DD241908A5

DD241908A5 - Verfahren zur herstellung eines cyclosporins

Info

Publication number: DD241908A5
Application number: DD27436485A
Authority: DD
Inventors: Roland Wenger; Rene P Traber; Hans Kobel; Hans Hofmann
Original assignee: Sandoz Ag,Ch
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-22
Publication date: 1987-01-07
Also published as: AU4027285A; GB8407618D0; AU596071B2; ZA852195B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins fuer die Anwendung als Arzneimittel. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Cyclosporinen mit starker immunsuppressiver, entzuendungshemmender und antiparasitaerer Wirkung. Erfindungsgemaess werden neue Cyclosporine, worin der Aminosaeurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosaeurerest ist, in der Weise hergestellt, dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosaeurerest in Stellung 8 ein (D)-Hydroxy-a-aminosaeurerest ist, acyliert, oder dass man ein Cyclosporin, worin der Aminosaeurerest in Stellung 1 -MeBmt- ist und der Rest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosaeurerest ist, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhaelt, worin der Rest in Stellung 1-Dihydro-MeBmt- ist.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften, insbesondere mit immunsuppressiver, entzündungshemmender und antiparasitärer Wirkung. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen werden angewandt als Arzneimittel.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Unter Cyclosporinen wird eine Reihe von strukturell eigenartigen, cyclischen, poly-N-methylierten Undecaptiden bezeichnet, die üblicherweise pharmakologische Wirkungen, insbesondere immunsuppressive, entzündungshemmende und antiparasitäre Wirkungen aufweisen. Das als erste isolierte Cyclosporin und auch die Stammverbindung dieser Reihe ist der natürliche Pilzmetabolit Cyclosporin A der Formel A.

fMeBmt- oU-bu-Sar-MeLeu-Yal-MeLeu-Ala-CD) AIa-Me Leu-Meleu-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

worin -MeBmt- den Rest N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl-(L)threonyl der Formel B,

Γ²

HO (R)' CH _(B)

^ CH "(R) ^X

-H CH-CO-

(S) CH₃

worin -x-y-für-CH=CH- (trans) steht, bedeutet.

Seit der ursprünglichen Entdeckung von Cyclosproin A wurden zahlreiche, natürliche Cyclosporine isoliert und identifiziert, und es wurden mehrere weitere, in der Natur nicht vorkommende Cyclosporine durch Totalsynthese oder halbsynthetisch, oder auch durch modifizierte Kulturverfahren hergestellt. Deswegen hatdieCyclosporinreihean Bedeutung gewonnen und nun beinhaltet sie z. B. die natürlichen Cyclosporine A bis Z (siehe Kobel et al., European Journal of applied Microbiology and Biotechnology 14, 237-240 [1982] und den von Traber et al., 24th. Interscience Conference on Antimicrobial Agentsand Chemotherapy, Washingon, [8.-10.10.1984], präsentierten Poster), ferner verschiedene Cyclosporine nicht natürlicher Herkunft, beinhaltend Dihydro-cyclosporine (worin die -x-y-Gruppe im -MeBmt-Rest — siehe obige Formel B — gesättigt ist, z.B. wie in den US-PS 4108985,4210581 und4220641 beschrieben), Cyclosporine, worin der -MeBmt-Rest in isomerisierter oder N-demethylierter Form vorhanden ist (siehe EP-PS 0034567 und „Cyclosporin A", Proc. Internat. Conference on Cyclosporin A, Cambridge (U. K.) Semptember 1981, Ed. D. J. G. White, Elsevier Press (1982) — beide enthaltend das von R.Wenger entwickelte totalsynthetische Herstellungsverfahren von Cyclosporinen) und Cyclosporine, worin verschiedene Aminosäuren an bestimmten Stellen der Peptidsequenz eingebaut wurden (siehe das EP-PS 0056782). Als Beispiele solcher, in der oben erwähnten Literatur beschriebenen Cyclosporine können erwähnt werden: [THr]²-, [VaI]²-, [Nva]²-und [Nva]²-[Nva]⁵-Cyclosporin (auch bekannt als Cyclosporin C, D, G bzw. M), [Dihydro-MeBmtr-[Val]²-Cyclosporin (auch bekannt als Dihydro-cyclosporin D) und [(D)Ser]⁸- und [Dihydro-MeBmtJ^HDJSerf-Cyclosporin.

Gemäß nun gebräuchlicher Nomenklatur für Cyclosporine werden diese in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen mit Bezug auf Cyclosporin A bezeichnet. Dies erfolgt, indem man zuerst die Teile des Moleküls angibt, die von denen in Cyclosporin A abweichen, und dann durch Angabe des Wortes „Cyclosporin" die übrigen Teile, die denjenigen in Cyclosporin A entsprechen, charakterisiert. Dazu wird der Ausdruck-Dihydro-MeBmt- verwendet, zur Bezeichnung des obigen Restes der Formel B, worin -X-Y-TOr-CH₂-CH₂ steht. So wird mit [Dihydro-MeBmt]¹-[Val]²-Cyclosporin jenes Cyclosporin bezeichnet, das die Sequenz gemäß Formel A aufweist, worin aber-MeBmt- [Formel B,-x-y-= -CH=CH-(trans)] in Stellung 1 durch-Dihydro-MeBmt-[Formel B,-x-y-= -CH₂-CH₂] und-aÄbu-in Stellung 2 durch-VaI-ersetzt ist. In ähnlicher Weise wird mit [(D)Ser]⁸-Cyclosporin das Cyclosporin mit der Sequenz gemäß Formel A, worin aber-(D)Ala- in Stellung B durch -(D)Ser- ersetzt ist, bezeichnet.

