JP2000502320A - 抗−ｈｉｖ−作用を有するシクロスポリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 一般式（Ｉ）の新規環状ペプチド｛式中、Ａ〜Ｋは次のアミノ酸残基を示す：Ａは一般式 II：Ｒ₁-ＣＨ₂ ＣＨ (ＣＨ₃)-ＣＨ (ＯＨ)-ＣＨ (ＮＨＣＨ₃)-ＣＯＯＨ（式中、Ｒ₁はｎ-プロピル又はプロペニルであり、その二重結合は好ましくは立体配置中にある。）の置換されたホモスレオニンであり、Ｂはα−アミノ酪酸、バリン、ノルバリン又はスレオニンであり、Ｃは一般式III：（ＣＨ。ＮＨ-ＣＨ（Ｒ）-Ｃ０ＯＨ〔式中、Ｒは直鎖状又は分枝状Ｃ₂- アミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ アルキルアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ ジアルキルアミノ、アルコ ＣＯＮＨＲ₂（式中、Ｒ₂ は直鎖状又は分枝状Ｃ₁−Ｃ₄ アルキルであってよい。）、Ｘ−Ｒ₃（式中、ＸはＯ又はＳてあり、Ｒ₃は直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、但し、ＸがＳである場合、Ｒ₃はアリール又はヘテロアリールであってもよい。）、ハロゲン、好ましくはフッ素、シアノ、又はＣＨＲ₄Ｒ₅（式中Ｒ₄ は水素、メチル、エチル又はフエニルであり、Ｒ₅ は水素、ヒドロキシル又はハロゲン、好ましくはフッ素、更にアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄アルキルアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ジアルキルアミノ、アシルオキシ、好ましくはアセチルオキシ、更にｔ- ブトキシカルボニル- ア ミノエトキシ- エトキシ- アセチルオキシ、又はアルコキシカルボニル、好ましくはブトキシカルボニルである。）である。］の（Ｄ）- アミノ酸であり、ＤはＮ- メチル -γ- ヒドロキシロイシン又はＮ-メチル-γ-アセチルオキシロイシンであり、Ｅはバリンであり、Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンであり、Ｇはアラニンであり、Ｈは (Ｄ)-アラニン又は (Ｄ)-セリンであり、ＫはＮ- メチルバリンである。｝、その製造方法及びこれをヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の治療及ひ予防に使用する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 抗- ＨＩＶ- 作用を有するシクロスポリン誘導体 本発明は、シクロスポリン系の新規環状ペプチドに関し、これはいかなる免疫 抑制活性を有することなくヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に強い阻害作用を有 する。この様な環状ペプチドは特にヨーロッパ特許第４８４２８１号明細書中に 記載されている。この特許明細書中に特に記載された物質の１つは（γ- ヒドロ キシ -Ｎ- メチルロイシン）シクロスポリンである。この物質は微生物によるヒ ドロキシル化によってシクロスポリンＡから極めて容易に製造されるので、ヨー ロッパ特許第４８４２８１号明細書にはこの物質がＨＩＶに対する活性を有する か、これはもっとも強く活性な物質すなわちＭｅＩｌｅ -４- シクロスポリン又 はＭｅＶａｌ -４- シクロスポリンの活性よりも約５〜６倍弱いと示されている 。３つの物質のすべては実質上全く免疫抑制活性を有さない。予期せぬことに本 発明者は（γ- ヒドロキシ- ＭｅＬｅｕ -４）シクロスポリンの抗ＨＩＶ作用を 、何ら免疫抑制活性を増加させずに、適する置換基を上記シクロスポリンの３位 のアミノ酸サルコシンのメチレン基に導入することによって実質的に改良するこ とができることを見い出した。移植された臓器の拒絶反応を防ぐために臓器移植 後に使用されるシクロスポリンＡの治療上の薬用量は極めて高く、そして同様に 高い薬用量はシクロスポリン誘導体を使用する抗ＨＩＶ治療に期待されているの で、本発明の課題は、高い抗ＨＩＶ活性を有する新規シクロスポリン誘導体を提 供すること及びその製造が同時にすでに多量に製造された生成物であるシクロス ポリンＡから少ない工程で行われることにある。 