JP2001511820A - サイクロスポリン誘導体およびその使用 - Google Patents
サイクロスポリン誘導体およびその使用Info
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Classifications
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、改良されたタンパク接合体および加水分解安定性を有する新規なサイクロスポリンC(CsC)誘導体を提供する。本発明はさらに担体例えば固体支持体へ接合されたCsC誘導体を提供する。好ましくは、固体支持体はラテックスまたは磁性粒子である。
Description
【発明の詳細な説明】
サイクロスポリン誘導体およびその使用本発明の背景
1.本発明の分野
本発明は、改良されたタンパクおよび固相表面接合性と加水分解安定性を有す
る新規なサイクロスポリン誘導体に関する。本発明のサイクロスポリン誘導体は
サイクロスポリンAのアッセイ測定において、またサイクロスポリン免疫原およ
び捕捉接合体の製造において有用である。
2.背景
サイクロスポリンA(シクロスポリン)は、腎臓、心臓、骨髄および肝臓のよ
うなヒトに移植された臓器の拒絶を防止するためアメリカ合衆国および他の国々
において広く使用されている強力な免疫抑制剤である。
同種移植拒絶を防止するため、患者の生涯を通じて血中の最低サイクロスポリ
ンAレベルが必要である。慢性的な高投与量は腎臓および肝臓損傷を発生し得る
。この薬物の分布および代謝は個人間で、または1人の個人でも治療のコースの
間に大きく変化する。それ故同種移植受領者の血液もしくは血清中のサイクロス
ポリンAレベルのモニタリングは必須と考えられる。
サイクロスポリンの検出のための研究室方法が開発されている。これら技術は
典型的には高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ラジオイムノアッセイ(
RIA)および非ラジオイムノアッセイ
を含む。
CsA自体は非免疫原的であることが報告されている(Donatsh,P.
et al.,J.Immuno Assay 1981;2:19)。それ故
抗体を得るためには、CsAをタンパク担体へ連結することが必要である。しか
しながらCsAの側鎖は大部分脂肪族基から構成されている。官能基の少数が慣
例的にハプテンを担体へ連結するために使用された。サイクロスポリンC(Cs
C)は位置2にスレオニン残基を持っているので、以前の研究者は免疫原性Cs
Cタンパク接合体を製造した。タンパクへの連結はエステル基によりヘミスクシ
ネートリンカーを介していた(US特許No.5,169,773)。加えて、
ヘミスクシネートカップリング化学はCsCを安定化した二酸化クロム粒子のよ
うな固相支持体へ固定化するために使用された(US特許No.5,151,3
48)。例えば、ヘミスクシネートリンカーの短い鎖長、サイクロスポリンCヘ
ミスクシネート分子の疎水性およびヘミスクシネートエステルの加水分解不安定
性を含む多数の要因のため、CsCヘミスクシネート誘導体はタンパクおよび固
相表面へ貧弱にしか接合しない。さらに、CsCタンパク接合体およびヘミスク
シネートカップリングによって固相支持体へ固定化したCsCは加水分解的に不
安定である。このように、そのようなヘミスクシネートCsC誘導体を用いて開
発されたイムノアッセイは低い感度および貧弱な試薬安定性を蒙むる。もっとた
くましいそして感受性のCsAのためのイムノアッセイによって広く使用されて
いるラジオイムノアッセイおよびHPLC方法を置き換える強い要望が存在する
。従ってこの分野において、固相支持体および担体へもっと効率的にそして安定
に接合することができるサイクロスポリン誘導体に対して需要が存在する。本発明の概要
本発明は、改良されたタンパク接合性および加水分解安定性を有する新規なサ
イクロスポリンC(CsC)誘導体を提供する。本発明はさらに、担体、例えば
固相支持体へ接合されたCsC誘導体を提供する。
本発明はまた、シクロスポリンを含有する疑いがあるサンプル、例えば全血中
のシクロスポリンレベルの測定のためのアッセイの改良を提供する。
さらに本発明は、シクロスポリンの測定のためのアッセイを実施するためのキ