Ferner und gemäß gebräuchlicher Praxis weisen die Aminosäuren, die durch Abkürzungen definiert werden, z. B. -Ala-, -MeVaI-usw., die (L)-Konfiguration auf, insofern nichts anderes angegeben wird. Reste mit der Vorsilbe „Me" wie z. B. in -MeLeu- sind N-methylierte Reste. Die verschiedenen Reste des Cyclosporin-Moleküls werden wie in der Literatur numeriert, d. h. im Uhrzeigersinn und ausgehend von dem-MeBmt-oder-Dihydro-MeBmt-Rest in Stellung 1. In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird stets dieselbe Zahlensequenz verwendet.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Cyclosporinen mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften, insbesondere mit starker immunsuppressiver Wirkung.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Cyclosporine mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß neue Cyclosporine mit pharmazeutischer Anwendbarkeit erhalten werden können, worin der Rest in Stellung 8 aus einer Acyloxy-a-aminosäure mit der (D)-Konfiguration besteht.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung im breitesten Umfang ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, d. h. der Rest einer Aminosäure der (D)-Reihe, worin die Seitenkette auf dem a-Kohlenstoffatom durch Acyloxy substituiert ist.

Bevorzugt ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurerest, d.h. ein Rest einer Aminosäure der (D)-Reihe mit einer Acyloxygruppe, die über das ß-Kohlenstoffatom an der Aminosäure gebunden ist. Bevorzugte (D)-ß-Acyloxy-aaminosäurereste entsprechen der Formel II,

R2

Rl-CO-O-CH(ß) ι

• - (II)

-NH-CH-CO- !

Ri Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet und R₂ für Wasserstoff oder Methyl steht.

Besonders bevorzugte Cyclosporine gemäß der vorliegenden Erfindung sind jene, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein O-Acyl-(D)-seryl- oder O-Acyl-(D)-threonylrest ist, insbesondere ein O-Acyl-(D)-seryl- oder O-Acyl-(D)-threonylrest der obigen Formel II.

In einer Gruppe von erfindungsgemäßen Cyclosporinen ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein O-Acyl-(D)-serylrest, insbesondere ein O-Acyl-(D)-serylrest, worin die Acylgruppe der Formel Ri-CO- entspricht, wobei R₁ obige Bedeutung besitzt.

In einer weiteren Gruppe von erfindungsgemäßen Cyclosporinen ist der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-ß-Acyloxy-aaminosäurerest, insbesondere ein O-Acyl-(D)-serylrest, ganz besonders ein D-Acyl-(D)-serylrest, worin die Acylgruppe der Formel R₁-CO-entspricht, worin Ri für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht, und der Rest in Stellung 5 ein (L)-Norvalylrest ist.

Ganz besonders bevorzugte Cyclosporine sind jene der Formel I,

P-X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-Val—, 123 45 6 789 10 11

(D

X -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- bedeutet,

Y -$Abu-,-AIa-,-Thr-,-VaI-oder-Nva-bedeutet, Z -VaI-oder-Nva-bedeutet und

Y einen oben definierten Rest der Formel Il bedeutet.

In der Formel I ist Q vorzugsweise ein O-Acyl-(D)-seryl- oder O-Acyl-(D)-threonyl-rest, worin die Acylgruppe der Formel. R₁-CO-entspricht, worin R₁ obige Bedeutung besitzt. Y steht vorzugsweise für -aAbu-, -Thr-, -VaI- oder -Nva-.

Eine Gruppe von erfindungsgemäßen Cyclosporinen bilden jene der Formel I, worin Y -aAbu- oder -Nva-, Z -VaI- und R₂ Wasserstoff bedeuten.

Eine weitere Gruppe von erfindungsgemäßen Cyclosporinen bilden jene der Formel I, worin Y -aAbu- oder -Nva-, Z -Nva-, R₁ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R₂ Wasserstoff bedeuten.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurerest, z. B. zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel I, dadurch gekennzeichnet,

a) daß man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Hydroxy-a-aminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-ß-Hydroxy-a-aminosäurerest, acyliert, z. B. daß man ein Cyclosporin der Formel III,

-X-Y-Sar-MeLeu-Z-MeLeu-Aia-W-MeLeu-MeLeu-MeVal-, 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11

(III)

worin X, Y und Z obige Bedeutung besitzen und W für einen Rest der Formel IV steht, R₂

=.-. HO-CH

(IV)

NH-CH-CO-(D)

worin R₂ obige Bedeutung besitzt, acyliert, indem man eine R-pCO-Gruppe, worin Ri obige Bedeutung besitzt, in ß-Stellung einführt, oder

b) ,daß man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 1 -MeBmt-ist und der Rest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-aaminosäurerest ist, beispielsweise ein (D)-ß-Acyloxy-a-aminosäurerest, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin der Rest in Stellung 1-Dihydro-MeBmt- ist, z. B. daß man ein Cyclosporin der Formel I, worin X für

. -MeBmt- steht, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin X -Dihydro-MeBmt- bedeutet. Verfahren a) kann nach an sich bekannten Methoden für die Acylierung von Hydroxygruppen durchgeführt werden, z. B. durch Umsetzung mit vorzugsweise zwei Äquivalenten, oder, falls Y = -Thr-, einem Äquivalent eines geeigneten Acyl-, ζ. Β.

. (Ci-₅)Alkanoyl- oder Benzoyl-Halogenids, oder entsprechenden -Anhydrids oder, zur Formylierung, durch Umsetzung mit z.B. Essigsäure-Ameisensäure-Anhydrid, bei einer Temperatur von z.B. ca. — 10⁰C bis 5O⁰C. Die Umsetzung erfolgt unter .. wasserfreien Bedingungen, zweckmäßigerweise in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel wie Methylenchlorid und in Anwesenheit eines Kondensationsmittels wie 4-Dimethyl-amino-pyridin. Unter diesen Bedingungen findet die Acylierung auf der Hydroxygruppe des Aminosäurerests in Stellung 8 eher als auf der Hydroxygruppe des Aminosäurerests in Stellung 1 statt.

Verfahren b) kann auf an sich für die Reduktion natürlicher Cyclosporine zu den entsprechenden Dihydrocyclosporinen bekannterWeise durchgeführt werden, beispielsweise durch katalytische Hydrierung, z.B. nach den in der GB-PS 1 567201 beschriebenen, allgemeinen Methoden.

Die Hydrierung erfolgt zweckmäßigerweise im neutralen Bereich, bei Temperaturen zwischen ca. 20⁰C und 3O⁰C und unter Atmosphärendruck oder leicht erhöhtem Druck. Als Hydrierungskatalysator eignen sich z. B. Platinoxyd oder Palladium-Katalysatoren, z. B. Palladium auf Kohle. Die Hydrierung kann z. B. in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel wie Ethylacetat oder einem niederen aliphatischen Alkanol wie Methanol oder Isopropanol durchgeführt werden.