結果として本発明は、一般式 ｛式中、Ａ〜Ｋは次のアミノ酸残基を示す： Ａは一般式 Ｒ₁-ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）-ＣＨ（ＯＨ）-ＣＨ（ＮＨＣＨ₃）-ＣＯＯＨ II （式中、Ｒ₁ はｎ-プロピル又はプロペニルを示し、二重結合は好ましくはト ランス一立体配置されている。） の置換されたホモスレオニンであり、 Ｂはα-アミノ酪酸、バリン、ノルバリン又はスレオニンであり、 Ｃは一般式 ＣＨ₃ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ III ［式中、Ｒは直鎖状又は分枝状Ｃ₂-Ｃ₆アルキル、アルケニル、アルキニル Ｃ₄ジアルキルアミノ、アルコキシ又はアシルオキシによって更に置換され ＣＯＯＲ₂ 、Ｃ０ＮＨＲ₂ （式中Ｒ₂は直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄ アルキルで あってよい。）、 Ｘ−Ｒ₃ （式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ₃ は直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄ アル キル、アルケニル又はアルキニルであり、但し、ＸがＳである場合、Ｒ₃ はア リール又はヘテロアリールであってもよい。）、 ハロゲン、好ましくはフッ素、 シアノ、又は ＣＨＲ₄ Ｒ₅ （式中Ｒ₄は水素、メチル、エチル又はフエニルであり、Ｒ₅ は 水素、ヒドロキシル又はハロゲン、好ましくはフッ素、更にアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ アルキルアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ ジアルキルアミノ、アシルオキシ、好ましくはアセ チルオキシ、更にｔ-ブトキシカルボニル-アミノエトキシ-エトキシ- アセチ ルオキシ、又はアルコキシカルボニル、好ましくはブトキシカルボニルである 。） である。] の（Ｄ）-アミノ酸であり、 ＤはＮ-メチル-γ-ヒドロキシロイシン又はＮ-メチル-γ-アセチルオキ シロイシンであり、 Ｅはバリンであり、 Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンであり、 Ｇはアラニンであり、 Ｈは（Ｄ）-アラニン又は（Ｄ）-セリンであり、 ＫはＮ-メチルバリンである。｝ の新規環状ペプチドに関する。 本発明の重要な要件は、式IIIのアミノ酸Ｃ中の基Ｒの変化である。 式III中の基Ｒの例は、直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₆アルキル、アルケニル又はア ルキニルであり、この場合これらの基はヒドロキシル、アルコキシ、アシルオキ シ、Ｃ₁-Ｃ₄アルキルアミノ又はＣ₁-Ｃ₄ジアルキルアミノによって置換されてい てよい。たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソ ブチル、ｔ-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ-ペンチル、ヘ キシル、シクロプロピルメチル、アリル、ブテニル、ペンテニル、イソペンテニ ル、プロパルギル及びブチニルである。基Ｒのアルキルオキシ及びアシルオキシ 置換基の例は、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、β-メトキシエトキシそ してまたアセトキシ又はピバロイルオキシである。基Ｒ中のＣ₁-Ｃ₄アルキルア ミノ及びＣ₁-Ｃ₄ジアルキルアミノ置換基の例は、メチルアミノ、ジメチルアミ ノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、イソブロピニアミノ、ジ プロピルアミノ、ジィソプロピルアミノ及びｔ-ブチルアミノである。Ｒ中の基 Ｒ₂はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル又はｔ -ブチルの意味を有する。更にＲはハロゲン又はシアノの意味を有していてよい 。Ｘ−Ｒ₃中の基Ｒ₃は、直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄アルキル、アルケニル又はア ルキニルであってよく、ＸがＳである場合、Ｒ₃はアリール又はヘテロアリール であってもよい。アリールの例は、フエニル、１−ナフチル及び２−ナフチル、 そしてヘテロアリールの例は、２-ピリジル、３-ピリジル、４-ピリジル、２-ピ リミジニル、４-ピリミジニル、ピラジニル及びベンゾチアゾール-２-イルであ る。 好ましい化合物は、Ａ中の基Ｒ₁がプロペニル、Ｂがα-アミノ酪酸、ＤがＮ- メチル-γ-ヒドロキシロイシン、Ｅがバリン、Ｆ，Ｉ及びＪが夫々Ｎ-メチルロ イシン、Ｇがアラニン、Ｈが (Ｄ)-アラニン、ＫがＮ-メチルバリンである ものである。