PL159763B1

PL159763B1 - Sposób wytwarzania nowych cyklicznych peptolidów PL

Info

Publication number: PL159763B1
Application number: PL27352088A
Authority: PL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-07-04
Filing date: 1988-07-04
Publication date: 1993-01-29
Also published as: PL273520A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych cykli- cznych peptolidów o strukturze cyklospory- ny, w której jedno wiazanie amidowe jest zastapione wiazaniem estrowym i która skla- da sie z jednej reszty MeBmt lub jej pochod- nej, 9 reszt innych aminokwasów i jednej reszty a -hydroksykwasu, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle wytwarzajacego je mikroorganizmu grzyba z rodzaju Cylindro- trichum Bonorden w pozywce. W z ó r 2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku je3t s^posób wytwarzania nowyc^h cyklicznych ^peptolidów, stosowanych jako śrotiki farmaceut^yczne.

^Stosowane okreMenie peptolid oznacza naturalny lub syntetyczny związek, Móry slcłada się z oć -hydroksykwasów i °C-aminokwasów, połączonych wiązaniami amidow^ymi i estrow^ymi. Zatem struktura, Mórą otrzymuje się zastępując wi^ązanie amidowe wiązaniem estrowym w peptyśie, jest sśukturą ^peptolidu.

Ważną Masę p^eptydów stanowią cy^klosporyn^y, Móre charakteryzują się cykliczną strukturą, zwykle zawierają 11 reszt aminokwasów z których Jedną jest reszta N-metylo-/4R/-4-but-2E-en-l-ylo-4-metylo-/L/-treoniny^, oznaczonej jako MeBmt^, l^iib jej prahodnej. Wiele cykl^o^oryn okazuje Maraści farmMologiczne, zwłaszcza imraunosupresyjne i przeciwzapalne. ^pier#szą wyizolowaną cyMosporyną, A /CyMoaporyna/, dostępna w handlu pod zarejestrowaną p

razwą ^Saniimm^une , Mórej sśukturę Mreala wzór ¹ prześtawiony na rysunku. Poniżej proedMawiono znaczenia Mrótów i symboli Mosowanycb w tym wzorze oraz ^w innych ^powołan^ych ^wopisie wzorac^h:

A^bu Ala BOC Bz Gly Hiv Ile Leu ^Me Bmt JńeBmtHg ⁸ *^HHMeBmt

Mas ^c.C -zminzmosłowy alanina t-butoksyśrśnyl benzyl glicyna

Mas oC -h^drossyizowalerianowy izoleucyna leuc^a

N-metyl(j-/4R/-4-but-2E-en-l-y l^Amnie ty lo~^LL/-treonina

N-mety lo-/4R/-4-but-l-yl4-Z-tle tyro-/L/-tΓeonina

N-metylo-/4R/-4-/4 -^sydΓok^y^but-2E-en-l-slo/-4-mt^tylo-LL/-tΓeo.^ina

159 763

Sar

Thr

Val sarkozyna treonina walina

Reszty Minokwaaów w cykloaporynach numeruje alę zgodnie z ruchem wstazówek zeg^ara z^aczyn^aJąc ^od re^azty MeBmt. Wszystkie C⁴ -aminokwasy mają konfiguruję /L/, jeśli nie zazntozoⁿo inacze^ji tak więc alanina w pozycji 8 we wzorze 1 ma tanfigurację/D/. ^Symbol Me przed ^ayrn bólem ^aminokwaau oznacza, że atom azotu w wiązaniu amidowym Jes^t N-metylow^any.

Przedmiotem wynalazku jest a^posób wytwarzania cyklicznyoh peptolidów ° Hrukturze ^cykl^o ^apor^yny, w której Jedno wiązanie amidowe Jest zastąpione wiązaniem etorowym.

Korzystnie cykliczny ^peptolid jest złożony z Jednej reszty MeBmt lub jej pochodnej, 9 reszt innych (^χ -aminokwasów i jednej reszty & -hydroksykwasu, który tar^zystnie ^znajdu^Js Hę w ^pozycji ⁸·

Korzystne ^pochodne ^MeBmt, ^przedatawionej wzorem 9, stanowi ^pochodna ⁸*hydroksy /8*-OHMeBmt/ o wzorze ^{10 1} nasycona ^pocho^dna tohytoo /MeBmt 1-° / ^o wzorze Π.

Korzystne cykliczne ^peptelidy wytwarzane s^posobem według wynalazta, mają strukturę przed stawioną wzorem 2, w Ictórym W oznacza MeBmt, 8'-OHMeBmt lub IfleBnit^, ^X oznacza ^Sar lub Gly,

V oznacza MeLeu lub Leu, Z oznacza Leu, Ile lub ^Val, a A oznacza resztę taasu ^-^ -hydrotayIcarboksylowego, ^korz^ystnie o wzorze 3, « taćryrn R oznacza grupę Cj^alkilową.