Cyclosporine mit einem ß-Hydroxy-a-aminosäurerest in Stellung 8, insbesondere [(D)Ser]⁸-Cyclosporine und [Dihydro-MeBmtr-MDlSer^-Cyclosporine, die sich als Ausgangsprodukte für Verfahren a) eignen, sind z. B. aus der oben erwähnten EP-PS 0056782, worin ebenfalls Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben werden, bekannt. Weitere als Ausgangsprodukte für Verfahren a) geeignete Cyclosporine mit einem Hydroxy-a-aminosäurerest in Stellung 8 können in analoger Weise oder nach den in der EP-PS 0034567 (aufweiche in der EP-PS 0056782 hingewiesen wird) beschriebenen allgemeinen Verfahren derCyclosporin-Totalsynthese hergestellt werden, oder noch nach den im weiteren, insbesondere in den Beispielen beschriebenen Verfahren.

Die Cyclosporine, die als Ausgangsverbindungen für Verfahren b) geeignet sind, können nach dem unter a) angegebenen Verfahren hergestellt werden.

Obwohl die Ausgangsverbindungen der obigen Formel III, die in den nachfolgenden Beispielen spezifisch beschrieben sind, unter den breiten Umfang der oben erwähnten EP-PS 0056782 fallen, sind gewisse davon formal neu, d. h. daß sie bis jetzt noch nie spezifisch beschrieben wurden. Erfindungsgemäß wurde nun auch gefunden, daß diese Cyclosporine ein ganz besonders interessantes oder vorteilhaftes Wirkungsspektrum aufweisen, insbesondere bezüglich ihrer immunsuppressiven Wirkung, und ganz besonders bezüglich der Verhütung von mit Transplantationen, z.B. Organtransplantationen, verbundenen unerwünschten Effekten (Abwehr), z. B. im Vergleich zu den bekannten Cyclosporinen der Formel Hl, d. h. mit jenen Cyclosporinen der Formel IM, die in der EP-PS 0056782 spezifisch beschrieben sind. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Cyclosporin der Formel IMa,

2 3 4 5. 6 7 8 9 10 11 | (lila)

Y' -aAbu-, -Thr-, -VaI- oder-Nva- bedeutet,

Z' -Val-bedeutetode^fallsY'-aAbu-oder-Nva-bedeute^fur-Nva-steht, W' -(D)Ser- bedeutet oder, falls Y' -Abu- und Z' -VaI bedeuten, für -(D)Thr- steht und X' -MeBmt- bedeutet oder, falls Y' -Thr-, -VaI- oder-Nva-, Z' -VaI- und W' -(D)Ser- bedeuten, für -Dihydro-MeBmt- steht.

Spezifische Cyclosporine der Formel lila sind

a) [(D)Thr]⁸-Cyclosporin

b) [Thr]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin

c) [Diriydro-MeBrntlMThrf-KDiSerf-Cyclosporin

d) [Val]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin

e) [Dihydro-MeBmtlMValP-KDiSerf-Cyclosporin

f) [Nva]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin

g) [Dihydro-MeBmt]¹-[Nva]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin h) [Nva]⁵-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin und

i) [Nva]²-[Nva]⁵-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin.

Von den obigen Cyclosporinen sind die Verbindungen a), b), e),f) und i), insbesondere a),f) und i), im Hinblick auf ihre Wirkung/ ihr Wirkungsspektrum, z. B. ihre Immunsuppressive Wirkung, von besonderem Interesse, z. B. im Vergleich mit den in der EP-PS 0056782 spezifisch beschriebenen Cyclosporinen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oben definierten Cyclosporin der Formel III a, dadurch gekennzeichnet,

c) daß man in einem in O-geschützter Form vorhandenen, oben definierten Cyclosporin der Formel III die Schutzgruppe abspaltet, oder

d) daß man ein geradkettiges Undecapaptid enthaltend die Sequenz

—W-MeLeu-MeLeu-MeVal-X'-Y'-Sar-MeLeu-Z'-MeLeu-AIa-8 9 10 11 123 45 6 7

worin Y', Z', W' und X' obige Bedeutung besitzen, cyclisiert, wobei das Undecapeptid in ungeschützter oder O-geschützter Form vorhanden ein kann, und nötigenfalls die Schutzgruppe abspaltet, oder

e) daß man zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel lila, worin Y' -Thr-,-VaI-oder Nva-bedeutet,

Z' -VaI- bedeutet oder, falls Y' -Nva- bedeutet, für -Nva- steht,

W' -(D)Ser- bedeutet und

X' -MeBmt- bedeutet,

ein [Thr]²-Cyclosporin, [Val]²-Cyclosporin, [Nva]²-Cyclosporin oder [Nva]²-Cyclosporin produzierender Pilzstamm in Gegenwart eines (D)-Serin enthaltenden Nährmediums züchtet und das Cyclosporin der Formel III a von der erhaltenen Kulturbrüiie isoliert, oder

f) daß man zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel III a, worin X' -Dihydro-MeBmt- bedeutet, das entsprechende Cyclosporin der Formel HIa, worin X'-MeBmt- bedeutet, reduziert.

Undecapaptide zur Anwendung im Verfahren d) können analog zu den in der oben erwähnten EP-PS 0056782 allgemeinen Methoden hergestellt werden, beispielsweise mit Bezug auf das Schema des Beispiels 1a dieses Patentes, indem man die Peptidsequenz, bestehend aus den Resten 8 bis 11 des Cyclosporin-Moleküls mit der Sequenz, bestehend aus den Resten 1 bis 7 kombiniert, mit der nötigen Substition der Reste in Stellung 2 und/oder 5 und/oder 8. Der-(D)Ser-oder-(D)Thr-Restin Stellung 8 ist zweckmäßigerweise in O-geschützter Form, z. B. in Form des O-t-Butyl-Derivates. Die Cyclisierung wird unter Anwendung der in erwähnter EP-PS speziellen Methoden durchgeführt, mit anschließender Abspaltung der O-Schutzgruppen, falls erforderlich [Verfahren c)] nach den in der Peptidchemie an sich bekannten Methoden.