この立体配置に於て、式III中の基Ｒはメチル、エチル、プロピル 、アリル、プロパルギル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシベ ンジル、アミノメチル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、エチルア ミノメチル、ジエチルアミノメチル、プロピルアミノメチル、イソプロピルアミ ノメチル、ジプロピルアミノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ｔ-ブチル アミノメチル、フルオロメチル、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシカ ルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソブチルオキシカル ボニル、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、プロピルアミノカ ルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、フエニルアミノカルボニル、メトキ シカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル 、ｔ-ブトキシカルボニルメチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロ ポキシ、ｎ-ブトキシ、イソブトキシ、ｔ-ブトキシ、ヒドロキシエトキシ、メチ ルチオ、エチルチオ、ヒドロキシエチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ 、ｎ-ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ-ブチルチオ、フエニルチオ、２-ピリジ ルチオ、ベンゾチアゾール-２-イルチオ、シアノ又はフッ素である。 新規化合物を、一般式Ｉの環状ペプチド（式中ＤはＮ-メチルロイシンを意味 する。）からポリアニオンを製造するために適する塩基を使用し、このポリアニ オンと適する求電子試薬を反応させ、場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得る ために、新たに導入された基を更に変換することによって製造することかできる 。次いで得られた生成物を、微生物変換によってヒドロキシル化する。新規化合 物を製造するための他の方法は上述の様に、一般式Ｉの環状ペプチド（式中Ｄは Ｎ-メチル-γ-ヒドロキシ-ロイシンを意味する。）からポリアニオンを製造する ために適する塩基を使用し、このポリアニオンを適する求電子試薬と反応させ、 場合によりアミノ酸Ｃの所望の置換を得るために新たに導入された基を更に変換 することから成る。出発化合物を適する無水溶剤、たとえばテトラヒドロフラン 中に有する溶液を低温度、好ましくは−４０度以下の温度で、無水テトラヒドロ フラン中に溶解された適する塩基、好ましくはリチウムジイソプロピルアミドの 過剰と反応させ、得られたポリアニオンを適する求電子試薬で捕捉することによ ってポリアニオンを製造する。この方法はゼーバッハによって記載された方 法に実質上に対応する（D．Seebach等、Helv．Chim．Acta，Vol．76,1564-1590 ，1993)。更に適する塩基は、他のアルカリ金属アミド、たとえばリチウムジエ チルアミド又はリチウムヘキサメチルジシルアシド、またアルカリ金属アルコラ ート、たとえばカリウムメトキサイド、カリウムｔ-ブトキサイド、カリウムｔ- アモキサイド及びナトリウムメトキサイドである。適する求電子試薬の例は、ア ルキルハライド、たとえばヨウ化メチル、ヨウ化エチル、臭化アリル及び臭化ベ ンジル、ハロゲン化アルコキシメチル、たとえば塩化メトキシメチル、塩化メト キシエトキシメチル及び塩化ベンジルオキシメチル、又は他のカルボニル化合物 、たとえばアルデヒド又はいくつかのケトン、たとえばホルムアルデヒド、アセ トアルデヒド、ベンズアルデヒド、アセトン又は環状ケトン、たとえばシクロプ ロパノン及びその高級同族体、そしてまた炭酸の反応性誘導体、たとえばイソシ アネート、有機カルボン酸の反応性誘導体、たとえばエステル、たとえばギ酸エ チル、シュウ酸ジエチル、安息香酸エチル及びニコチン酸エチルである。他の適 する求電子試薬は、ハロゲン、正ハロゲンの他の起源のもの、たとえばＮ-クロ ロスクシンイミド、Ｎ-ブロモスクシンイミド、Ｎ-フルオロ-Ｎ-ネオペンチル- ｐ-トルエンスルホンアミド、パークロリルフルオライド、Ｎ-ハロハロゲン、た とえば塩化シアノゲン、二硫化物及びそのスルホニウム塩、たとえば硫化ジメチ ル、ヨウ化ジメチルチオメチルスルホニウム、二硫化ジフエニル、二硫化ジピリ ジル及び２，２'-ベンゾチアゾリルジスルフィドである。