JP3920919B2 - 抗−ｈｉｖ−作用を有するシクロスポリン誘導体 - Google Patents
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Description
本発明は、シクロスポリン系の新規環状ペプチドに関し、これはいかなる免疫抑制活性を有することなくヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に強い阻害作用を有する。この様な環状ペプチドは特にヨーロッパ特許第４８４２８１号明細書中に記載されている。この特許明細書中に特に記載された物質の１つは（γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシン）シクロスポリンである。この物質は微生物によるヒドロキシル化によってシクロスポリンＡから極めて容易に製造されるので、ヨーロッパ特許第４８４２８１号明細書にはこの物質がＨＩＶに対する活性を有するが、これはもっとも強く活性な物質すなわちＭｅＩｌｅ-４-シクロスポリン又はＭｅＶａｌ-４-シクロスポリンの活性よりも約５〜６倍弱いと示されている。３つの物質のすべては実質上全く免疫抑制活性を有さない。予期せぬことに本発明者は（γ-ヒドロキシ-ＭｅＬｅｕ-４）シクロスポリンの抗ＨＩＶ作用を、何ら免疫抑制活性を増加させずに、適する置換基を上記シクロスポリンの３位のアミノ酸サルコシンのメチレン基に導入することによって実質的に改良することができることを見い出した。移植された臓器の拒絶反応を防ぐために臓器移植後に使用されるシクロスポリンＡの治療上の薬用量は極めて高く、そして同様に高い薬用量はシクロスポリン誘導体を使用する抗ＨＩＶ治療に期待されているので、本発明の課題は、高い抗ＨＩＶ活性を有する新規シクロスポリン誘導体を提供すること及びその製造が同時にすでに多量に製造された生成物であるシクロスポリンＡから少ない工程で行われることにある。
結果として本発明は、一般式
｛式中、Ａ〜Ｋは次のアミノ酸残基を示す：
Ａは一般式
Ｒ1-ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ(ＮＨＣＨ3)-ＣＯＯＨ II
（式中、Ｒ1はｎ-プロピル又はプロペニルを示し、二重結合は好ましくはトランス-立体配置されている。）
の置換されたホモスレオニンであり、
Ｂはα-アミノ酪酸、バリン、ノルバリン又はスレオニンであり、
Ｃは一般式
ＣＨ3ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ III
［式中、Ｒは直鎖状又は分枝状Ｃ2-Ｃ6アルキル、アルケニル、アルキニル、―これらの基はヒドロキシル、アミノ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1-Ｃ4ジアルキルアミノ、アルコキシ又はアシルオキシによって更に置換されていてよい―、
ＣＯＯＲ2、ＣＯＮＨＲ2（式中Ｒ2は直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキルであってよい。）、
Ｘ−Ｒ3（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ3は直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、但し、ＸがＳである場合、Ｒ3はアリール又はヘテロアリールであってもよい。）、
ハロゲン、好ましくはフッ素、
シアノ、又は
ＣＨＲ4Ｒ5（式中Ｒ4は水素、メチル、エチル又はフエニルであり、Ｒ5は水素、ヒドロキシル又はハロゲン、好ましくはフッ素、更にアミノ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1-Ｃ4ジアルキルアミノ、アシルオキシ、好ましくはアセチルオキシ、更にｔ-ブトキシカルボニル-アミノエトキシ-エトキシ-アセチルオキシ、又はアルコキシカルボニル、好ましくはブトキシカルボニルである。）
である。］
の(Ｄ)-アミノ酸であり、
ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシン又はＮ-メチル-γ-アセチルオキシロイシンであり、
Ｅはバリンであり、
Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンであり、
Ｇはアラニンであり、
Ｈは(Ｄ)-アラニン又は(Ｄ)-セリンであり、
ＫはＮ-メチルバリンである。｝
の新規環状ペプチドに関する。
本発明の重要な要件は、式IIIのアミノ酸Ｃ中の基Ｒの変化である。
式III中の基Ｒの例は、直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ6アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、この場合これらの基はヒドロキシル、アルコキシ、アシルオキシ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ又はＣ1-Ｃ4ジアルキルアミノによって置換されていてよい。たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｔ-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ-ペンチル、ヘキシル、シクロプロピルメチル、アリル、ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、プロパルギル及びブチニルである。基Ｒのアルキルオキシ及びアシルオキシ置換基の例は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、β-メトキシエトキシそしてまたアセトキシ又はピバロイルオキシである。基Ｒ中のＣ1-Ｃ4アルキルアミノ及びＣ1-Ｃ4ジアルキルアミノ置換基の例は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ及びｔ-ブチルアミノである。Ｒ中の基Ｒ2はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル又はｔ-ブチルの意味を有する。更にＲはハロゲン又はシアノの意味を有していてよい。Ｘ−Ｒ3中の基Ｒ3は、直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキル、アルケニル又はアルキニルであってよく、ＸがＳである場合、Ｒ3はアリール又はヘテロアリールであってもよい。アリールの例は、フエニル、１-ナフチル及び２-ナフチル、そしてヘテロアリールの例は、２-ピルジル、３-ピルジル、４-ピリジル、２-ピリミジニル、４-ピリミジニル、ピラジニル及びベンゾチアゾール-２-イルである。
