Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindung Isocyclosporin G der Formel I
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Erfindungsgemäss gelangt man zum Isocyclosporin Gdurch Säurebehandlung des Cyclosporin G der Formel II.
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Isocyclosporin G hat folgende Charakteristika:
Aus Äther farblose Prismen, Smp. 143-146 .
[ < z1D20 = - 196 (c = 0,72 in Chloroform), - 128 (c = 0,73 in Methanol) Elementaranalyse: C3H113N1 1012
Ber. C 62,2 H 9,4 N 12,7 0 15,8% Gef. C 62,0 H 9,6 N 12,9 0 16,1% Im Dünnschichtchromatogramm auf Polygram SIL G-
Folien mit Chloroform-Methanol-Eisessig (90 : 6 :4), Lauf strecke 10 cm, werden folgende Rf-Werte beobachtet:
Isocyclosporin G 0,38
Cyclosporin G 0,56
Die Detektion erfolgt mit Joddampf.
UV-Spektrum in CH3OH: Endabsorption.
IR-Spektrum in CH2CI2: siehe Fig. 1.
1H-NMR-Spektrum in CDCI3, 90 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 2.
Die Säurebehandlung nach dem erfindungsgemässen Verfahren lässt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, z. B. mit starken organischen Säuren. Als vorzugs weise geeignet haben sich Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure erwiesen. Es können aber auch andere starke organische Säuren verwendet werden, z. B. Trifluoressigsäure.
Die Menge der starken Säure, die zur Isomerisierung angewendet wird, liegt vorzugsweise zwischen 1 und 4 Mol pro Mol Isocyclosporin G.
Als Lösungsmittel kommen niedrige Alkohole, z. B. Me thanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform oder Ather, z. B. Dioxan, in Frage.
Die Reaktionstemperatur kann zwischen 20 und 65 "C, vorzugsweise von 45 bis 55 "C variieren.
Das als Ausgangsprodukt benützte Cyclosporin G kann erhalten werden, indem man einen Cyclosporin G produzierenden Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und Cyclosporin G aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Ein bevorzugter Cyclosporin G produzierender Stamm ist der frei zugängliche Stamm NRRL 8044 der Pilzspedies Tolypocladium infiatum Gams. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, I11., USA deponiert. Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z.B. in der DE-OS 2455 859 beschrieben.
Isocyclosporin G zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
Insbesondere zeichnet sich die Substanz durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung von Isocyclosporin G kann wie folgt gezeigt werden: a) Im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy wird in vitro in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 pg/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierten Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
b) Lokale Hämolyse im Gel in vitro, Jerne-Test [J. F.
Borel, Agents and Actions, 4, 277 (1974)1: Die Hemmung der Hämolysenhöfe in % gegenüber Kontrollen beträgt bei einer Dosis von 3 x 50 mg/kg p. o. 95%. Es wird sowohl die Bildung von Immunoglobulin M- wie auch von Immunoglobulin G-Antikörpern gehemmt.
Aufgrund seiner immunosuppressiven Wirkung kann Isocyclosporin G zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen, angewandt werden.
Isocyclosporin G besitzt ebenfalls eine Arthritishemmende Wirkung. So wirkt es z. B. im Freund-Adjuvans-Arthritis Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von 30 mg/kg Körpergewicht/Tag stark schwellungshemmend.
Aufgrund seiner Arthritis-hemmenden Wirkung kann Isocyclosporin G zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und rheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg Isocyclosporin G neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann Isocyclosporin G allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
Zur Lösung von 6,08 g Cyclosporin G in 40 ml absolutem Dioxan gibt man die Lösung von 1,20 g Methansulfonsäure in 20 ml Dioxan und hält das Gemisch bei 50 unter Feuchtigkeitsausschluss. Der Fortgang der Reaktion wird im Dünnschichtchromatogramm verfolgt [Polygram SIL G-Folien, Chloroform-Methanol-Eisessig (90 : 6 :4), Joddampf zur Sichtbarmachung]. Nach 16 Stunden wird auf Raumtemperatur gekühlt. Durch Zufügen von 1,13 g wasserfreiem Natriumacetat wird die Säure abgestumpft, nach Rühren während 45 Minuten das ausgeschiedene Salz abgenutscht und das Filtrat im Vakuum bei 45" eingedampft. Die 8,1 g Rückstand werden an 500 g Kieselgel, Merck, Korngrösse 0,063-0,2 mm, chromatographiert, wobei zur Elution Chloroform-Methanol (98 : 2) dient.