Bairdziej tarzystnie ^R we wzorze 3 oznacza ^grupę izopropylową i wówczas A ^prze^dstawiona jest wzorem ¹² i oznacza resztę taasu C⁴ -hydroks^zowaler tonowego, oznaczoną symbolem ^Hiv. Naj korzy etniesazym związkiem wytwarzanym sposobem według wynalazku jest zwi^ązelc, w Ictórym we wzorze ^{2 W} oznacza MeBmt, X oznacza Sar, V oznacza MeLeu, ^Z oznacza Leu, a A oznaoza /D/Hiv. Przetotawiony na rysunku wzór 4 jest pełnym wzorem strukturalnym tego zwi^ązku. Motaa ^go też przetotawió stosując (konwencjonalną nomenklaturę c^ykloapor^yn, opartą na strukturze Cyklosporyny /cyklosporyny A/ o wzorze ¹ i wówczas wymienia się talejno tażdą reeztę w cząsteczce, taćra jeta inna niż odpowiednia reszta w Cyklos^porynie 1 dodaje się na tańcu CyMosporyna. ^Zwi^ązek o wzorze ⁴ można zatem przetotawió jako /TM·/² /Leu/^ /D-Hiv/⁸ /Leu/^1- - Cyklosporyną, to znaczy Cykloapor^ę, w taórej w ^pozycji 2 A^bu zastąpiono przez Thr, w ^pozycji 5 Val zastąpiono Leu, ^w pozycji ⁸ /D/Ala zastąpiono /D/Hiv i w pozycji i.0 MeLeu zastąpiono Leu, a ^pozostałe reszty s^ą takie same jak reszty w Cyklosporynie.

^Sp°3obθm ^wodług wynalazku nowe cykliczne ^pep^tydy wytwarza się przez prowadzenie hodowli ^szczepu wytwarz^ającego je mikroorganizmu w po^żywce. ^Korz^ystnymi mikroorganizmami s^ą szczepy grzybów z ro^dz^aju Cylindrotrichurn Bonorden, a zwłaszcza szczep NRRL 1⁸23^-» który wytwarza cykliczne peptolidy o wzorze 2.

toczap wyizolowano ^z prtoki liści pocłiodzących z Waltotourga w Jurze Szwaj carskiej i ztolną to ^życia talturę zdeponowano 17 czeiwfca 1987 r. w Ministerstwie Rolnictwa Stanów ^Zjedn. Ameryki /North Central togio^ tarthern Regional Reaearch Centre/, Peoria, 111, ^pod merem ^NRRL l⁸²³0. taltarę można torzymaó z fi mny Santoz Ltd., Bazylea, Szwa.jcarto.

^Szczep grzyba ^NRR^{L 182}30 jest podobny do ^pleśni i inkubowany w 2¹-24°C na pożywce 2% ekstrakt Modowy /eg^ar /=MAi ²% ekstraktu słodowe^go, ^-,4% ekstraktu toożdżowego, 2% a^garu w totnineraltoowane,} wodzie/ wytwarza nieseptawane lub ozęsto lsseptowane ^pałeczkowate hiaUnowe tanidia, o wielkości 6-15 Λΐ x 1,5-2,7 m /najozęściej 9,5-13,5 a/.

tamórki z^otoikotwtocze są zwykle cylindryczne i mają wyraźną kr^yz^ęj niektóre komórki ^są ^mptoialno^olifialidowe. Według klucza identyfikacyjnego M.B. Elles /Dematlsceons Hyptoi^ceteai ^Commⁿnⁿea^jt^c Mycological Institute, Kew^, Surrey, Anglia, ta71/ szczep zożm najwtotatoiej zaklasyfikować to rodzaju Cylindro^i^em Bonordeⁿ· toczep grzyba ^NR^{RL 182}30 rośHe Hosunkowo wolno i ^po ^1— dniach inkubacji w temperatu-

te^eratura wzr^tu ^jest p^iętoy ¹⁸°c i ²7°C, a ^powyżej 33°C wzrost He zsctiodzi. Kolonie

159 763 rozgałęzionej i septowanej grzybni powietrznej hodowane na MA w 21°C mają zwykle azerokość 1,5-3,5>u /zwykle 2-3 ui/j w ^grzybni ^podstawowej można również zauważyć strzępki ^do 5,5 «·

Przedmiotem wynalazku Jest również brzeczka fermentacyjna otrzymana przez hodowanie ^szczepu grzyba ^z rodroju Cylindrotrichum Bonorden. Row^y szczep NRRL l⁸²30 można ^ho^do^waó w grobowym jiroce^e ^powierzchniowym lub zanurzeniowym, w od^powiedniej temperaturze, w różn^ych Rżywkach zawierających składnilci o^dżywcze i sole mineralne w ^przyswajalnej postaoi.

Poż^ywk^a powinna zawierać ^przyswaJalne źróRo węgla i ewentualnie sole mineralne i c^zyrniki wzrostu. Wszystkie te składnilci można dodawać w ^poataci Rbrze określonych prostych związków lub w ^postaci ^kompleksow^ych mieszanin uzyskanych ze źródeł Rologicoiych. Hodowlę ^prowadzi Rę konwencjonalnymi metodami, a wytworzone ^podczas fermentacji cykliczne ^peptoli^dy można w końcu wyizolować ze środowiska hodowlanego stosując znane metody chromatograficzne. Sposobem według wynalazku nowe cykliczne ^peptolidy wytwarza się także ^prowadząc ^hodowlę wariantów lub mutaRów Rrzymanych na drodze selekcji lub ^poprzez Riałanie cz^ynnikami wywołującymi mutację, n^p. ultraf fofotmm, ^omieniami X lub muta^genaml Remicznymi, na HRRL ¹⁸²30 lub inne szczepy CylindrotriRum Bonorden.

