CH667274A5

CH667274A5 - Cyclosporine, ihre herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.

Info

Publication number: CH667274A5
Application number: CH1194/85A
Authority: CH
Inventors: Roland Dr Wenger; Rene P Dr Traber; Hans Dr Kobel; Hans Hofmann
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-18
Publication date: 1988-09-30
Also published as: US4639434A; FR2561651B1; HU200786B; SE8501392L; IT8547852A0; NL8500828A; GR850716B; DE3509809A1; PT80149B; FR2561651A1; NZ211526A; AT388737B; ATA86385A; CA1247546A; SE8501392D0; LU85819A1; JPS60215700A; IT1199962B; PH21868A; DK128285D0

Description

BESCHREIBUNG Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Cyclo-sporine, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeuti-20 sehe Zusammensetzungen, die diese Cyclosporine enthalten. Unter Cyclosporinen wird eine Reihe von strukturell eigenartigen, cyclischen, poly-N-methylierten Undecapepti-den bezeichnet, die üblicherweise pharmakologische Wirkungen, insbesondere immunsuppressive, entzündungshem-25 mende und antiparasitäre Wirkungen aufweisen. Das als erste isolierte Cyclosporin, und auch die Stammverbindung dieser Reihe, ist der natürliche Pilzmetabolit Cyclosporin A der Formel A,

rMeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Al a- (D )A1 a-MeLeu-MeLeu-MeVaU

1

8

10 11

(a)

worin -MeBmt- den Rest N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)threonyl der Formel B,

ch3

wCH2

(b)

ho (r) ch ch (r) ch3

—n ch—c0-

(S)

ch3

worin -x-y- für -CH = CH- (trans) steht, bedeutet.

Seit der ursprünglichen Entdeckung von Cyclosporin A wurden zahlreiche, natürliche Cyclosporine isoliert und identifiziert, und es wurden mehrere weitere in der Natur nicht vorkommende Cyclosporine durch Totalsynthese oder halbsynthetisch, oder auch durch modifizierte Kulturverfahren hergestellt. Deswegen hat die Cyclosporinreihe an Bedeutung gewonnen, und nun beinhaltet sie z.B. die natürlichen Cyclosporine A bis Z [siehe Kobel et al., European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 14,237-240 (1982) und den von Traber et al., 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, (8.-10.10.1984), präsentierten Poster], ferner verschiedene Cyclo-

55

65

sporine nicht natürlicher Herkunft, beinhaltend Dihydro-cyclosporine (worin die -x-y-Gruppe im -MeBmt-Rest -siehe obige Formel B - gesättigt ist, z.B. wie in den US-Patenten Nrn 4.108.985,4.210.581 und 4.220.641 beschrieben), Cyclosporine, worin der -MeBmt-Rest in isomerisierter oder N-demethylierter Form vorhanden ist [siehe das .Europäische Patent Nr. 0 034 567 und «Cyclosporin A», Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U.K.) September 1981, Ed. D.J.G. White, Elsevier Press (1982) - beide enthaltend das von R. Wenger entwickelte totalsynthetische Herstellungsverfahren von Cyclosporinen] und Cyclosporine, worin verschiedene Aminosäuren an bestimmten Stellen der Peptid-sequenz eingebaut wurden (siehe das Europäische Patent Nr. 0 056 782). Als Beispiele solcher, in der oben erwähnten Literatur beschriebenen Cyclosporine können erwähnt werden: [Thr]2-, [Val]2-, [Nva]2- und [Nva]2-[Nva]5-Cyclosporin (auch bekannt als Cyclosporin C, D, G bzw. M), [Dihydro-MeBmtJ'-tValp-Cyclosporin (auch bekannt als Dihydro-Cyclosporin D) und [(D)Ser]8- und [Dihydro-MeBmt]1-[(D)Ser]8-Cyclosporin.

Gemäss nun gebräuchlicher Nomenklatur für Cyclosporine werden diese in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen mit bezug auf Cyclosporin A bezeichnet. Dies erfolgt, indem man zuerst die Teile des Moleküls angibt, die von denen in Cyclosporin A abweichen, und dann durch Angabe des Wortes «Cyclosporin» die übrigen Teile, die denjenigen in Cyclosporin A entsprechen, charakterisiert. Dazu wird der Ausdruck -Dihydro-MeBmt- verwendet, zur Bezei-chung des obigen Restes der Formel B, worin -x-y- für -CH2-CH2- steht. So wird mit [Dihydro-MeBmt]1-[Val]2-Cyclosporin jenes Cyclosporin bezeichnet, das die Sequenz gemäss Formel A aufweist, worin aber -MeBmt-[Formel B, -x-y- = -CH = CH- (trans)] in Stellung 1 durch -Dihydro-MeBmt- [Formel B, -x-y- = -CH2-CH2-] und

667 274

4

-aAbu- in Stellung 2 durch -Val- ersetzt ist. In ähnlicher Weise wird mit [(D)Ser]8-Cyclosporin das Cyclosporin mit der Sequenz gemäss Formel A, worin aber -(D)Ala- in Stellung 8 durch -(D)Ser- ersetzt ist, bezeichnet.

Ferner und gemäss gebräuchlicher Praxis weisen die Aminosäuren, die durch Abkürzungen definiert werden, z. B. -Ala-, -MeVal- usw., die (L)-Konf!guration auf, insofern nichts anderes angegeben wird. Reste mit der Vorsilbe «Me» wie z. B.in -MeLeu- sind N-methylierte Reste. Die verschiedenen Reste des Cyclosporin-Moleküs werden wie in der Literatur numeriert, d. h. im Uhrzeigersinn und ausgehend von dem -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt-Rest in Stellung 1. In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird stets dieselbe Zahlensequenz verwendet.

Erfindungsgemäss wurde nun gefunden, dass neue Cyclosporine mit pharmazeutischer Anwendbarkeit erhalten werden können, worin der Rest in Stellung 8 aus einer Acyloxy-a-aminosäure mit der (D)-Konfiguration besteht.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung im breitesten Umfang ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, d.h. der Rest einer Aminosäure der (D)-Reihe, worin die Seitenkette auf dem a-Kohlenstoffatom durch Acyloxy substituiert ist.

Bevorzugt ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurerest, d.h. ein Rest einer Aminosäure der (D)-Reihe mit einer Acyloxygruppe, die über das ß-Kohlenstoffatom an der Aminosäure gebunden ist.

