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PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Cyclo sporin E, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der
Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams auf oder in einem
Nährmedium züchtet und hierauf das neue Antibiotikum Cylo sporin E aus dem Nährmedium isoliert und reinigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her stellung des neuen Antibiotikums Cyclosporin E.
Erfindungsgemäss gelangt man zum neuen Antibiotikum Cyclosporin E, indem man einen Stamm der Pilzspecies Toly pocladium inflatum Gams auf oder in einem Nährmedium züch tet, das neue Antibiotikum aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Ein Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams wurde in der DOS 2455859 beschrieben. Er wurde aus einer in Norwegen gesammelten Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III., USA, am 12. August 1974 unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin E kann man beispielsweise in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Medium mit einer Konidien- und Mycelsuspension des Stammes NRRL 8044 beimpft und die Kultur 11 bis 18 Tage, vorzugsweise 13 Tage, bei 25 bis 30 , vorzugsweise bei 27 , und bei einem pH-Wert von 4,3 bis 6,2, vorzugsweise 5,6, in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/ Min./Liter Nährlösung) inkubiert wird.
Sobald eine maximale Menge an Antibiotikum produziert ist, wird dieses aus der Kulturbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen.
Charakterisierung von Cyclosporin E Farblose, prismatische Kristalle Smp. 149-152" (Zers.) [a]D = -178,7 (c = 0,54 in CHCl3) = -186,10(c = 0,51 in CH,OH) UV-Spektrum in CH,OH: Endabsorption.
IR-Spektrum in CH2Cl2: siehe Fig. 1.
'H-NMR-Spektrum in CDCl3, MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Fig. 2.
'3C-NMR-Spektrum in CDCl3, 22,63 MHz, Tetramethylsilan als interner Standard: siehe Tab. 1.
Massenspektrum: Peaks bei 1187 (Molekularpeak von C61H109N11012); 1169(1187-18: Eliminierung von H20); ferner 1114,1086,1075.
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm: Polygram SIL G-Folien, Schichtdicke 0,25 mm, Laufstrecke 10 cm. Aufgetragene Substanzmenge: 40 y.
Fliessmittel Rf-Werte
Cyclosporin Cyclosporin
E A Chloroform-Methanol (96:4) 0,35 0,35 Äther-Methanol (9:1) 0,28 0,39 Aceton-Chloroform (1:1) 0,49 0,51 Aceton-Hexan (1:1) 0,27 0,35
Die Detektion erfolgt mit Joddampf.
Elementaranalyse (im Hochvakuum 3 Stunden bei 80 "C getrocknet):
Bruttoformel: C61H1o9N1l0l2 Analyse:ber. C61,6 H9,2 N13,0 016,2 % gef. C61,5 H9,4 N13,0 016,5 %
Aminosäureanalyse: Im Hydrolysat, das man durch Erhitzen von Cyclosporin E mit 6 N Salzsäure während 16 Stunden bei 115 "C erhält, können die Aminosäuren Alanin, a-Aminobuttersäure, Valin und Sarcosin nachgewiesen werden.
Löslichkeit: Cyclosporin E ist leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und chlorierten Kohlenwasserstoffen; mässig löslich in Äther; praktisch unlöslich in Wasser und gesättigten
Kohlenwasserstoffen.
Das neue Antibiotikum Cyclosporin E zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmt es das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnet sich die Substanz Cyclosporin E durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung von Cyclosporin E kann im Lymphozytenstimulationstest nach Jänossy gezeigt werden.
In vitro wird in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0 Lg/ml eine starke Hemmung des H3-Thymidin-Einbaus, der Proliferationsrate und der Blastogenese von mit Concanavalin A stimulierter.
Lymphozyten aus Mäusemilz festgestellt.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art des Antibiotikums, der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei etwa 50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg des neuen Antibiotikums neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel kann das neue Antibiotikum allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel
500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO4- 7H20, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO, 0,5 g KCI, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 inkubiert (siehe DOS 2 455 859).
Die Kulturbrühe wird mit der gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3stufige Verteilung zwischen Methanol-Wasser (9:1) und Petrol äther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Dieses wird anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A neben Cyclosporin B und Cyclosporin E enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C.
