはない。
本発明はさらに、
(1) サンプルを
(a) アビジンまたはストレプトアビジンまたはその誘導体
(b) 被検体の１種または数種の特異的結合相手
と接触させ、そして
(2) 被検体と特異的結合相手から形成された複合体を、該被検体の存在の指標
として測定する、
ことによるサンプル中の被検体の測定方法に関する。
被検体は、ハプテン、抗原、抗体、核酸などの少なくとも１つの特異的結合相
手と複合体を形成すべく反応するあらゆる物質であり得る。本発明による方法は
抗体、とりわけ自己抗体、を検出するのに特に適している。
一般には、サンプルは血液、血漿、血清、唾液、尿といった体液であり得る。
被検体と特異的に結合して複合体を形成し得る特異的結合相手として、どのよ
うな生物学的または化学的結合相手を使用してもよい。こうしたものには抗体、
抗体断片、抗原、ハプテン、ホルモン、アビジン、ビオチン、核酸、オリゴヌク
レオチド、またはそれらの誘導体が挙げられる。本発明においては、抗体もしく
は抗原またはそれらの断片を被検体の結合相手として用いることが好ましい。
被検体と特異的結合相手とからなる複合体を検出するには、当業者に知られた
あらゆる方法を用いることができる。結合相手が全て可溶性形態で存在する均一
系の方法、例えば、形成された複合体の濁度測定やネフェロメトリー（比濁分析
）による沈殿法、またはＣＥＤＩＡ、ＥＭＩＴもしくはＦＰＩＡ原理に基づくイ
ムノアッセイが利用可能である。また、少なくとも１つの試薬が固相に結合され
ている不均一系の方法も適している。その例としては、結合対の一方の相手が例
えばラテックスに結合されている凝集試験、サンドイッチアッセイ、特異的抗体
（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、風疹ウイルス、トキソプラズマ、グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼまたはチログロブリンに対する抗体）を検出するためのＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡまたはイムノメトリックアッセイがある。沈殿法は別として、これら
の全ての方法では、特異的結合相手の１つが標識される。その標識には測定可能
なシグナルを直接発生するものがあり、例えば、放射性同位体、化学発光、蛍光
もしくは電気化学発光標識、あるいは金属ゾル粒子や着色または未着色ラテッ
クスのような着色粒子である。また、この標識は間接的なシグナルを発生するも
のであってもよく、例えば、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識がある。
イムノアッセイは、特に結合相手の１つがＳＡを介して固相に結合されている
場合、試験片やバイオセンサーを用いて実施できる。プラズモン共鳴の原理に基
づくイムノアッセイでも、本発明に従って干渉を軽減しうる。
被検体の検査法では、１つの試薬がアビジンまたはストレプトアビジン／ビオ
チンのような特異的結合対を介して固相に結合されることが多い。その利点は、
いくつかの検査法でその固相を普遍的に使用できることにある。また、特異的結
合対によってアッセイの一成分に標識を結合させることもできる。例えば、酵素
をアビジンかストレプトアビジンに結合させ、そして結合相手（例えば抗体）を
ビオチン化する。こうした検査法の例は当業者に公知である。本発明によるアビ
ジンまたはストレプトアビジン誘導体は、アビジン／ビオチンまたはストレプト
アビジン／ビオチンによる反応成分の間接的結合を利用する検査法において干渉
を軽減させるのに特に適している。
被検体の検査法はワンステップでも数ステップでも実施できる。すなわち、被
検体と個々の試験成分とのインキュベーションを同時に行っても逐次行ってもよ
い。ビオチン結合部位が不活性化されていないアビジン、ストレプトアビジンま
たはその誘導体を用いる場合は、結合成分がアビジン／ビオチンまたはストレプ
トアビジン／ビオチンにより結合される方法を実施するに際して、アビジン、ス
トレプトアビジンまたはその誘導体を添加する前にアビジン／ビオチンまたはス
トレプトアビジン／ビオチンによる結合成分の結合がすでに完了しているように
注意すべきである。なぜならば、非不活性化ビオチン結合部位がビオチン化結合
成分に結合して干渉を起こす恐れがあるからである。例えば、アビジンまたはス
トレプトアビジン固相を用いるのであれば、最初に被検体のビオチン化特異的結