好ましい化合物は、Ａ中の基Ｒ1がプロペニル、Ｂがα-アミノ酪酸、ＤがＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシン、Ｅがバリン、Ｆ，Ｉ及びＪが夫々Ｎ-メチルロイシン、Ｇがアラニン、Ｈが(Ｄ)-アラニン、ＫがＮ-メチルバリンであるものである。この立体配置に於て、式III中の基Ｒはメチル、エチル、プロピル、アリル、プロパルギル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシベンジル、アミノメチル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジエチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、イソプロピルアミノメチル、ジプロピルアミノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ｔ-ブチルアミノメチル、フルオロメチル、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、フエニルアミノカルボニル、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル、ｔ-ブトキシカルボニルメチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ-ブトキシ、イソブトキシ、ｔ-ブトキシ、ヒドロキシエトキシ、メチルチオ、エチルチオ、ヒドロキシエチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ-ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ-ブチルチオ、フエニルチオ、２-ピリジルチオ、ベンゾチアゾール-２-イルチオ、シアノ又はフッ素である。
新規化合物を、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチルロイシンを意味する。）からポリアニリンを製造するために適する塩基を使用し、このポリアニオンと適する求電子試薬を反応させ、場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得るために、新たに導入された基を更に変換することによって製造することができる。次いで得られた生成物を、微生物変換によってヒドロキシル化する。新規化合物を製造するための他の方法は上述の様に、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシ-ロイシンを意味する。）からポリアニオンを製造するために適する塩基を使用し、このポリアニオンを適する求電子試薬と反応させ、場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得るために新たに導入された基を更に変換することから成る。出発化合物を適する無水溶剤、たとえばテトラヒドロフラン中に有する溶液を低温度、好ましくはー４０度以下の温度で、無水テトラヒドロフラン中に溶解された適する塩基、好ましくはリチウムジイソプロピルアミドの過剰と反応させ、得られたポリアニオンを適する求電子試薬で捕捉することによってポリアニオンを製造する。この方法はゼーバッハによって記載された方法に実質上に対応する(D. Seebach等、Helv. Chim. Acta, Vol. 76,1564-1590, 1993)。更に適する塩基は、他のアルカリ金属アミド、たとえばリチウムジエチルアミド又はリチウムヘキサメチルジシルアジド、またアルカリ金属アルコラート、たとえばカリウムメトキサイド、カリウムｔ-ブトキサイド、カリウムｔ-アモキサイド及びナトリウムメトキサイドである。適する求電子試薬の例は、アルキルハライド、たとえばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、臭化アリル及び臭化ベンジル、ハロゲン化アルコキシメチル、たとえば塩化メトキシメチル、塩化メトキシエトキシメチル及び塩化ベンジルオキシメチル、又は他のカルボニル化合物、たとえばアルデヒド又はいくつかのケトン、たとえばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド、アセトン又は環状ケトン、たとえばシクロプロパノン及びその高級同族体、そしてまた炭酸の反応性誘導体、たとえばイソシアネート、有機カルボン酸の反応性誘導体、たとえばエステル、たとえばギ酸エチル、シュウ酸ジエチル、安息香酸エチル及びニコチン酸エチルである。他の適する求電子試薬は、ハロゲン、正ハロゲンの他の起源のもの、たとえばＮ‐クロロスクシンイミド、Ｎ‐ブロモスクシンイミド、Ｎ‐フルオロ‐Ｎ‐ネオペンチル‐ｐ‐トルエンスルホンアミド、パークロリルフルオライド、Ｎ‐ハロシアノゲン、たとえば塩化シアノゲン、二硫化物及びそのスルホニウム塩、たとえば硫化ジメチル、ヨウ化ジメチルチオメチルスルホニウム、二硫化ジフエニル、二硫化ジピリジル及び２，２'‐ベンゾチアゾリルジスルフィドである。この求電子試薬の反応は、キラリティーの新しい中心の生成を導く。２つの可能なジアステレオマーうちの１つが圧倒的に多い混合物が、反応条件に対応して得られる。新たに形成されたこれらのジアステレオマーは、相互に一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが一方で、（Ｄ）立体配置、他方で（Ｌ）立体配置を有する点で異なっている。本発明に於て、一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが（Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマーが好ましい。（Ｄ）ジアステレオマー又は（Ｌ）ジアステレオマーの好ましい形成を導くファクター、使用される塩基の影響及び広範な求電子試薬は、シクロスポリンＡが出発化合物である場合に関してゼーバッハによって詳細に調べられ、文献中に記載され(D. Seebach等、Helv. Chim. Acta, 第76巻、1564-1590, 1993)、そして他の著者によって批判的にコメントされている(S.David, Chemtracts Organic Chemistry, 第６巻、303-306, 1193)。本発明に於て記載される実験条件は、アミノ酸Ｃの新たに形成されるキラリティー中心が（Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマーの形成を主に導く。これは４‐(γ‐ヒドロキシ)-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンがシクロスポリンＡの代りに出発化合物として使用される場合でもあることが本発明で証明される。この様な変換に出発化合物としての４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの使用は、新規であり、本発明の目的の１つである。