PrzyRadowo cykliczne peptolidy można również wytwarzać na ^drodze syntetycznej lub półsyntetycznej^, np. przez cyklizację liniowego peptolidu lub liniowego Rptyd^ Róry zamiast końcowej ^grupy -NH? zawiera Rńcową grupę -OH lub przez zastąpienie wiązanie amidow^o w naturalnej, syntetycznej lub półsyntetycznej cyklospor^ynie wiązaniem estrowym.

CałkowRą syntezę ^korz^ystnych związków o wzorze ² można ^prowedzió sposobem analogicznym do całkowitej s^yntezy cyldosporyny A i analogów, opisanej np. w europejskim opisie pateRo^wym nr ^{34 5}67 lub przez R.Wsngsra w Tranaplatation Proceedingie, vol.XV, str. 2²30-2241 /1983/. Według tego sposobu wytwarza się najpierw: C-Rroniony ^he^ptape^ptyd o wzorze 5, w ^w którym Bz oznacza grupę Rnzylową, a W, X, Y i Z mają wyżej Rreślone ziaczeniα^, który następnie poddaje się reakcji z tetrppep^dem o sekwencji o^{d 8} do 11.

Tetrapeptyd ten, okroRony wzorem 6, zawiera 3 normalne wiązania ^peptydowe, ale zamiast N-końca występuje O-koniec, ponieważ reszta w ^pozycji ⁸ poRodzi od (2 -hydroksykwaau ^anie od -aminokwasu.

Tetrapeptyd wytwarza eię według schematu ^przedetawionego na rysunku, w którym BOC oznacza grupę t-butok8ykarbonylową zRezpieczającą atom azotu, a R* oznacza Rpowiednią grupę ^zabe^zpieczającą atom tlenu. Zatem reageR pirzeRtawiony jako R'-A-OH Jest (X -hydroksykwaRm karboksyfowym z zRezpieczoną grupą Oh ^któr^y, gdy A oznacza ^grupę o wzorze 3, Rreślony jeet wzorem 7, w którym ^R ma wyżej określone znaczenie.

Grupa ^R* korzystnie jest wybrana spRród ^grup o wzorze 13, 14, ^grupy CH^OtC^- i tBi»Si/ /CH^/?-. ^Nor^zyatne ^związki ^o wzorze ⁷ można wytworzyć ^przez reakcję CA-hydrokaykwasu ^z z^a~ ^be^zpieczoną grupą karbinylową^, np. w ^postaci esRu ^benz^ylowe^gi^, z dihydrofuranem^, etokiayetylenem, t-butylodime^lochloroailanem lub eterm chlorod:lmetyfowym, ⁱdpowiedniⁱ.

^W reRcji heptapeptydu z zaRzpieczoną grupą COOh przedstawionego wzoren 5, ^z l-ydro^yteRapeptydem ^{o wzo}rze ⁶ z za^be^zpieczoną grupą Oh wytwarza się Unoowy hydrok^^dekapeptyd o wzorze ⁸ o sekwencji od 8 do 7.

^Cykliza^cję tego linfowego hdrokeypeptydu można ^przeprowadzió usuwając gjrupę ^zRezpie^cz^aJącą na drodze ^kwasowej lub zasadowej ^hydrolizy i sRZęgając resztę 8 ^z re^tą 7 z ^utw^o~ rzeniem wiązania estrowego. Reakcję sRzęgania korzystnie powadzi Rę w Rlorku (netylenu w Recności ^krrbidiimidu, n^p. N-etylo-N'-/D-dimeRlouminoapropyiokarbodiUmidu.

^ptap^tyd ^{o w}zorze ⁵ i tetrapeptyd o wzorze ⁶ można także wytrorzyó ^przez kontrolow^a~ ną ^hydrolizę cyklicznych peptolidów o wzorze ² uz^yakanych na drodze feroentaoji. ^podc^zas te^j Rróbki kweeem trifluorooctowym w niskiej temperaturze rozszcz^ia Rę wi^ązanie ^p°^mi^ędzy re^sztą 1.1 i 1, w ^wyniku czego uzyslcuje się linfowy undekapeptolid ^Risrający ^N-końcową resztę ¹ i C-końcową re^tę 11 z ^wiązaniern estrowym mi^ędzy resztą 7 i 8. W ^wyniku alkalicz^{nej h}ydrolizy ^powsta^je ¹~7 h^tap^tyd i 8-11 hydroksy te trapeRyd. Pół^Retyczne cykliczne

159 763 peptolidy można zatem w^ⁱtw^trzaó np. przez reakcję hydroksytetrapeptydu wytworzonego w powyższy sposób z syntetycznym heptapeptydem lub od iwotnie i cyklizację produktu liniowego.