Bevorzugte (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurereste entsprechen der Formel II,

«2

(II)

P-X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-MeVal-i

Z -Val- oder -Nva- bedeutet und Q einen oben definierten Rest der Formel II bedeutet. In der Formel I ist Q vorzugsweise ein 0-Acyl-(D)-seryl-oder 0-Acyl-(D)-threonyl-rest, worin die Acylgruppe der For-5 mei Ri-CO- entspricht, worin Ri obige Bedeutung besitzt. Y steht vorzugsweise für -aAbu-, -Thr-, -Val- oder Nva-

Eine Gruppe von erfmdungsgemässen Cyclosporinen bilden jene der Formel I, worin Y -aAbu- oder -Nva-, Z -Val-und R2 Wasserstoff bedeuten.

io Eine weitere Gruppe von erfmdungsgemässen Cyclosporinen bilden jene der Formel I, worin Y -aAbu- oder -Nva-, Z -Nva-, Ri Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R2 Wasserstoff bedeuten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren 15 zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest, z.B. zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel I, dadurch gekennzeichnet,

20 a) dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Hydroxy-a-aminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-ß-Hydroxy-a-aminosäurerest, acyliert, z.B. dass man ein Cyclosporin der Formel III,

Rl-CO-O-CH(ß)

-NH-CH-CO-(D)

worin

Ri Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet und

R2 für Wasserstoff oder Methyl steht.

Besonders bevorzugte Cyclosporine gemäss der vorliegenden Erfindung sind jene, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein 0-Acyl-(D)-seryl- oder 0-Acyl-(D)-threonylrest ist, insbesondere ein 0-Acyl-(D)-seryl- oder 0-Acyl-(D)-threo-nylrest der obigen Formel II.

In einer Gruppe von erfmdungsgemässen Cyclosporinen ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein 0-Acyl-(D)-serylrest, insbesondere ein 0-Acyl-(D)-serylrest, worin die Acylgruppe der Formel Ri-CO- entspricht, wobei Ri obige Bedeutung besitzt.

In einer weiteren Gruppe von erfmdungsgemässen Cyclosporinen ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-ß-Acy-loxy-a-aminosäurerest, insbesondere ein 0-Acyl-(D)-seryl-rest, ganz besonders ein D-Acyl-(D)-serylrest, worin die Acylgruppe der Formel Ri-CO- entspricht, worin Ri für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, und der Rest in Stellung 5 ein (L)-Norvalylrest ist.

Ganz besonders bevorzugte Cyclosporine sind jene der Formel I,

r-X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-W-MeLeu-MeLeu-MeVal—

1 2 3

7 8

10

11

III)

worin X, Y und Z obige Bedeutung besitzen und W für einen 30 Rest der Formel IV steht,

R2

HO-CH

(IV)

-NH-CH-CO-(D)

1 2 3

7 8

10 11

(I)

worin

X -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- bedeutet, Y -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,

worin R2 obige Bedeutung besitzt, acyliert, indem man eine Ri-CO-Gruppe. worin Ri obige Bedeutung besitzt, in ß-Stel-lung einführt, oder b) dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in 45 Stellung 1 -MeBmt- ist und der Rest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurerest, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin der Rest in Stellung 1 -Dihydro-MeBmt- ist, z. B. dass man ein Cyclosporin der so Formel I, worin X für -MeBmt- steht, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin X -Dihydro-MeBmt- bedeutet.

Verfahren a) kann nach an sich bekannten Methoden für die Acylierung von Hydroxygruppen durchgeführt werden, 55 z.B. durch Umsetzung mit vorzugsweise zwei Äquivalenten, oder, falls Y = -Thr-, einem Äquivalent eines geeigneten Acyl-, Z.B. (Ci_5)Alkanoyl- oder Benozyl-Halogenids, oder entsprechenden -Anhydrids oder, zur Formylierung, durch Umsetzung mit z.B. Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid, bei 60 einer Temperatur von z.B. etwa -10 bis 50 °C. Die Umsetzung erfolgt unter wasserfreien Bedingungen, zweckmässigerweise in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid und in Anwesenheit eines Kondensationsmittels wie 4-Dimethyl-amino-pyridin. Unter 65 diesen Bedingungen findet die Acylierung auf der Hydroxy-gruppe des Aminosäurerests in Stellung 8 eher als auf der Hydroxygruppe des Aminosäurerests in Stellung 1 statt. Verfahren b) kann auf an sich für die Reduktion natürli-

5

667 274

cher Cyclosporine zu den entsprechenden Dihydrocyclospo-rinen bekannte Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch katalytische Hydrierung, z. B. nach den in der englischen Patentschrift Nr. 1.567.201 beschriebenen, allgemeinen Methoden.

Die Hydrierung erfolgt zweckmässigerweise im neutralen Bereich, bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 30 °C und unter Atmosphärendruck oder leicht erhöhtem Druck. Als Hydrierungskatalysator eignen sich z. B. Platinoxyd oder Palladium-Katalysatoren, z.B. Palladium auf Kohle. Die Hydrierung kann z.B. in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel wie Ethylacetat oder einem niederen aliphatischen Alkanol wie Methanol oder Isopropanol durchgeführt werden.

Cyclosporine mit einem ß-Hydroxy-a-aminosäurerest in Stellung 8, insbesondere [(D)Ser]8-Cyclosporine und [Di-hydro-MeBmt]1-[(D)Ser]8-Cyclosporine, die sich als Ausgangsprodukte für Verfahren a) eignen, sind z.B. aus dem oben erwähnten Europäischen Patent Nr. 0 056 782, worin ebenfalls Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben werden, bekannt. Weitere als Ausgangsprodukte für Verfahren a) geeignete Cyclosporine mit einem Hydroxy-a-aminosäurerest in Stellung 8 können in analoger Weise oder nach den im Europäischen Patent Nr. 0 034 567 (auf welches in der Veröffentlichung 0 056 782 hingewiesen wird) beschriebenen allgemeinen Verfahren der Cyclosporin-Totalsynthese hergestellt werden, oder noch nach den im weiteren, insbesondere in den Beispielen beschriebenen Verfahren.

Die Cyclosporine, die als Ausgangsverbindungen für Verfahren b) geeignet sind, können nach dem unter a) angegebenen Verfahren hergestellt werden.

Obwohl die Ausgangsverbindungen der obigen Formel III, die in den nachfolgenden Beispielen spezifisch beschrieben sind, unter den breiten Umfang des oben erwähnten Europäischen Patentes Nr. 0 056 782 fallen, sind gewisse davon formal neu, d.h., dass sie bis jetzt noch nie spezifisch beschrieben wurden. Erfindungsgemäss wurde nun auch gefunden, dass diese Cyclosporine ein ganz besonders interessantes oder vorteilhaftes Wirkungsspektrum aufwiesen, insbesondere bezüglich ihrer immunsuppressiven Wirkung, und ganz besonders bezüglich der Verhütung von mit Transplantationen, z.B. Organtransplantationen, verbundenen unerwünschten Effekten (Abwehr), z.B. im Vergleich zu den bekannten Cyclosporinen der Formel III, d.h. mit jenen Cyclosporinen der Formel III, die in dem Europäischen Patent Nr. 0 056 782 spezifisch beschrieben sind.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Cyclosporin der Formel lila,

P-X ' -Y ' -Sar-MeLeu-Z ' -MeLeu-AI a-W1 -MeLeu-MeLeu-MeVal—

123 45 6 7 8 9 10 11

(lila)

worin

Y' -aAbu-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,

Z' -Val- bedeutet oder, falls Y' -aAbu- oder -Nvabedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet oder, falls Y' -aAbu- und Z' -Val-bedeuten, für -(D)Thr- steht, und

X' -MeBmt- bedeutet oder, falls Y' -Thr-, -Val- oder -Nva-, Z' -Val- und W' -(D)Ser- bedeuten, für -Dihydro-MeBmt- steht.