一般にこの場合に得られる生成物はまた（Ｄ）アミノ酸の立体配置を主に有する。
位置Ｄのアミノ酸のγ-位の微生物ヒドロキシル化を、アクチノマイセス(Actinomyces)属の種々の微生物、たとえばEur. J. Immunol. 1987, 17, 1359中に記載されている様にSebekia benihanaを用いて実施する。この変換の重要性は、実質上にシクロスポリンの免疫抑制作用がほとんど完全に１段階で除かれることである。
低毒性であるので、式Ｉの化合物は有利な生物学的性質、特にヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に抑制作用を及ぼす性質を有し、それ故にＨＩＶ感染に於ける薬剤として使用することができる。この抑制作用は適する試験管内実験で０．０５〜５０ｍｇ／ｌの濃度で生じることが観察される。式Ｉの化合物及び場合によりその塩を単独で又は無機又は有機の薬理学的に不活性な賦形剤と共に適する医薬剤で薬剤として使用することができる。
例１：
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-（γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの製造
Eur. J. Immunol., 1987, 第17巻、1359には、微生物変換によってシクロスポリンＡの４-位でＮ-メチルロイシンのγ-位にヒドロキシル基を導入することが記載されている。このバイオトランスフォーメンションを、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンを３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリンから調製するのに使用することができる。使用される菌株は名称ＮＲＲＬ１１１１１を有し、Actinoplanaceae科に属する。
出発培養：
ＮＲＲＬ１１１１１の寒天培養を２７°で１０日間、ｐＨ７に調整され、グルコース２０ｇ、酵母抽出物(Gistex)１０ｇ、ペプトン１０ｇ、でんぷん４０ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、寒天４０ｇ及び水１ｌから成る滅菌培地中で生長させる。
予備培養：
予備培養培地は水５ｌ中のグルコース３５ｇ、でんぷん５０ｇ、ペプトン１２．５ｇ、麦芽抽出物５０ｇ、酵母抽出物２２．５ｇ及び炭酸カルシウム５ｇから成る。更に、この培地は、微量元素の溶液５ｍｌ（蒸留水１ｌ中に濃硫酸１ｍｌ、硫酸鉄（II）７水和物５ｇ、ＫＩ ５０ｍｇ、ホウ酸１００ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物４ｇ、塩化マンガン（II）４水和物２ｇ、硫酸銅５水和物２００ｍｇ及び塩化コバルト６水和物２ｇ）を含有する。出発培養の胞子及び菌系体を０．９％塩溶液１０ｍｌに懸濁し、懸濁液を滅菌された予備培養培地１００ｍｌに加える。この培養を２７°で４日間２００回転／分でオービタルシェカー（orbital shaker）上で振とうする。４日後、予備培養を滅菌された予備培養培地で（１：１０）に稀釈し、更に３日間振とうする。
主培養：
主培養用醗酵培地（蒸留水１ｌ、微量元素の上記溶液１ｍｌ、モリブテン酸アンモニウム２００ｍｇ、リン酸水素カリウム２５５ｍｇ、リン酸二水素カリウム１２０ｍｇ、硫酸マグネシウム７水和物１００ｍｇ、塩化カルシウム６水和物５０ｍｇ、大豆ミール１２．５ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、でんぷん１０ｇ、デキストリン１０ｇ及びセレロース１０ｇ）をｐＨ７．３に調整し、１２０°で２０分間滅菌する。上記の得られた予備培養１０ｍｌを次いで加え、混合物をオービタルシェカーを用いて２４時間２７℃で振とうし、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロ-スポリン１００ｍｇを加えた後、更に３日間振とうする。
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの単離
主培養から濾過によって菌系体を除き、濾液を５回ジクロロメタンで抽出する。一緒にされた抽出物を回転蒸発器中で濃縮し、残留物をシリカゲル２５０ｇ（メルクシリカゲル、粒子サイズ０．４−０．０６３メッシュ）上でクロマトグラフィー分離する。シリカゲル７０ｇ上でのシクロスポリン分画の更なるクロマトグラフィーによって３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリン１５ｍｇが無定形粉末として生じる。この物質の施光性は〔α〕D＝−１６６°（Ｃ＝０．５、ジクロロメタン）である。この生成物をメタノールから結晶化し、得られた結晶は１５０−１５２°で融解する。
1Ｈ ＮＨＲスペクトルに於て、重水素化ＤＭＳＯ中で、Ｎ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンの２個のメチル基は１．０５ｐｐｍで一重線として表われる。
例２：
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリンの製造
この物質の製造は、D. Seebach等による文献(Helv. Chimica Acta, 第76巻、1564-1590, 1993)中に記載されている。
この物質は次の方法で得られる：
２ａ）３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン
ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液３０ｍｌを０℃で、不活性ガス雰囲気（アルゴン）下に乾燥ＴＨＦ８００ｍｌ中にジイソプロピルアミン８．７ｍｌを有する溶液に滴加する。０℃で２０分後、この溶液を−７８℃に冷やし、乾燥テトラヒドロフラン１５０ｍｌ中にシクロスポリンＡ１０．０ｇを有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を少しづつ分けて上記溶液に加える。得られた混合物をー７８℃で１時間攪拌し、その後乾燥ＣＯ2の流れを通す。次いでメチルクロロホルマート６．４ｍｌを滴加し、混合物を−７８℃で、２時間攪拌する。ジイソプロピルアミン１．１ｍｌを加えた後、温度を２０℃に上げ、混合物をこの温度で１４時間攪拌する。次いで４５分間還流加熱する。混合物を２０℃に冷やした後、１０％リン酸１００ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル６００ｍｌで抽出する。次いで水性相を数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で乾燥状態にする。得られた油状物をシリカゲル（０．０２−０．０５メッシュ）５００ｇ上で酢酸エチル及びシクロヘキサンの４：１混合物を用いてクロマトグラフィー分離する。生成物を含有する分画を一緒にし、溶剤を減圧除去する。３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン１．９ｇを融点１３８°を有する無色粉末として得られる。
２ｂ）３-Ｎ-メチル-Ｄ-セリンシクロスポリン
ＴＨＦ中に水素化ホウ素リチウムを有する２．０モル溶液２．４ｍｌを、乾燥テトラヒドロフラン３０ｍｌ中に３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン１．０ｇを有する溶液に０℃で滴加する。この混合物を０℃で２２時間攪拌する。次いで蒸留水２ｍｌを加え、次いで１０％塩酸―これは滴加する―、更に蒸留水１０ｍｌを加える。この混合物を酢酸エチル２５ｍｌと共に振とうし、その後、相を分離し、次いで水性相を更に３回、夫々の場合に酢酸エチル５０ｍｌで抽出する。一緒にされた抽出物を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で濃縮乾燥する。残留物をシリカゲル３００ｇ上で酢酸エチルを溶離剤として用いてクロマトグラフィー分離する。生成物含有分画を一緒にし、減圧で濃縮し、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリン４０１ｍｇが無色無定形粉末として得られる。この生成物の融点は、１２８−１３０℃である。
例３：
４-(γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンから３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの製造
ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液５ｍｌを、乾燥ＴＨＦ５０ｍｌ中にジイソプロピルアミン１．１２ｍｌを有する溶液に０℃で、不活性ガス雰囲気（アルゴン）下に滴加する。０℃で２０分後、乾燥テトラヒドロフラン５０ｍｌ中に４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリン１．２ｇを有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を、上記溶液に少しづつ分けて加える。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、その後モノメリックホルムアルデヒドをアルゴンの穏やかな流れを用いて反応混合物中に通す。混合物を−７８℃で更に２時間攪拌する。次いで温度を２０℃に上げ、その後、１０％リン酸１０ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル１００ｍｌで抽出する。次いで水性相を数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で乾燥状態にする。得られた油状物をシリカゲル（０．０２−０．０５メッシュ）１００ｇ上で溶離剤として酢酸エチルを用いてクロマトグラフィー分離する。生成物を含有する分画を一緒にし、溶剤を減圧で除去する。３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロフポリン５ｍｇが、この方法で得られる。すべての物理化学的基準によれば、この方法で製造された物質は例１に記載した様に製造された物質と同一である。
抗ウィルス活性に関するテスト：
I. Myoshi等によって記載されたＴ細胞系統ＭＴ４（Nature 294, 第770-771頁、1981）を、このテストに使用する。ＨＩＶ-１（菌株IIIＢ）を、２時間３７°で細胞上に吸着する。次いで接種物を除き、感染した細胞を、種々の濃度でテスト化合物を含有する組織培養プレートに移す。これに関連してウィルス接種物は、感染４日後までに細胞上澄み中でウィルスｐ２４抗原の濃度が指数関数的に増加する様に選択し、細胞上澄みをｐ２４抗原に関してＥＬＩＳＡによって分析する。ＩＣ50値を感染した、物質処理された細胞からの上澄み及び未処理の感染したコントロール細胞からの上澄みのｐ２４濃度を比較して決定する。このテストで、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンに対するＩＣ50は０．１ｍｇ／ｌである。比較とし、シクロスポリンＡに対する対応値は０．５ｍｇ／ｌである。
結果として本発明は、一般式
Ａは一般式
Ｒ1-ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ(ＮＨＣＨ3)-ＣＯＯＨ II
（式中、Ｒ1はｎ-プロピル又はプロペニルを示し、二重結合は好ましくはトランス-立体配置されている。）
の置換されたホモスレオニンであり、
Ｂはα-アミノ酪酸、バリン、ノルバリン又はスレオニンであり、
Ｃは一般式
ＣＨ3ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ III
［式中、Ｒは直鎖状又は分枝状Ｃ2-Ｃ6アルキル、アルケニル、アルキニル、―これらの基はヒドロキシル、アミノ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1-Ｃ4ジアルキルアミノ、アルコキシ又はアシルオキシによって更に置換されていてよい―、
ＣＯＯＲ2、ＣＯＮＨＲ2（式中Ｒ2は直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキルであってよい。）、
Ｘ−Ｒ3（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ3は直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、但し、ＸがＳである場合、Ｒ3はアリール又はヘテロアリールであってもよい。）、