この求電子試薬の反応 は、キラリティーの新しい中心の生成を導く。２つの可能なジアステレオマーう ちの１つが圧倒的に多い混合物が、反応条件に対応して得られる。新たに形成さ れたこれらのジアステレオマーは、相互に一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが一方で、（ Ｄ）立体配置、他方で（Ｌ）立体配置を有する点で異なっている。本発明に於て 、一般式Ｉ中のアミノ酸Ｃが（Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマー が好ましい。（Ｄ）ジアステレオマー又は（Ｌ）ジアステレオマーの好ましい形 成を導くファクター、使用される塩基の影響及び広範な求電子試薬は、シクロス ポリンＡが出発化合物である場合に関してゼーバッハによって詳細に調べられ、 文献中に記載され（D．Seebach等、Helv．Chim．Acta，第76巻、1564-1590，199 3)、そして他の著者によって批判的にコメントされている（S. David，Chemtracts 0rganic Chemistry，第６巻、303-306，1993)。本発明に於 て記載される実験条件は、アミノ酸Ｃの新たに形成されるキラリティー中心が（ Ｄ）立体配置を有するこれらのジアステレオマーの形成を主に導く。これは４-( γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンがシクロスポリンＡの代り に出発化合物として使用される場合でもあることが本発明で証明される。この様 な変換に出発化合物としての４-(γ−ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロス ポリンの使用は、新規であり、本発明の目的の１つである。 一般にこの場合に得られる生成物はまた（Ｄ）アミノ酸の立体配置を主に有す る。 位置Ｄのアミノ酸のγ-位の微生物ヒドロキシル化を、アクチノマイセス（Act inomyces ）属の種々の微生物、たとえばEur．J．Immunol．1987，17，1359中に 記載されている様にSebekia benihanaを用いて実施する。この変換の重要性は、 実質上にシクロスポリンの免疫抑制作用がほとんど完全に１段階で除かれること である。 低毒性であるので、式Ｉの化合物は有利な生物学的性質、特にヒト免疫不全ウ ィルス（ＨＩＶ）に抑制作用を及ぼす性質を有し、それ故にＨＩＶ感染に於ける 薬剤として使用することがてきる。この抑制作用は適する試験管内実験て０．０ ５〜５０ｍｇ／ｌの濃度で生じることが観察される。式Ｉの化合物及び場合によ りその塩を単独で又は無機又は有機の薬理学的に不活性な賦形剤と共に適する医 薬形で薬剤として使用することができる。 例１： ３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポ リンの製造 Eur．J．Immunol.，1987，第17巻、1359には、微生物変換によってシクロスポ リンＡの４-位でＮ-メチルロイシンのγ-位にヒドロキシル基を導入することが 記載されている。このバイオトランスフォーメンションを、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)- セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンを３-Ｎ-メチル-( Ｄ)-セリンシクロスポリンから調製するのに使用することができる。使用される 菌株は名称ＮＲＬＬ 11111を有し、Actinoplanaceae 科に属する。 出発培養： ＮＲＬＬ 11111の寒天培養を２７゜で１０日間、ｐＨ７に調整され、グルコー ス２０ｇ、酵母抽出物(Gistex)１０ｇ、ペプトン１０ｇ、でんぷん４０ｇ、炭酸 カルシウム２ｇ、寒天４０ｇ及び水ｌから成る滅菌培地中で生長させる。 予備培養： 予備培養培地は水５ｌ中のグルコース３５ｇ、でんぷん５０ｇ、ペプトン１２ ．５ｇ、麦芽抽出物５０ｇ、酵母抽出物２２．５ｇ及び炭酸カルシウム５ｇから 成る。更に、この培地は、微量元素の溶液５ｍｌ（水１ｌ中に濃硫酸１ｍｌ、硫 酸鉄(II)５水和物５ｇ、ＫＩ５０ｍｇ、ホウ酸１００ｍｇ、硫酸亜鉛５水和物４ ｇ、塩化マンガン(II)４水和物２ｇ、硫酸銅５水和物２００ｍｇ及び塩化コバル ト６水和物２ｇ）を含有する。出発培地の胞子及び菌系体を０．９％塩溶液１０ ｍｌ中に懸濁し、懸濁液を滅菌された予備培養培地１００ｍｌに加える。この培 養を２７°で４日間２００回転／分でオービタルシェカー（orbital shaker）上 で振とうする。４日後、予備培養を滅菌された予備培養培地で（１：１０）に希 釈し、更に３日間振とうする。 