DE69928938T2

DE69928938T2 - Neues cyclosporin mit verbesserter wirkung

Info

Publication number: DE69928938T2
Application number: DE69928938T
Authority: DE
Inventors: M. Roland WENGER; Manfred Mutter; Thomas Ruckle
Original assignee: Debiopharm SA
Current assignee: Debiopharm SA
Priority date: 1998-07-01
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: CA2335903A1; ES2255275T3; CA2335903C; ATE312843T1; CN1308635A; AU4385699A; US6927208B1; AU759480B2; JP2002519434A; DE69928938D1; WO2000001715A1; JP4350898B2; DK1091975T3; USRE40987E1; MXPA00013019A; PT1091975E; EP1091975A1; EP1091975B1; CN1218958C; BR9911724A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Cyclosporin (Cs), dessen pharmazeutische Verwendung sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die es umfasst.
Die Cs sind eine Klasse cyclischer Undekapeptide, die Poly-N-methyliert sind, besitzen mehrere pharmakologische Wirkungen, insbesondere sind es immunsupprimierende, entzündungshemmende, anti-parasitäre Mittel, Mittel zur Unterdrückung der Resistenz gegenüber Medikamenten (anti-MDR) und Mittel gegen Viren. Das erste Cyclosporin, das aus einer Pilzkultur isoliert wurde, ist das Cyclosporin A, das man im natürlicherweise findet, und das durch die folgende Formel dargestellt wird: Struktur von Cyclosporin A

Abu: = L-[α]-Aminobuttersäure
Ala: = L-Alanin
MeBmt: = N-Methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonin
Leu: = L-Leucin
MeLeu: = N-Methyl-L-leucin
MeVal: = N-Methyl-L-valin
Nva: = L-Norvalin
Sar: = Sarkosin
Thr: = L-Threonin
Val: = L-Valin.

Die nachfolgend nach ihrer konventionellen Abkürzung beschriebenen Aminosäuren liegen in L-Konfiguration vor, sofern nichts anderes angegeben worden ist.
Seit dieses erste Cyclosporin entdeckt worden ist, sind eine große Anzahl anderer Varianten isoliert und identifiziert worden, wie auch nicht natürliche Varianten, die durch synthetische Verfahren oder semi-synthetische Verfahren erhalten wurden, oder sogar durch die Anwendung modifizierter Kulturtechniken. Die Produktion von Cyclosporin A wird beschrieben von [Kobel et al. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 14, 237–240 (1982)]. Beschrieben ist ebenfalls die Herstellung künstlicher Cyclosporine, die mit rein synthetischen Verfahren hergestellt wurden, welche von R. Wenger entwickelt wurden – siehe Traber et al. 1, Traber et al. 2 und Kobel et al., US-Patente Nrn. 4,108,985; 4,210,581; 4,220,641; 4,288,431; 4,554,351 und 4,396,542; EP 34 567 und 54 782; WO 86/02080; Wenger 1, Transpl. Proc. 15, Ergänzung 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ausgabe., 24,77 (1985) und Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 50, 123 (1986).
Cyclosporin A (CsA), das vor 20 Jahren aus Tolypocladium inflatum isoliert worden ist, besitzt eine stark immunsupprimierende Wirkung. Es hat die Organtransplantation revolutioniert und wird häufig zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet. Für einen kürzlich erstellten Überblick zur Verwendung von CsA und seiner Wirkmechanismen siehe Wenger et al.: Cyclosporine Chemistry, Structure-activity relationships and Mode of Action, Progress in Clinical Biochemistry und Medicine, Band 2, 176 (1986).