Spezifische Cyclosporine der Formel lila sind:

a) [(D)Thr]8-Cyclosporin b) [Thr]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin c) [Dihydro-MeBmtJ'-fThrp-IXDJSerf-Cyclosporm d) [Val]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin e) [Dihydro-MeBmt]'-[Val]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin f) [Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin g) [Dihydro-MeBmt]1-[Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin h) [Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin und i) [Nva]2-[Nva]5-[(D)Ser]8-Cyclosporin.

Von den obigen Cyclosporinen sind die Verbindungen a), b), e), f) und i), insbesondere a), f) und i), im Hinblick auf ihre Wirkung/ihr Wirkungsspektrum, z.B. ihre immunsuppressive Wirkung, von besonderem Interesse, z. B. im Vergleich mit den in der Europäischen Patentschrift Nr. 0 056 782 spezifisch beschriebenen Cyclosporinen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oben definierten Cyclosporin der Formel lila, dadurch gekennzeichnet,

c) dass man in einem entsprechenden in O-geschützter Form vorhandenen Cyclosporin die Schutzgruppe abspaltet, oder d) dass man ein geradkettiges Undecapeptid enthaltend die Sequenz

-W1-MeLeu-MeLeu-MeV a1-X1-Y'-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-Ala-8 9 10 11 123 45 6 7

worin Y', Z', W' und X' obige Bedeutung besitzen, cyclisiert, wobei das Undecapeptid in ungeschützter oder O-geschützter Form vorhanden sein kann, und nötigenfalls die Schutzgruppe abspaltet, oder e) dass man zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila, worin

Y' -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,

Z' -Val- bedeutet oder, falls Y' -Nva- bedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet und

X' -MeBmt- bedeutet,

ein [Thr]2-Cyclosporin, [Val]2-Cyclosporin, [Nva]2-Cyclospo-rin oder [Nva]2-[Nva]5-Cyclosporin produzierender Pilzstamm in Gegenwart eines (D)-Serin enthaltenden Nährmediums züchtet und das Cyclosporin der Formel lila von der erhaltenen Kulturbrühe isoliert, oder f) dass man zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila, worin X' -Dihydro-MeBmt- bedeutet, das entsprechende Cyclosporin der Formel lila, worin X'-MeBmt-bedeutet, reduziert.

Undecapeptide zur Anwendung im Verfahren d) können analog zu den im oben erwähnten Europäischen Patent Nr. 0 056 782 allgemeinen Methoden hergestellt werden, beispielsweise mit Bezug auf das Schema des Beispiels la dieses Patentes, indem man die Peptidsequenz bestehend aus den Resten 8 bis 11 des Cyclosporin-Moleküls mit der Sequenz bestehend aus den Resten 1 bis 7 kombiniert, mit der nötigen Substitution der Reste in Stellung 2 und/oder 5 und/oder 8. Der -(D)Ser- oder -(D)Thr-Rest in Stellung 8 ist zweckmässigerweise in O-geschützter Form, z. B. in Form des O-t-Butyl-Derivates. Die Cyclisierung wird unter Anwendung der im erwähnten Europäischen Patent speziellen Methoden durchgeführt, mit anschliessender Abspaltung der O-Schutzgrup-pen, falls erforderlich [Verfahren c)] nach den in der Peptid-chemie an sich bekannten Methoden.

Der bevorzugte Stamm zur Anwendung im Verfahren e) ist der Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum (Gams). Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III., USA deponiert und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung. Eine andere Kultur davon wurde beim Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, unter der Kulturnummer FRI FERM-P Nr. 2796

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

667 274

6

deponiert. Die morphologischen Merkmale dieses Stammes, der vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) zugeordnet wurde, sowie Methoden zur Herstellung und Erhaltung von Vor- und Nachkulturen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben, z.B. in der englischen Patentschrift Nr. 1 491 509.

Gemäss Verfahren e) wird der ausgwählte Stamm, z. B. der Species Tolypocladium inflatum (Gams), zweckmässigerweise während etwa 2 Wochen in einem Nährmedium wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben und in Gegenwart von zugegebenem (D)- oder (D, L)-Serien bei 27 °C gezüchtet. Der Aminosäure-Prekursor wird zweckmässigerweise in einer Menge von etwa 1 bis etwa 15 g, vorzugsweise etwa 4 bis eta 10 g/Liter Kulturmedium zugegeben. Zweckmässigerweise enthält das Kulturmedium ebenfalls zugegebenen Amino-säure-Prekursor für den Rest in Stellung 2 des gewünschten Cyclosporins, z.B. in Mengen von etwa 6,0 bis etwa 10,0, vorzugsweise etwa 8,0 g/Liter Kulturmedium. Nach der Inkubationszeit wird das erhaltene Cyclosporin der Formel lila nach an sich bekannten Methoden aus der Kulturbrühe gewonnen, z. B. durch Trennung der Brühe in Mycel und Kul-turfiltrat, Extraktion des Mycels unter Homogenisieren, und Abzentrifugieren des Zellmaterials.

Das erhaltene rohe Cyclosporin kann z.B. chromatographisch und/oder durch Umkristallisieren gereinigt werden. Damit werden besonders die weiteren Cyclosporine, insbesondere die natürlichen Cyclosporine entfernt.

Verfahren f) kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man die unter b) beschriebenen Methoden anwendet.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Ausführung der erfmdungsgemässen Verfahren.

Beispiel 1

Synthese von [(0-acetyl)-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-j

Man fügt 20 mg 4-Dimethylaminopyridin zu 47 mg [(D)Ser]8-Cyclosporin (hergestellt in Übereinstimmung mit der in Beispiel 1 oder 3 des oben erwähnten Europäischen Patentes Nr. 0 056 782 beschriebenen Methode) gelöst in 3 ml Methylenchlorid. Hierauf fügt man 6,1 mg frisch destilliertes Acetylchlorid in 1 ml Methylenchlorid hinzu und rührt die erhaltene Reaktionsmischung während 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man verdünnt die Reaktionsmischung mit 50 ml Methylenchlorid und schüttelt mit 30 ml Wasser. Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der Rückstand wird aus 60 g Sili-cagel (0,062-0,20 mm) filtriert, wobei Methlyenchlorid/5% Methanol als Eluans verwendet wird und in 25 ml Fraktionen gesammelt. Die Titelverbindung wird mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von CHCh/5% Methanol als Trägerphase aus den Fraktionen 4 bis 8 gewonnen.