合相手を添加し、その後でサンプルをアビジン、ストレプトアビジンまたはその
誘導体と共に加える必要がある。ビオチン結合部位が不活性化されている本発明
のアビジンまたはストレプトアビジン誘導体を用いるときは、ビオチン化試薬が
そのアビジンまたはストレプトアビジン誘導体に結合することはないから、全部
の検査試薬を同時にインキュベートすることが可能である。従って、この不活性
化されたアビジンまたはストレプトアビジン誘導体は考え得るあらゆる検査法に
おいて普遍的に使用でき、それゆえ好ましいものである。
試験混合物中の本発明の干渉除去剤の濃度は0.0001〜１％（ｍ／ｖ）、好まし
くは0.01〜１％（ｍ／ｖ）である。
被検体検査法のそれぞれの反応成分は有利にはテストコンビネーションまたは
テストキットの形で提供される。従って、本発明の別の主題はアビジン、ストレ
プトアビジン、またはその誘導体および被検体の少なくとも１つの特異的結合相
手を含んでなる、サンプル中の被検体の検査法で用いるためのテストコンビネー
ションである。さらに、このテストコンビネーションはその検査法を実施するの
に必要な他の全ての試薬類、例えば、バッファー、界面活性剤、標識、酵素基質
のような標識を検出するための補助物質、固相などを含んでいてもよい。本発明
の干渉除去剤と被検体の１以上の結合相手とは別個の容器に収納することが好ま
しい。ビオチン結合部位が不活性化されている本発明の干渉除去剤を用いるので
あれば、その干渉除去剤を被検体の結合相手に直接添加してもよい。
本発明について以下の実施例でさらに詳しく説明することにする。実施例１ 重合ストレプトアビジンの製造
重合ストレプトアビジンはEP-A-0 331 127に従って製造した。
マレイミド−ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによるス
トレプトアビジンの活性化：
30mgのストレプトアビジンを３mlの30mMリン酸カリウム/100mM塩化ナトリウム
（pH7.1）に溶解し、25℃に加熱した。DMSO中の0.15mlのマレイミド-ヘキサノイ
ル-N- ヒドロキシスクシンイミドエステル(MHS)(Boehringer Mannheim GmbH)(10
mg/ml)を攪拌しながら滴下した。25℃で１時間反応させた後、溶液を氷浴中で冷
却した。続いて、生成されたMHS-ストレプトアビジンを１リットルの50mMリ
ン酸カリウム/100mM塩化ナトリウム(pH5.0)に対して４℃で２回透析した。
Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物によるストレプトアビジンの活性化：
30mgのストレプトアビジンを３mlの100mM リン酸カリウム(pH7.8)に溶解し、2
5℃に加熱した。DMSO中の0.175ml のS-アセチルメルカプトコハク酸無水物(SAMB
A)(10mg/ml)攪拌しながら滴下した。25℃で３時間反応させた後、生成されたSAM
BA-ストレプトアビジンを１リットルの50mMリン酸カリウム/2mMEDTA(pH6.5)に対
して４℃で２回透析した。
ストレプトアビジンの均一架橋：
３mlの活性化SAMBA-ストレプトアビジン溶液(10mg/ml)を25℃に加熱し、50μl
の1Mヒドロキシルアミン(pH6.5)と混合した。25℃で30分後、この溶液に15mlの
50mMリン酸カリウム/100mM塩化ナトリウム/1mM EDTA（pH6.5）を添加して希釈し
た。３mlの活性化MHS-ストレプトアビジン(10mg/ml)を添加することによりスト
レプトアビジンの均一架橋を開始させた。注意深く攪拌しながら25℃で２時間反
応させた後、0.2ml の100mM システイン/HClを添加して反応を停止させた。25℃
で30分インキュベートした後、この溶液のpH値を1Mリン酸水素二カリウムの添加
により7.5 に調整した。0.2ml の500mM ヨードアセトアミドの添加後、25℃でさ
らに１時間インキュベートした。次いで、これを３リットルの50mMリン酸カリウ
ム/100mM塩化ナトリウム(pH7.5)に対して４℃で２回透析した。透析後、このコ
ンジュゲートを限外濾過により濃縮し、スクロース(8%)を添加した後に凍結乾燥
した。実施例２ サーモ-BSA-SAの製造
サーモ-BSA-SA（thermo-BSA streptavidin）はEP-A-0 331 127に従って製造し
た。
BSA の架橋によるサーモ-BSAの製造：
1.0gのBSA を100ml の20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解し、70℃