Der bevorzugte Stamm zur Anwendung im Verfahren e) ist der Stamm NRRL 8044 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum (Garns). Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA deponiert und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung. Eine andere Kultur davon wurde beim Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, unter der Kulturnummer FRI FERM-P Nr.2796 deponiert. Die morphologischen Merkmale dieses Stammes, der vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) zugeordnet wurde, sowie Methoden zur Herstellung von Erhaltung von Vor- und Nachkulturen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben, z. B. in der GB-PS 1491 509.

Gemäß Verfahren e) wird der ausgewählte Stamm, z. B. der Species Tolypocladium inflatum (Garns), zweckmäßigerweise während ca. 2 Wochen in einem Nährmedium wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben und in Gegenwart von zugegebenem (D)- oder (D,L)-Serin bei 27 ⁰C gezüchtet. Der Aminosäure-Prekursor wird zweckmäßigerweise in einer Menge von ca. 1 bis ca. 15g, vorzugsweise ca. 4 bis ca. 10 g/Liter Kulturmedium zugegeben. Zweckmäßigerweise enthält das Kulturmedium ebenfalls zugegebenen Aminosäure-Prekursor für den Rest in Stellung 2 des gewünschten Cyclosporins, z.B. in Menge von ca. 6,0 bis ca. 10,0, vorzugsweise ca. 8,0g/Liter Kulturmedium. Nach der Inkubationszeit wird das erhaltene Cyclosporin der Formel III a nach an sich bekannten Methoden aus der Kulturbrühe gewonnen, z. B. durch Trennung der Brühe in Mycel und Kulturfiltrat, Extraktion des Mycels unter Homogenisieren, und Abzentrifugieren des Zellmaterials.

Das erhaltene rohe Cyclosporin kann z. B. chromatographisch und/oderdurch Umkristallisieren gereinigt werden. Damit werden besonders die weiteren Cyclosporine, insbesondere die natürlichen Cyclosporine entfernt. Verfahren f) kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man die unter b) beschriebenen Methoden anwendet.

Ausführungsbeispiel

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 1 Synthese von [(0-acetyl)-(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel l:

X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyMDJSer-]:

Manfügt20mg4-Dimethylaminopyridinzu47mg [(DJSer^-Cyclosporin (hergestellt in Übereinstimmung mitderin Beispiel 1 oder 3 des oben erwähnten Europäischen Patentes Nr. 0056782 beschriebenen Methode) gelöst in 3 ml Methylenchlorid. Hierauf fügt man 6,1 mg frisch destilliertes Acetylchlorid in 1 ml Methylenchlorid hinzu und rührt die erhaltene Reaktionsmischung während 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man verdünnt die Reaktionsmischung mit 50 ml Methylenchlorid und schüttelt mit 30 ml Wasser. Die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der Rückstand wird an 60g Silicagel (0,062-0,20mm) filtriert, wobei Methylenchlorid/5% Methanol als Eluans verwendet wird und in 25ml Fraktionen gesammelt. Die Titel verbindung wird mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von CHCl3/5% Methanol als Trägerphase aus den Fraktionen 4 bis 8 gewonnen

[α]²,⁰ = -202⁰C (c = 0,92 in CHCI₃).

Beispiel 2

In Analog zu Beispiel 1 werden die folgenden Verbindungen ausgehend von dem entsprechenden nicht acylierten Cyclosporin hergestellt:

2.1. [(0-benzoyl-(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel l:

X = -MeBmt-,Y = -oAbu-,Ζ = -Val-,Q = -O-benzoyl-(D)Ser-]: [a]g° = -20°C(c = 1,0in CHCI₃); 2.2 [O-acetyl-(D)Thr]^s-Cyclosporin [Formell:

X = -MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyl-fDi-Ser-]: [a]§° = -219⁰C (c = 1,0 in CHCI₃);

2.3. [NvalMO-acetyHDISerf-Cyclosporin [Formel I:

X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyHDJSer-]: [a]g° = -240⁰C (c = 1,0 in CHCI₃)/-233°C (c = 0,8 in CHCI₃)/ -177⁰C (c = 0,76 in CH₃OH): Smp. = 143-147⁰C.

2.4. [Val]²-[O-acetyl-(D)Ser]⁸-CycIosporin [Formel I:

X = -MeBmt-, Y = -VaI-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyl-fDJSer-]: [ag⁰ = -219⁰C (c = 0,9 in CHCI₃);

2.5. [Nvaf-tO-acetyl-IDJSerf-Cyclosporin [Formel I:

X =-MeBmt-, Y =-[aAbu-,Z =-Nva-, Q =-O-acetyl-tDJSer-]: [a]g° = -215°C (c = 1,0 in CHCI₃);

2.6. [Nvaf-INvaf-IO-acetyi-fDlSerf-Cyclosporin [Formel I:

X = -MeBmt-, Y = -Nva-, Z = -Nva-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: [a]g° = -169°C (c = 1,0 in CHCI₃); und 2.7 [Thr]²-[O-acetyl-(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel I:

X = -MeBmt-, Y = -Thr-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyl-fDJSer-]: [α]²,⁰ = -251⁰C (c = 0,86 in CHCI₃)/-174°C (c = 0,81 in CH₃OH): Smp. = 143-146°C.

Beispiel 3

Synthesevon[Dihydro-MeBmt]¹-[O-acetyl-(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel I: X = -dihydro-MeBmt-, Y = -aAbu-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]:

54mg [(O-acetylMDlSer^-Cyclosporin in 10ml Aethanol werden unter Verwendung von 10mg Palladium/Tierkohle (10%) bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Nach 20 Stunden wird die erhaltene Reaktionslösung durch eine dünne Talgschicht filtriert und der Aethanol im Vakuum abgedampft. Nach weiterem Trocknen im Hochvakuum wird die Titelverbindung erhalten.

[a]g° = -205,8°C (c = 1,02 in CHCI₃).