主培養： 主培養用醗酵培地（蒸留水１ｌ、微量元素の上記溶液１ｍｌモリブテン酸アン モニウム２００ｍｇ、リン酸水素カリウム２５５ｍｇ、リン酸二水素カリウム１ ２０ｍｇ、硫酸マグネシウム７水和物１００ｍｇ、塩化カルシウム６水和物５０ ｍｇ、大豆ミール１２．５ｇ、酵母抽出物２．５ｇ、でんぷん１０ｇ、デキスト リン１０ｇ及びセレロース１０ｇ）をｐＨ７．３に調整し、１２０゜で２０分間 滅菌する。上記の得られた予備培養１０ｍｌを次いで加え、混合物をオービタル シェカーを用いて２４時間振とうし、３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロースポリ ン１００ｍｇを加えた後、更に３日間振とうする。 ３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セエン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロス ポリンの単離 主培養から濾過によって菌系体を除き、濾液を５回ジクロロメタンで抽出する 。一緒にされた抽出物を回転蒸発器中で濃縮し、残留物をシリカゲル２５０ｇ（ メルカシリカゲル、粒子サイズ０．４−０．０６３メッシュ）上でクロマトグラ フィー分離する。シリカゲル７０ｇ上でのシクロスポリン分画の更なるクロマト グラフィーによって３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチル ロイシンシクロスポリン１５ｍｇが無定形粉末として生じる。この物質の旋光性 は〔α〕_D＝−１６６°（Ｃ＝０．５、ジクロロメタン）である。この生成物を メタノールから結晶化し、得られた結晶は１５０−１５２°で融解する。 ¹Ｈ ＮＨＲスペクトルに於て、重水素化ＤＭＳＯ中で、Ｎ-メチル-γ-ヒドロ キシロイシンの２個のメチル基は１．０５ｐｐｍで一重線として表われる。 例2： ３-Ｎ-メチル-(Ｄ)-セリンシクロスポリンの製造 この物質の製造は、D．Seebach等による文献 (Helv．Chimica Acta，第76巻、 1564-1590，1993)中に記載されている。 この物質は次の方法で得られる： ２ａ）３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液３０ｍｌを０℃で、 不活性ガス雰囲気（アルゴン）下に乾燥ＴＨＦ８００ｍｌ中にジイソプロピルア ミン８．７ｍｌを有する溶液に滴加する。０℃で２０分後、この溶液を−７８℃ に冷やし、乾燥テトラヒドロララン１５０ｍｌ中にシクロスポリンＡ１０．０ｇ を有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を少しづつ分けて上記溶液に加え る。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、その後乾燥ＣＯ₂の流れを通す 。次いでメチルクロロホルマート６．４ｍｌを滴加し、混合物を−７８℃で、２ 時間攪拌する。ジイソプロピルアミン１．１ｍｌを加えた後、温度を２０℃に上 げ、混合物をこの温度で１４時間攪拌する。次いで４５分間還流加熱する。混合 物を２０℃に冷やした後、１０％リン酸１００ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル ６００ｍｌで抽出する。次いで水性相を数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物 を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で乾燥状態にする。得られた油状 物をシリカゲル（０．０２−０．０５メッシュ）５００ｇ上で酢酸エチル及びシ クロヘキサンの４：１混合物を用いてクロマトグラフィー分離する。生成物を含 有する分画を一緒にし、溶剤を減圧除去する。３-α-メトキシカルボニルシクロ スポリン１．９ｇを融点１３８゜を有する無色粉末として得られる。 ２ｂ）３-Ｎ-メチル-Ｄ-セリンシクロスポリン ＴＨＦ中に水素化ホウ素リチウムを有する２．０モル溶液２．４ｍｌを、乾燥 テトラヒドロフラン３０ｍｌ中に３-α-メトキシカルボニルシクロスポリン１． ０ｇを有する溶液に０℃で滴加する。この混合物を０℃で２２時間攪拌する。 留水１０ｍｌを加える。この混合物を酢酸エチル２５ｍｌと共に振とうし、その 後、相を分離し、次いで水性相を更に３回、夫々の場合に醇酸エチル５０ｍｌで 抽出する。一緒にされた抽出物を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧で濃縮乾燥 する。残留物をシリカゲル３００ｇ上で酢酸エチルを溶離剤として用いてクロマ トグラフィー分離する。生成物含有分画を一緒にし、減圧で濃縮し、３-Ｎ-メチ ル-(Ｄ)-セリンシクロスポリン４０１ｍｇが無色無定形粉末として得られる。