W razie potrzeby do reakcji cyklizacji można użyć peptydu z zabezpieczonym atomem tlenu, tj. o którym grupa hydroksylowa o 1-MeBmt lub o Jej pochodnych i/lub o reszcie 2-tzeonlny może być zoiązana z grupą zabezpieczającą, Jak opisano o europejskim opisie patentowym nr 34 567. Takie grupy zabezpieczające atom tlenu usuoa się następnie zamykając pierścień standardooymi metodami. Ha przykład grupę benzylooą można usunąć przez i oóoczas będzie zachodziło także lwoioinieils MeBmt do MeBmtH? i o każdym przypadku początkowo oytoiΓZons cykliczne peptolidy zawierające resztę MeBmt o pozycci 1 można przeprowadzić o odpowiedni zoiązek MeBmt Hg przez

Przykładooo, sposób ^^^^^rrzan^a cyklicznego peptolidu o ozorze 2, określonego powyżee, polega na a/ usunięciu grupy zabezpieczającej atom tlenu z cyklicznego peptolidu o ozorze 2 o postaci z zabezpieczonym atomem tlenu: b/ cykUzacji prostołańluchowegi hydroksyundekapeptydu o ozorze 8 o postaci niezabezpieczonej lub z zabezpieczonym atomem tlenu o obydou lub o Jednej z reszt 1 i 2 i eoθniualiie pΓzepriwadzβnia procesu a/ i o razie potrzeby c/ uwoioinienia wytoorzinegi cyklicznego peptolidu o ozorze 2, o którym W oznacza MeBmt o celu otrzymania odpowiednisgi cyklicznego peptolidu, o którym W oznacza MsBmiHg.

CykUczne peptolidy ^^^^^^zane sposobem oedług oynalazku oykazują aktyoiiść farmakologiczną i mogą być zatem stosooane jako środki farmaceutyczne. W następujących testach oykazano aktyoność immiliiUurrsyJną, przsjiizapalią 1 przeciopasożytoiczą.

Testy 1-3 przeprooadzono in vitro.

1. Zahamowanie oytoarzania intereeukiny 2 /IL-2/. Interleukinę 2 indukuje się przez mitogenną stymulację misich komórek śledziony. Po 48 godzinach zbiera się supernatanty i poddaj s się analizie na zaiwartość o nich IL-2 linię kimÓΓkioą zależną od IL-2 /CTLL/. Wzrost tych komórek ocenia się po 48 godzinach stosując próbę enzymatyczną, o której mierzy się aktyoność mitichoniΓialną. /T. Mosmann J. Ι^νικ^. Kethods 65:55-63 /1983/ /.

Związki ^^toa^zane sposobem oedług wynilaxll działanie h^m^ląje przy stężeniach od IC50 0,01 do około 0,1 ug/iln.

2. ProUferacja liifocytóo jako odpowiedź na stymuuację allogeiiczią. Reakcja mieszanych liifocytóo mysich /Mm/.

Komtoki śledziony /0,⁵ x W^/ myszy IBl^b/c /samice ⁸-l⁰-tygodiⁱowθ/ intabuje się przez ⁵ toi ^or^{az z} tarnSrlkami ^toUony /^0,5 χ Ι,Οθ/ myszy CBA /samlce^{, 8}-¹⁰ tygodiiiwe/ nap^rnieiiooaiymi /2000 radóo/ lub potrakiooanymi mitomycyną C. Napromieniooane allogeniczne komórki indukują proliferację o komirkach śledziony Balb/c, którą można zmierzyć przez ołączenie do DNA znakiwaiegi prekursora. Ponleoaż Ι^πΝ^Ι stymulujące są napromienione /lub pitΓakiowane N-t^omycyną 0/, nie odpoooadają na komirki Balb/c proliferacją ale zacho^Ją sooją aitygsnooość, /T.Meo Immuliioiical Methode, L.Lefkoyits i B. Pernis, Academic Press, N.Y. str. 227-239 /1979/ /.

Związki oytoarzane sposobem oedług wynalazkl oykazują hamulce działanie przy stężeniach od ^^50 = 0,0001 do około 0,001 ug/ml.

3. Odpowoedź immuuiiogiczia humiialia pierootna na erytrocyty barana in vitro /test Hisheei-Duttona/.

tarniki ^toztono^ /^Op^ samice ⁸-¹⁰ ty^go^dnⁱiwθ^{, 1} x io?/ ^hoduje si^ę razem z ^er^ytr°^cyta^Ni ^ba^raⁿa ^/SRB^C, ³ x W*?/ pr^zez ³ dni o objętotoi ¹ ml na ²4 płytkato z zagubieniami. Zbiera się limfocyty, przemyoa eię i nanosi się na płytki z miękkim agarem utrzymując gęs^{tość 1 z 106} tamórek, oraz ze ^śoie^żym antygenem /SRBCC. Po 60-90 minutato tokuba^i d^a^ się dopełniacza /^urroolcy świnki morskej/ i pr^adzi się inkubację przez dalsze 60 Nlnut, po czym ocenia się testu przez policzenie łysinek pod mikroskopem. W ciągu 3 dni inkubs^^o^ limfocyty uczulają się na antygen /SRBC/. Ponownie iikubowaie z antygenem limfocyty B oydzzelają specyficzne przec^o^iało, które oiąże się z antygenem o pobliżu limfocy^o Oydzielniczych. Dodanie dopełniacza piwoduJe lizę erytrocytóo opłaszczonych pΓzeciwciaeam

159 763 i powstawanie łysinek. Każda łysitaa oznacza pojedynczą komórkę wytwarzającą przeciwciało. /R.I. Mishell i R. W. DUtton J. Exp. Med. 126:423-442 /1967/ /.