の温度で５時間保った。続いてそれを20℃に冷却して、100mM リン酸カリウムバ
ッファー(pH7.8)に対して透析した。
SAMBA によるサーモ-BSAの活性化：
68mgのサーモ-BSAを２mlの0.1Mリン酸カリウムバッファー(pH7.8)に溶解し、
それを0.38mlのSAMBA(DMSO 中10mg/ml)と徐々に混合した。25℃で3.5時間反応さ
せた後、１リットルの50mMリン酸カリウムバッファー(pH6.5)に対して４℃で透
析した。
サーモ-BSA-SA コンジュゲートの製造：
ストレプトアビジンとサーモ-BSAとの不均一な架橋は実施例１に記載した均一
架橋と同様に行った。この方法では、60mgの活性化MHS-ストレプトアビジン（実
施例１に従って製造）を68mgのSAMBA-サーモ-BSAと反応させた。反応生成物をゲ
ル濾過（Superose 6 調製用グレード）で精製し、限外濾過により濃縮した。得
られた生成物をその後凍結乾燥した。実施例３ 遊離のビオチンによるサーモ-BSA-SA の飽和
6.0ml の100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した60mgのサーモーB
SA-SAを、0.5ml の10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.8)に溶解した２mgのD-ビ
オチンと混合し、１時間攪拌した。
遊離のビオチンをゲル濾過（Superose 6）により分離した。高分子タンパク質
画分を10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に対して透析し、8%スクロースの
添加後に凍結乾燥した。実施例４ 共有結合的に修飾されたストレプトアビジンの製造
ストレプトアビジン／アビジンの活性中心にあるチロシン残基を、G．Gitlin,
E.A．Bayer，M．Wilchek: Studies on the biotin-binding sites of Avidin an
d Streptavidin（アビジンとストレプトアビジンのビオチン結合部位に関する研
究）；Biochem．J．(1990)，269，527-530に従ってフッ化ｐ−ニトロベンゼンス
ルホニルを用いて誘導体化した。
0.1Mトリス-HClバッファー(pH7.9)中に10mg/ml のタンパク質濃度で溶解した
１ｇのストレプトアビジンに、ストレプトアビジンサブユニットに対して200 倍
モル過剰量のフッ化ｐ−ニトロベンゼンスルホニルを添加した。添加後、この混
合物を25℃でさらに18〜20時間攪拌した。次いで、未反応の誘導体化試薬を分離
するために、生成物を500 倍容量以上のPBS バッファー(pH7.5)に対して透析し
た（４℃で16〜18時間）。実施例５ 光活性化可能なビオチンの製造
ビオチン-[8-(4-アジドベンゾイル)アミノ-3,6- ジオキサオクチル]アミド
(ビオチン-DADOO-AB)の合成：
蒸留直後の50mlのDMFに、攪拌しながら、1.50g(4mmol)のビオチノイル-1,8-ジ
アミノ-3,6- ジオキサオクタン（ビオチン-DADOO，Boehringer Mannheim GmbH）
を溶解した。この溶液に、1.04g(4mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミジル-(4-ア
ジドベンゾエート)(HSAB，Boehringer Mannheim GmbH)および0.55ml(4mmol)のト
リエチルアミンを順次加え、20℃で２時間攪拌した。続いてロータリーエバポレ
ーターでオイルポンプ減圧下に溶媒を除去し、残留する粗生成物をシリカゲルで
クロマトグラフィーにより精製した。そのために、粗生成物をできる限り少量の
クロロホルム／メタノール 2/l(v/v)中に約40℃へわずかに加熱しながら溶解し
、シリカゲル60（Merck社，ドイツ）カラム（4x60cm）にかけた。これをクロロ
ホルム／メタノール 2/l(v/v)で溶出し、50mlの画分をプールした。純粋な生成
物を含む画分をTLC（下記のシステム）で調べ、プールした。溶媒をロータリー
エバポレーターで除去し、半固体の残留物を約50mlのジイソプロピルエーテルで
ダイジェスト(digest)した。微細な結晶質の、無色の生成物を吸引濾過し、減圧
乾燥器（0.1〜0.15バール／40℃）に入れて一夜乾燥させた。