こ の生成物の融点は、１２８−１３０℃である。 例３： ４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンから３-Ｎ-メチル-(Ｄ)- セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンの製造 ヘキサン中にｎ-ブチルリチウムを有する１．６モル溶液５ｍｌを、乾燥ＴＨ Ｆ５０ｍｌ中にジイソプロピルアミン１．１２ｍｌを有する溶液に０℃で、不活 性ガス雰囲気（アルゴン）下に滴加する。０℃で２０分後、乾燥テトラヒドロフ ラン５０ｍｌ中に４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリン１．２ ｇを有する、前もって−７８℃に冷やされた溶液を、上記溶液に少しづつ分けて 加える。得られた混合物を−７８℃で１時間攪拌し、その後モノメリックホルム アルデヒドをアルゴンの穏やかな流れを用いて反応混合物中に通す。混合物を− ７８℃で更に２時間攪拌する。次いで温度を２０℃に上げ、その後、１０％リン 酸１０ｍｌを加え、水性相を酢酸エチル１００ｍｌで抽出する。次いで水性相を 数回酢酸エチルで抽出する。有機抽出物を一緒にし、硫酸マグネシウムで乾燥し 、減圧で乾燥状態にする。得られた油状物をシリカゲル（０．０２−０．０５メ ッシュ）１００ｇ上で溶離剤として酢酸エチルを用いてクロマトグラフィー分離 する。生成物を含有する分画を一緒にし、溶剤を減圧で除去する。３-Ｎ-メチル -(Ｄ)-セリン-４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロフポリン５ ｍｇが、この方法で得られる。すべての物理化学的基準によれば、この方法で製 造された物質は例１に記載した様に製造された物質と同一である。 抗ウィルス活性に関するテスト： Ｉ．Myoshi 等によって記載されたＴ細胞系統ＭＴ４（Nature 294，第770-771 頁、1981）を、このテストに使用する。ＨＩＶ-１（菌株IIIＢ）を、２時間３７ ゜で細胞上に吸着する。次いで接種物を除き、感染した細胞を、種々の濃度でテ スト化合物を含有する組織培養プレートに移す。これに関連してウィルス接種物 は、感染４日後までに細胞上澄み中でウィルスｐ２４抗原の濃度が指数関数的に 増加する様に選択し、細胞上澄みをｐ２４抗原に関してＥＬＩＳＡによって分析 する。ＩＣ₅₀値を感染した、物質処理された細胞からの上澄み及び未処理の感染 したコントロール細胞からの上澄みを比較して決定する。このテストで、３-Ｎ- メチル-(Ｄ)-セリン-４-γ-ヒドロキシ-Ｎ-メチル-ロイシンシクロスポリンに対 するＩＣ₅₀は０．１ｍｇ／ｌである。比較とし、シクロスポリンＡに対する対応 値は０．５ｍｇ／ｌである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月４日（１９９７．２．４） 【補正内容】 ８．請求の範囲１に記載された環状ペプチド１種又はそれ以上を薬学的に容認さ れた希釈剤又は賦形剤と共に含有する医薬。 ９．請求の範囲１に記載された化合物をヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による 感染の治療又は予防するための医薬の製造に使用する方法。 10．式Ｃがサルコシン、ＤがＮ- メチル -γ- ヒドロキシロイシンである、一般 式Ｉのポリアニオン。 11．４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ-メチルロイシンシクロスポリンのポリアニオン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:045） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｔ Ｒ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式 ｛式中、Ａ〜Ｋは次のアミノ酸残基を示す： Ａは一般式 Ｒ₁-ＣＨ₂ＣＨ (ＣＨ₃)-ＣＨ (ＯＨ)-ＣＨ (ＮＨＣＨ₃)- ＣＯＯＨ II （式中、Ｒ₁はｎ- プロピル又はプロペニルを示し、二重結合は好ましく はトランス-立体配置されている。） の置換されたホモスレオニンであり、 Ｂはα- アミノ酪酸、バリン、ノルバリン又はスレオニンであり、 Ｃは一般式 ＣＨ₃ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ III 〔式中、Ｒは直鎖状又は分枝状Ｃ₂-Ｃ₆アルキル、アルケニル、アルキニ Ｃ₁-Ｃ₄ジアルキルアミノ、アルコキシ又はアシルオキシによって更に置 ＣＯＯＲ₂、ＣＯＮＨＲ₂ （式中、Ｒ₂は直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄アルキ ルであってよい。）