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PATENTANSPRÜCHE 1. Das monocyclische Peptid der Formel I.
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2. Verfahren zur Herstellung des monocyclischen Peptids der Formel I nach Anspruch 1 durch Züchtung eines dieses Peptid produzierenden Stammes der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid aus der Fermentationsbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
3. Heilmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das monocyclische Peptid der Formel I nach Anspruch 1 enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft das monocyclische Peptid der Formel I,
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im folgenden auch als neues Antibiotikum Cyclosporin F bezeichnet.
Man gelangt zum monocyclischen Peptid der Formel I, indem man einen dieses Peptid produzierenden Stamm der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und das Peptid aus der Fermen
tationsbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Ein bevorzugter Cyclosporin F produzierender Stamm ist der frei zugängliche Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of-Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, I11., USA, deponiert.
Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z.B. in der DOS 2455859 beschrieben.
Für die Herstellung von Cyclosporin F lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium infiatum Gams verwenden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation des Pilzstammes NRRL 8044 unter der Einwirkung von Ultraviolettoder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z.B. durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können.
Cyclosporin F kann auf an sich bekannte Weise isoliert werden, z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben. Hierbei kann Cyclosporin F abgetrennt werden von gleichzeitig vorhandenen Naturprodukten, z.B. das Cyclosporin D, das etwas polarere Cyclosporin A (auch bekannt als S 7481/F-1), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polarere Cyclosporin C.
Charakterisierung von Cyclosporin F
Farblose Polyeder (krist. aus Äther/Petroläther 1:1) Smp.183-184" [oilD = -290" (c = 1,15 in CHCI3) -218 (c= l,00inCHOH) UV-Spektrum in CHOH: Endabsorption IR-Spektrum in CH2CI2: siehe Fig. 1 'H-NMR-Spektrum in CDCl3, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 2.
'3C-NMR-Spektrum in CDCl3, 22,63 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard. Instrument: Bruker HX-90 E. Aufnahme bei 22,63 MHz. Spektrenbreite (sweep width): 6000 Hz: siehe folgende Tabelle 1.
Tabelle I O(ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 173,15 55,4 36,0 23,8 172,89 55,1 31,7 23,8 172,62 54,9 31,6 23,8 172,62 54,3 31,2 23,5 171,72 49,9 31,2 21,9 170,87 48,7 29,9 21,9 170,58 48,3 29,9 21,3 170,26 47,9 29,9 20,9 170,14 44,7 29,6 20,4 169,74 40,5 29,6 20,1 169,53 40,5 24,9 19,7 129,4 39,2 24,8 18,5 126,6 39,2 24,8 18,3
58,4 37,3 24,5 17,8
57,3 36,7 24,3 17,8
15,1
9,9 Massenspektrum: Peak bei m/e 1187 (Molekularpeak von C62HXlNxlOt) Elementaranalyse (im Hochvakuum 3 Stunden bei 80" getrocknet) Bruttoformel: C62HIllNllO Analyse: Ber.: C 62,8; H 9,4; N 13,0; 0 14,8% Gef.: C 62,8; H 9,5; N 13,0; 0 14,8%
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm
Kieselgel-Fertigplatten Merck , Schichtdicke 0,25 mm, aufgetragene Substanzmenge: 40 y.
Rf-Werte: siehe folgende Tabelle 2. (Die Detektion erfolgt mit Joddampf oder Dragendorff-Sprühreagenz nach Munier.)
Tabelle 2 Metabolit Chloroform-Meth- Aceton-Hexan 1:1 Essig-ester anol 96:4 a) a) b) Cyclosporin FC) 0,51 0,45 0,50 Cyclosporin D 0,47 0,43 0,58 Cyclosporin A 0,40 0,35 0,39 a) Laufstrecke: 1 x 10 cm b) Laufstrecke: 3 X 10 cm c) Anfärbung in Jod schwächer als Cyclosporin A.
Aminosäureanalyse: Im Hydrolysat, das man durch Erhitzen von Cyclosporin F mit 6N Salzsäure während 16 Stunden bei 115 erhält, können mittels eines Aminosäureanalysators aufgrund der Retentionszeiten die Aminosäuren Alanin, or-Aminobuttersäure, Valin und Sarcosin nachgewiesen werden.