ハロゲン、好ましくはフッ素、
シアノ、又は
ＣＨＲ4Ｒ5（式中Ｒ4は水素、メチル、エチル又はフエニルであり、Ｒ5は水素、ヒドロキシル又はハロゲン、好ましくはフッ素、更にアミノ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ、Ｃ1-Ｃ4ジアルキルアミノ、アシルオキシ、好ましくはアセチルオキシ、更にｔ-ブトキシカルボニル-アミノエトキシ-エトキシ-アセチルオキシ、又はアルコキシカルボニル、好ましくはブトキシカルボニルである。）
である。］
の(Ｄ)-アミノ酸であり、
ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシン又はＮ-メチル-γ-アセチルオキシロイシンであり、
Ｅはバリンであり、
Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンであり、
Ｇはアラニンであり、
Ｈは(Ｄ)-アラニン又は(Ｄ)-セリンであり、
ＫはＮ-メチルバリンである。｝
の新規環状ペプチドに関する。
本発明の重要な要件は、式IIIのアミノ酸Ｃ中の基Ｒの変化である。
式III中の基Ｒの例は、直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ6アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、この場合これらの基はヒドロキシル、アルコキシ、アシルオキシ、Ｃ1-Ｃ4アルキルアミノ又はＣ1-Ｃ4ジアルキルアミノによって置換されていてよい。たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｔ-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ-ペンチル、ヘキシル、シクロプロピルメチル、アリル、ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、プロパルギル及びブチニルである。基Ｒのアルキルオキシ及びアシルオキシ置換基の例は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、β-メトキシエトキシそしてまたアセトキシ又はピバロイルオキシである。基Ｒ中のＣ1-Ｃ4アルキルアミノ及びＣ1-Ｃ4ジアルキルアミノ置換基の例は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ及びｔ-ブチルアミノである。Ｒ中の基Ｒ2はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル又はｔ-ブチルの意味を有する。更にＲはハロゲン又はシアノの意味を有していてよい。Ｘ−Ｒ3中の基Ｒ3は、直鎖状又は分枝状Ｃ1-Ｃ4アルキル、アルケニル又はアルキニルであってよく、ＸがＳである場合、Ｒ3はアリール又はヘテロアリールであってもよい。アリールの例は、フエニル、１-ナフチル及び２-ナフチル、そしてヘテロアリールの例は、２-ピルジル、３-ピルジル、４-ピリジル、２-ピリミジニル、４-ピリミジニル、ピラジニル及びベンゾチアゾール-２-イルである。
好ましい化合物は、Ａ中の基Ｒ1がプロペニル、Ｂがα-アミノ酪酸、ＤがＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシン、Ｅがバリン、Ｆ，Ｉ及びＪが夫々Ｎ-メチルロイシン、Ｇがアラニン、Ｈが(Ｄ)-アラニン、ＫがＮ-メチルバリンであるものである。この立体配置に於て、式III中の基Ｒはメチル、エチル、プロピル、アリル、プロパルギル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシベンジル、アミノメチル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジエチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、イソプロピルアミノメチル、ジプロピルアミノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ｔ-ブチルアミノメチル、フルオロメチル、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、フエニルアミノカルボニル、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル、ｔ-ブトキシカルボニルメチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ-ブトキシ、イソブトキシ、ｔ-ブトキシ、ヒドロキシエトキシ、メチルチオ、エチルチオ、ヒドロキシエチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ-ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ-ブチルチオ、フエニルチオ、２-ピリジルチオ、ベンゾチアゾール-２-イルチオ、シアノ又はフッ素である。
新規化合物を、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチルロイシンを意味する。）からポリアニリンを製造するために適する塩基を使用し、このポリアニオンと適する求電子試薬を反応させ、場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得るために、新たに導入された基を更に変換することによって製造することができる。次いで得られた生成物を、微生物変換によってヒドロキシル化する。新規化合物を製造するための他の方法は上述の様に、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシ-ロイシンを意味する。）からポリアニオンを製造するために適する塩基を使用し、このポリアニオンを適する求電子試薬と反応させ、場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得るために新たに導入された基を更に変換することから成る。出発化合物を適する無水溶剤、たとえばテトラヒドロフラン中に有する溶液を低温度、好ましくはー４０度以下の温度で、無水テトラヒドロフラン中に溶解された適する塩基、好ましくはリチウムジイソプロピルアミドの過剰と反応させ、得られたポリアニオンを適する求電子試薬で捕捉することによってポリアニオンを製造する。