[aß° = -202° (c = 0,92 in CHCh).

Beispiel 2

In Analogie zu Beispiel 1 werden die folgenden Verbindungen ausgehend von dem entsprechenden nicht acylierten Cyclosporin hergestellt.

2.1 [(0-benzoyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = aAbu-, Z = -Val-, Q = -O-benzoyl-(D)-Ser-]: [aß0 = -220° (c = 1,0 in CHC13);

2.2 [0-acetyl-(D)Thr]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Val-, Q = -O-acetyl-(D)-Ser-]:[a]2D° = -219° (c = 1,0 in CHC13);

2.3 [Nva]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [aß0 = -240° (c = 1,0 in CHCl3)/-233° (c = 0,8 in CHCh)/-177° (c = 0,76 in CHjOH): Smp. = 143-147° C.

2.4 [Val]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X =

-MeBmt-, Y = -Val-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [aß0 = -219° (c = 0,9 in CHC13);

2.5 [Nva]5-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: [aß0 = -215° (c = 1,0 in CHCh);

2.6 [Nva]2-[Nva]5-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Nv-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: [aß0 = -196,9° (c = 1,0 in CHCh); und

2.7 [Thrj2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel I: X = -MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [aß0 = -251° (c = 0,86 in CHCh)/-174° (c = 0,81 in CH3OH): Smp. = 143-146° C.

Beispiel 3

Synthese von [Dihydro-MeBmt]'-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclo-sporin [Formel I : X = -dihydro-MeBmt-, Y=-aAbu-, Z=-Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]

54 mg [(0-acetyl)-(D)Ser8]-Cyclosporin in 10 ml Äthanol werden unter Verwendung von 10 mg Palladium/Tierkohle (10%) bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Nach 20 Stunden wird die erhaltene Reaktionslösung durch eine dünne Talgschicht filtriert und der Äthanol im Vakuum abgedampft. Nach weiterem Trocknen im Hochvakuum wird die Titelverbindung erhalten.

[aß0 = -205,8° (c = 1,02 in CHCh).

Beispiel 4

Die folgenden Verbindungen werden hergestellt, entweder analog zu Beispiel 1, ausgehend vom entsprechenden nicht acylierten Cyclosporin oder analog zu Beispiel 3, durch Hydrierung des entsprechenden in Beispiel 2 beschriebenen Cyclosporins:

4.1 [Dihydro-MeBmt]'-[Nva]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclo-sporin [Formel I : X = -dihydro-MeBmt-, Y=-Nva-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: Smp. = 139-141°C; [afe0 = -225° (c = 0,88 in CHCh)/-163° (c = 0,76 in CH3OH);

4.2.[Dihydro-MeBmt]I-[Val]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclospo-rin [Formel I : X = -dihydro-MeBmt-, Y=-Val-, Z=-Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [aß0=-210° (c=0,85 in CHCh)); und

4.3 [Dihydro-MeBmt]1 -[Thr]2-[0-acetyl-(D)Ser]8-Cyclo-sporin [Formel I : X = -dihydro-MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -Val-, Q = -0-acetyl-(D)Ser-]: [afe0—241° (c= 1,0 in CHCh)/-162° (c= 1,0 in CHsOH): Smp. = 148-150 °C.

Herstellung des Ausgangsmaterials:

Beispiel 5

Die folgenden für die Herstellung der Verbindungen der Beispiele 2.2 bis 2.7 benötigten Ausgangsverbindungen werden analog zu der bekannten Verbindung [(D)Ser]8-Cyclospo-rin hergestellt. Die Herstellung der letzteren wird beschrieben in Beispiel 1 des Europäischen Patentes Nr. 0 056 782, mit Substitution der entsprechenden Reste in den Stellungen 2 und/oder 5 und/oder 8 in der Verfahrenssequenz, wie sie im Reaktionsschema zu Beispiel la des genannten Patentes aufgeführt wird.

5.1 [(D)Thr]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' =-MeBmt-, Y' = -aAbu-, Z' = -Val-, W' = -(D)Thr-] : [aß0 = -248,7° (c= 1,0 in CHCh);

5.2 [Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-] : Smp. = 150-153 °C; [a]o = -262° (c = 0,71 in CHCh)/-191° (c=0,73 in CHsOH);

5.3 [Val]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Val-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-]: [aß0 = -257° (c= 1,0 in CHCh)/-255° (c = 0,45 in CHCh)/-189° (c=0,42 in CHsOH): Symp. = 136-140 °C.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

667 274

5.4 [Nva]5-[(D)Ser]8-CycIosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -aAbu- Z' = -Nva-, W' = -(D)Ser-] : [a]?? = -212° (c= 1,0 in CHCh);

5.5 [Nva]2-[Nva]s-f(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Nva-, W' = -(D)Ser-J: [a]2D0 = -217° (c = 1,0 in CHCh); und

5.6 [Thr]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -MeBmt-, Y' = -Thr-, Z' = -Val-, W' = -(D)Ser-]: [a]2D° = -258° (c=0,39 in CHCh)/-178° (c = 0,40 in CHsOH): Symp.= 147-152 °C.

Beispiel 6

Die Verbindung des Beispiels 5.2 kann auf andere Weise mikrobiologisch wie folgt hergestellt werden:

a) 10 Liter eines Nährmediums enthaltend 50 g Maltose, 5 g (DL)-Norvalin, 8 g (D)-Serin, 0,75 gKHîPCU, 0,5 g MgSC>4-7H20; 0,1 CaCl2-6H20 und 8 g Caseinpepton pro Liter werden angeimpft mit 1 Liter einer Konidien- und Mycel-Suspension des Pilzstammes NRRL 8044, welcher einer drei Tage alten Vorkultur entnommen wurde. Das angeimpfte Produktionsmedium wird in 100 ml Portionen in 100 Erlenmeyerkolben gefüllt, die dann während 14 Tagen bei

27 °C auf einer Rundschüttelmaschine mit 180 UPM inkubiert werden. Das Mycel wird vom Kulturmedium getrennt und in einem Turrax durch Zerkleinern und Rühren mit 3x3 Liter 90% Methanol extrahiert. Das zerkleinerte Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C.konzentriert, bis dass der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 4 x unter Verwendung von 0,5 Liter 1,2-Dichloräthan bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten 1,2-Dichloräthan-Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (1,4 kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen und dann in 280 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 9-11, enthaltend eine Cyclosporin-Mischung, werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säurenchromatographie (1 kg Silicagel, Korngrösse 0,063-0,2 mm, «Merck») unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Eluans (Fraktionen von 500 ml) getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst [Nva2]-Cyclosporin (Fraktionen 7-9) eluiert, gefolgt von einer Mischung enthaltend [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin und Cylosporin. Die Trennung von [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin und Cylosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (280 g, «Merck», 0,63-0,2 mm) unter Verwendung von Chloroform/Methanol (98:2) als Eluans (Fraktionen von 100 ml). Die Fraktionen 20-30, enthaltend rohes [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin, werden weiter gereinigt durch Druckchromatographie auf einer phasenumgekehrten Silicagelsäule («Merck» LiChropep RP 18,260 g, Korngrösse 0,04-0,063 mm) unter Verwendung von Methanol/Wasser (85:15) als Eluans und in 25 ml Fraktionen gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 45-55 ergeben reines [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin als amorphes weisses Pulver.