収量： 1.24g(理論量の60%)
TLC： シリカゲル60(Merck)F254，クロロホルム／メタノール
2/1(v/v);
Rf=0.711
H-NMR(100MHz/d6-DMSO): δ（ppm）= 1.20-1.65(m,6H); 2.07(tr,2H); 2.60-
3.65(m,15H); 4.05-4.20(m,2H); 6.38(d,br,2H);
7.20(d,2H); 7.62(tr,br,1H); 7.91(d,2H); 8.53
(tr,br,1H)
UV(CH3OH)： λ（max）= 267nm
IR(KBr)： υ= 2125 cm-1
ビオチン-DADOO-AB の合成経路を図１に示す。実施例６ （光活性化）ビオチン／ストレプトアビジンの製造
ストレプトアビジンを光活性化可能なビオチン誘導体（例：ビオチン-DADOO-A
B）と反応させ、未結合の遊離のビオチンを除くため透析を行った。Hg蒸気ラン
プ(350〜700nm)で照射して光反応を開始させ、ビオチンをストレプトアビジンの
結合中心に共有結合で固定させた。
PBS バッファー(pH7.5)中に20mg/ml のタンパク質濃度で溶解した１g のスト
レプトアビジンに、10倍モル過剰量のビオチン-DADOO-AB 試薬（DMSO中の25mg/m
l ビオチン-DADOO-AB のストック溶液3.5ml）を加えた。添加後、光を遮断して2
5℃で２時間攪拌した。
光を遮断して500倍容量以上のPBSバッファー(pH7.5)に対して４℃で20時間透
析することにより、未結合の遊離のビオチン誘導体を完全に分離した（もはや検
出不能）。次いで、この混合物を攪拌しながらHg蒸気ランプ(350〜700nm)を使っ
て溶液の経路長＜５cmで20分間照射し、続いて500倍容量以上のPBSバッファー(p
H7.5)に対して４℃で16〜18時間透析した。実施例７ 不活性化ストレプトアビジン、サーモBSA-SA、並びにそれらの誘導体および断片 の精製
BSA-ビオチン吸着剤の製造：
PBS バッファー(pH8.5)中に10mg/ml のタンパク質濃度で溶解した１g のBSAに
、10倍モル過剰量のD-ビオチノイル-ε-アミノカプロン酸-N- ドロキシスクシン
イミドエステル（Boehringer Mannheim GmbH）を加えた。
添加後、この混合物を25℃で２時間攪拌し、次いでリシンを10mMの最終濃度と
なるまで加えて反応を停止させた。500倍容量以上のPBSバッファー(pH7.5)に対
して４℃で16〜18時間透析することにより、未結合の遊離のビオチン誘導体を完
全に分離した（もはや検出不能）。
40g のアミノ-Spherosil（Boehringer Mannheim GmbH）に300ml のグルタルジ
アルデヒド(10%)を加え、この混合物を回転させながらpH3.7、55℃で２時間攪拌
した。この懸濁物を７倍Spherosil 容量以上の再蒸留水および５倍Spherosil容
量のPBSバッファー(pH8.0)で洗った。続いてこの活性化Spherosil をBSA-ビオチ
ン（タンパク質供給量５〜10mg／ml Spherosil）と室温で20時間振とう下に反応
させた。
未反応のタンパク質溶液をガラス吸引濾過器で分離し、吸着剤物質を10倍Sphe
rosil 容量の0.9% NaCl 溶液で洗い、５倍Spherosil 容量のエタノールアミン溶
液とともに１時間インキュベートした。
次に吸着剤物質を５倍Spherosil 容量の0.9% NaCl 溶液で洗い、３倍Spherosi
l 容量の1Mプロピオン酸およびpH6.5 とするのに十分な30mM NaCl 溶液で洗った
。この吸着剤をPBS バッファー(pH7.5)で適度に平衡化した。
ストレプトアビジン−Spherosil 吸着剤の製造：
40g のアミノ-Spherosil（Boehringer Mannheim GmbH）に300ml のグルタルジ
アルデヒド(10%)を加え、この混合物を回転させながらpH3.7、55℃で２時間攪拌
した。この懸濁物を７倍Spherosil 容量以上の再蒸留水および５倍Spherosil容
量のPBSバッファー(pH8.0)で洗った。続いてこの活性化Spherosil をストレ
プトアビジン（タンパク質供給量５〜10mg／ml Spherosil）と室温で20時間振と
う下に反応させた。
未反応のタンパク質溶液をガラス吸引濾過器で分離し、吸着剤物質を10倍Sphe
rosil 容量の0.9% NaCl 溶液で洗い、５倍Spherosil 容量のエタノールアミン溶