ットを含んでいる。本発明はまた、本発明のCsC誘導体を含んでいるシクロス
ポリン免疫原および捕捉接合体の製造を提供する。本発明の詳細な説明
本発明は以下の構造を有するサイクロスポリンC(CsC)に関する。式中、Xは、からなる群から選ばれ、Yは、
−CH2−;からなる群から選ばれ、Zは、
R1およびR2は各自C1−C8アルキル基であり、R3はC0−C8アルキル基であ
り、そしてmは1〜200である。
本発明の特定の具体例は以下の構造を有するCsC誘導体を含んでいる。
本発明のCsC誘導体は、ジスクシンイミジルカーボネートを用いてCsC位
置2ヒドロキシ基を活性化し、次いで例えばエチレングリコールビス(2−アミ
ノエチル)エーテル(DA−10)のようなジアミンリンカーのようなリンカー
とカップリングすることによって製造された。以下のスキームは本発明のCsC
誘導体の合成へのこの操作の適用を例証する。 上に記載したスキームに使用される出発物質は既知であるか、または商業的に
入手し得る。
本発明のCsC誘導体は全血サンプル中のサイクロスポリンAレベルの測定の
ためのイムノアッセイに使用することができる。
そのようなアッセイの一例は、
(a)サイクロスポリンAを含有する全血サンプル中の赤血球を溶解し、
(b)溶解した全血サンプルを過剰の標識した、例えばβ−D−ガラクトシダー
ゼ標識した抗サイクロスポリン抗体と標識抗体−サイクロスポリンA複合体が生
成するように接触させ、
(c)ステップ(b)において生成した混合物を固体支持体上に固定した本発明
のサイクロスポリン誘導体を含んでいる固相と接触させることによって複合体か
ら未結合抗体を分離し、そして
(d)もしβ−D−ガラクトシダーゼ標識が用いられるならば、例えばクロロフ
ェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド(CPRG)およびレゾルフィン
−β−D−ガラクトピラノシド(ReG)よりなる群から選ばれたβ−D−ガラ
クトシダーゼ基質を用いて、サイクロスポリンAの測定として複合体中の標識の
量を測定するステップよりなる。
本発明の酵素連結イムノアッセイは、サイクロスポリンAを投与されている患
者の全血サンプル中のサイクロスポリンAレベルを測定するために有用である。
サイクロスポリンA血液レベルのモニタリングおよびその後のサイクロスポリン
A投与調節は、高いサイクロスポリンA血液レベルによって生ずる毒性効果を防
止し、そして低いサイクロスポリンA血液レベルによって生ずる臓器拒絶を防止
するために必要である。
本発明のイムノアッセイは、サイクロスポリンAを含有する溶解した全血サン
プルを例えばβ−D−ガラクトシダーゼ標識した過剰の標識した抗サイクロスポ
リン抗体と、サイクロスポリンAと標識抗体との複合体および遊離標識抗体を含
んでいる反応混合物を生成するように接触させ、反応混合物を固体支持体、例え
ば磁性粒子上に固定した本発明のCsC誘導体を含んでいる固相と接触させるこ
とにより、反応混合物から遊離抗体を分離し、液相から固相を分離し、そしても
しβ−D−ガラクトシダーゼ標識が使用されるならば液相へβ−D−ガラクトシ
ダーゼ基質として例えばCPRGまたはReGを加えることにより液相中の結合
した標識の量を測定することによって実施される。
特に、サイクロスポリンAを含んでいる全血サンプルの赤血球はサイクロスポ
リンAを遊離するため溶解されなければならない。赤血球溶解は超音波、洗浄剤
溶解および蒸留水溶解のような多数の方法によって達成することができる。選ば
れる溶解剤は標識した抗サイクロスポリン抗体と両立性でなければならない。あ
る種の洗浄剤はβ−D−ガラクトシダーゼを変性し得るけれども、β−D−ガラ
クトシダーゼ基質としてCPRGおよびReGを使用することにより、サンプル
容積を洗浄剤の変性効果を最小にするように十分に少なくすることができること
が発見された。好ましい溶解方法は洗浄剤を使用する。
溶解後、溶解した全血サンプルを過剰の標識した抗サイクロスポリン抗体と接
触させ、そして標識した抗体がサンプル中のサイクロスポリンAの全部と、複合
体を形成するのを許容するのに十分な時
間および温度において反応混合物をインキュベートすることによって反応混合物
が生成される。これは通常室温で1〜5分かかる。抗サイクロスポリン抗体は商