Löslichkeit: Cyclosporin F ist leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; mässig löslich in Äther; praktisch unlöslich in Wasser und gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin F zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger und Curvularia lunata.
Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 Fg/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt; SI = 0,62 nach 5 x70 mg/kg p.o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung kann die Substanz zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes.
Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 60 bis 300 mg/kg Körperge wicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 300 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 150 bis 300 mg des neuen Antibiotikums Cyclosporin F neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum Cyclosporin F allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
Cyclosporin F
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2,0 g Natriumcaseinat, 2,5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgSO4- 7H20, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3-stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit Hexan Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin Aund D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei - 15 kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2:1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei - 15 kristallisieren gelassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin F.
Zur Gewinnung von Cyclosporin F wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin F im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Gemisch zuerst an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck), mit Chloroform-Methanol (98:2) und anschliessend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2:1) chromatogrpahiert; dabei enthalten die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin F in sehr stark angereicherter Form.
Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin F-Anteile zweimal aus Äther Petroläther (1:4) bei Raumtemperatur kristallisiert, wobei dünnschichtchromatographisch-einheitliches, reines Cyclosporin F in Form farbloser Polyeder vom Smp. 183-184 erhalten wird.
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PATENT CLAIMS 1. The monocyclic peptide of formula I.
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2. A process for the preparation of the monocyclic peptide of the formula I according to claim 1 by culturing a strain of the fungal species Tolypocladium infiatum Gams producing this peptide in the presence of a nutrient medium, characterized in that the peptide is isolated from the fermentation broth by extractive and / or adsorptive working methods and then cleaned chromatographically or by means of countercurrent distribution.
3. Remedy, characterized in that it contains the monocyclic peptide of formula I according to claim 1.
The present invention relates to the monocyclic peptide of the formula I,
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hereinafter also referred to as the new antibiotic cyclosporin F.
The monocyclic peptide of the formula I is obtained by growing a strain of the fungal species Tolypocladium infiatum Gams producing this peptide in the presence of a nutrient medium and the peptide from the fermenter
tion broth isolated by extractive and / or adsorptive working methods and then cleaned chromatographically or by means of countercurrent distribution.
A preferred strain producing cyclosporin F is the freely accessible strain NRRL 8044 of the fungal species Tolypocladium inflatum Gams. A culture of this was deposited in the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, I11., USA.
This strain was previously assigned to the fungus species Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) And is e.g. described in DOS 2455859.
Strains of the fungal species Tolypocladium infiatum Gams can also be used for the production of cyclosporin F, such as those e.g. by selection or mutation of the NRRL 8044 fungal strain under the influence of ultraviolet or X-rays or by application of other measures, e.g. by treating laboratory cultures with suitable chemicals.
Cyclosporin F can be isolated in a manner known per se, e.g. as described in Example 1. Cyclosporin F can be separated from natural products that are present at the same time, e.g. the cyclosporin D, the more polar cyclosporin A (also known as S 7481 / F-1), the more polar cyclosporin B (also known as S 7481 / F-2) and the even more polar cyclosporin C.
Characterization of cyclosporin F
Colorless polyhedron (crystallized from ether / petroleum ether 1: 1) mp 183-184 "[oilD = -290" (c = 1.15 in CHCI3) -218 (c = 1.00 in CHOH) UV spectrum in CHOH: final absorption IR spectrum in CH2CI2: see FIG. 1 'H-NMR spectrum in CDCl3, 90 MHz, tetramethylsilane as internal standard: see FIG. 2.
'3C NMR spectrum in CDCl3, 22.63 MHz, tetramethylsilane as internal standard. Instrument: Bruker HX-90 E. Recording at 22.63 MHz. Spectra width (sweep width): 6000 Hz: see table 1 below.
Table IO (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 173.15 55.4 36.0 23.8 172.89 55.1 31.7 23.8 172.62 54.9 31.6 23.8 172.62 54.3 31.2 23.5 171.72 49.9 31.2 21.9 170.87 48.7 29.9 21.9 170.58 48.3 29.9 21. 3 170.26 47.9 29.9 20.9 170.14 44.7 29.6 20.4 169.74 40.5 29.6 20.1 169.53 40.5 24.9 19.7 129 , 4 39.2 24.8 18.5 126.6 39.2 24.8 18.3
58.4 37.3 24.5 17.8
57.3 36.7 24.3 17.8
15.1
9.9 mass spectrum: peak at m / e 1187 (molecular peak of C62HXlNxlOt) elemental analysis (dried under high vacuum for 3 hours at 80 ") gross formula: C62HIllNllO analysis: calc .: C 62.8; H 9.4; N 13.0; 0 14.8% Found: C 62.8; H 9.5; N 13.0; 0 14.8%
Behavior in the thin layer chromatogram
Ready-made silica gel panels Merck, layer thickness 0.25 mm, amount of substance applied: 40 y.