液とともに１時間インキュベートした。次に吸着剤物質を５倍Spherosil 容量の
0.9% NaCl 溶液、３倍Spherosil 容量の1Mプロピオン酸およびpH6.5 とするのに
十分な30mM NaCl 溶液で洗った。この吸着剤をPBS バッファー(pH7.5)で適度に
平衡化した。
Spherosil をベースとしたウシ血清アルブミン(BSA)-ビオチンおよび／または
ストレプトアビジン吸着剤でのクロマトグラフィーを用いて、実施例３、４また
は６による残留活性（ビオチン結合性）を有するストレプトアビジン、残留する
遊離のビオチン、または（結合ポケットに固定化されたビオチンとは対照的に）
表面に共有結合で接近可能なビオチンを有するストレプトアビジンから不活性化
ストレプトアビジンを精製した。
PBS バッファー(pH7.5)で平衡化した１mlのストレプトアビジン-Spherosil吸
着剤を10mgのタンパク質につき反応混合物に加え、25℃で２時間攪拌した。
次に懸濁物をカラムに移し、カラム材料をPBS バッファー(pH7.5)で洗った。
この方法では、UVモニターを使ってＡ280nmでカラムの出口にてタンパク質含量
を監視した。タンパク質が含まれなくなるまで洗った。タンパク質を含む溶出物
を一画分として回収した。
PBS バッファー(pH7.5)で平衡化した１mlのウシ血清アルブミン−ビオチン(BS
A-Bi)-Spherosil吸着剤を、タンパク質を含むストレプトアビジン吸着剤の溶出
物に10mgのタンパク質につき加え、それを室温で２時間攪拌した。
この懸濁物をカラムに移し、PBS バッファー(pH7.5)で洗った。この方法では
、UVモニターを使ってＡ280nmでカラムの出口にてタンパク質含量を監視した。
タンパク質を含む溶出物が生成物を含むものであり、一画分として回収した。生
成物（不活性化（ポリ）ストレプトアビジンまたはサーモ-BSA-SA またはそれら
の誘導体もしくは断片）を20mg/ml のタンパク質濃度に濃縮し、小分けした後で
凍結乾燥した。実施例８ ビオチン化抗原およびサンプルに関しての逐次試験法でのGAD 抗体検査の実施
サーモ-BSA-ストレプトアビジンをプレコーティングしたマイクロタイタープ
レートの各ウェルに、それぞれのバッチにつき最適濃度（Boehringer Mannheim
g/ml）で、ブタ脳から単離してビオチン化したグルタミン酸デカルボキシラーゼ
(GAD)100 μl をピペットで分注し、室温で30分インキュベートした。その後プ
レートを0.1%(w/v)CHAPSO(3-[3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-2-ヒ
ドロキシ-1- プロパンスルホネート）を毎回添加した 50mmol/l リン酸カリウ
らのインキュベーションバッファーで1+25に希釈し、これにそれぞれの量のサー
モ-BSA-ストレプトアビジン（未処理または不活性化）またはストレプトアビジ
ン単量体またはストレプトアビジン重合体（未処理または不活性化）を加えた。
このように希釈したサンプルをマイクロタイタープレート中で100 μl/ウェルの
容量にて振とうしながら室温で１時間インキュベートした。続いてサンプルを吸
引し、プレートを上記のように３回洗った。ヒトIgG に対して結合特異性を有す
ュゲートバッファーで75mU/ml の濃度に希釈し、この希釈溶液 100μl を各ウェ
ル中で振とうしながら室温で１時間インキュベートした。液体を吸引し、プレー
ー中に１mg/ml の濃度で溶解し、100 μl/ウェルを振とうせずに室温でインキュ
ベートした。約30分後、マイクロタイタープレートフォトメーターで吸光度を読
み取った。測定波長は405nm、基準波長は492nmとした。ブランクは基質／色素溶
液のみを含む２つの未処理ウェルであった。２つのブランクウェルの吸光度の平
均値を他の全ての吸光度から差し引いた。
２ウェルから反復測定されたサンプルの平均値を表２、３および４に吸光度と
して示す。
実施例９ （光活性化）ビオチン-SA を用いた抗HCV 検査における干渉除去 検査原理
：
ストレプトアビジン固相を用いる２ステップサンドイッチアッセイ（
薬）
第１ステップ： ビオチン化ペプチド＋サンプル
第２ステップ： 壁面結合抗体と抗ヒトIgG-POD コンジュゲートとの反応
第３ステップ： ABTS基質との指示薬反応バッファー
：
コア、NS4およびNS5領域由来のHCV ペプチド
±実施例６および７により製造された不活性化ストレプトアビジン