業的に入手し得るか、既知方法によって調製し得るか、または本発明の誘導体を
使用して調製することができる。抗サイクロスポリン誘導体はポリクローナルま
たはモノクローナルであることができる。サイクロスポリンAに対し特異性のモ
ノクローナル抗サイクロスポリン抗体が好ましい。抗サイクロスポリン抗体は、
標準的技術を使用し、例えば放射性アイソトープ、酵素のような触媒(例えばβ
−D−ガラクトシダーゼ)、補酵素、フルオレッサー、染料またはケミルミネッ
サーのような発色原、非磁性もしくは磁性であることができる分散し得る粒子、
固体支持体、リポソーム、リガンド、ハプテン等を含む、検出し得る分子で標識
することができる。
未結合抗サイクロスポリン抗体は、反応混合物を固体支持体上に固定化した本
発明のCsC誘導体を含む固相と、未結合標識抗体が固定化したCsC誘導体と
複合体を形成することを許容するのに十分な時間接触させることにより、反応混
合物から分離される。これは通常約1分内に発生する。
本発明のCsC誘導体の固定化は多数の既知の固定化技術によって達成するこ
とができる。本発明の誘導体のための好ましい固定化技術は、例えば2−フルオ
ロ−1−メチルピリジニウムp−トルエンスルホネート(FMPT)を用いて末
端カルボキシル基を活性化し、次に固体支持体へ共有結合し得るアルブミンまた
はグロブリンのようなタンパクへ連結することである。
CsC誘導体は、デキストランビーズ、アガロースビーズ、ポリ
アクリルアミドまたはガラスのような多種類の固体支持体上に固定化することが
できる。本発明のイムノアッセイにおいて有用な好ましい固体支持体は米国特許
5,151,348および5,302,532に記載されている。
好ましい固体支持体は、それらの表面へ結合したサイクロスポリンを有する安
定化した二酸化クロム粒子を含む。好ましい固体支持体に有用なこの安定化二酸
化クロム粒子は米国特許4,661,408に記載されているものである。これ
ら粒子はアルミナで被覆され、ホウ酸塩を含んでいるシリカでさらに被覆され、
そしてウシガンマグロブリンのようなサイクロスポリン−タンパク接合体がそれ
へ結合されるシランでさらに被覆された、大きく面積を減らされたルチル型二酸
化クロムのコアよりなる。これら粒子は大きい表面積40〜100m2/gを有
し、水溶液中で安定で、そしてサイクロスポリン接合体へ容易に結合することが
できる。
支持体は多孔質もしくは非多孔質水不溶性材料であることもできる。支持体は
親水性であるか、または親水性とすることができ、そしてシリカ、硫酸マグネシ
ウムおよびアルミナのような無機粉末;天然ポリマー材料、特に繊維含有紙例え
ば濾紙、クロマトグラフィー用紙のようなセルロース材料およびセルロースから
誘導された材料;ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリレート、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメ
タクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ナイロン、ポリ(ビニルブチ
レート)等のような合成もしくは変性した天然ポリマーを含み、それ自体または
他の材料、ガラス、セラミックス、金属等と組合せて使用される。
固相は液相から標準的分離技術によって分離される。好ましくは分離技術は磁
性粒子を液相から沈降させるため磁石を使用することである。
サイクロスポリンAの量は液相中の結合した標識の量を測定することによって
決定される。例えば、結合したβ−D−ガラクトシダーゼの量は、液相へβ−D
−ガラクトシダーゼ基質としてCPRGまたはReGを加え、そして577nm
において生成した発色団の量を分光測光的に測定することによって決定される。
本発明のイムノアッセイは人力によって実施することができ、またはそれはD
imensionTMRxL(非連続臨床アナライザー)、イリノイ州ディヤフィ
ールドのDade International Inc.の登録商標)のよう
な種々の自動または半自動機器へ適応化することができる。DimensionTM
RxL上のアッセイの実施において、全血サンプルは最初に溶解され、そして
機器上のクベット中で過剰のβ−D−ガラクトシダーゼ標識抗サイクロスポリン
抗体とプレインキュベートされる。本発明のCsC誘導体を固定化した安定化二