この方法はゼーバッハによって記載された方法に実質上に対応する(D. Seebach等、Helv. Chim. Acta, Vol. 76,1564-1590, 1993)。更に適する塩基は、他のアルカリ金属アミド、たとえばリチウムジエチルアミド又はリチウムヘキサメチルジシルアジド、またアルカリ金属アルコラート、たとえばカリウムメトキサイド、カリウムｔ-ブトキサイド、カリウムｔ-アモキサイド及びナトリウムメトキサイドである。適する求電子試薬の例は、アルキルハライド、たとえばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、臭化アリル及び臭化ベンジル、ハロゲン化アルコキシメチル、たとえば塩化メトキシメチル、塩化メトキシエトキシメチル及び塩化ベンジルオキシメチル、又は他のカルボニル化合物、たとえばアルデヒド又はいくつかのケトン、たとえばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド、アセトン又は環状ケトン、たとえばシクロプロパノン及びその高級同族体、そしてまた炭酸の反応性誘導体、たとえばイソシアネート、有機カルボン酸の反応性誘導体、たとえばエステル、たとえばギ酸エチル、シュウ酸ジエチル、安息香酸エチル及びニコチン酸エチルである。他の適する求電子試薬は、ハロゲン、正ハロゲンの他の起源のもの、たとえばＮ‐クロロスクシンイミド、Ｎ‐ブロモスクシンイミド、Ｎ‐フルオロ‐Ｎ‐ネオペンチル‐ｐ‐トルエンスルホンアミド、パークロリルフルオライド、Ｎ‐ハロシアノゲン、たとえば塩化シアノゲン、二硫化物及びそのスルホニウム塩、たとえば硫化ジメチル、ヨウ化ジメチルチオメチルスルホニウム、二硫化ジフエニル、二硫化ジピリジル及び２，２'‐ベンゾチアゾリルジスルフィドである。この求電子試薬の反応は、キラリティーの新しい中心の生成を導く。２つの可能なジアステレオマーうちの１つが圧倒的に多い混合物が、反応条件に対応して得られる。新たに形成されたこれらのジアステレオマーは、相互に一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが一方で、（Ｄ）立体配置、他方で（Ｌ）立体配置を有する点で異なっている。本発明に於て、一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが（Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマーが好ましい。（Ｄ）ジアステレオマー又は（Ｌ）ジアステレオマーの好ましい形成を導くファクター、使用される塩基の影響及び広範な求電子試薬は、シクロスポリンＡが出発化合物である場合に関してゼーバッハによって詳細に調べられ、文献中に記載され(D. Seebach等、Helv. Chim. Acta, 第76巻、1564-1590, 1993)、そして他の著者によって批判的にコメントされている(S.David, Chemtracts Organic Chemistry, 第６巻、303-306, 1193)。本発明に於て記載される実験条件は、アミノ酸Ｃの新たに形成されるキラリティー中心が（Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマーの形成を主に導く。これは４‐(γ‐ヒドロキシ)-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンがシクロスポリンＡの代りに出発化合物として使用される場合でもあることが本発明で証明される。この様な変換に出発化合物としての４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの使用は、新規であり、本発明の目的の１つである。
一般にこの場合に得られる生成物はまた（Ｄ）アミノ酸の立体配置を主に有する。
位置Ｄのアミノ酸のγ-位の微生物ヒドロキシル化を、アクチノマイセス(Actinomyces)属の種々の微生物、たとえばEur. J. Immunol. 1987, 17, 1359中に記載されている様にSebekia benihanaを用いて実施する。この変換の重要性は、実質上にシクロスポリンの免疫抑制作用がほとんど完全に１段階で除かれることである。
低毒性であるので、式Ｉの化合物は有利な生物学的性質、特にヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に抑制作用を及ぼす性質を有し、それ故にＨＩＶ感染に於ける薬剤として使用することができる。この抑制作用は適する試験管内実験で０．０５〜５０ｍｇ／ｌの濃度で生じることが観察される。式Ｉの化合物及び場合によりその塩を単独で又は無機又は有機の薬理学的に不活性な賦形剤と共に適する医薬剤で薬剤として使用することができる。
例１：
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-（γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの製造
Eur. J. Immunol., 1987, 第17巻、1359には、微生物変換によってシクロスポリンＡの４-位でＮ-メチルロイシンのγ-位にヒドロキシル基を導入することが記載されている。このバイオトランスフォーメンションを、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンを３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリンから調製するのに使用することができる。使用される菌株は名称ＮＲＲＬ１１１１１を有し、Actinoplanaceae科に属する。
出発培養：
ＮＲＲＬ１１１１１の寒天培養を２７°で１０日間、ｐＨ７に調整され、グルコース２０ｇ、酵母抽出物(Gistex)１０ｇ、ペプトン１０ｇ、でんぷん４０ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、寒天４０ｇ及び水１ｌから成る滅菌培地中で生長させる。
予備培養：
予備培養培地は水５ｌ中のグルコース３５ｇ、でんぷん５０ｇ、ペプトン１２．５ｇ、麦芽抽出物５０ｇ、酵母抽出物２２．５ｇ及び炭酸カルシウム５ｇから成る。更に、この培地は、微量元素の溶液５ｍｌ（蒸留水１ｌ中に濃硫酸１ｍｌ、硫酸鉄（II）７水和物５ｇ、ＫＩ ５０ｍｇ、ホウ酸１００ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物４ｇ、塩化マンガン（II）４水和物２ｇ、硫酸銅５水和物２００ｍｇ及び塩化コバルト６水和物２ｇ）を含有する。出発培養の胞子及び菌系体を０．９％塩溶液１０ｍｌに懸濁し、懸濁液を滅菌された予備培養培地１００ｍｌに加える。この培養を２７°で４日間２００回転／分でオービタルシェカー（orbital shaker）上で振とうする。４日後、予備培養を滅菌された予備培養培地で（１：１０）に稀釈し、更に３日間振とうする。