Die therapeutische Wirkung von CsA stammt hauptsächlich aus der selektiven Unterdrückung der Aktivierung von T-Lymphozyten. Diese immunsupprimierende Wirkung erklärt sich dadurch, dass CsA an einen intrazellulären Proteinrezeptor, das Cyclophilin A (CyP), bindet und den Komplex CyP-CsA bildet, welcher mit Calcineurin (CaN) interagiert und auf diese Weise dessen Phosphataseaktivität hemmt. Auch die Transkription von Genfamilien der frühen Aktivierung wird blockiert (siehe O'Keefe, S. J; Tamura, J; Nature 1992, 357, 692–694).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines neuen Cyclosporins mit starker inhibitorischer Wirkung gegenüber HIV-1 (Humanes-Immundefizienz-Virus), welches nicht die immunsupprimierende Wirkung von CsA aufweist.
Der Infektionsmodus des HIV Typ 1 ist einzigartig unter den Retroviren, da es die spezifische Inkorporierung des Zellproteins CyP in sein Virion benötigt, welches mit dem Polyprotein Gag interagiert (siehe Eltaly Kara Franke, Bi-Xing Chen Journal of Virology, Sept. 1995, Band 69, Nr. 9). Es ist bekannt, dass CyP sich mit CsA und CaN in einem Dreierkomplex verbindet. Die ursprüngliche Funktion von CyP ist jedoch die Katalyse der Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Bindungen, ein limitierender und wichtiger Schritt in einem Prozess, der Proteinen erlaubt, eine dreidimensionale endgültige Struktur anzunehmen. Das CyP schützt die Zellen ebenfalls gegen thermische Schocks und dient als Chaperon-Protein. Im Gegensatz zum CsA unterbindet das Produkt des Gag-Gens des HIV-1 die Bildung eines Dreier- Komplexes mit CyP und CaN. Das HI-Virus benötigt CyP sogar, damit es sich mit dem Produkt des Gag-Gens in einer Weise verbindet, um seine eigenen Virionen zu bilden (siehe Franke, E.K; 1994 Nature 372:359–362). In Gegenwart von CsA gibt es einen direkten Wettbewerb um die Bindung an CyP mit dem Polyprotein, das aus dem Gag-Gen von HIV-1 stammt. Dieses CsA wirkt auf zwei Ebenen auf die Replikation des viralen Zyklus ein. Zuerst auf Ebene der Translokation in den Kern des Präintegrationskomplexes, und anschließend auf die Produktion der infektiösen viralen Partikel.
Das Patent US 4,814,323 beschreibt bereits eine Wirkung gegen HIV durch CsA, jedoch weist dieses ebenfalls eine stark immunsupprimierende Wirkung auf, die bei der Behandlung von Patienten, die mit dem HI-Virus infiziert sind, nicht erwünscht ist. Kürzlich wurde eine andere Art von Cyclosporin entwickelt, wobei es sich um Derivate an der Position 4 handelt, wie MeIle⁴Cs, MeVal⁴Cs oder [(4-OH) MeLeu⁴-Cs], um nur die Substanzen zu nennen, die am stärksten gegen HIV wirken, und am wenigsten immunsupprimierend sind. Das Derivat [(4-OH) MeLeu⁴-Cs] wird durch Oxidierung von Cyclosporin A mit Hilfe eines Mikroorganismus synthetisiert. Ein anderes Patent, WO 97/04005, verwendet das Herstellungsverfahren des Patents EP 484 281 sowie ein Verfahren, das von Seebach entwickelt worden ist, EP 194972 , um Derivate an Position 3 herzustellen, wie beispielsweise das (D)-MeSer³-(4-OH)MeLeu⁴-Cyclosporin. Diese Substanz besitzt eine bessere Affinität für CyP, aber besitzt nur noch eine beschränkte anti-HIV-Wirkung, im Vergleich mit dem Referenzderivat MeIle⁴-Cs (NIM 811). Der hydrophilere Charakter dieser Substanz verhindert dessen Eindringen in die Zellen und den Organismus. Das wird direkt durch die reduzierte anti-HIV-Aktivität dieser Substanz widergespiegelt (siehe Christos Papageorgiou, J.J. Sanglier und René Traber – Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Band 6, Nr. 1, Seiten 23–26, 1996).