^Supreaję tarnórek tworzących łysinki obserwuje eię przy stężeniu zawiązku wytwarzanego sposobem ^według wynalazku od ΙΟ^θ 0,01 ^do taoło 0,1 ng/ml.

T^esty 4-9 ^przeprowadzono in vivo.

4. Tworzenie komórek wytwarzających łysinta /odpowiedź immunologiczna tamoralna/.

^Sarni^ce ^szczurów /OFA/ uodpornia się ^przez tażylne wstrzytaięcie ^erytrocytów tarana /SRBC/ fl χ 10®/ i ^przez trzy kolejne tai podaje się tadane leki. ⁶-go dnia p^o uodpornieniu przygotowuje się zawiesinę komórek śledzionowych i 1 x 10® limfocytów umieszcza się na płytce z miękkim ^ag^arem, w obecności komórek indykatorowych /BR8Z/ i tapełntacza. ^Jako ^efekt lizy tamórek indykatorowych spowodowanej sekrecją s^pecyficznego prreciwctała i obecnością tapełnia^cza, tworzą aię łyainki. Liczy aię ilość łyainek na płytkę i przelicza ^się na ilość łysinek ^na śledssionęi /N.K. J^erne i A.A. Hordin, Science 140:405 /19⁶9/, N.K. ^Jerne, A.A. Nordin i C. Henry /1963/ Celi Bound Antibodie^s, B. Amoa i H. Koprowski, wyd. Wiatar Inst. Pre^ss, Filadelfia, str. 109-125 /19⁶3/ /.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują powyższą aktywność ^u s^zczurów p° ^podaniu doustnym w dawce olcoło ⁶,0-8,0 mg/kg.

5. ZlokalZzowana reakcja ^przeszczep przeciwko ^goapodarzowi.

γ

Komórki śledzoonowe fl χ 1⁰ / ^ctadzące od ⁶-tygodniowych samic szczura Wistar/Purth /W?/ wstrzykuje się ^podakórnie ta lewej tylnej łapy samic szczura /F344 x WF/FI ważących olcoło ^{100 g}. Przez 4 tale jne tai zwierzętom podaje się tatan^y lek ^{1 7}-go taia usuwa się i wa^żypodtalanowe węzły ohłonne. Różnicę w ciężarze prz^yjmuje się jako parametr do oceny reakcji» /W.L. Ford, W. Burr i M. Simonem Trensplantation ¹⁰:258-266 /19⁷0/ /.

Douatna dawka ED^q związków wytwarzanych sposobem według wynalazku w powyższym teście wynosi około ²°-30 mg/^kg.

⁶. Zapalenie stawów wywołane adiuwantem Freunta.

^Szczurom ^OFA i wiatar /samcom i samic om o wadze ¹5° ^g / wstrz^ytaje się taótakórnie u nasady o^gona lub w tylną łapę ⁰,1 ml oleju mineralnego zawiera,]iącego °,6 mg liofiltaownnych ztaitych ^przez ogrzewanie ^prątków Hycobacterium smeipnatia. ¹⁴=go dnia, ^gd^y tabrze rozwija się już wtórne zapalenie /14-20 dni/^ zaczyna się podawać leki. Przy końcu doświadczenia mierzy się obrzęk stawów za ^pomoc^ą mikrocyrkla. Εϋ^θ oznacza doustną dawkę w mg/k^ która p^oduje zmilejszenie obrzęku /piewnotne lub wtórne/ do ^połowy obrzęku występującego w grupie tantrolnej. Dla związków wytworzonych sposobem według wynalazku doustna Εϋ^θ Jest do ³⁰ mg/kg^, /C.A. Winter i G.W. ^Husa Arthritis and Rheumatism 9:394-404 /1966/ /.

7. ^Odpowiedź altaprzeszczepu nerlti u szczura.

^Jedną nei*kę prntad^cą ta samicy s^zczura ^Fistar 344 przeszczepia się do naczynia iierkowego^, z taórego wyci^ęto lewą nerkę u szczura taorcy Wiatar/Furth, stosując reapoletae rniowe. ^Zeapolenie mocz^tau jeat także rniowe. ^podawania leku rozpoczyna się w dniu trans^plantacji i prowadzi się przez ¹⁴ dni.. W ⁷ dni po transplantacji wycina aię drugą nerkę prnrntawia^jąc taorcy tylko nerkę poctadz^ą od dawcy. ^Prze^życie taorcy przyjmu^je taę ^Jako kcr^yterium funkcjonalnego przeszczepu» /F.C, Hiestata i in. Immunology 55 249-255 /1985/ /.

^Związki wytwarzane siioaobem według wynalazku s^ą skuteczna u ^azc^^ira w dawrn doustne;]

ED^q od 6 do około 9 m;/kg.

⁸. ^Tee^t na rumień wywołany ultrafooletem.