Beispiel 4

Die folgenden Verbindungen werden hergestellt, entweder analog zu Beispiel 1, ausgehend vom entsprechenden nicht acylierten Cyclosporin oder analog zu Beispiel 3, durch Hydrierung des entsprechenden in Beispiel 2 beschriebenen Cyclosporins:

4.1. [Dihydro-MeßmtlMNva^-tO-acetyl-fDJSerf-Cyclosporin [Formel I:

X = -dihydro-Meßmt-,Υ = -Nva-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyMDJSer-]: Smp. = 139-141 °C; [α]²,⁰ = -225° (c = 0,88 in CHCI₃)/ -163° (C = 0,76 in CH₃OH);

4.2. [Dihydro-Meßmtr-IVallMO-acetyMDJSerf-Cyclosporin [Formel I:

X = -dihydro-Meßmt-, Y = -VaI-, Z = -Vat-, Q = -O-acetyl-fDJSer-]: [a]g> = -210° (c = 0,85 in CHCI₃); und

4.3. [Dihydro-Meßmtl^tThrj^lO-acetyl-lDiSerl^Cyclosporin [Formel I:

X = -dihydro-Meßmt-, Y = -Thr-, Z = -VaI-, Q = -O-acetyl-(D)Ser-]: [a]g° = -241° (c = 1,0 in CHCI₃)/-162° (c = 1,0 in CH₃OH): Smp. = 148-150°C

Herstellung des Ausgangsmaterials:

Beispiel 5

Diefolgenden für die Herstellung der Verbindungen der Beispiele 2.2 bis 2.7 benötigten Ausgangsverbindungen werden analog zu der bekannten Verbindung [(D)Ser]⁸-Cyclosporin hergestellt. Die Herstellung der letzteren wird beschrieben in Beispiel 1 des Europäischen Patentes Nr. 0056782, mit Substitution der entsprechenden Reste in den Stellungen 2 und/oder 5 und/oder 8 in der Verfahrenssequenz, wie sie im Reaktionsschema zu Beispiel 1 a des genannten Patentes aufgeführt wird.

5.1. [(D)Thr]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = -Meßmt-,Υ' = -aAbu-,Z' = -VaI-, W = -(D)Thr-]: [α]²,⁰ = -248,7°(c = 1,0in CHCI₃);

5.2. [Nva]²-[{D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel IHa: X' = -Meßmt-, Y' = -Nva-,Z' = -VaI-, W = -(D)Ser-]: Smp. = 150-153°C; [a]g° = -262° (c = 0,71 in CHCI₃)/-191° (c = 0,73 in CH₃OH);

5.3. [Val]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = Meßmt-, Y' = -VaI-,Z' = -VaI-, W = -(D)Ser-]: [a]g° = -257° (c = 1,0 in CHCI₃)/-255° (c = 0,45 in CHCI₃)/-189° (c = 0,42 in CH₃OH): Smp. = 136-14O⁰C.

5.4. [Nva]⁵-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = -Meßmt-, Y' = -aAbu-, Z' = -Nva-, W = -(D)Ser-]: [a]g° = -212° (c = 1,0 in CHCI₃);

5.5. [Nva]²-[Nva]⁵-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = -Meßmt-, Y' = -Nva-, Z' = -Nva-, W = -|D)Ser-]: [a]g> = -217° (C= 1,0 in CHCI₃); und

5.6. [lhr]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel IHa: X' = -Meßmt-, Y' = -Thr-, Z = -VaI-, W = -(D)Ser-]: [α]²,⁰ = 258° (c = 0,39 in

Beispiel 6

Die Verbindung des Beispiels 5.2. kann auf andere Weise mikrobiologisch wie folgt hergestellt werden:

a) 10 Liter eines Nährmediums enthaltend 50g Maltose, 5g (DL)-Norvalin, 8g (D)-Serin, 0,75g KH₂PO₄, 0,5g MgSO₄-7 H₂O; 0,1 CaCI₂ 6 H₂O und 8g Caseinpepton pro Liter werden angeimpft mit 1 Liter einer Konidien- und Mycel-Suspension des Pilzstammes NRRL 8044, welcher einer drei Tage alten Vorkultur entnommen wurde. Das angeimpfte Produktionsmedium wird in 100ml Portionen in 100 Erlenmeyerkolben gefüllt, die dann während 14 Tagen bei 27°C auf einer Rundschüttelmaschine mit 180 UPM inkubiert werden. Das Mycel wird vom Kulturmedium getrennt und in einem Turrax durch Zerkleinern und Rühren mit 3 x 3 Liter 90% Methanol extrahiert. Das zerkleinerte Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40^cC konzentriert, bis daß der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 4x unter Verwendung von 0,5 Liter 1,2-Dichloräthan bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten 1,2-Dichloräthan Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 4O⁰C konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (1,4kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen und dann in 280 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 9-11, enthaltend eine Cyclosporin-Mischung, werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säulenchromatographie (1 kg Silicagel, Korngröße 0,063-0,2 mm) unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Äthylacetat als Eluans (Fraktionen von 500 ml) getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst [Nva²]-Cyclosporin (Fraktionen 7-9) eluiert, gefolgt von einer Mischung enthaltend [Nva²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin und Cyclosporin. Die Trennung von [Nva²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin und Cyclosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (280 g, 0,063-0,2 mm) unter Verwendung von Chloroform/Methanol (98:2) als Eluans (Fraktionen von 100 ml). Die Fraktionen 20-30, enthaltend rohes [Nva²H(D)Ser⁸]-Cyclosporin, werden weiter gereinigt durch Druckchromatographie auf einer phasenumgekehrten Silicagelsäule LiChropep RP 18,260g, Korngröße 0,04-0,063 mm) unter Verwendung von Methanol/ Wasser (85:15) als Eluans und in 25 ml Fraktionen gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 45-55 ergeben reines [Nva²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin als amorphes weißes Pulver