Die in dieser Erfindung beschriebenen Substanzen weisen den doppelten Vorteil auf, dass sie die gleiche Affinität für CyP bewahren, die bei [(4-OH)Meleu⁴]-Cs oder Cyclosporin A beobachtet wurde, während sie eine identische anti-HIV-Wirkung haben, die gegenüber den Referenzderivaten (MeVal⁴-Cs oder MeIle⁴-Cs) sogar überlegen sein kann, und klar über der anti-HIV-Wirkung von Cyclosporin A oder von (4-OH) MeLeu⁴-Cs liegt. Das Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Cyclosporins, das nicht die immunsupprimierende Wirkung von CsA aufweist, und ein verbessertes Aktivitätsprofil besitzt. Diese neue Cs-Familie wird charakterisiert durch die Formel (I):
worin:
X -MeBmt oder 6,7-Dihydro-MeBmt- ist,
u -Abu, Nva, Val, Thr ist,
Y Sar oder (D)-MeSer oder (D)-MeAla oder (D)-MeSer (OAcyl) ist,
Z (N-R)aa ist, wobei aa = {Val, Ile, Thr, Phe, Tyr, Thr (OAc), Thr (OG₁), Phe (G₂), PheCH₂ (G₃), Tyr (OG₃)} mit R = {Alkyl > CH₃ und Alkyl < -C₁₀H₂₁},
G₁ = {Phenyl-COOH, Phenyl-COOMe, Phenyl-COOEt},
G₂ = {CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt, CH₂PO(OMe)₂, CH₂PO(OH)₂},
G₃ = {PO(OH)₂, PO(OCH₂CH=CH₂)₂, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt} ist.
Auch durch Ersetzen der natürlichen MeLeu-Gruppe an Position 4 durch die Gruppe N-(Alkyl) aa (wobei Alkyl > CH₃ und Alkyl < -C₁₀H₂₁ ist) verbessert man die anti-HIV-1-Aktivität dieses Derivats.
In einer Ausführungsform ist Z (N-R) Val.
Das auf diese Weise erhaltene neue Cyclosporinmolekül bietet den unerwarteten und überraschenden Vorteil, dass es eine viel bessere Stabilität gegenüber der Metabolisierung aufweist, als alle anderen bis heute bekannten Cyclosporine.
Dieses neue Molekül widersteht viel besser den Phänomenen der Oxidation und der Degradierung, welche in der Zelle auftreten. Aus diesem Grund ist die "in vivo"-Lebensdauer dieses neuen N-Alkyl aa Cs besonders verlängert.
Außerdem besitzt dieses neue N-Alkyl aa⁴-Cyclosporin eine erhöhte Affinität für CyP und weist eine gleiche oder bessere Aktivität gegen HIV auf als die der vorhandenen Cyclosporine.
Die 1 stellt die allgemeine Struktur dieses neuen Cyclosporins dar. Die Gruppen R1, R2, R3 und R4 werden in Tabelle III umfassend beschrieben. Durch die Veränderung dieser 4 Schlüsselpositionen ist es möglich gewesen, eine sehr gute Affinität für Cyclophilin zu bewahren, und die Bildung eines Dreierkomplexes mit CaN zu verhindern und vor allem in spezifischer und vorteilhafter Weise seine Stabilität gegenüber der enzymatischen Oxidierung zu steigern und infolgedessen dessen Wirkung gegenüber HIV.
Dieses neue Cyclosporin wird also hauptsächlich durch das Vorhandensein eines Restes gekennzeichnet, bei dem R > CH₃ und R < -C₁₀H₂₁ ist. Als Substituenten für Stickstoff wird beispielsweise Ethyl, Propyl, Butyl oder Pentyl verwendet, aber diese Beispiele sind nicht beschränkend. Dieses neue Cyclosporin ist besonders wirksam, wenn der Rest an Position 4 ein N-ethylierter Aminosäurerest ist (siehe Zeichnungen 2 und 3).