^Test prowadzi taę nsi samicach ^świnek morskich albinosek o ciężarze taoło taO ^g. ^Zwierzętom goli taę ^oba taki za pomocą mikrożyltaek typu Braun, tak ab^y nie wywołta ^drażnimia ^skór^y. Dla ktataj ta<iane^j substancji wykorzystuje się 5 zwierząt, ^u których ^ptadaje ^się n^aproiaientaniu iftraftatatem ^o tartalonej intensywności ^przez 10 Mk. każdy ^z 4 talarów na ^skórze ^o taetaicy ¹⁰ mm. Bezpośrednio ^tern u każdego zwierz^ęcia ^na dwie ^z ntarorntanionych powierzctai tatay ^nanosi taę ⁵0 mikrolitrów roztworu tadanej mbstancji w taładtae taanol/

159 763 glikol propylenow/dimetyloacetamid /19:19:2 obj./obj./, a na pozostałe dwie, potraktowane Jako kontrolne, nanosi aię 50 mikrolitrów mieszaniny rozpuszczalników. Po 4 godzinach od naniesienia ocenia się wizualnie stopień zaawanaowwnla rumieniai /Raake W. Arzneim.-Porach. 34/1/ nr 4 /1984/ /.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne przy stężeniu od 1 do 10 % .

9. Test przeciwmalaryczny.

Maszy /OPI, samce/ zakaża się i.p. 0,2 ml zawiesiny erytrocytów zawierającej 10' komórek, na któiych pasożytuje Plasmodium berghei /szczep NK 65/. Podskórnie podoje się badaną substancję w różnych dawkach wykorzystując 5 do 10 myazy /dawkę. Odnotowuje się czas przeżycia i oblicza się minimalną dawkę skuteczną /MBD/ przez porównanie czasu przeżycia z czasem przeżycia w próbie kontrolnej. Czas przeżycia w próbie kontrolnej wynosi w przybbiżeniu 7 dni. MED oznacza dawkę, przy której czas przeżyoia Jest dwkrotnie wLększyt /L. Ranę Chemooiierapy and Drug Re8iatαtlce in M^aria, wyd. V. ^ters, Academic Press, Nowy Jork. /1979/ /.

Z uwagi na aktywność immunttuuΓθeyjną związki wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się do stosowania w profilaktyce i leczeniu stanów 1 chorób wymoaalących supreeji odpowiedzi iomonttogiczntj, np. do leczenia chorób autoimiontzacyjnych, do zapobiegania odrzutowi tkanki w przeszczepach, np. szpiku kostnego lub nerki. Specyficzne choroby autoimmunizacyjne, do których leczenia można stosować związki wytwarzane sposobem według wynalazku, obejmują takie choroby jak niedokrwistość aplastyczna, niedokrwistość krwinek czerwonych, idiopatyczna tΓOobotctopθnta, toczeń rumieniowaty rozsiany, polychonnrilis, twardzina skóry, ziarniniak Wegennra, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, niedomoga mięśniowa, zespół Stgvgn-Johnaona, łuszczyca, idiopatyczna sprue, choroba Crohna, choroba oczu Graveee, sarkoldoza, stwardnienie rozsiane, pierwotna marskość żółciowa, pierwotna cukrzyca młodocianych, późne zapalenie jago^rowi, śródmiąższowe zwłóknienie płuc 1 łuszczycowe zapalenie stawów.

Z uwagi na własności przeciwzapalne związki wytwarzane sposobem według wynalazku zaleca się do leczenia stanów zapalnych, zwłaszcza o etiologii., która obejmuje czynnik autoimountzacyjny, np. do leczenia zapalenia stawów 1 chorób reurotycznych takich jak przewlekłe postępujące zapalenie stawów.

Z uwagi na własności pΓZGciwpaβożytniczg zwwązki wytwarzane sposobem według wynalazku polecane są do stosowania w leczeniu chorób wywołanych przez pasożyty, np, schistozomiazy, fUazrozy, lesszoaniozy, kokcydiozy, a zwłaszcza hIhiIH.

Zwwązki wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się także do stosowania w leczeniu pewnych chorób skóry, które obejmują obok wyżej wymienionych wyłysienie plackowate, pokrzywkę, zapalenie naczyń, rumień, etapowe zapalenie skóry, wyprysk, skórną eozynnoilię i aneioreΓmę.

W tych zastosowaniach wskazana dawka dzienna jest w zakresie od około 70 do około 3000 mg związku wytwarzanego sposobem według wynalazku, dogodnie podane w dawkach podzielonych cztery razy dziennie.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można podawać konwencjonalnym sposobem, zwłaszcza- doustnie, np. w postaci tabletek lub kapsułek, pozalelitowg w postaci roztworów lub zawiesin do watrzykiwań lub miejscowo w poataci płynu do przemywana, kremu lub żelu.

Zwwązki wytwarzane sposobem według wynalazku wchodzą w skład środków farmaceutycznych wraz z co jednym farmaceutycznym nośnikiem lub rozcigńczalnlkgeo. Środk i takie można wytwarzać kotwincjonalnyoi sposobami. Dawka jednostkowa postaci użytkowej zawera, np. od około 20 mg do około 1500 og związku wytwarzanego sposobem według wneaazku.

Następujące przykłady, w których wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza, ilustrują wynalazek.

159 763

Przykład I. Kultura szczepu NRRL 18230 w kolbie Frlenmeyara.

Wyjściowe kultury szczepu NRRL 18230 inkubuje się w 21°C przez 14 dni na MA na skosach.