主培養：
主培養用醗酵培地（蒸留水１ｌ、微量元素の上記溶液１ｍｌ、モリブテン酸アンモニウム２００ｍｇ、リン酸水素カリウム２５５ｍｇ、リン酸二水素カリウム１２０ｍｇ、硫酸マグネシウム７水和物１００ｍｇ、塩化カルシウム６水和物５０ｍｇ、大豆ミール１２．５ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、でんぷん１０ｇ、デキストリン１０ｇ及びセレロース１０ｇ）をｐＨ７．３に調整し、１２０°で２０分間滅菌する。上記の得られた予備培養１０ｍｌを次いで加え、混合物をオービタルシェカーを用いて２４時間２７℃で振とうし、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロ-スポリン１００ｍｇを加えた後、更に３日間振とうする。
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの単離
主培養から濾過によって菌系体を除き、濾液を５回ジクロロメタンで抽出する。一緒にされた抽出物を回転蒸発器中で濃縮し、残留物をシリカゲル２５０ｇ（メルクシリカゲル、粒子サイズ０．４−０．０６３メッシュ）上でクロマトグラフィー分離する。シリカゲル７０ｇ上でのシクロスポリン分画の更なるクロマトグラフィーによって３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリン１５ｍｇが無定形粉末として生じる。この物質の施光性は〔α〕D＝−１６６°（Ｃ＝０．５、ジクロロメタン）である。この生成物をメタノールから結晶化し、得られた結晶は１５０−１５２°で融解する。
1Ｈ ＮＨＲスペクトルに於て、重水素化ＤＭＳＯ中で、Ｎ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンの２個のメチル基は１．０５ｐｐｍで一重線として表われる。
例２：
３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリンの製造
この物質の製造は、D. Seebach等による文献(Helv. Chimica Acta, 第76巻、1564-1590, 1993)中に記載されている。
この物質は次の方法で得られる：
２ａ）３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン
ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液３０ｍｌを０℃で、不活性ガス雰囲気（アルゴン）下に乾燥ＴＨＦ８００ｍｌ中にジイソプロピルアミン８．７ｍｌを有する溶液に滴加する。０℃で２０分後、この溶液を−７８℃に冷やし、乾燥テトラヒドロフラン１５０ｍｌ中にシクロスポリンＡ１０．０ｇを有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を少しづつ分けて上記溶液に加える。得られた混合物をー７８℃で１時間攪拌し、その後乾燥ＣＯ2の流れを通す。次いでメチルクロロホルマート６．４ｍｌを滴加し、混合物を−７８℃で、２時間攪拌する。ジイソプロピルアミン１．１ｍｌを加えた後、温度を２０℃に上げ、混合物をこの温度で１４時間攪拌する。次いで４５分間還流加熱する。混合物を２０℃に冷やした後、１０％リン酸１００ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル６００ｍｌで抽出する。次いで水性相を数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で乾燥状態にする。得られた油状物をシリカゲル（０．０２−０．０５メッシュ）５００ｇ上で酢酸エチル及びシクロヘキサンの４：１混合物を用いてクロマトグラフィー分離する。生成物を含有する分画を一緒にし、溶剤を減圧除去する。３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン１．９ｇを融点１３８°を有する無色粉末として得られる。
２ｂ）３-Ｎ-メチル-Ｄ-セリンシクロスポリン
ＴＨＦ中に水素化ホウ素リチウムを有する２．０モル溶液２．４ｍｌを、乾燥テトラヒドロフラン３０ｍｌ中に３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン１．０ｇを有する溶液に０℃で滴加する。この混合物を０℃で２２時間攪拌する。次いで蒸留水２ｍｌを加え、次いで１０％塩酸―これは滴加する―、更に蒸留水１０ｍｌを加える。この混合物を酢酸エチル２５ｍｌと共に振とうし、その後、相を分離し、次いで水性相を更に３回、夫々の場合に酢酸エチル５０ｍｌで抽出する。一緒にされた抽出物を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で濃縮乾燥する。残留物をシリカゲル３００ｇ上で酢酸エチルを溶離剤として用いてクロマトグラフィー分離する。生成物含有分画を一緒にし、減圧で濃縮し、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリン４０１ｍｇが無色無定形粉末として得られる。この生成物の融点は、１２８−１３０℃である。
例３：
４-(γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンから３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ）-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの製造
ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液５ｍｌを、乾燥ＴＨＦ５０ｍｌ中にジイソプロピルアミン１．１２ｍｌを有する溶液に０℃で、不活性ガス雰囲気（アルゴン）下に滴加する。０℃で２０分後、乾燥テトラヒドロフラン５０ｍｌ中に４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリン１．２ｇを有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を、上記溶液に少しづつ分けて加える。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、その後モノメリックホルムアルデヒドをアルゴンの穏やかな流れを用いて反応混合物中に通す。混合物を−７８℃で更に２時間攪拌する。次いで温度を２０℃に上げ、その後、１０％リン酸１０ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル１００ｍｌで抽出する。次いで水性相を数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で乾燥状態にする。得られた油状物をシリカゲル（０．０２−０．０５メッシュ）１００ｇ上で溶離剤として酢酸エチルを用いてクロマトグラフィー分離する。生成物を含有する分画を一緒にし、溶剤を減圧で除去する。３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロフポリン５ｍｇが、この方法で得られる。すべての物理化学的基準によれば、この方法で製造された物質は例１に記載した様に製造された物質と同一である。
抗ウィルス活性に関するテスト：
I. Myoshi等によって記載されたＴ細胞系統ＭＴ４（Nature 294, 第770-771頁、1981）を、このテストに使用する。ＨＩＶ-１（菌株IIIＢ）を、２時間３７°で細胞上に吸着する。次いで接種物を除き、感染した細胞を、種々の濃度でテスト化合物を含有する組織培養プレートに移す。これに関連してウィルス接種物は、感染４日後までに細胞上澄み中でウィルスｐ２４抗原の濃度が指数関数的に増加する様に選択し、細胞上澄みをｐ２４抗原に関してＥＬＩＳＡによって分析する。ＩＣ50値を感染した、物質処理された細胞からの上澄み及び未処理の感染したコントロール細胞からの上澄みのｐ２４濃度を比較して決定する。このテストで、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンに対するＩＣ50は０．１ｍｇ／ｌである。比較とし、シクロスポリンＡに対する対応値は０．５ｍｇ／ｌである。
Claims (9)
- 一般式
｛式中、Ａ〜Ｋは次のアミノ酸残基を示す：
Ａは一般式
Ｒ1-ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)-ＣＨ(ＯＨ)-ＣＨ(ＮＨＣＨ3)-ＣＯＯＨ II
（式中、Ｒ1はプロペニルを示し、二重結合はトランス-立体配置されている。）
の置換されたホモスレオニンであり、
Ｂはα-アミノ酪酸であり、
Ｃは一般式
ＣＨ3ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ III
〔式中、Ｒはメチル、エチル、プロピル、アリル、プロパルギル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシベンジル、アミノメチル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジエチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、イソプロピルアミノメチル、ジプロピルアミノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ｔ-ブチルアミノメチル、フルオロメチル、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、フエニルアミノカルボニル、メトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル、ｔ-ブトキシカルボニルメチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ-ブトキシ、イソブトキシ、ｔ-ブトキシ、ヒドロキシエトキシ、メチルチオ、エチルチオ、ヒドロキシエチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ-ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ-ブチル-チオ、フエニルチオ、2-ピリジルチオまたはベンゾチアゾール-２-イルチオである。］
の（Ｄ）−アミノ酸であり、
ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンであり、
Ｅはバリンであり、
Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンである。］
Ｇはアラニンであり、
Ｈは（Ｄ）-アラニンであり、
ＫはＮ-メチルバリンである。｝
の新規環状ペプチド。 - ３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリン。
- 請求の範囲１に記載された一般式Ｉの化合物（式中Ｃは上述の意味を有し、ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンを意味する。）の製造方法に於て、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチルロイシンを意味する。）をアクチノプラナセアエ(Actinoplanaceae)科に属し、そして上記一般式Ｉの化合物をヒドロキシル化する能力のある微生物を用いてヒドロキシル化することを特徴とする、上記方法。
- 微生物がセベキア ベニハナ（Sebekia benihana）である、請求の範囲３記載の方法。
- 請求の範囲１に記載された一般式Ｉの化合物の製造方法に於て、一般式Ｉの環状ペプチド（式中Ｃはサルコシンであり、ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンである。）を、適する塩基を用いてポリアニオンへ変え、このポリアニオンを適する求電子試薬と反応させて請求の範囲１に記載された生成物に変換することを特徴とする、上記方法。
- 請求の範囲１に記載された環状ペプチド１種又はそれ以上を薬学的に容認された希釈剤又は賦形剤と共に含有する医薬。
- 請求の範囲１に記載された化合物をヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による感染の治療又は予防するための医薬の製造に使用する方法。
- Ｃがサルコシン、ＤがＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシンである、請求の範囲１に記載された一般式Ｉのポリアニオン。
- ４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシン-シクロスポリンのポリアニオン。
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