酸化クロム粒子の既知量がクベット中へ移され、そして一定期間インキュベート
され、液相から磁性粒子を分離するために磁石が使用される。上清の液相は、全
血サンプルからのサイクロスポリンAと複合化したβ−D−ガラクトシダーゼ標
識した抗サイクロスポリン抗体を含んでいる。上清の分画がピペットされ、そし
て577nmにおける吸光度測定の直前にCPRGまたはReGを加えた他のク
ベットへ移される。
本発明はさらに、一般に5,000より大きい分子量の化合物である担体また
は標識へ接合されたCsC誘導体を提供する。担体は
ポリアミノ酸、リポポリサッカライドおよび粒子を含む。このCsC接合体はア
ッセイにおける捕捉接合体として、または免疫原として多数の用途に使用するこ
とができる。担体は免疫原的、すなわち免疫原的担体であることができる。
ポリ(アミノ酸)は一般に約5,000の分子量からの範囲であり、分子量上
限を持たないが、通常10,000,000以下、普通約600,000ダルト
ンより大きくない。
ポリ(アミノ酸)免疫原材料として種々のタンパクタイプを使用することがで
きる。これらのタイプはアルブミン、血清タンパク例えばグロブリン、眼レンズ
タンパク、リポタンパク等を含む。例示的タンパクはウシ血清アルブミン、キー
ホールリムペットヘモシアニン、卵オバルブミン、ウシガンマグロブリン等を含
む。代わって合成ポリ(アミノ酸)を使用することができる。
免疫原担体は、モノサッカライドの反復縮合によって形成された高分子量ポリ
マーであるポリサッカライドであることもできる。ポリサッカライドの例は、デ
ンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴム、寒天のような炭水化物ガム
等である。ポリサッカライドはポリアミノ酸残基および/またはリピット残基を
含むこともできる。
免疫原単体はまた、単独でまたは上記のポリ(アミノ酸)またはポリサッカラ
イドの一つへ接合した核酸であることができる。
担体は粒子であることもできる。粒子は一般に少なくとも0.02ミクロンで
ありそして約100ミクロンより大きくなく、通常少なくとも約0.05ミクロ
ンでそして約20ミクロン以下であり、好ましくは約0.3ないし10ミクロン
直径である。粒子は有機ま
たは無機、膨潤性または非膨潤性、多孔質または非多孔質、好ましくは水に大体
等しい密度の一般に約0.7から約1.5g/mlのものでよく、そして透明、
部分的に透明または不透明であることができる材料で構成されることができる。
粒子は、例えば赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、ストレプトコッカ
ス、スタフイロコッカスアウレウス、E.coli,ウイルス等の細胞および微
生物のような生物学的材料であることができる。粒子はまた、有機および無機ポ
リマー、リポソーム、ラテックス粒子、リン脂質小胞、キロミクロン、リポタン
パク、クロム等よりなる粒子であることができる。
粒子は天然に存在する材料、合成的に変性された天然存在材料および合成材料
から誘導することができる。特に関心ある有機ポリマーはポリサッカライド、特
にセファロースとして入手し得るアガロース、セファデックスおよびセファクリ
ルとして入手し得るデキストランのような架橋ポリサッカライド、セルロース、
デンプル等,ポリスチレン、ポリビニルアルコール、アクリレートおよびメタク
リレートの誘導体のホモポリマーおよびコポリマー,特に遊離ヒドロキシル基官
能を有するエステルおよびアミド等である。
粒子は通常多官能であり、そしてCsC誘導体へ結合するかまたは結合し得る
であろう。多種類の官能基が利用できるかまたは導入できる。官能基はカルボン
酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプ
ト基等を含む。多種類の化合物を粒子へ結合する方法は良く知られており、そし
て文献中に多数例示されている。例えばCautrecasas,J.Biol
.Chem.(1970)245:3059を見よ。
担体は信号発生システムの一部である酵素であることができる。信号発生シス
テムの機能は結合したおよび結合しない標識の量に関連した検出し得る信号を提
供する生産物を生成することである。酵素を使用する場合、含まれる反応は大部