Die für das obige Verfahren benötigte Vorkultur kann wie folgt erhalten werden:

b) Die für die Beimpfung verwendete Sporen- und Mycel-suspension, hergestellt aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 8044, wird während 21 Tagen bei

27 °C auf folgendem Agarmedium gezüchtet: 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt pro Liter entmineralisiertes Wasser. Die Sporen dieser Kultur werden in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen, wobei eine Endkonzentration von 5 x 106 Sporen/ml erhalten wird. 10 ml dieser Suspension werden verwendet für die Beimpfung von 1 Liter einer Nährlösung mit der gleichen Zusammensetzung wie das

Kulturmedium des Beispiels 6a, mit Ausnahme der (DJ-Sermund der (DL)-Norvalin-Komponente. Die Bebrütung erfolgt während 3 Tagen bei 27 °C auf einer Rundschüttelmaschine (200 UPM). Diese Kultur wird zur Beimpfung der Produk-5 tionskultur verwendet. [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin kann im Fermenter wie folgt-produziert werden:

c) Etwa 109 Sporen einer Schrägagarkultur des Stammes NRRL 8044 werden in einem rostfreien Stahlfermenter enthaltend 20 Liter eines Vorkulturmediums folgender Zusam-lo mensetzung gegeben:

Fructose

75 g

Amber EHC

25 g

KH2OP4

5g

KCl

2,5 g

Dest. Wasser ad

11

(pH = 5,5)

Vorgehend erfolgt Sterilisation während 20 Minuten bei 20 120 °C. Günstige Inkubationsbedingungen sind eine Temperatur von 27 °C, eine Luftrate von 16 Litern pro Minute bei einem Überdruck von 0,5 Bar und einer Umdrehungszahl von 200 UPM. Die sich entwickelnde Vorkultur wird während 6 Tagen bebrütet und hierauf 15 Liter in einen rostfreien Stahl-25 fermenter enthaltend 300 Liter eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

Maltose 75 g

Amber EHC 25 g

30 KH2OP4 5 g

KCl 2,5 g

(DL)-Norvalin 5 g

(D)-Serin 8 g

Dest. Wasser ad 11 35 (pH = 5,5)

Vorgehend erfolgt Sterilisation während 20 Minuten bei 120 °C. Die Kultur wird bei einer Temperatur von 27 °C gehalten, belüftet mit einer Luftrate von 120 Liter Luft pro 40 Minute, bei einem Überdruck von 0,5 Bar und gerührt bei einer Umdrehungszahl von 70 UPM. Die Schaumkontrolle wird durch Zugabe einer Silicon-Emulsion durchgeführt.

Nach der Bebrütung während 14 Tagen wird die Kultur, welche ein Totalvolumen von 275 Litern aufweist, auf 10 °C 45 abgekühlt und das Mycel unter Verwendung eines Westfalia-Separators entfernt. Das Filtrat wird durch 2maliges Rühren mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum getrocknet. Das Mycel wird mit Methanol versetzt, homogenisiert und fil-50 triert. Diese Extraktion wird 2 x unter Verwendung von 90% Methanol wiederholt. Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende wässrige Konzentrat wird 2 x mit Äthylacetat extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser gewa-55 sehen, vereinigt und im Vakuum konzentriert. Die extrahierte wässrige Phase wird noch 2 x mit Äthylacetat/Isopropanol (8:2) extrahiert. Diese Extrakte werden vereinigt und wiederum im Vakuum eingedampft.

Die Mycel- und Filtratextrakte werden filtriert, wobei 60 50 x die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wobei 100 x die Menge an Silicagel 60 (Korngrösse = 0,04-0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Äthylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert [Nva2]-65 Cyclosporin, gefolgt von Cyclosporin und [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 140 x die Menge an Silicagel 60 (Korngrösse 0,063-0,20 mm)

667 274

8

und Chloroform/Methanol (98:2) als Eluans verwendet wird. Es wird reines [Nva2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin erhalten.

Beispiel 7

Die Verbindung des Beispiels 5.3 kann auch mikrobiologisch hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6 a) vorgeht, jedoch mit folgenden Abänderungen:

a) Im Nährmedium wird das (DL)-Norvalin durch 10 g (L)-Valin ersetzt. Nach der Trennung des Mycels vom Kulturmedium wird wie folgt extrahiert:

Das rohe Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate unter Zugabe von Wasser durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40 ° C konzentriert, bis der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 3 x unter Verwendung von 5 Litern Äthylacetat bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (1,4 kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen. Die Fraktionen, die eine Cyclosporin-Mischung enthalten, werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säulenchro-matographie (3 kg Silicagel, Korngrösse 0,020-0,045 mm, «Grace») unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Eluans getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst [Val2]-Cyclosporin eluiert, gefolgt von einer Mischung enthaltend [Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin als Hauptkomponente. Die weitere Reinigung von [Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (80 g, «Grace», 0,020-0,0045 mm) unter Verwendung von Aceton/Hexan (1:1) als Eluans. Die Fraktionen, die rohes [Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin enthalten, werden weiter gereinigt durch Druckchromatographie auf einer phasenumgekehrten Silicagelsäule («Merck» LiChropep RP 18,160 g, Korngrösse 0,04-0,063 mm) unter Verwendung von Methanol/Wasser (80:20) als Eluans, wobei reines [Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin als amorphes weisses Pulver erhalten wird.

b) Die benötigte Vorkultur wird wie im Beispiel 6 b) erhalten.

[Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin kann auf der Fermenterebene hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6 c) vorgeht, jedoch mit folgenden Abänderungen:

c) In der Zusammensetzung des Produktionsmediums wird das (DL)-Norvalin durch 10 g (L)-Valin ersetzt. Nach der Zugabe von Methanol zum Mycel, Homogenisieren und Filtrieren (2 x mit 90% Methanol), wird wie folgt vorgegangen:

Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende, wässrige Konzentrat wird 3 x mit Äthylacetat extrahiert, die Exktrakte mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum eingedampft.

Die Mycel- und Filtratextrakte werden filtriert, wobei 50 x die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wobei 40 x die Menge an Silicagel 60 (Korngrösse = 0,04-0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Äthylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert [Val2]-Cyclosporin, gefolgt von Cyclosporin und [Val2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 100 x die Menge an Silicagel 60 und Aceton/Hexan (1:1) verwendet wird, und einer Druckchromatographie auf phasenumgekehrtem Silicagel («Merck» LiChropep RP 18, Korngrösse 0,04-0,063 mm) unter Verwendung von Methanol/ Wasser (80:20) als Eluans, wobei reines [Val2]-[(D)Ser8j-Cyclosporin èrhalten wird.