Następnie uzyskuje się prakulturę przez homooeeizowanie całej zawaarości hodowli wyjściowej w warunkach Jałowych, przeniesienie do 500 ol kolby Erlenoeyera zawierającej 200 ol odżywki M /^66 ekstraktu słodowego, 0,456 ekstratu drożdżowego w wodzie deolniralizolraiJ/ i inkubację na watrząsarce obrotowej przy 200 obrotach/oinutę przez 10 dni w 21°C.

Następnie uzyskuje się kultury przejściowe przez przeniesienie 20 O. prekultury do 500 O. kolby Frlenoeyera zawierającej 200 ol odżywki M w postaci roztworu i inkubowanie na wstrząserce obrotowej przy 200 obrotach /minutę przez 7 dni w 21°C.

W końcu 100 kolb Erleoeyera /500 ol/, z których każde zawiera 200 ol roztworu odżywki M, zaszczepia się 20 ol kultury przejściowej. Kolby inkubuje się w 21° na watrząearce obrotowej przy 200 obrotach /oinutę. Po 10 dniach brzeczki feroentacyjnej łączy się /20 litrów/ w oelu wyekstrahowania produktu.

Prz^ykład II. Wy^yzielanie /Ή&β /Leu/⁵ /D-M.v/® /Leu/1°-C^yklospor^yny.

1 środowiska hodowlanego uzyskanego w przykładzie I poddaje się oieazaniu o dużej sile ścinającej w oieazalniku prętowyo /Lutz, Wertheio, Rra/ w celu rozerwania kooórek, po czyo ekstrahuje się trzykrotnie 20 1 octanu etylu. Włączone fazy organiczne o pojeowści 60 1 suszy się nad bezwodny o siarczaneo sodu i odparowuje się do suchości pod próżnią, uzyskując 17,4 g pozoosałości.

Pozostałość rozpuszcza się w 80 ol oeeanolu i poddaje się chromaZoggtaii na kolumnie o średnicy 90 oo oyppłnionrj 1300 g Sefadeksu LH-20 /PharoaaltPine ChemiosZ.a AB, Uppasaa, Szneja/. róbiera si^{ę f}ra^kcje WO ol. We ^fra^kcjach 22-3° zjawia si^ę /Thr/² /Leu/⁵ /D-Hiv® ^/Leu/1® -Cyklospo^na. Frakcje te ^łącz^y się 1 od^ron^e ^pod pró^żni^ą uzyskuj^ąc 840⁰ og lekko zabarwionego spienionego ciała stałego. Pozzstałość tę rozpuszcza się w w.l^g^o^^;^o octanie etylu i poddaje się chromotoggraii na koluoile o średnicy 55 oo wypełnionej 500 żelu Kieselgel /Merck/ o wielkości cząstek 0,04-0,063 om. Żądany produkt wykryto we frakcjach 9-14 /frakcje o objętości 100 Po odparowaniu uzyskuje się bladożółtą pozostałość w ilości

4200 o;· Po obróbce węgleo drzeonyo odbarniającyo /Merck/ w eterze dietygowyo i przesączeniu przez cienką warsśę Ullcu uzyskuje si.ę /Tłir/² /Leu/⁵ /D-Hiv/® /Leu/^-Cyklos^rynę w postaci białego proszku, po rekrystalizacji z eteru o tropθratuΓie topnienia 163-164° /rozkład/, ^)(27^{20 =} 186°, /c = 1 w oeUnolu/j /θ^²⁰ = -223° /^c « 1 w CHCI3/.

Przykłady III-VII, Przez oogyjlkację poooższjjh technik chtgmatoggrαicinyjh z brzeczki feroentacyjnej wyizolowano w [Olierazjch ilościach następujące związki:

Przykład nr

III

IV

V

VI

VII /ΤήτΓ /Th·/² /Thr/² /Thr/² ^/Leu^ /Leu/’ /Gly/³ 'Leu/⁵ /e^HHMeBmt/¹ /Thr/²

Zwwązek /D-Nś/^{8 /}Leu/¹⁰-Cyklos^egr^ynt /Ile/⁵ /D-^Hivy® /Leu/¹⁰-Cyklos^egr^yna /D-^Hi^v/® /Leu/¹® -^Cyklos^pgr^jna ^/D-Hi^v^ /Leu/·® -cy^kloepor^yna /Leu/^{5 /D}-^Hiv/® /Leu/¹⁰-Cykloapor^ynt

Związki te mają własności przedstawione w tablicy.

159 763

Tablica

Związek z przykładu nr	Wzór	C. cz. oblicz.	C. cz· znalez.*	Temp, topnienia	ΖΞ _7²⁰ /c=i w MeOH/
III	^C63^H112^H1O^O14	1233,6	1233,9	164 /rozkład/	-184°
IV	^C64^H114^N10°14	1247,7	1247,6	151,3 /rozkł./	-180°
V	^C63^H112^N10°14	1233,6	1233,6	166,8 /rozkł./	-174°
VI	^C63^H112^N1O^O14	1233,6	1233,6	140,43 /rozkł./	-154°
VII	^C64^H114^H14°15	1263,7	1263	158 /spiek/ 195 /rozkład/	-174°

na drodze spektroskopii nas FAB /Fast Atomie Bombardrnent/

Przykład VIII. Synteza /Thr/² /Lnu/^ /D-Hiv>® /Leu/lO-Cjłlosioryny ^przez cyklizację.