Die praktisch aus reinem Isocyclosporin G bestehenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 50 eingedampft und der Rückstand aus Ather bei + 7 kristallisiert, wobei Isocyclosporin G vom Smp. 143-146 anfällt.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Cyclosporin G wird wie folgt hergestellt:
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2,0 gNatriumcaseinat, 2,5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgSO4 7H2O, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DE-OS 2455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an der 5- bis 7fachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die Spitzenfraktionen werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck) mit Hexan Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5fachen Menge Aceton bei - 15" kristallisiert und anschliessend durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck) weiter aufgetrennt, wobei die mit Hexan-Aceton (2:1) zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese werden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei -15" kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat besteht aus sehr stark angereichertem Cyclosporin D, die Mutterlauge enthält neben Cyclosporin D noch weitere Komponenten, so Cyclosporin G.
Zur Gewinnung von Cyclosporin G wird die zur Trockne verdampfte Mutterlauge an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck) mit wassergesättigtem Essigester chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D enthalten, und die später eluierten Fraktionen Cyclosporin G im Gemisch neben weiteren Komponenten. Zur weiteren Anreicherung wird das Ge- misch zuerst an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,2 mm (Merck) mit Chloroform-Methanol (98 : 2) und anschliessend zur Auftrennung mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert; dabei enthalten die zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin G in sehr stark angereicherter Form.
Zur Reingewinnung werden die Cyclosporin G-Anteile zweimal aus Äther-Petroläther (1:1) bei Raumtemperatur kristallisiert; sie liefern dünnschichtchromatographisch-einheitliches, reines Cyclosporin G als farblose Polyeder vom Smp. 193-194e (nach Trocknen der Kristalle im Hochvakuum bei 80 während 2 Stunden).
The present invention relates to the compound isocyclosporin G of the formula I.
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According to the invention, isocyclosporin G is obtained by acid treatment of cyclosporin G of the formula II.
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Isocyclosporin G has the following characteristics:
Colorless prisms from ether, mp. 143-146.
[<z1D20 = - 196 (c = 0.72 in chloroform), - 128 (c = 0.73 in methanol) Elemental analysis: C3H113N1 1012
Ber. C 62.2 H 9.4 N 12.7 0 15.8% found C 62.0 H 9.6 N 12.9 0 16.1% in a thin layer chromatogram on polygram SIL G-
Films with chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4), running distance 10 cm, the following Rf values are observed:
Isocyclosporin G 0.38
Cyclosporin G 0.56
The detection is done with iodine vapor.
UV spectrum in CH3OH: final absorption.
IR spectrum in CH2CI2: see Fig. 1.
1H NMR spectrum in CDCI3, 90 MHz, tetramethylsilane as internal standard: see FIG. 2.
The acid treatment according to the inventive method can be carried out according to methods known per se, for. B. with strong organic acids. Methanesulfonic acid or p-toluenesulfonic acid have proven to be suitable. However, other strong organic acids can also be used, e.g. B. trifluoroacetic acid.
The amount of strong acid used for isomerization is preferably between 1 and 4 moles per mole of isocyclosporin G.
Low alcohols, e.g. B. Me thanol, halogenated hydrocarbons, for. B. chloroform or ether, e.g. B. dioxane in question.
The reaction temperature can vary between 20 and 65 "C, preferably from 45 to 55" C.
The cyclosporin G used as the starting product can be obtained by cultivating a strain of the fungal species Tolypocladium inflatum Gams producing cyclosporin G in the presence of a nutrient medium and isolating cyclosporin G from the fermentation broth in a manner known per se by extractive and / or adsorptive working methods and then chromatographically or cleans by means of counterflow distribution.
A preferred strain producing cyclosporin G is the freely accessible strain NRRL 8044 of the mushroom spies Tolypocladium infiatum Gams. A culture of this was deposited in the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, I11., USA. This strain was previously assigned to the fungus species Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) And is e.g. described in DE-OS 2455 859.
Isocyclosporin G is characterized by interesting pharmacological properties and can therefore be used as a remedy.
In particular, the substance is characterized by an immunosuppressive and anti-inflammatory effect.