Beispiel 8

Die Verbindung des Beispiels 5.6 kann auch mikrobiologisch hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6 a) vorgeht, jedoch mit folgenden Abweichungen:

a) Im Nährmedium wird das (DL)-Norvalin durch 5 g (L)-Threonin ersetzt. Nach der Inkubation wird wie folgt extrahiert:

Das Mycel wird vom Kulturmedium getrennt und in einem Turrax durch Zerkleinern und Rühren mit 3x9 Litern 90% Methanol extrahiert. Das zerkleinerte Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate unter Zugabe von Wasser durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C konzentriert, bis der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 3 x unter Verwendung von 5 Litern Äthylacetat bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 40 °C konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (2 kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen. Die Fraktionen enthaltend eine Cyclosporin-Mischung werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säulenchromato-graphie (2 kg Silicagel, Korngrösse 0,02-0,045 mm, «Grace») unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Eluans getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst Cyclosporin eluiert, dann [(D)Ser8]-Cyclosporin gefolgt von [Thr2]-Cyclosporin und letztlich [Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclo-sporin in roher Form. Die weitere Reinigung von [Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (50 g, «Grace», 0,02-0,45 mm) unter Verwendung von Aceton/Hexan (2:1) als Eluans, wobei reines [Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin als amorphes weisses Pulver erhalten wird.

b) Die benötigte Vorkultur wird wie im Beispiel 6 b) erhalten.

[Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin kann auf der Fermenterebene hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6 c) vorgeht, jedoch mit folgenden Abweichungen:

c) In der Zusammensetzung des Produktionsmediums wird das (DL)-Norvalin durch 5 g (L)-Threonin ersetzt. Nach der Inkubation und dem Entfernen des Mycels unter Verwendung eines Westfalia-Separators wird wie folgt vorgegangen:

Das Mycel wird mit Methanol versetzt, homogenisiert und filtriert. Diese Extraktion wird 2 x unter Verwendung von 90% Methanol wiederholt. Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende wässrige Konzentrat wird 2 x mit Äthylacetat extrahiert, die Exktrakte mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum konzentriert.

Die Mycelextrakte werden filtriert, wobei 50 x die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wobei 30 x die Menge an Silicagel 60 (Korngrösse = 0,04-0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Äthylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert Cyclosporin, dann [(D)Ser8]-Cyclosporin gefolgt von [Thr2]-Cyclosporin und letztlich [Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 250 x die Menge an Silicagel 60 (Korngrösse 0,02-0,045 mm) und Aceton/Hexan (2:1) als Eluans verwendet wird. Es wird ein reines [Thr2]-[(D)Ser8]-Cyclosporin erhalten.

Beispiel 9

Folgende Verbindungen, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der in den Beispielen 4.1 bis 4.3 aufgeführten Verbindungen verwendet werden können, können aus den in den Beispielen 5 bis 7 angegebenen Cyclosporinen hergestellt werden, indem man anlog Beispiel 3 vorgeht.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

667 274

9.1 [Dihydro-MeBmt]1-[Nva]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Val-,

W' = -(D)Ser-] - hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.2 oderò: [aß0 = -251° (c=l,23 in CHCl3)/-179° (c= 1,16 in CHsOH): Smp. = 155-157 °C.

9.2 [Dihydro-MeBmt]1-[Val]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Val-, Z' = -Val-,

W = -(D)Ser-] - hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.3 oder 7: [aß0=-224° (c= 1,0 in CHCh).

9.3 [Dihydro-MeBmt]1-[Thr]2-[(D)Ser]8-Cyclosporin [Formel Illa: X' = -dihydro-MeBmt-, Y' = -Thr-, Z' = -Val-,

W = -(D)Ser-] - hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.6 oder 8: [aß0 = -262° (c=0,73 in CHCl3)/-173° (c = 0,79 in CHsOH): Smp. = 156-158 °C.

Die Cyclosporine, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, wie vorgehend definiert und beschrieben, im folgenden als erfindungsgemässe Cyclosporine bezeichnet, besitzen wie aus den folgenden Testmethoden hervorgeht, pharmakologische Aktivität.

1. Immunosuppressive Wirkungen:

1.1 Lokale Hämolyse in vitro in Gel [R.I. Mishell und R.W. Dutton, J. Exp. Medicine, 126,423-442 (1976)]. Die erfindungsgemässen Cyclosporine hemmen Haemolysezonen verglichen mit unbehandelten Kontrollen in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 [xg/ml.

1.2 Lymphozyten-Stimulationstest nach Janossy und Greaves [Clin. Exp. Immunol., 9,483 (1971) und 10, 525 (1972)]: Die erfindungsgemässen Cyclosporine hemmen die durch Concanavalin A stimulierte DNA-Synthese (Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus), die Zellproliferation und Blasto-genese bei Mäusemilzzellen im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen in Konzentrationen von 0,001 bis 10,0 (ig/ml.

1.3 Mixed lymphocyte reaction [Beach et al., J. Exp. Med. 136,1430 (1972)]: Die Reaktion (d.h. Proliferation und Differenzierung) von Lymphozyten [Mäuse (Balb/c) Milzzellen] bei Co-Inkubation während 5 Tagen mit allogenischen Milzzellen von bestrahlten Mäusen (CBA ^) wird in Anwesenheit und in Abwesenheit der Testsubstanz gemessen. Die Reaktion in Anwesenheit wird in der prozentualen Änderung der Reaktion, verglichen mit 100% der Kontrollreaktion ausgedrückt. Bei der Verwendung von erfindungsgemässen Cyclosporinen wird eine Hemmung der Reaktion bei einer Konzentration von 0,001 bis 10,0 |ig/ml-1 beobachtet.

1.4 Unterdrückung der Organabstossung:

Nieren von Geber-Ratten (F 344, 9 ) werden in Empfänger-Ratten (Wistar-Furth, 9 ) transplantiert. Die Testsubstanz wird p.o. während 14 Tagen den Empfänger-Ratten verabreicht. Danach wird die Behandlung unterbrochen. 7 Tage nach der Transplantation werden die Testtiere einer bilateralen Nephrectomie unterworfen. Da das Leben der Testtiere von der Akzeptanz und dem Funktionieren des übertragenen Organs abhängt, dient die Erhöhung der Überlebenszeit, verglichen mit derjenigen von Kontrolltieren, welche nur Placebo erhalten, als Parameter für die Wirksamkeit der Testsubstanz. Tiere, die erfindungsgemässe Cyclosporine erhalten, weisen bei Dosen von 2,5 bis 10 mg/kg p.o. eine Überlebensspanne von 60 bis 250 Tagen auf, verglichen mit unbehandelten Kontrollen, die alle als Folge der Organabstossung innerhalb von etwa 9 bis 10 Tagen sterben.