W temperaturze pokojowej rozpuszcza się w 145 el chlorku metylenu 2,4 g /2,29 mmli/ niezsbezpiecoonego hydroksyundekspeptydu /O-/D//iv-MnLeu-Leu-MeVal-MeBmt-ThΓ-Sar-MeLeu-Leu-MeLeu-Ala-Oh, 0,84 g /6,88 mmli/ 4-dieetyloaeinoiirydyny i 0,66 g /1,5 równowwannka, 3,44 mmmli/ IJ-etylo-N-/3-dbmetyloabino/propylokarbodiibidu i prowadzi się reakcję przez 3 dni mieszając w atmosferze bez wilgoci. Wytworzony roztwór rozcieńcza się 300 ml chlorku eeeylenu, wytrząsa się ze 100 ml wody zakwaszonej 1 N HC1 do pH 2, przesącza się przez taik i odparowuje. R>zoltałlść poddaje się ^ΓΚ^ο^Ηυ! na 100 g żeiu krzemionkowego stosując 10% MeOO/CCH-Cn i uzyskuje się 2,55 g związku tytułowego /89%/. Identyczność tego związku ze związkiem z przykładu II ustalono za pomocą spektroskopU NMR i ° -220C, /c = 1 w OTHC-j/.

159 763

BOC - MeLeu·* Leu - OBz 9 . W

BOC-MeLeu - Leu -OBz . 10

I H₂/Pd

BOC -MeLeu - Leu - OH 10 ♦MeVal-OBz

BOC - MeLeu - Leu -MeVal - OBz . 10 Tl

Ψ

H - MeLeu - Leu -MeVal - OBz

10 11

I ♦ R'-A-CHI

R' - A - MeLeu - Leu - MeVal - OBz

10 11

I Hj/Pd

R' - A - MeLeu - Leu - MeVal - OH

9 10 11

Schemat ch₃ \

CH2 ch₂

CH2 I ^L ^,r,C_h

X XcH₃ ch₃ ę^H —N — CH — CO —

Wzór 11

I

-O-CH — CO —

Wzór 12

C^O

CHI

CH3

Wzór 13

Wzór U

159 763

W-Thr -X - Y - Z - MeLu-Ala-OBz

3 4 5 6 7

Wzór 5

HO - A - MeLeu-Leu - MeVal

Θ 9 «11

Wzór 6

Wzór 7

R'-A-MeLeu-Leu-MeVal-W-Thr -X- Y -Z- MeLeu-Ala-OBz

10 11 123456 7

Wzór 8

II

H—C— CHj

(S)

Wzór 9

HOCH^

II

^Ηθ\ „,,™CH

CHj ^{-H X}CH₃ — N — CH — CO(SJ

Wzór 10

159 763

CH3,

CHv .C^H3

^CHK CH3

H

HO ^{CH3 CH} CHj |

CH (R)

CH2 *:<k

OH>|

CH3

CH-OH CH3 I l ^J

I L CO »

CH-CH9-CH L 9 ruf ² ‘

CH3 CH_VN

O | O

CH

H-N-CH-CO-N — OH-C-N-CH-CO-N-CH-C-N-CH₂

I

CO

I

O

II

N-CHs ί|

OC-CH-O-CO-CH-N-CO-CH — N-C-CH-N-CO-CH

I

CH

Chj ^CH3

Wzór 4

I

CH³

I

OH' I

I I CH3 CHj xCH CH ^CH 'CH3 / \

CH3 CH3

I

CH2 „CH

CH³ CIH3

Wzór 1 —W - Thr -X-Y- Z - MeLeu -Ala - A - MeLeu - Leu - MeVal —

3 4 5 6 78 9 10 11

Wzór 2 R

-O - CH - COWzór 3

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowych cyklicznych ^peptolidów o strukturze cykloeporyny, w której jedno ^wiąz^anie amidowe jest zaMąpione wiązaniem estrowym i Móra slcłada się z jednej reszty MeBmt lub ^{Jej p}°chodnej, 9 reszt innych aminokwasów i jednej reszt^y-hydroksykwasu, ^z n amienny tym, że ^pr^owadzi się hośwlę wytwarzającego je Mikroorganizmu grzyba z rodzaju Cylinirotrichun Bonorśn w ^po^żywce.
2. S^po^sób według zastrz. 1, znamienny tym, ^że cykliczny peptolid ^{o w}zorze 2, w którym W oznacza MeBmt, 8*-0HMeBmt lub MeBmtHg, X oznacza ^Sar lub U.y, Y °^znacza Mel^eu lub Leu, Z oznacza Leu, Ile lub Val, a A Jest resztą ^kwasu ^cA -hydroksykarboksylowego, wytwarza się ^przez hośwanie szczepu ^grzyba z rośaju tyiindrotriohum Bonorśn w p^oży^wce.
3. S^posób według zastrz. 2, znamienny tym, ^że wytwarza się związek ° wzorze ²w Mórym A oznacza /D/Hiv.
4. Spośb według zastrz. 3, znamienny ^tym, ^żew przypaclku wytwarzania /Tś/ /Leu/^ /D-Hlv/^ /Leu/1° -CyMosporyny ^prowadzi się śdowlę szczepu ^NRR^{L 182}30 lub jego mutan ta lub ^pochodnej^, w ^po^żywce śdowlanej.