Die für das obige Verfahren benötigte Vorkultur kann wie folgt erhalten werden:

b) Die für die Beimpfung verwendete Sporen- und Mycelsuspension, hergestellt aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 8044, wird während 21 Tagen bei 21 °C auf folgendem Agarmedium gezüchtet: 20g Malzextrakt, 20g Agar, 4g Hefeextrakt pro Liter entmineralisiertes Wasser. Die Sporen dieser Kultur werden in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen, wobei eine Endkonzentration von 5 x 10⁶ Sporen/ml erhalten wird. 10 ml dieser Suspension werden verwendet für die Beimpfung von 1 Liter einer Nährlösung mit der gleichen Zusammensetzung wie das Kulturmedium des Beispiels 6a, mit Ausnahme der (D)-Serin- und der (DL)-Norvalin-Komponente. Die Bebrütung erfolgt während 3 Tagen bei 27°C auf einer Rundschüttelmaschine (200 UPM). Diese Kultur wird zur Beimpfung der Produktionskultur verwendet. [Nva²]-[(DJSer^l-Cyclosporin kann im Fermenter wie folgt produziert werden:

c) Ca. 10⁹ Sporen einer Schrägagarkultur des Stammes NRRL 8044 werden in einem rostfreien Stahlfermenter enthaltend 20 Liter eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

Fructose	75 g
Amber EHC	25g
KH₂OP₄	5g
KCI	2,5 g
Dest. Wasser ad	1 Liter
(pH = 5,5

Vorgehend erfolgt Sterilisation während 20 Minuten bei 120°C. Günstige Inkubationsbedingungen sind eineTemperatur von 27°C, eine Luftrate von 16 Litern pro Minute bei einem Überdruck von 0,5 Bar und einer Umdrehungszahl von 200 UPM. Die sich entwickelnde Vorkultur wird während 6 Tagen bebrütet und hierauf 15 Liter in einem rostfreien Stahlfermenter enthaltend 300 Liter eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

Maltose	75 g
Amber EHC	25 g
KH₂PO₄	5g
KCI	2,5 g
(DL)-Norvalin	5g
(D)-Serin	8g
Dest. Wasser ad	1 Liter
(pH = 5,5)

Vorgehend erfolgt Sterilisation während 20 Minuten bei 120°C. Die Kultur wird bei einer Temperatur von 27°C gehalten, belüftet mit einer Luftrate von 120 Liter Luft pro Minute, bei einem Überdruck von 0,5 Bar und gerührt bei einer Umdrehungszahl von 70 UPM. Die Schaumkontrolle wird durch Zugabe einer Silicon-Emulsion durchgeführt. Nach der Bebrütung während 14 Tagen wirddie Kultuivwelche ein Totalvolumen^/on^75_Liter aufweist auf 10X abgekühlt und das Mycel unter Verwendung eines Westfalia-Separators entfernt. Das Filtrat wird durch 2maiiges Rühren mit Aethylacetat extrahiert. Die Extrakte werden mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum getrocknet. Das Mycel wird mit Methanol versetzt, homogenisiert und filtriert. Diese Extraktion wird 2x unter Verwendung von 90% Methanol wiederholt. Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende wäßrige Konzentrat wird 2x mit Aethylacetat extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum konzentriert. Die extrahierte wäßrige Phase wird noch2x mitAethylacetat/lsopropanol (8:2) extrahiert. Diese Extrakte werden vereinigt und wiederum im Vakuum eingedampft.

Die Mycel- und Filterextrakte werden filtriert, wobei 5Ox die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wöbe 10Ox die Menge an Silicagel 60 (Korngröße = 0,04-0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Aethylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert [Nva²]-Cyclosporin, gefolgt von Cyclosporin und [Nva²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren

chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 14Ox die Menge an Silicagel 60 (Korngröße 0,063-0,20mm) und Chloroform/Methanol (98:2) als Eluans verwendet wird. Es wird reines [Nva²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin erhalten.

Beispiel 7

Die Verbindung des Beipiels 5.3 kann auch mikrobiologisch hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6a) vorgeht, jedoch mit folgenden Abänderungen:

a) Im Nährmedium wird das (DL)-Norvalin durch 10g (L)-Valin ersetzt. Nach der Trennung des Mycels vom Kulturmedium wird wie folgt extrahiert:

Das rohe Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate unter Zugabe von Wasser durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40⁰C konzentriert, bis der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 3x unter Verwendung von 5 Litern Aethylacetat bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten Aethylacetat-Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 40"C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (1,4kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen. Die Fraktionen, die eine Cyclosporin-Mischung enthalten, werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säulenchromatographie (3kg Silicagel, Körngröße 0,020-0,045 mm, „Grace") unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Aethylacetat als Eluans getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst [Val²]-Cyclosporin eluiert, gefolgt von einer Mischung enthaltend [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin als Hauptkomponente. Die weitere Reinigung von [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (80g, „Grace",, 0,020-0,0045 mm) unter Verwendung von Aceton/Hexan (1:1) als Eluans. Die Fraktionen, die rohes [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin enthalten, werden weiter gereinigt durch Druckchromatographie auf einer phasenumgekehrten Silicagelsäule („Merck" LiChropep RP18,160g, Körngröße 0,04-0,063 mm) unter Verwendung von Methanol/Wasser (80:20) als Eluans, wobei reines [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin als amorphes weißes Pulver erhalten wird.

b) Die benötigte Vorkultur wird wie im Beispiel 6 b) erhalten.

[Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin kann auf der Fermenterebene hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6c) vorgeht, jedoch mit folgenden Abänderungen:

c) In der Zusammensetzung des Produktionsmediums wird das (DL)-Norvalin durch 10g (L)-VaMn ersetzt. Nach der Zugabe von Methanol zum Mycel, Homogenisieren und Filtrieren (2x mit 90% Methanol), wird wie folgt vorgegangen:

Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende, wäßrige Konzentrat wird 3x mit Aethylacetat extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum eingedampft.

Die Mycel und Filtratextrakte werden filtriert, wobei 50x die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wobei 40x die Menge an Silicagel 60 (Korngröße = 0,04-0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Aethylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert [VaI²]-Cyclosporin, gefolgt von Cyciosporin und [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 100x die Menge an Silicagel 60 und Aceton/Hexan (1:1) verwendet wird, und einer Druckchromatographie auf phasenumgekehrtem Silicagel („Merck" LiChroprep RP 18, Korngröße 0,04 bis 0,063mm) unter Verwendung von Methanol/Wasser (80:20) als Eluans, wobei reines [Val²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin erhalten wird.