Die Erfindung beansprucht ebenfalls die pharmazeutische Zusammensetzung der Substanz, die durch die Formel (I) beschrieben worden ist. Diese kann in einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung vorliegen. Die galenische Formulierung, die auf diese Weise hergestellt wurde, erlaubt die Löslichkeit in Wasser zu steigern, oder die Zusammensetzung in Form von Mikroemulsionen in Suspension in Wasser zu bewahren. Das Ziel dieser Erfindung ist ebenfalls ein neues Medikament bereitzustellen, das beispielsweise bei der Behandlung und Prävention von AIDS (acquired immunodeficiency syndrome, erworbenes Immunschwäche-Syndrom) verwendet werden kann. Insbesondere verwendet man hierzu ein modifiziertes Cyclosporin, dessen Position 4 durch den Rest Z modifiziert ist, der N-Ethyl-Valin ist, zur Herstellung eines Medikaments, das auf die Behandlung und Prävention von AIDS abzielt. Die Anwendung zur Prävention von AIDS ist nicht beschränkend. Diese Substanz kann ebenfalls aufgrund seiner entzündungshemmenden Wirkungen verwendet werden.
Hinsichtlich des Fabrikationsverfahrens dieses neuen Cyclosporins haben wir die klassische Techniken verwendet, die in der Literatur beschrieben sind, ebenso wie einige spezifielle Verfahren, die im Labor entwickelt worden sind.
Das Verfahren zur Synthese von CsA ist beschrieben in: R. Wenger (Helv. Chim. Acta Band 67, Seiten 502–525 (1984)). Das Verfahren der Öffnung des geschützten Cyclosporin A (OAc) ist beschrieben in Peptides 1996. Das CsA-Molekül wird mit dem Meerwein-Reaktionsmittel behandelt (CH₃)₃OBF₄, dann durch Behandlung mit Säure in Methanol aufgeteilt, oder in Wasser hydrolysiert, um es in ein lineares Peptid mit 11 Aminosäureresten umzuwandeln: H-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OCH3. Das Verfahren ist auf der Internationalen Konferenz der Europäischen Gesellschaft für Peptide (EPS-24) in Edinburgh von 8.–13.9.1996 vorgestellt wurden, und in Peptides 1996 von R. Wenger publiziert worden. Dieses lineare Peptid wird nachfolgend mit einem klassischen Verfahren nach Edman behandelt, um dessen letzten Aminosäurerest (MeLeu) zu abzuteilen und um unser Ausgangsprodukt bereitzustellen: das Dekapeptid H-Val-MeLeu-Ala(D)Ala-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe. Dieses Produkt wird anschließend in den folgenden Schritten verwendet:
Herstellung von (1) (Anfügung einer Schutzgruppe):
Boc-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeValMeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe (1)
Zu einer Lösung aus 2,83 g (2,46 mmol) des Dekapeptids H-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-OMe in 120 ml Dioxan werden 0,72 ml (4,18 mmol) einer Diisopropylethylaminlösung und 0,65 g (2,95 mmol) Boc-Anhydrid in 50 ml Dioxan gegeben. Es werden 17 ml Wasser zur Lösung hinzugegeben, die für 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt wird. Das Lösungsmittel wird dann verdampft und die erhaltene Reaktionsmischung in 300 ml Ethylacetat gelöst, dann dreimal mit einer 5%igen Zitronensäurelösung gewaschen, dreimal mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und anschliessend dreimal mit einer NaCl-Lösung. Die organischen Phasen werden mit Hilfe von Na₂SO₄-Anhydrid getrocknet, gefiltert und das Lösungsmittel wird schließlich unter Vakuum verdampft. Auf diese Weise erhält man 3 g (98 %) des geschützten Dekapeptids (Boc-Dekapeptid-Methylester).