分加水分解または酸化還元反応である。使用し得るそのような酵素はハイドロラ
ーゼ、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼまたはシンセタ
ーゼおよびオキシドレダグターゼであり、好ましくはハイドロラーゼである。代
わってほたるルシフェラーゼおよびバクテリアルシフェラーゼのようなルシフェ
ラーゼを使用してもよい。
標識は検体または抗体へ、または他の分子へ接合した任意の分子でよい。本発
明においては、標識は信号発生手段を含んでいる信号発生システムのメンバーで
あることができる。標識はアイソトープまたは非アイソトープでよく、好ましく
は非アイソトープである。限定でなく例示として、標識は酵素のような触媒、補
酵素、フルオレッサー、染料またはケミルミネッサーのようなクロモゲン、非磁
性もしくは磁性であることができる分散し得る粒子、固体支持体、リガンド、ハ
プテン等であることができる。
信号発生システムは二以上の成分持つことができ、少なくとも一成分は標識で
ある。信号発生システムは、信号を発生するように標識と相互作用することがで
きる信号発生手段を含んでいる、測定可能な信号を発生するのに要するすべての
試薬を含んでいる。
信号発生システムは外部手段により、通常電磁線の測定により、望ましくは目
視によって検出し得る信号を提供する。大部分について、信号発生システムは発
色団基質および酵素を含み、この場合発色団基質は紫外または可視域の光を吸収
する染料、リン光団または
フルオレッサーへ酵素的に変換される。
信号発生手段は検出可能な信号を発生するように標識と相互作用することがで
きる。そのような手段は、例えば電磁線、熱、化学試薬等を含む。化学試薬が使
用される場合、化学試薬のあるものは発色溶液の一部として含めることができる
。化学試薬は基質、補酵素、エンハンサー、第2の酵素、アクチベーター、助因
子、インヒビター、スキャベンジャー、金属イオン、信号発生物質の結合のため
に必要な特異性結合物質等を含むことができる。補酵素、酵素製品と反応する物
質、他の酵素および触媒等のような一部の化学試薬は他の分子または支持体へ結
合することができる。
標識を含んでいる信号発生システムは、少なくとも約50nmそして約50ミ
クロンより大きくない、通常少なくとも約100nmで約25ミクロン以下の、
好ましくは約0.2ないし5ミクロン直径の不溶性粒子である、一種以上の粒子
を含むことができる。粒子は有機または無機の、多孔質または非多孔質の、好ま
しくは水に大体等しい密度の、好ましくは約0.5ないし約1.5g/mlのも
のでよく、そして透明、部分的に透明とまたは不透明であることができる材料で
構成される。
標識はまた、直接に、または慣用方法により粒子へ結合した蛍光化合物もしく
はフルオレッサーによって蛍光性であることができる。フルオレッサーは通常C
sC誘導体へまたは粒子へ結合することができるか、またはそれらを結合できる
ように官能化することができるであろう。
本発明のCsC誘導体は上に論じそして実施例に述べた反応を使用して接合体
を調製するために利用することができる。
本発明の他の一面は、免疫原担体へ接合したCsC誘導体に応答して調製した
抗体を含む。さらに本発明はそのような抗体と標識の接合体を含む。
抗体は他の分子へ特異的に結合し、そしてそれにより他の分子の特定の空間的
および極性組織と相補的であると定義される。抗体はモノクローナルまたはポリ
クローナルであることができ、そして宿主の免疫化そして免疫グロブリンをそれ
から既知技術によって分離することができる血清の採取のようなこの分野でよく
知られた技術(ポリクローナル)により、または連続細胞ラインを調製し、分泌
されたタンパクを採取すること(モノクローナル)によって調製することができ
る。抗体は完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含むことができ、そ
のような免疫グロブリンはIgA,IgD,IgE,IgG1,IgG2a,I
gG2bおよびIgG3,IgMのような種々のクラスおよびイソタイプを含む
。そのフラグメントはFab,Fv,F(ab’)2,Fab’等を含み得る。
モノクローナル抗体は、MilsteinおよびKohlerにより論ぜられ