インキュベーション時間：
第１ステップ： １時間（サンプル＋インキュベーションバッファー）
第２ステップ： １時間（＋コンジュゲートバッファー）
第３ステップ： １時間（ABTSとの基質反応）サンプル
：
３つの陰性血清サンプル（基準１）
６つの偽陽性抗HCV 陰性サンプル
３つの陽性抗HCV サンプル（基準２）容量
：
サンプル 20μl
他の全ての試薬 各500 μl検査手順
：
基質測定：
ES 600（Boehringer Mannheim GmbH）を用いて422nm で基質溶液を測定。吸光
度を表５に示す。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９６年１月５日
【補正内容】実施例３ 遊離のビオチンによるサーモ-BSA-SA の飽和
6.0ml の100mM リン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した60mgのサーモ-BS
A-SA を、0.5ml の10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.8)に溶解した２mgのD-ビ
オチンと混合し、１時間攪拌した。
質画分を10mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に対して透析し、8%スクロース
の添加後に凍結乾燥した。実施例７ 不活性化ストレプトアビジン、サーモBSA-SA、並びにそれらの誘導体および断片 の精製
BSA-ビオチン吸着剤の製造：
PBSバッファー(pH8.5)中に10mg/ml のタンパク質濃度で溶解した１g のBSAに
、10倍モル過剰量のD-ビオチノイル-ε-アミノカプロン酸-N- ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（Boehringer Mannheim GmbH）を加えた。
添加後、この混合物を25℃で２時間攪拌し、次いでリシンを10mMの最終濃度と
なるまで加えて反応を停止させた。500 倍容量以上のPBS バッファー(pH7.5)に
対して４℃で16〜18時間透析することにより、未結合の遊離のビオチン誘導体を
完全に分離した（もはや検出不能）。
ジアルデヒド(10%)を加え、この混合物を回転させながらpH3.7、55℃で２時間
温で20時間振とう下に反応させた。
未反応のタンパク質溶液をガラス吸引濾過器で分離し、吸着剤物質を10倍
アミン溶液とともに１時間インキュベートした。
液で洗った。この吸着剤をPBS バッファー(pH7.5)で適度に平衡化した。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，Ｋ
Ｒ，ＵＳ
(72)発明者 ヴィードマン，ミッシェル
ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン
ツベルグ，イン デア アウ 11番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体を含有する、イム ノアッセイにおいて非特異的相互作用を避けるための干渉除去剤。 ２．均一に架橋されたアビジンまたはストレプトアビジン分子がアビジンまたは ストレプトアビジン誘導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去剤。 ３．二官能性または多官能性化合物により架橋されたアビジンまたはストレプト アビジン分子がアビジンまたはストレプトアビジン誘導体として用いられる、請 求項１に記載の干渉除去剤。 ４．不均一に架橋されたアビジンまたはストレプトアビジン分子がアビジンまた はストレプトアビジン誘導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去剤。 ５．タンパク質と架橋されたアビジンまたはストレプトアビジン分子が用いられ る、請求項４に記載の干渉除去剤。 ６．重合タンパク質と架橋されたアビジンまたはストレプトアビジン分子が用い られる、請求項５に記載の干渉除去剤。 ７．均一に架橋されたアビジンまたはストレプトアビジン分子がアビジンまたは ストレプトアビジン分子として用いられる、請求項５または６に記載の干渉除去 剤。 ８．アビジンまたはストレプトアビジンの断片または断片の混合物がアビジンま たはストレプトアビジン誘導体として用いられる、請求項１に記載の干渉除去剤 。 ９．