2. Entzündungshemmende Wirkung

Die entzündungshemmende Wirkung kann mit dem Adju-

vans-Arthritis-Test an der Ratte gezeigt werden. Bei diesem

Test wird die Adjuvans-Arthritis nach der Methode von Pear-

son und Wood, «Arthr. Rheum.» 3,440 (1959) induziert. Die erfindungsgemässen Cyclosporine zeigen sich bei diesem Test als wirksam bei der sich entwickelnden und bei der etablierten Arthritis in Dosen von 10 bis 30 mg/kg/Tag p.o.

3. Antiparasitäre Wirkung

Anti-Malaria-Test nach L. Rane, «Chemotherapie and Drag Resistance in Malaria», ed. W. Peters, Academic Press, New York, 1970. Mäuse (OF1 : männlich) werden am Tage 0 mit 0,2 ml einer Suspension enthaltend 10"7 parasitische Zellen der Species Plasmodium berghei (Stamm NK 65) infiziert. Die Verabreichung erfolgt i.p. Am Tag 3 wird die Testsubstanz bei veränderlichen Dosen unter Verwendung von 5 bis 10 Mäusen pro Dosis s.c. verabreicht. Die Überlebenszeit wird festgehalten und die minimale effektive Dosis (MED) berechnet durch Vergleich der Überlebenszeit mit derjenigen unbehandelter Kontrolltiere. Bei den Kontrolltieren beträgt die Überlebenszeit etwa 7 Tage. Die MED ist die Dosierung, bei welcher die Überlebenszeit verdoppelt ist. Die erfindungsgemässen Cyclosporine zeigen sich bei diesem Test als wirksam in Dosen von 25 bis 100 mg/kg/Tag, s.c.

Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung können die erfindungsgemässen Cyclosporine zur Prophylaxe und Behandlung von Konditionen und Krankheiten, welche eine Herabsetzung der Immunantwort benötigen, angewandt werden. So können die erfindungsgemässen Cyclosporine Anwendung finden bei der Unterdrückung der Proliferation von Lymphocyten und Immunocyten, so z. B. bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, zur Verhinderung der Gewebsabstossung in Transplantationen, z.B. bei Haut, Lunge, Herz, Herz-Lunge, Knochenmark, Nieren, Milz und Hornhauttransplantationen. Spezifische Àutoimmunkrank-heiten, bei welchen die erfindungsgemässen Cyclosporine Anwendung finden können, sind solche, für die die Behandlung mit Cyclosporin A vorgeschlagen oder bereits angewendet worden ist, z.B. aplastische Anämis, «pure red cell anae-mia», idiopathische Tjombocytopänie, systemischer Lupus erythematodes, Polychondritis, Sklerodermie, Wegener gra-nulomatosis, chronisch aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Psoriasis, Steven-Johnson-Syndrom, idiopathische Sprue, Morbus Crohn, Graves Opthalmopathie, Sarcoidose, Multiple Sklerose, primäre billiare Zirrhose, primäre juvenile Diabetes, Uveitis posterior, interstitielle Lungenfibrose und Psoriasis Arthritis.

Aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkung können die erfindungsgemässen Cyclosporine Anwendung finden bei der Behandlung von entzündlichen Konditionen, insbesondere entzündliche Konditionen mit einer Äthiologie, die eine Autoimmun-Komponente einschliesst, z.B. die Behandlung von Arthritis und rheumatischen Erkrankungen wie Arthritis chronica progrediens.

Aufgrund ihrer antiparasitären Wirkung können die erfindungsgemässen Cyclosporine Anwendung finden als antiparasitäre Heilmittel, z.B. zur Behandlung von parasitären Infektionen verschiedenen Typus, insbesondere bei Protozoen wie auch Trematoden- und Nematodeninfektionen. Spezifische Typen von parasitären Infektionen, bei welchen die erfindungsgemässen Cyclosporine Anwendung finden können, sind solche, für die die Behandlung mit Cyclosporinen in der Literatur bereits vorgeschlagen worden ist, z.B. Schisto-mosomiasis, Filariasis, Leishmania, Coccidioidomycosis und insbesondere Malaria.

Für die oben genannten Indikatoren liegt die tägliche Dosis bei etwa 75 bis etwa 5000, vorzugsweise bei etwa 2000, ganz bevorzugt bei etwa 1500 mg. Bei Verwendung einer Einheitsdosis, z.B. für die orale Verabreichung, ist eine Dosis von etwa 25 bis etwa 2500, vorzugsweise etwa 1000, ganz bevorzugt etwa 800 mg eines erfindungsgemässen Cyclosporins geeignet, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

667 274

10

Die erfindungsgemässen Cyclosporine können auf irgend einem konventionellen Weg verabreicht werden, insbesondere in Übereinstimmung mit geläufigen Methoden bei der Verabreichung von Cyclosporin A, insbesondere durch intravenöse Infusion, z. B. im Falle einer Organtransplantation, vor und sofort nach der Transplantation, wie auch bei Auftreten einer gastrointestinalen Störung, welche sonst die Absorbtion verschlechtern würde oder oral, z.B. in Form einer oralen Lösung.

In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden sieht die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein erfindungsgemässes Cyclosporin zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder einem Träger vor.

Wie vorstehend beschrieben sind auch die Cyclosporine der Formel lila neu. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Zwischenprodukte zeigen sie eine pharmakologische Wirkung und/oder Profil, insbesondere im Verhältnis zur immunosup-pressiven Aktivität und insbesondere im Verhältnis zu ihrer Verwendung bei der Verhinderung der Transplantatabstos-sung. Dies macht sie besonders interessant in Beziehung zu anderen Cyclosporinen, wie sie spezifisch im Europäischen Patent Nr. 0 056 782 offenbart sind. Die pharmakologische Wirkung von Cyclosporinen der Formel lila kann beispielsweise gezeigt werden in den oben beschriebenen Testmethoden 1.1, 1.2, 1.3,2 oder 3. Die Cyclosporine der Formel lila sind in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung aktiv:

In Test 1.1 bei Konzentrationen von 0,01 bis 10 [ig/ml; in Test 1.2 bei Konzentrationen von 0,001 bis 10 (xg/ml; in Test 1.3 bei Konzentrationen von 0,001 bis 10 (ig/ml; in Test 2 in Dosen von 10 bis 30 mg/kg/Tag p.o.; und in Test 3 in Dosen von 50 bis 100 mg/kg/Tag s.c. In Anbetracht ihrer immunosuppressiven Wirkung sind Cyclosporine der Formel lila nützlich zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten und Konditionen, die eine Reduktion der Immunantwort fordern, z. B. zur Unterdrük-kung der Proliferation von Lymphozyten und Immunozyten, z.B. bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, z.B. in der Behandlung spezifischer Autoimmunkrankheiten wie sie vorstehend aufgeführt wurden in Zusammenhang mit der Verwendung der erfindungsgemässen Cyclosporine oder bei der Vorbeugung der Transplantatabstossung, z.B. bei den vorstehend zitierten verschiedenen spezifischen Arten im 5 Zusammenhang mit der Verwendung von den erfindungsgemässen Cyclosporinen.