Das Produkt wird dann ohne zusätzlichen Reinigungsschritt in den folgenden Synthesewegen verwendet. Diese Substanz wird hydrolysiert, dann aktiviert und mit einer entsprechenden Aminosäure kondensiert, um ein neues Peptid aus 11 Resten herzustellen, welches das Ausgangsprodukt für die Cyclisierung und die Produktion eines neuen Cyclosporins mit den erwünschten Eigenschaften ist.
Herstellung von (2) (Esterhydrolyse):
Boc-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeValMeBmt(OAc)-Abu-Sar-OH (2)
Zu 4,08 g (3,26 mmol) der vorhergehenden Verbindung (I) in 146 ml Tetrahydrofuran werden tröpfchenweise (bei 15°C) 192 mg (4,56 mmol) LiOH/H₂O, gelöst in 36 ml Wasser gegeben. Dies wird alles bei 15°C gerührt. Die Reaktion ist innerhalb von 120 Stunden nach sukzessiver Zugabe von jeweils 5 Teilen bzw. 1,4 Äquivalenten LiOH/H₂O beendet. Die erhaltene Lösung wird mit 0,1 N HCl neutralisiert und das Lösungsmittel wird anschließend verdampft. Das erhaltene feste Produkt wird dann in 500 ml Ethylacetat gelöst, und zweimal mit einer Lösung aus 5%iger Zitronensäure und zweimal mit einer Lösung de Sole gewaschen. Die wässrigen Phasen werden viermal mit Hilfe von 50 ml Ethylacetat extrahiert und die zusammengegebenen organischen Phasen werden anschließend mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und verdampft. Man erhält auf diese Weise 3,84 g (95 %) der Verbindung (2). Das Produkt wird anschließend in zusätzlichen Reinigungsschritten verwendet.
Herstellung von (3) (Zugabe einer neuen Aminosäure):
Boc-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-EtVal-OtBu (3)
6,18 g (5 mmol) der Verbindung (2) werden in 250 ml Dichlormethan wasserfrei unter Argon gelöst. Die Lösung wird dann abkühlen gelassen und man gibt langsam unter Argon 3,9 ml N-Methylmorpholin (10 mmol; pH 8,5) und 1,1 ml (10 mmol) Isobutylchlorformiat hinzu. Die Lösung wird für 15 Minuten bei –15°C gerührt. Man gibt dann über 20 Minuten eine Lösung aus 2,4 g (12 mmol) H-NEt Val-OtBu hinzu, das in 40 ml Dichlormethan wasserfrei gelöst ist. Die Mischung wird für 1 Stunde bei –15°C gerührt, dann für 1 Stunde bei 0°C und anschließend die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 400 ml Dichlormethan hinzu, und anschließend führt man 3 Extraktionen mit einer 5%igen Zitronensäurelösung durch, gefolgt von 3 Extraktionen mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und schließlich 3 letzte Extraktionen mit einer gesättigten NaCl-Lösung. Die organischen Phasen werden mit Na₂SO₄ wasserfrei getrocknet, anschließend filtriert und schließlich wird das Lösungsmittel verdampft. Man erhält so nach einer Chromatographie 4,42 g (62 %) des reinen Undekapeptids.
Herstellung von (4) (Entschützung):
H-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(OAc)-Abu-Sar-EtVal-OH (4)
830 mg (0,58 mmol) des geschützten Undekapeptids (4) werden in 15 ml reinem Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung gibt man über 3 Minuten bei Umgebungstemperatur 3,2 ml Trifluoressigsäure. Der Reaktion folgt eine HPLC, die nach 1 Stunde und 30 Minuten beendet ist. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rest der Trifluoressigsäure wird zweimal in Gegenwart von Ethylacetat verdampft.
Das Rohprodukt (900 mg) wird mittels Chromatographie gereinigt (150 g Kieselgel (0,4–0,63)], als Elutionsmittel werden Dichlormethan/Methanol/Triethylamin (17:3:0,05) verwendet, um 700 mg (95 %) des entschützten, reinen Undekapeptids (4) zu eluieren.