Beispiele

Die Verbindung des Beispiels 5.6 kann auch mikrobiologisch hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6a) vorgeht, jedoch mit folgenden Abweichungen:

a) Im Nährmedium wird das (DL)-Norvalin durch 5g (L)-Threonin ersetzt. Nach der Inkubation wird wie folgt extrahiert: Das Mycel wird vom Kulturmedium getrennt und in einem Turrax durch Zerkleinern und Rühren mit 3 x 9 Litern 90% Methanol extrahiert. Das zerkleinerte Mycel wird vom Lösungsmittel durch Saugfiltration abgetrennt und die vereinigten Filtrate unter Zugabe von Wasser durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 4O⁰C konzentriert,, bis der Dampf zur Hauptsache aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird 3x unter Verwendung von 5 Litern Aethylacetat bei jeder Extraktion extrahiert. Die vereinigten Aethylacetat-Lösungen werden durch Verdampfen unter Vakuum bei einer Temperatur von 40⁰C konzentriert.

Der erhaltene Rückstand wird einer Gelfiltration an Sephadex LH-20 (2 kg; Pharmacia) mit Methanol unterworfen. Die Extraktion enthaltend eine Cyclosporin-Mischung werden vereinigt und dann mittels Silicagel-Säulenchromatographie (2kg Silicagel, Korngröße 0,02-0,045mm, „Grace") unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Aethylacetat als Eluans getrennt. In Übereinstimmung mit ihrer Polarität wird zuerst Cyciosporin eluiert, dann [(Ö)Ser⁸]-Cyclosporin gefolgt von [Thr²]-Cyclosporin und letztlich [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin in roher Form. Die weitere Reinigung von [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin erfolgt mittels Silicagel-Chromatographie (50g, „Grace", 0,02-0,45 mm) unter Verwendung von Aceton/Hexan (2:1) als Eluans, wobei reines [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin als amorphes weißes Pulver erhalten wird.

b) Die benötigte Vorkultur wird wie im Beispiel 6 b) erhalten. [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin kann auf der Fermenter-Ebene hergestellt werden, indem man analog Beispiel 6c) vorgeht, jedoch mit folgenden Abweichungen:

c) In der Zusammensetzung des Produktionsmediums wird das (DL-Novalin durch 5 g (L)-Threonin ersetzt. Nach der Inkubation und dem Entfernen des Mycels unter Verwendung eines Westfalia Separators wird wie folgt vorgegangen:

Das Mycel wird mit Methanol versetzt, homogenisiert und filtriert. Diese Extraktion wird 2x unter Verwendung von 90% Methanol wiederholt. Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und unter Zugabe von Wasser im Vakuum konzentriert. Das zurückbleibende wäßrige Konzentrat wird 2x mit Aethylacetat extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser gewaschen, vereinigt und im Vakuum konzentriert.

Die Mycelextrakte werden filtriert, wobei 5Ox die Menge an Sephadex LH-20 mit Methanol als Eluans verwendet wird. Die Spitzenfraktionen werden hierauf chromatographisch gereinigt, wobei 3Ox die Menge an Silicagel 60 (Korngröße = 0,04 -0,063 mm) und mit Wasser gesättigtes Aethylacetat als Eluans verwendet wird. Zuerst eluiert Cyciosporin, dann [(D)Ser⁸]-Cyclosporin gefolgt von [Thr²]-Cyclosporin und letztlich [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin. Diese späteren Fraktionen werden einer weiteren chromatographischen Reinigung unterworfen, wobei 25Ox die Menge an

Silicagel 60 (Korngröße 0,02-0,045mm) und Aceton/Hexan (2:1) als Eluans verwendet wird. Es wird reines [Thr²]-[(D)Ser⁸]-Cyclosporin erhalten.

Beispiel 9

Folgende Verbindungen, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der in den Beispielen 4.1 bis 4.3 aufgeführten Verbindungen verwendet werden können, können aus den in den Beispielen 5 bis 7 angegebenenen Cyclosporinen hergestellt werden, indem man analog Beispiel 3 vorgeht.

9.1. [Dihydro-Meßmt]¹-[Nva]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel IHa: X' = -dihydro-Meßmt-, Y' = Nva-,Z' = -VaI-, W = -(D)Ser-] -hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.2 oder 6: [α]²)⁰ = -251° (c = 1,23 in CHCI₃,/-!79° (c = 1,16 in CH₃OH):

Smp. = 155-157°C.

9.2. [Dihydro-Meßmt]¹-[Val]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = -dihydro-Meßmt-, Y' = -VaI-,Z' = -VaI-, W = (D)Ser-] -hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.3 oder 7: [α]*⁰ = -224° (c = 1,0 in CHCI₃).

9.3. [Dihydro-Meßmt]¹-[Thr]²-[(D)Ser]⁸-Cyclosporin [Formel lila: X' = -dihydro-Meßmt-, Y' = -Thr-,Z' = -VaI-, W = -(D)Ser-] -hergestellt aus dem Produkt des Beispiels 5.6 oder 8: [a]g° = -262° (c = 0,73 in CHCI₃)/-173° (c = 0,79 in CH₃OH): Smp. = 156-158°C.

Die Cyclosporine, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-aminosäurerest ist, wie vorgehend definiert und beschrieben, in folgenden als erfindungsgemäße Cyclosporine bezeichnet, besitzen wie aus den folgenden Testmethoden hervorgeht, pharmakologische Aktivität.

1. ImmunosuppressiveWirkungen:

1.1 Lokale Hämolyse in vitro in Gel [R. I. Mishell und R. W. Dutton, J. Exp. Medicine, 126,423-442 (1976)]. Die erfindungsgemäßen Cyclosporine hemmen Haemolysezonen verglichen mit unbehandelten Kontrollen in Konzentrationen von 0,01 bis 10,0^g/ ml.