Rf values: see table 2 below. (Detection is carried out using Munier iodine vapor or Dragendorff spray reagent.)
Table 2 Metabolite chloroform-meth-acetone-hexane 1: 1 acetic ester anol 96: 4 a) a) b) Cyclosporin FC) 0.51 0.45 0.50 Cyclosporin D 0.47 0.43 0.58 Cyclosporin A 0.40 0.35 0.39 a) Running distance: 1 x 10 cm b) Running distance: 3 X 10 cm c) Staining in iodine weaker than cyclosporin A.
Amino acid analysis: In the hydrolyzate, which is obtained by heating cyclosporin F with 6N hydrochloric acid for 16 hours at 115, the amino acids alanine, or-aminobutyric acid, valine and sarcosine can be detected using an amino acid analyzer due to the retention times.
Solubility: Cyclosporin F is easily soluble in methanol, ethanol, acetone and chlorinated hydrocarbons; moderately soluble in ether; practically insoluble in water and saturated hydrocarbons.
The new antibiotic Cyclosporin F is characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger and Curvularia lunata.
In particular, the substance is characterized by an immunosuppressive effect.
The immunosuppressive effect can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janossy, in vitro concentrations of 0.01 to 10.0 Fg / ml show a strong inhibition of H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blastogenesis of with concanavalin A. stimulated lymphocytes from mouse spleen were found.
b) Oxazolone test on the mouse:
The decrease in ear swelling is expressed as a suppressive index (SI); SI = 0.62 after 5 x70 mg / kg p.o.
Due to its immunosuppressive effect, the substance can be used for the prophylaxis and treatment of diseases that are related to the negative effects of the defense reaction.
The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated.
In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 60 to 300 mg / kg of body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form. For larger mammals, the daily dose is around 300 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 150 to 300 mg of the new antibiotic cyclosporin F in addition to solid and liquid carriers.
As a remedy, the new antibiotic cyclosporin F can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
Cyclosporin F
500 liters of a nutrient solution containing 40 g glucose, 2.0 g sodium caseinate, 2.5 g ammonium phosphate, 5 g MgSO4-7H20, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and contains demineralized water, are inoculated with 50 liters of a pre-culture of strain NRRL 8044 and incubated in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min. / liter nutrient solution) for 13 days at 27 (see DOS 2455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The material obtained after the filtration is chromatographed on the 5- to 7-fold amount of Sephadex LH-20 with methanol as the eluent. The top fractions are then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck), with hexane acetone (2: 1), the fractions eluted first predominantly containing cyclosporin A and cyclosporin D, the later eluted portions predominantly cyclosporin C.
For further purification, the cyclosporin A and D-containing fractions are crystallized from the 2- to 2.5-fold amount of acetone at -15 and then further separated by double chromatography on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck), the Fractions cyclosporin D first eluted with hexane-acetone (2: 1) contained in a highly enriched form. These are dissolved in twice the amount of acetone and left to crystallize at - 15. The crude crystallizate obtained in this way consists of very strongly enriched cyclosporin D, the mother liquor contains, in addition to cyclosporin D, further components, so cyclosporin F.
To obtain cyclosporin F, the mother liquor evaporated to dryness is chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck), with water-saturated ethyl acetate, the fractions which eluted first contain cyclosporin D and the fractions which later eluted cyclosporin F in a mixture, among others Components. For further enrichment, the mixture is first chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck), with chloroform-methanol (98: 2) and then for separation with hexane-acetone (2: 1); the fractions eluted first contain cyclosporin F in a very enriched form.
For purification, the cyclosporin F fractions are crystallized twice from ether petroleum ether (1: 4) at room temperature, pure cyclosporin F in the form of colorless polyhedra of mp.