Herstellung von (5) (Zyklisierung):
MeBmt(OAc)¹-EtVal⁴-Cs (5)
275 mg TFFH (1,04 mmol) werden unter Argon in 3,45 1 Dichlormethan wasserfrei gelöst. Das entschützte Undekapeptid (4) [438 mg (0,347 mmol)] werden dann in 40 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und 0,52 ml (3,82 mmol) Collidin werden hierin zugegeben. Diese leicht basische Peptidlösung wird tröpfchenweise über 20 Minuten unter Argon zu TFFH und unter starkem Rühren hinzugegeben. Nach 1 Stunde 30 Minuten ist das gesamte Ausgangsmaterial zyklisiert. Um den Überschuss TFFH einzuschließen, gibt man 5 ml Wasser hinzu und dann wird die Lösung verdampft. Es werden 200 ml Dichlormethan zugegeben und dann wird alles jeweils dreimal mit einer 0,1 N wässrigen HCl-Lösung und dreimal mit einer Sole gewaschen und dann mit Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wird verdampft. Man erhält 360 mg eines gelblichen Öls. Das Rohprodukt wird mittels Kieselgel-Chroma tographie gereinigt, indem 100 g Kieselgel (0,04–0,0063 mm) und 1 % Methanol in Ethylacetat als Elutionsmittel verwendet werden. Auf diese Weise werden 230 mg (54 %) des reinen Derivats (5) hergestellt.
Abspaltung der Acetatgruppe von MeBmt (OAc)-EtVal⁴-Cs (5) und Herstellung von EtVal⁴-Cs (6):
Zu einer Lösung aus 700 mg (0,562 mmol) des Cs-Derivats (5) in 28 ml MeOH gibt man tröpfchenweise unter Argon 1,44 ml einer 0,45 molaren NaOCH₃-Lösung in MeOH (0,647 mmol) hinzu. [Die NaOCH₃-Lösung in Methanol wird durch Zugabe von Natrium zu reinem MeOH hergestellt.] Die Reaktion ist nach 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur beendet. Die Mischung wird durch Zugabe von 50%iger Essigsäure in Wasser auf pH 5 gebracht. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird in 200 ml Ethylacetat gelöst und zweimal mit Wasser extrahiert. Die wässrige Phase wird mit 50 ml Ethylacetat reextrahiert, und dann werden die organischen Phasen zusammengegeben, die zweimal mit einer Lösung aus Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, gefiltert werden und dann wird das Lösungsmittel verdampft.
Das erhaltene Produkt (750 mg) wird auf 180 g Kieselgel (0,04–0,063 mm) chromatographiert, indem eine Lösung aus Aceton/Hexan 1:1 (Fraktionen von 20 ml) verwendet wird. Auf diese Weise werden 550 mg (82 %) (EtVal⁴)Cs (6) hergestellt.
Herstellung von H-EtVal-Ot-Bu:
Zu einer Suspension aus 5 g (23,8 mmol) H-ValOtBu × HCl in 1 l Trimethyloxoformiat werden unter Argon 4,1 ml (23,83 mmol) Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 10 Minuten wird die Suspension klar. Zu dieser Lösung gibt man unter wasserfreien Bedingungen tröpfchenweise 13,5 ml (0,24 mmol) Acetaldehyd, das in 30 ml Trimethyloxoformiat gelöst ist. Die Reaktion wird für 45 Minuten unter Argon bei Raumtemperatur gerührt.
Indem man ein leichtes Vakuum anwendet, wird der Überschuss an Acetaldehyd durch Verdampfen über 1 Stunde und 30 Minuten entfernt. Zu dieser Lösung gibt man unter Argon 25 g (0,112 mmol) an festem NaBH(OAc)₃ hinzu. Nach 15 Minuten wird die Lösung auf 0°C abgekühlt und man gibt langsam 500 ml einer wässrigen 2%igen HCl-Lösung hinzu.