不活性化されたアビジンまたはストレプトアビジンがアビジンまたはストレ プトアビジン誘導体として用いられる、請求項１〜８のいずれか１つに記載の干 渉除去剤。 10．アビジンまたはストレプトアビジンの不活性化がビオチンまたはビオチン誘 導体で飽和することにより実施される、請求項９に記載の干渉除去剤。 11．不活性化がアビジンまたはストレプトアビジンの活性中心を共有結合的に修 飾することにより達成される、請求項９に記載の干渉除去剤。 12．共有結合修飾のために活性中心の少なくとも１つのアミノ酸が誘導体化され るか、またはビオチンが活性中心に共有結合される、請求項11に記載の干渉除去 剤。 13．ビオチンが光活性化可能なビオチン、例えばビオチン-DADOO-AB、によって 活性中心に共有結合される、請求項12に記載の干渉除去剤。 14．活性中心が個々のまたは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入のよう な遺伝子工学的手法により不活性化される、請求項９に記載の干渉除去剤。 15．不活性化されたアビジンまたはストレプトアビジンが固相に結合されたビオ チンおよび／またはアビジンまたはストレプトアビジンでさらに精製されたもの である、請求項９〜14のいずれか１つに記載の干渉除去剤。 16．イムノアッセイにおける請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤の 使用。 17．アビジンまたはストレプトアビジンが結合成分として用いられるイムノアッ セイにおける請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤の使用。 18．(1) サンプルを (a) 請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤 (b) 被検体の１種または数種の特異的結合相手 と接触させ、そして (2) 被検体と特異的結合相手から形成された複合体を、該被検体の存在の指 標として測定する、 ことを含んでなるサンプル中の被検体の測定方法。 19．前記方法の少なくとも１つの結合成分がアビジン／ビオチンまたはストレプ トアビジン／ビオチンによりカップリングされ、そしてこの結合成分のカップリ ングが干渉除去剤の添加前に行われる、請求項18に記載のサンプル中の被検体の 測定方法。 20．(1) サンプルを (a) 請求項１〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤 (b) 被検体の１種または数種の特異的結合相手 と接触させ、そして (2) 被検体と特異的結合相手から形成された複合体を、該被検体の存在の指 標として測定する、 ことを含んでなり、その際、サンプルを(a)および(b)と同時に接触させること からなるサンプル中の被検体の測定方法。 21．(1) 請求項１〜15のいずれか１つに記載のアビジンまたはストレプトアビジ ン誘導体、および (2) 被検体の少なくとも１つの特異的結合相手 を含有する、サンプル中の被検体の測定方法に用いるテストコンビネーション 。 22．前記の方法が測定のために必要とする他の全ての試薬をさらに含有する、請 求項21に記載のテストコンビネーション。 23．アビジンまたはストレプトアビジンを修飾し、場合により、固相に結合させ たビオチンおよび／またはアビジンまたはストレプトアビジンで精製することを 含んでなる、請求項９〜15のいずれか１つに記載の干渉除去剤の製造方法。 24．アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心をビオチンまたはビオチン誘 導体で飽和させるか、または該活性中心を共有結合的に修飾し、そして固相に結 合させたビオチンおよび／またはアビジンまたはストレプトアビジンで精製する ことにより得られる、不活性化されたアビジンまたはストレプトアビジン。 25．アビジンまたはストレプトアビジンの活性中心を光活性化可能なビオチン誘 導体で飽和させ、続いて光反応を開始させてビオチン誘導体を共有結合させるこ とにより得られる、ビオチンが該活性中心に結合され、さらに該活性中心の外側 に共有結合で結合されている、不活性化されたアビジンまたはストレプトアビジ ン。 26．ビオチン-DADOO-ABがビオチン誘導体として用いられる、請求項25に記載の 不活性化されたアビジンまたはストレプトアビジン。
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