Zur weiteren Reinigung werden die Cyclosporin A-, Bund E-haltigen Fraktionen erneut an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Hexan-Aceton (2:1) chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend aus Cyclosporin A und die später eluierten Anteile aus Cyclosporin
Bund E bestehen. Diese werden anschliessend an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Chloroform-Methanol (98:2) weiter aufgetrennt, wobei die ersten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin E und die späteren Fraktionen Cyclosporin B enthalten. Zur weiteren Anreicherung werden die Cyclosporin E-haltigen Fraktionen an Kieselgel 60, Korngrösse 0,063-0,20 mm (Merck) mit Äther-Methanol (95:5) nachchromatographiert. Die laut Dünnschichtchromatogramm [Polygram SIL G-Folien, Fliessmittel Chloroform-Methanol (96:4)] Cyclosporin E enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und aus Äther bei +7" kristallisiert. Dabei wird ein stark angereichertes Rohkristallisat von Cyclosporin E erhalten.
Wiederholte Kristallisation aus Äther bei +7 liefert dünnschichtchromatographisch einheitliches Cyclosporin E als farblose, prismatische Kristalle, die nach Waschen mit wenig eiskaltem Äther und anschliessendem Trocknen im Hochvakuum bei 80 während 3 Stunden einen Smp. von 149-152 aufweisen.
Tabelle 1 t3C-NMR-Spektrum von Cyclosporin E
Instrument: Bruker HX-90 E, Aufnahme: bei 22,63 MHz, Spektrenb.reite (sweep width): 6000 Hz 3 (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 173,86 50,7 24,8 173,81 49,6 24,3 173,29 49,5 23,5 172,92 49,1 23,5 171,21 47,1 23,1 170,92 39,6 23,1 170,80 39,2 22,8 170,23 39,2 21,6 169,33 38,6 21,3 169,33 37,8 20,0 167,95 36,8 19,2 129,5 36,5 18,6 125,8 35,6 18,6
78,8 CDCl3 32,9 18,3
77,4 CDCl3 32,0 18,0
76,6 31,5 17,6 76,0 CDCl3 31,5 16,3
59,2 30,1 10,4
58,0 29,2
57,3 25,5
55,7 25,5
55,7 25,1
52,8 25,0
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PATENT CLAIM
Process for the preparation of the new antibiotic Cyclo sporin E, characterized in that a strain of
Mushroom species Tolypocladium inflatum Gams on or in one
Culture medium grows and then the new antibiotic Cylo sporin E isolated and purified from the culture medium.
The present invention relates to a process for the manufacture of the new antibiotic cyclosporin E.
According to the invention, the new antibiotic cyclosporin E is obtained by cultivating a strain of the fungus species Toly pocladium inflatum Gams on or in a nutrient medium, isolating the new antibiotic from the fermentation broth in a manner known per se by extractive and / or adsorptive working methods and then chromatographically or cleans by means of counterflow distribution.
A strain of the fungus species Tolypocladium inflatum Gams has been described in DOS 2455859. It was isolated from a soil sample collected in Norway and a culture of it was deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III, USA on August 12, 1974 under number NRRL 8044.
The new antibiotic cyclosporin E can be prepared, for example, by inoculating a liquid medium with a conidia and mycelium suspension of strain NRRL 8044 and the culture for 11 to 18 days, preferably 13 days, at 25 to 30, preferably at 27, and at a pH of 4.3 to 6.2, preferably 5.6, in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min./liter nutrient solution).
As soon as a maximum amount of antibiotic is produced, this is obtained from the culture broth by extractive and / or adsorptive methods in a manner known per se.
Characterization of Cyclosporin E Colorless, prismatic crystals mp 149-152 "(dec.) [A] D = -178.7 (c = 0.54 in CHCl3) = -186.10 (c = 0.51 in CH, OH) UV spectrum in CH, OH: final absorption.
IR spectrum in CH2Cl2: see Fig. 1.
'H-NMR spectrum in CDCl3, MHz, tetramethylsilane as internal standard: see Fig. 2.
'3C NMR spectrum in CDCl3, 22.63 MHz, tetramethylsilane as internal standard: see Table 1.
Mass spectrum: peaks at 1187 (molecular peak of C61H109N11012); 1169 (1187-18: elimination of H20); further 1114,1086,1075.
Behavior in a thin layer chromatogram: Polygram SIL G foils, layer thickness 0.25 mm, running distance 10 cm. Amount of substance applied: 40 y.
Eluent Rf values
Cyclosporin Cyclosporin
EA chloroform-methanol (96: 4) 0.35 0.35 ether-methanol (9: 1) 0.28 0.39 acetone-chloroform (1: 1) 0.49 0.51 acetone-hexane (1: 1 ) 0.27 0.35
The detection is done with iodine vapor.
Elemental analysis (dried under high vacuum for 3 hours at 80 "C):
Gross formula: C61H1o9N1l0l2 Analysis: calc. C61.6 H9.2 N13.0 016.2% found C61.5 H9.4 N13.0 016.5%
Amino acid analysis: The amino acids alanine, a-aminobutyric acid, valine and sarcosine can be detected in the hydrolyzate, which is obtained by heating cyclosporin E with 6 N hydrochloric acid for 16 hours at 115 ° C.