The immunosuppressive effect of isocyclosporin G can be shown as follows: a) In the lymphocyte stimulation test according to Janossy, in vitro concentrations of 0.01 to 10.0 pg / ml show a strong inhibition of the H3-thymidine incorporation, the proliferation rate and the blastogenesis of Lymphocytes from mouse spleen stimulated with Concanavalin A were found.
b) Local hemolysis in the gel in vitro, Jerne test [J. F.
Borel, Agents and Actions, 4, 277 (1974) 1: The inhibition of the hemolysis areas in% compared to controls is at a dose of 3 x 50 mg / kg p or 95%. The formation of both immunoglobulin M and immunoglobulin G antibodies is inhibited.
Due to its immunosuppressive effect, isocyclosporin G can be used for the prophylaxis and treatment of diseases that are related to the negative effects of the defense reaction.
Isocyclosporin G also has an anti-arthritic effect. So it works z. B. in Freund's adjuvant arthritis latency test on the rat in doses of 30 mg / kg body weight / day strongly anti-swelling.
Due to its arthritis-inhibiting effect, isocyclosporin G can be used for the prophylaxis and treatment of arthritis and rheumatic diseases.
The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated. In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 10 to 200 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form.
For larger mammals, the daily dose is around 50 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 25 to 300 mg of isocyclosporin G in addition to solid and liquid carriers.
As a remedy, isocyclosporin G can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
To the solution of 6.08 g of cyclosporin G in 40 ml of absolute dioxane, the solution of 1.20 g of methanesulfonic acid in 20 ml of dioxane is added and the mixture is kept at 50 with the exclusion of moisture. The progress of the reaction is monitored in the thin layer chromatogram [Polygram SIL G foils, chloroform-methanol-glacial acetic acid (90: 6: 4), iodine vapor for visualization]. After 16 hours, the mixture is cooled to room temperature. By adding 1.13 g of anhydrous sodium acetate, the acid is blunted, after stirring the precipitated salt is filtered off with suction for 45 minutes and the filtrate is evaporated in vacuo at 45 ". The 8.1 g of residue are dissolved in 500 g of silica gel, Merck, particle size 0.063- 0.2 mm, chromatographed using chloroform-methanol (98: 2) for elution.
The fractions, which consist practically of pure isocyclosporin G, are combined, evaporated in vacuo at 50 and the residue is crystallized from ether at + 7, isocyclosporin G of mp 143-146 being obtained.
The cyclosporin G used as the starting material is produced as follows:
500 liters of a nutrient solution containing 40 g glucose, 2.0 g sodium caseinate, 2.5 g ammonium phosphate, 5 g MgSO4 7H2O, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO3, 0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and demineralized water per liter contains, are inoculated with 50 liters of a pre-culture of strain NRRL 8044 and incubated in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min. / liter nutrient solution) for 13 days at 27 (see DE-OS 2455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. The material obtained after the filtration is chromatographed on the 5- to 7-fold amount of Sephadex LH-20 with methanol as the eluent. The peak fractions are then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck) with hexane acetone (2: 1), the fractions which eluted first contain mainly cyclosporin A and cyclosporin D, the later eluted parts predominantly cyclosporin C.
For further purification, the cyclosporin A and D-containing fractions are crystallized from the 2 to 2.5 times the amount of acetone at - 15 "and then further separated by double chromatography on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck), the fractions first eluted with hexane-acetone (2: 1) contain cyclosporin D in a highly enriched form. These are dissolved in twice the amount of acetone and allowed to crystallize at -15 ". The crude crystallizate obtained in this way consists of very strongly enriched cyclosporin D, the mother liquor contains, in addition to cyclosporin D, further components, so cyclosporin G.
To obtain cyclosporin G, the mother liquor evaporated to dryness is chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck) with water-saturated ethyl acetate, the fractions which eluted first contain cyclosporin D and the fractions eluted later cyclosporin G in a mixture, among others Components. For further enrichment, the mixture is first chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.2 mm (Merck) with chloroform-methanol (98: 2) and then for separation with hexane-acetone (2: 1); the first eluted fractions contain cyclosporin G in a very enriched form.
The cyclosporin G fractions are crystallized twice from ether-petroleum ether (1: 1) at room temperature for pure recovery; they provide pure, thin-layer chromatography, pure cyclosporin G as a colorless polyhedron of mp 193-194e (after drying the crystals in a high vacuum at 80 for 2 hours).