、 Ｘ−Ｒ₃ （式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ₃は直鎖状又は分枝状Ｃ₁-Ｃ₄ア ルキル、アルケニル又はアルキニルであり、 但し、ＸかＳである場合、Ｒ₃はアリール又はヘテロアリールであっても よい。） ハロゲン、好ましくはフッ素、 シアノ、又は ＣＨＲ₄Ｒ₅（式中Ｒ₄は水素、メチル、エチル又はフエニルであり、 Ｒ₅は水素、ヒドロキシル又はハロゲン、好ましくはフッ素、 更にアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ アルキルアミノ、Ｃ₁-Ｃ₄ジアルキルアミノ、アシ ルオキシ、好ましくはアセチルオキシ、更にｔ- ブトキシカルボニル- ア ミノエトキシ- エトキシ- アセチルオキシ、又はアルコキシカルボニル、 好ましくはブトキシカルボニルである。） である。〕 の（Ｄ）- アミノ酸であり、 ＤはＮ-メチル -γ- ヒドロキシロイシン又はＮ- メチル -γ- アセチルオ キシロイシンであり、 Ｅはバリンであり、 Ｆ，Ｉ及びＪは夫々Ｎ-メチルロイシンであり、 Ｇはアラニンであり、 Ｈは (Ｄ)-アラニン又は (Ｄ)-セリンであり、 ＫはＮ- メチルバリンである。｝ の新規環状ペプチド。 ２．Ａ中の基Ｒ₁がプロペニル、Ｂがα- アミノ酪酸、ＤがＮ- メチル -γ- ヒ ドロキシロイシン、Ｅがバリン、Ｆ，Ｉ及びＪが夫々Ｎ-メチルロイシン、Ｇ がアラニン、Ｈが (Ｄ)-アラニン、ＫがＮ-メチルバリンであるものである、 請求の範囲１記載の一般式Ｉの環状ペプチド。 ３．式III中の基Ｒがメチル、エチル、プロピル、アリル、プロパルギル、ヒド ロ キシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシベンジル、アミノメチル、メチ ル アミノメチル、ジメチルアミノメチル、エチルアミノメチル、ジエチルアミ ノ メチル、プロピルアミノメチル、イソプロピルアミノメチル、ジプロピルア ミ ノメチル、ジイソプロピルアミノメチル、ｔ-ブチルアミノメチル、フルオ ロ メチル、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシカルボニル、エトキシ カ ルボニル、プロポキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、メチルア ミ ノカルボニル、エチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、イソ プ ロピルアミノカルボニル、フエニルアミノカルボニル、メトキシカルボニル メ チル、エトキシカルボニルメチル、プロポキシカルボニルメチル、ｔ- ブト キ シカルボニルメチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、 ｎ - ブトキシ、イソブトキシ、ｔ- ブトキシ、ヒドロキシエトキシ、メチルチオ 、エチルチオ、ヒドロキシエチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ - ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ- ブチル- チオ、フエニルチオ、２- ピリ ジルチオ、ベンゾチアゾール -２- イルチオである、請求の範囲２記載の一般 式Ｉの環状ペプチド。 ４．３ -Ｎ- メチル-(Ｄ)-セリン -４-(γ-ヒドロキシ)-Ｎ- メチル- ロイシン シクロスポリン。 ５．一般式Ｉの化合物（式中Ｃは上述の意味を有し、ＤはＮ- メチル -γ- ヒド ロキシロイシンを意味する。）の製造方法に於て、一般式Ｉの環状ペプチド（ 式中ＤはＮ- メチルロイシンを意味する。）を微生物を用いてヒドロキシル化 することを特徴とする、上記方法。 ６．微生物がセベキア ベニハナ（ Sebekia benihana）である、請求の範囲５ 記載の方法。 ７．一般式Ｉの化合物（式中ＤはＮ- メチル -γ- ヒドロキシロイシンを意味す る。）の製造方法に於て、一般式Ｉの環状ペプチド（式中Ｃはサルコシンであ り、ＤはＮ- メチル -γ- ヒギロキシロイシンである。）を、適する塩基を用 いてポリアニオンへ変え、このポリアニオンを適する求電子試薬と反応させて 請求の範囲１に記載された生成物に変換することを特徴とする、上記方法。 ８請求範囲１に記載された環状ペプチド１種又はそれ以上を薬学的に容認された 希釈剤又は賦形剤と共に含有する医薬。 ９．請求の範囲１に記載された化合物をヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による 感染の治療又は予防するための医薬の製造に使用する方法。