Das Trimethyloxoformiat wird unter Vakuum verdampft und der Rest der wässrigen Lösung wird in 300 ml Wasser verdünnt. Diese Lösung wird dann zweimal mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wird anschließend mit einer 0,1 N normalen wässrigen HCl-Lösung reextrahiert. Die zusammengegebenen wässrigen Phasen werden auf 0°C abgekühlt, dann wird der pH-Wert mit Hilfe von NaOH (2 N) auf 9 gebracht. Die Lösung wird dadurch trüb. Die wässrige Lösung wird viermal mit Hilfe von 100 ml Diethylether extrahiert. Die zusammengegebenen organischen Phasen werden anschließend mit Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wird anschließend verdampft.
4,2 g eines gelblichen Öls, die aus diesem Schritt hervorgehen, werden mit Hilfe der Chromatographie unter Verwendung von 900 g Kieselgel (0,04–0,063 mm) sowie einer Mischung aus Hexan/Ethylacetat 8:2 als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält schließlich 3,13 g (65 %) an reinem H-EtLeu-OtBu.
Die Resultate der Tabelle I zeigen die Affinität der Cs-Derivate für Cyclophilin A in einem kompetitiven ELISA-Test, der von Quesniaux in Eur. J. Immunology 1987, 17, 1359–1365 beschrieben wurde. In diesem Test gibt man während der Inkubation mit Cyclophilin zu dem zu testenden Cs an BSA (Serumalbumin) gebundenes Cs hinzu. Man berechnet dadurch die benötigte Konzentration, um eine 50%ige Inhibition (IC₅₀) der Kontrollreaktion in Abwesenheit des Kompetitors zu erhalten. Die Ergebnisse werden durch den Bindungsindex IL ausgedrückt, welcher dem Verhältnis von IC₅₀ des Derivats zum IC₅₀ von CsA entspricht. Ein Bindungsindex (IL) von 1,0 zeigt, dass die getestete Verbindung genauso gut wie CsA bindet. Ein Wert unterhalb 1,0 zeigt an, dass das Derivat besser als CsA bindet, während ein Wert über 1,0 anzeigt, dass das Derivat weniger gut an CyP bindet als CsA. Tabelle I
Cs wird als immunsupprimierend angesehen, wenn seine Wirkung in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) über 5 % liegt. Die (MLR)-Reaktion ist beschrieben in T. Meo in "Immunological Methods", L. Lefkovits und B. Devis, Hrsg., Académie Prev. N.Y. Seiten: 227–239 (1979).
Milzzellen (0,5 × 106), die aus Balb/c-Mäusen stammen (Weibchen, 8 bis 10 Wochen), werden für 5 Tage in Gegenwart von behandelten Milzzellen coinkubiert, welche aus einer CBA-Maus stammen (Weibchen, 8 bis 10 Wochen). Diese Zellen sind mit Mitomycin C behandelt oder sind bei 2.000 Rad bestrahlt worden. Die allogenen Zellen der Milz, die nicht bestrahlt wurden, zeigen eine proliferative Reaktion bei den Balb/c-Zellen, die man durch Einbau eines markierten Bausteins in die DNA messen kann. Wenn die Stimulatorzellen bestrahlt werden (oder mit Mitomycin C behandelt werden), weisen die Balb/c-Zellen keine proliferative Reaktion mehr auf, aber sie bewahren dennoch ihre Antigenizität. Der IC₅₀, der im MLR-Test berechnet wird, wird mit dem IC₅₀ unter Zugabe von CsA in einem Parallelexperiment verglichen. Auf diese Weise wird der IR-Index gefunden, welcher dem Verhältnis des IC₅₀ im MLR-Test der Derivate bezogen auf den IC₅₀ mit Cyclosporin A entspricht.
Auf gleiche Weise wie beim vorhergehenden Bindungsindex (IL) zeigt ein Wert von 1,0 für IR eine ähnliche Aktivität an wie CsA. Ebenso zeigt ein darunterliegender Wert eine bessere Aktivität an und ein über 1,0 liegender Wert zeigt eine Wirkung der Verbindung an, die der von CsA unterlegen ist.