Im Hinblick auf ihre entzündungshemmende Wirkung sind Cyclosporine der Formel lila auch nützlich für die Behandlung von Entzündungszuständen, insbesondere von io Entzündungszuständen mit einer Ätiologie umfssend oder einschliessend eine Autoimmunokomponente, z.B. für die Behandlung von Arthritis und rheumatischen Erkrankungen wie Polyarthritis chronica progrediens.

Im Hinblick auf ihre antiparasitäre Wirkung sind Cyclo-i5 sporine der Formel lila auch nützlich als antiparasitäre Mittel, z. B. für die Behandlung parasitärer Infektionen verschiedener Typen, insbesondere wie vorstehend beschrieben im Zusammenhang mit der Verwendung von den erfindungsgemässen Cyclosporinen.

20 Für die oben erwähnten Indikationen bewegt sich die tägliche Dosis im Bereich von etwa 75 bis eta 5000 mg und bei Verwendung einer Einheitsdosis, z. B. für die orale Verabreichung, ist eine Dosis von etwa 25 bis etwa 2500 mg Cyclosporin der Formel lila geeignet, vermischt mit einem pharmazeu-25 tisch akzeptablen Verdünner oder Träger.

Die Cyclosporine der Formel lila können auf irgend einem konventionellen Weg verabreicht werden, insbesondere in Übereinstimmung mit geläufigen Methoden bei der Verabreichung von Cyclosporin, insbesondere durch intravenöse 3o Infusion, z.B. im Falle einer Organtransplantation, vor und sofort nach der Transplantation, wie auch bei Auftreten einer gastrointestonalen Störung, welche sonst die Absorbtion verschlechtern würde oder oral, z.B. in Form einer oralen Lösung.

35 In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden sieht die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Cyclosporin der Formel Illa wie vorstehend definiert zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger vor.

Claims

667 274

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist.
2. Ein Cyclosporin der Formel I,

worin

—X-Y -Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Al a-Q-MeLeu-MeLeu-MeVal-123 456 789 10 11

(I)

X -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- bedeutet, Y -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet, Z -Val- oder -Nva- bedeutet und W für einen Rest der Formel IV steht,

R2

worin

X -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- bedeutet und -MeBmt- den Rest N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)threonyl der Formel B,

CH3

HO-CH

(IV)

-NH-CH-CO-(D)

CH2

HO (R XH V / \ CH (R) CH3

-N CH—C0-

I (S)

CH3

worin -x-y- für -CH = CH- (trans) steht, bedeutet, Y -aAbu-, -Ala-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet, Z -Val- oder -Nva- bedeutet und Q einen Rest der Formel II bedeutet,

R2

15 worin R2 Wasserstoff oder Methyl bedeutet, acyliert, indem man eine Ri-CO-Gruppe, worin Ri Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet, in ß-Stellung einführt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung eines 20 Cyclosporins der Formel I gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cyclosporin der Formel I / g \ gemäss Anspruch 2, worin X für -MeBmt- steht, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin X -Dihydro-MeBmt- bedeutet.

25 7. Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Cyclosporin gemäss Anspruch 1 oder 2, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger.
8. Ein Cyclosporin der Formel lila,

30 X1 - Y1 -Sar-MeLeu-Z1 -MeLeu-A 1 a-W ' -MeLeu-MeLeu-MeVal-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

35

Rl-CO-O-CH(ß)

40

(II)

-NH-CH-CO-(D)

wonn • ■ 45

Ri Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet und

R2 für Wasserstoff oder Methyl steht, nach Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-amino- 50 säurerest ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Hy-droxy-a-aminosäurerest ist, acyliert.
4. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-amino- 55 säurerest ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 1 -MeBmt- ist und der Rest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin der Rest in Stellung 1 -Dihydro-MeBmt- ist. 60
5. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel I gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cyclosporin der Formel III,

worin (lila)

Y' -aAbu-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,

Z' -Val- bedeutet oder, falls Y' -aAbu- oder -Nva-bedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet oder, falls Y' -aAbu- und Z' -Val-bedeuten, für -(D)Thr- steht, und

X' -MeBmt- bedeutet oder, falls Y' -Thr-, -Val- oder -Nva-, Z' -Val- und W' -(D)Ser- bedeuten, für -Dihydro-MeBmt- steht, und -MeBmt- den Rest N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-methyl-(L)threonyl der Formel B,

CH3

CH2

(ß)

HO (R^CH

CH (R) CH3

_N CH—C0-

(S)

r-X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-AIa-W-MeLeu-MeLeu-MeVal— 1 2 3 4 5 5 7 8 9 10 11

CH3

worin -x-y- für -CH = CH- (trans) steht, bedeutet. 65 9. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass (III) man in einem entsprechenden, in 0-geschützter Form vorhandenen Cyclosporin die Schutzgruppe abspaltet.

3

667 274
10. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man ein geradkettiges Undecapeptid enthaltend die Sequenz

-W1-MeLeu-MeLeu-MeVal-X'-Y1-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-Ala-8 9 10 11 123 45 6 7

worin

Y' -aAbu-, -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,"

Z' -Val- bedeutet oder, falls Y' -aAbu- oder -Nva-bedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet oder, falls Y- ' -aAbu- und Z' -Val- bedeuten, für -(D)Thr- steht, und

X' -MeBmt- bedeutet oder, falls Y' -Thr-, -Val- oder -Nva-, Z' -Val- und W' -(D)Ser- bedeuten, für -Dihydro-MeBmt- steht,

cyclisiert, wobei das Undecapeptid in ungeschützter oder 0-geschützter Form vorhanden ist, und nötigenfalls die Schutzgruppe abspaltet.
11. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila gemäss Anspruch 8, worin

Y' -Thr-, -Val- oder -Nva- bedeutet,

Z' -Val- bedeutet oder, falls Y' -Nva- bedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet und X' -MeBmt- bedeutet,

dadurch gekennzeichnet, dass man einen ein [Thr]2-Cyclo-sporin, [Val]2-Cyclosporin, [Nva]2-Cyclosporin oder [Nva]2-

[Nva]5-Cyclosporin produzierenden Pilzstamm in Gegenwart eines (D)-Serin enthaltenden Nährmediums züchtet und das Cyclosporin der Formel lila von der erhaltenen Kulturbrühe isoliert.

s 12. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila gemäss Anspruch 8, worin X' -Dihydro-MeBmt-bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man das entsprechende Cyclosporin der Formel lila, worin X' -MeBmt-, y' -Thr-, -Val- oder -NVa-, Z' -Val- und W' -(D)Ser- bedeu-io ten, reduziert.
13. Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Cyclosporin der Formel lila gemäss Anspruch 8, zusammen mit einem pharmakologisch akzeptablen Verdünner oder Träger.