、そしてNature,256:495−497,1975に報告されたプロセ
スによって得ることができる。
本発明の抗体はサイクロスポリンAおよびサイクロスポリンの誘導体と代謝物
を含んでいるサイクロスポリン類を認識する。
本発明の抗体はサイクロスポリンを含む疑いのあるサンプル中のサイクロスポ
リンの測定に利用することができる。このアッセイは、サンプルをサイクロスポ
リンに対する抗体と接触させ、そして抗体とサイクロスポリンとの免疫複合体を
直接または間接に検出するステップを含むことができる。本発明によって提供さ
れる改良は、
サイクロスポリンに対する抗体として本発明の抗体の使用にある。免疫複合体は
、例えば使用される抗体が標識へ接合されている場合は直接検出される。免疫複
合体は信号発生システム上で、または本発明の抗体へ特異的に結合する標識抗体
を使用することにより、アッセイ媒体中の免疫複合体生成の効果を調べることに
よって間接的に検出される。
サイクロスポリンを含有する疑いあるサンプル中のサイクロスポリンの測定の
ためのアッセイの他の形態においては、サンプルはサイクロスポリンに対する抗
体およびそして該抗体によって認識される本発明の接合体と接触される。この方
法は接合体と抗体との免疫複合体を直接または間接に検出することをさらに含む
。本発明によって提供される改良は標識へ接合した本発明のCsC誘導体を使用
することにある。
本アッセイ発明はサイクロスポリンのためのすべてのイムノアッセイに用途を
有する。アッセイはどのアッセイ成分または生成物の分離なし(均質)または分
離あり(不均質)で実施することができる。不均質アッセイの例は酵素結合イム
ノソーベントアッセイ(ELISA)のような酵素結合イムノアッセイである。
“Enzyme−Immunoassay”by Edward T.Magg
io,CRC Press Inc.,Boca Raton,Fla.,19
80を見よ。均質イムノアッセイは、酵素マルチプライドイムノアッセイ技術(
例えば米国特許3,817,837を見よ)、米国特許3,993,345に開
示されているようなイムノ蛍光法、米国特許4,233,402に開示されてい
るような酵素チャンネリング技術、および前出Maggio中で論じている他
の酵素イムノアッセイによって例示される。
本明細書を通じて引用されている参考文献は参照としてここに取り入れられる
。
本発明は以下の実施例によってさらに例証される。これら実施例は本発明の理
解を助けるために提供され、そしてその限定として考えてはならない。
実施例1CsC−DA−10の合成
マグネチックスターラーを備えた25mL丸底フラスコに、CsC540mg
とDSC(ジスクシンイミジルカーボネート)454mgを入れ、次に乾燥アセ
トニトリル10mLとトリエチルアミン1000μLを加えた。反応はTLC(
薄層クロマトグラフィー)でCsCが見られなくなる迄室温で約16〜20時間
攪拌された。もし反応が16〜20時間後終了しなかったならば、DSCの50
mgをさらに溶液へ加え、反応をTLC(95%EtOAcと5%MeOHをT
LC溶媒として使用し、スポットを可視化するためにヨウ素を使用した。)によ
って2時間後に再びチェックした。次に溶液へDA−10の2627mg(すば
やく)と、トリエチルアミン1000μLを加えた。反応は室温で他の24時間
の間攪拌され、そして次にCH2Cl250mLが加えられた。反応溶液を水で3
回洗った。底の有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥した。回転蒸発および真
空により全部の溶媒の除去の後、CsC−DA−10の白色固体が得られた。
実施例2CsC−DA−10−ヘミグルタルネート(HG)の合成
20mLバイアルに、CsC−DA−10約550mgと、グルタルアルデヒ
ド93.75mgと、CH2Cl210mLとを入れた。トリエチルアミン344
μLを加え、そして反応溶液を室温で約2時間攪拌した。次に反応溶液へCH2
Cl240mLを加え、1N HClで2回そして水で2回洗った。有機層を硫
酸で乾燥し、そして全部の溶媒の除去後固体のCsC−DA−10−HGを得た
。
実施例3ウシガンマグロブリン(IgG)でのCsC−DA−10−HGの接合
A:ウシガンマグロブリン溶液4mg/mL:0.1M Na2CO3(pH9.