Ein IR-Wert > 20 zeigt, dass die Substanz nicht immunsupprimierend ist. Die Werte der Immunsuppression der Derivate werden in der Tabelle I angegeben.
Tabelle II beschreibt den Schutz der CEM-SS-Zelllinie gegen eine HIV-Infektion in Prozent. Der Schutz dieser Linie in Gegenwart eines Cs-Derivats wird mit der Infektion einer Linie verglichen, die in Abwesenheit des Cs-Derivats kultiviert wird (Kontrolle). Bei einer molaren 2 × 10^–6 Konzentration des Derivats wird ein Mittelwert erstellt. Die Messung dieser anti-HIV-Wirkung wurde vom NCI (National Cancer Institute) in Washington in den USA durchgeführt. Tabelle II
Der bessere Schutz in Prozent gegen eine Infektion mit HIV, der durch die Verbindung EtVal⁴-Cs erreicht wurde (verglichen mit zwei anderen Referenzen, die dafür bekannt sind, dass sie 10mal besser sind als CsA) zeigt den Vorteil der Substitution der Position 4 durch ein N-Ethyl. Diese Beobachtung ist noch viel wertvoller, wenn man die Affinität jeder Substanz für CyP vergleicht. Man erhält beim EtVal⁴-Cs-Derivat eine Affinität für CyP, die der von CsA ähnelt (IL = 1,0), während die MeVal⁴-Cs- und MeIle⁴-Cs-Derivate eine Affinität für CyP aufweisen, die höher ist (IL = 0,6 bzw. 0,5). Bei einer schwächeren Affinität für CyP hat EtVal⁴-Cs einer stärkeren Wirkung gegenüber HIV. Dies zeigt in herausragender Weise den Wert dieses neuen Derivats.

Claims

Synthetisches Cyclosporin, gekennzeichnet durch die Formel:
worin: X -MeBmt oder 6,7-Dihydro-MeBmt- ist, u -Abu, Nva, Val, Thr ist, Y Sar oder (D)-MeSer oder (D)-MeAla oder (D)-MeSer (OAcyl) ist, Z (N-R)aa ist, wobei aa = {Val, Ile, Thr, Phe, Tyr, Thr (OAc), Thr (OG₁), Phe (G₂), PheCH₂ (G₃), Tyr (OG₃)} mit R = {Alkyl > CH₃ und Alkyl < -C₁₀H₂₁}, G₁ = {Phenyl-COOH, Phenyl-COOMe, Phenyl-COOEt}, G₂ = {CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt, CH₂PO(OMe)₂, CH₂PO(OH)₂}, G₃ = PO(OH)₂, PO(OCH₂CH=CH₂)₂, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt} ist.
Cyclosporin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest Z an Position 4 (N-R)Val ist.
Cyclosporin gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest Z an Position 4 N-Ethyl-Valin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend die Verbindung, die durch die Formel gekennzeichnet ist:
worin: X -MeBmt oder 6,7-Dihydro-MeBmt- ist, u -Abu, Nva, Val, Thr ist, Y Sar oder (D)-MeSer oder (D)-MeAla oder (D)-MeSer (OAcyl) ist, Z (N-R)aa ist, wobei aa = {Val, Ile, Thr, Phe, Tyr, Thr (OAc), Thr (OG₁), Phe (G₂), PheCH₂ (G₃), Tyr (OG₃)} mit R = {Alkyl > CH₃ und Alkyl < -C₁₀H₂₁}, G₁ = {Phenyl-COOH, Phenyl-COOMe, Phenyl-COOEt}; G₂ = {CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt, CH₂PO(OMe)₂, CH₂PO(OH)₂}, G₃ = PO(OH)₂, PO(OCH₂CH=CH₂)₂, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂COOEt} ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung vorliegt.
Verwendung von Cyclosporin gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Verhinderung von Aids.
Verwendung von Cyclosporin gemäß Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Verhinderung von Aids.