Solubility: Cyclosporin E is easily soluble in methanol, ethanol, acetone and chlorinated hydrocarbons; moderately soluble in ether; practically insoluble in water and saturated
Hydrocarbons.
The new antibiotic Cyclosporin E is characterized by interesting chemotherapeutic and pharmacological properties and can therefore be used as a remedy. It inhibits the growth of Aspergillus niger, and in particular the substance cyclosporin E is characterized by an immunosuppressive and anti-inflammatory effect.
The immunosuppressive effect of Cyclosporin E can be demonstrated in the lymphocyte stimulation test according to Janossy.
In vitro concentrations of 0.01 to 10.0 Lg / ml strongly inhibit the incorporation of H3-thymidine, the proliferation rate and the blastogenesis of with concanavalin A.
Lymphocytes found from mouse spleen.
The doses to be used naturally vary depending on the type of antibiotic, the administration and the condition to be treated. In general, however, satisfactory results are obtained with test animals with a dose of 10 to 200 mg / kg body weight. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 portions or as a slow-release form.
For larger mammals, the daily dose is around 50 to 900 mg. For oral applications, the partial doses can contain, for example, about 25 to 300 mg of the new antibiotic in addition to solid and liquid carriers.
As a remedy, the new antibiotic can be administered alone or in a suitable pharmaceutical form with pharmacologically indifferent auxiliaries.
In the following example, which explains the invention in more detail but is not intended to restrict its scope in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
example
500 liters of a nutrient solution containing 40 g glucose, 5 g casein peptone, 5 g MgSO4-7H20, 2 g KH2PO4, 3 g NaNO, 0.5 g KCI, 0.01 g FeSO4 and demineralized water per liter are mixed with 50 liters a pre-culture of strain NRRL 8044 was inoculated and incubated in a steel fermenter with stirring (170 rpm) and aeration (1 liter air / min. / liter nutrient solution) at 27 for 13 days (see DOS 2 455 859).
The culture broth is stirred with the same amount of n-butyl acetate, after the organic phase has been separated off, it is concentrated in vacuo and the crude extract is degreased by 3-stage distribution between methanol-water (9: 1) and petroleum ether. The methanolic phase is separated off, concentrated in vacuo and the crude product is precipitated by adding water. This is then chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions which eluted first contain predominantly cyclosporin A in addition to cyclosporin B and cyclosporin E, the later eluted fractions predominantly cyclosporin C.
For further purification, the fractions containing cyclosporin A and bundle E are again chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with hexane-acetone (2: 1), the fractions first eluted predominantly from cyclosporin A and the later eluted portions from cyclosporin
Bund E exist. These are then further separated on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with chloroform-methanol (98: 2), the first fractions predominantly containing cyclosporin E and the later fractions cyclosporin B. For further enrichment, the cyclosporin E-containing fractions are re-chromatographed on silica gel 60, particle size 0.063-0.20 mm (Merck) with ether-methanol (95: 5). The fractions containing cyclosporin E according to the thin layer chromatogram [Polygram SIL G foils, eluent chloroform-methanol (96: 4)] are combined and crystallized from ether at +7 ". A strongly enriched crude crystallizate of cyclosporin E is obtained.
Repeated crystallization from ether at +7 provides thin-layer chromatography uniform cyclosporin E as colorless, prismatic crystals, which after washing with a little ice-cold ether and then drying in a high vacuum at 80 for 3 hours have a mp of 149-152.
Table 1 t3C NMR spectrum of cyclosporin E.
Instrument: Bruker HX-90 E, recording: at 22.63 MHz, spectrum width (sweep width): 6000 Hz 3 (ppm) 8 (ppm) 8 (ppm) 173.86 50.7 24.8 173.81 49.6 24.3 173.29 49.5 23.5 172.92 49.1 23.5 171.21 47.1 23.1 170.92 39.6 23.1 170.80 39.2 22. 8 170.23 39.2 21.6 169.33 38.6 21.3 169.33 37.8 20.0 167.95 36.8 19.2 129.5 36.5 18.6 125.8 35 , 6 18.6
78.8 CDCl3 32.9 18.3
77.4 CDCl3 32.0 18.0
76.6 31.5 17.6 76.0 CDCl3 31.5 16.3
59.2 30.1 10.4
58.0 29.2
57.3 25.5
55.7 25.5
55.7 25.1
52.8 25.0