5)125mL中に溶解したIgG500mg
B:2−フルオロ−1−メチルピリジニウムp−トルエンスルホネート(FMP
T)でのCsC−DA−10−HGの活性化
CsC−DA−10−HG134mg(0.0894mmol)と、FMPT
38.1mg(0.1345mmol)を秤取した。固体を溶解するため乾燥C
H3CN4800μLを加えた。次にTEA28.1μLを加えた。反応は室温
で2時間攪拌された。
C:タンパクヘCsC−DA−10−HGのカップリング
上の活性化したCsC−DA−10−HG溶液を攪拌下ウシガンマグロブリン
溶液4mg/mLへ加え、次の液滴を加える前に各液滴が分散するのを許容した
。添加が終了した後、溶液を室温で約18時間ゆるくかきまぜるのを許容した。
溶液はPBS緩衝液の6回交換に対し冷室中で透析(12,000MWカットオ
フ透析チューブ)された。透析した溶液は新鮮な透析PBS緩衝液を加えること
によってタンパク濃度2mg/mLへ希釈された。容器へブロントポール324
mgを加え、それが完全に溶解しそして均一に分散するまでかきまぜられた。
実施例4磁性粒子へCsC−ウシガンマグロブリン接合体のカップリング
上のCsC−IgG接合体40mLをグルタルアルデヒド活性化二酸化クロム
溶液40mLへ加えた。(活性化二酸化クロム粒子の製造の詳しい操作は米国特
許4,661,408に開示されており、その開示は参照としてここに取り入れ
られる。)反応は4℃において24時間回転された。溶液へ30%BSAが加え
られ、反応は室温で他の16〜20時間回転された。2Mグリシン緩衝液112
mLが反応を約1時間停止するために上の溶液へ加えられた。溶液は水で3回、
そしてクロム希釈液で3回洗浄された。二酸化クロム粒子はクロム希釈液で40
mLへ希釈された。
クロム希釈液:
重合したBSA(30%) 15.1g/L
トレハロース 28.7g/L
カルボワックス 4.8g/L
プロクリン 5g/L
硫酸ネオマイシン 0.06g/L
本発明をその好ましい具体例を含めて詳細に記載した。しかしながら、当業者
はこの開示を考慮する時、請求の範囲に述べた本発明の精神および範囲から逸脱
することなくそれに対し修飾および改良をなし得ることが認められるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 47/48 C07K 16/44
C07K 16/44 G01N 33/53 G
G01N 33/53 A61K 37/02
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下の構造の化合物: 式中、Xは、からなる群から選ばれ、Yは、 −CH2−;からなる群から選ばれ、Zは、 R1およびR2は各自C1−C8アルキル基であり、R3はC0−C8アルキル基であ り、そしてmは1〜200である。 2.下記構造の化合物: 式中、nは2〜3であり、mは2〜5であり、pは2〜3である。 3.下記構造の化合物:式中、nは2〜3であり、mは2〜5であり、pは2〜3である。 4.全血サンプル中のサイクロスポリンAレベルの測定のための酵素連結イム ノアッセイ方法であって、 (a)サイクロスポリンAを含有する全血サンプル中の赤血球を溶解し、 (b)溶解した全血サンプルを過剰の標識した抗サイクロスポリン抗体と標識抗 体−サイクロスポリンA複合体が生成するように接触させ、 (c)ステップ(b)において生成した混合物を固体支持体上に固定した請求項 1のサイクロスポリン誘導体を含む固相と接触させることによって複合体から未 結合抗体を分離し、そして (d)複合体中の標識の量をサイクロスポリンAの測定として測定する、 ステップを含んでいるイムノアッセイ方法。 5.標識はβ−D−ガラクトシダーゼである請求項4のイノムアッセイ方法。 6.サイクロスポリンAの測定としての複合体中のβ−D−ガラクトシダーゼ 標識の量は、クロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシドおよびレゾ ルフィン−β−D−ガラクトピラノシンドからなる群から選ばれたβ−D−ガラ クトシダーゼ基質を添加することによって測定される請求項5のイムノアッセイ 方法。 7.固相は安定化した二酸化クロム粒子である請求項1のイムノアッセイ方法 。 8.担体と、請求項1または2または3の化合物の接合体よりなる組成物。 9.担体は免疫原性である請求項8の組成物。 10.免疫原性担体はタンパクである請求項9の組成物。 11.タンパクは、ウシ血清アルブミン、キーホールリムペットヘモシアニン およびオバルブミンからなる群から選ばれる請求項10の組成物。 12.担体は粒子である請求項8の組成物。 13.粒子は二酸化クロム粒子である請求項12の組成物。 14.請求項9の組成物に対して調製された抗体。
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