1.2 Lymphozyten-Stimulations-Test nach Janossy und Greaves [Clin. Exp. Immunol., 9,483 (1971) und 10,552 (1072)]: Die erfindungsgemäßen Cyclosporine hemmen die durch Concanaval in A stimulierte DNA-Synthese (Hemmung des H³- . Thymidin-Einbaus), die Zell-Proliferation und Blastogenese bei Mäusemilzzellen im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen in Konzentrationen von 0,001 bis 10,0pg/ml.

1.3 Mixed lymphocyte reaction [Bach et al., J. Exp. Med. 136,1430 (1972)]:

Die Reaktion (d.h. Proliferation und Differenzierung) von Lymphozyten [Mäuse (Balb/c) Milzzellen] bei Co-Inkubation während 5 Tagen mit allogenischen Milzzellen von bestrahlten Mäusen (CBA t) wird in Anwesenheit und in Abwesenheit der Testsubstanz gemessen. Die Reaktion in Anwesenheit wird in der prozentualen Änderung der Reaktion, verglichen mit 100% der Kontrollreaktion ausgedrückt. Bei der Verwendung von erfindungsgemäßen Cyclosporinen wird eine Hemmung der Reaktion bei einer Konzentration von 0,001 bis 10,0μg/mΓ¹ beobachtet.

1.4 Unterdrückung der Organ-Abstoßung:

Nieren und Geber-Ratten (F 344, 9) werden in Empfänger-Ratten (Wistar-Furth, SJtransplantiert. Die Testsubstanz wird p.o. während 14Tagen den Empfänger-Ratten verabreicht. Danach wird die Behandlung unterbrochen. 7 Tage nach der Transplantation werden die Testtiere einer bilateralen Nephrectomie unterworfen. Da das Leben der Testtiere von der Acceptanz und dem Funktionieren des übertragenen Organs abhängt, dient die Erhöhung der Überlebenszeit, verglichen mit derjenigen von Kontrolltieren, welche nur Placebo erhalten, als Parameter für die Wirksamkeit der Testsubstanz. Tiere, die erfindungsgemäße Cyclosporine erhalten, weisen bei Dosen von 2,5 bis 10mg/kg p.o. eine Überlebensspanne von 60 bis 250 Tagen auf, verglichen mit unbehandelten Kontrollen, die alle als Folge der Organ-Abstoßung innerhalb von ca. 9 bis 10 Tagen sterben.

2. Entzündungshemmende Wirkung

Die entzündungshemmende Wirkung kann mit dem Adjuvans-Arthritis-Test an der Ratte gezeigt werden. Bei diesem Test wird die Adjuvans-Arthritis nach der Methode von Pearson und Wood, „Arthr. Rheum." 2,440 (1959) induziert. Die erfindungsgemäßen Cyclosporine zeigen sich bei diesem Test als wirksam bei der sich entwickelnden und bei der etablierten Arthritis in Dosen von 10 bis 30mg/kg/Tag p.o.

3. Antiparasitäre Wirkung

Anti-Malaria-Test nah L. Rane, „Chemotherapie and Drug Resistance in Malaria" ed. W. Peters, Academic Press, New York,

1970. Mäuse (OF1: männlich) werden am Tage 0 mit 0,2 ml einer Suspension enthaltend 10~⁷ parasitische Zellen der Species Plasmodium berghei (Stamm NK 65) infiziert. Die Verabreichung erfolgt i. p. Am Tag 3 wird die Testsubstanz bei veränderlichen Dosen unter Verwendung von 5 bis 10 Mäusen pro Dosis s.c. verabreicht. Die Überlebenszeit wird festgehalten und die minimale effektive Dosis (MED) berechnet durch Vergleich der Überlebenszeit mit derjenigen unbehandelter Kontrolltiere. Bei den Kontrolltieren beträgt die Überlebenszeit ca. 7 Tage. Die MED ist die Dosierung, bei welcher die Überlebenszeit verdoppelt ist. Dieerfindungsgemäßem Cyclosporine zeigen sich bei diesem Test als wirksam in Dosen von 25 bis 100 mg/kg/Tag; s; c.

Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung können die erfindungsgemäßen Cyclosporine zur Prophylaxe und Behandlung von Konditionen und Krankheiten, welche eine Herabsetzung der Immunantwort benötigen, angewandt werden. So können die erfindungsgemäßen Cyclosporine Anwendung finden bei der Unterdrückung der Proliferation von Lymphocyten und Immunocyten, so z. B. bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, zur Verhinderung der Gewebsabstoßung in Transplantationen, z. B. bei Haut, Lunge, Herz, Herz-Lunge, Knochenmark, Nieren, Milz und Hornhauttransplantationen. Spezifische Autoimmunkrankheiten, bei welchen die erfindungsgemäßen Cyclosporine Anwendung finden können, sind solche, für die die Behandlung mit Cyclosporin A vorgeschlagen oder bereits angewendet worden ist, z. B. aplastische Anämis, „pure red cell anaemia", idiopathische Trombocytopänie, systemischer Lupus erythematodes, Polychrondritis, Sklerodermie, Wegener granulomatosis, chronisch aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Psoriasis, Steven-Johnson Syndrom, idiopathische Sprue, MorbusCrohn, Graves Opthalmopathie, Sacoidose, Multiple Sklerose, primäre billiare Zirrhose, primäre juvenile Diabetes, Uveitis posterior, interstitielle Lungenfibrose und Psoriasis Arthritis.

Aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkung können die erfindungsgemäßen Cyclosporine Anwendung finden bei der Behandlung von entzündlichen Konditionen, insbesondere entzündliche Konditionen mit einer Äthiologie, die eine

Autoimmun-Komponente einschließt, ζ. B. die Behandlung von Arthritis und rheumatischen Erkrankungen wie Arthritis chronica progrediens.

Aufgrund ihrer anti-parasitären Wirkung können die erfindungsgemäßen Cyclosporine Anwendung finden als antiparasitäre Heilmittel, z. B. zur Behandlung von parasitären Infektionen verschiedenen Typus, insbesondere bei Protozoen wie auch Trematoden- und Neumatodeninfektionen. Spezifische Typen von parasitären Infektionen verschiedenen Typus, insbesondere bei Protozoen wie auch Trematoden- und Nematodeninfektionen. Spezifische Typen von parasitären Infektionen, bei welchen die erfindungsgemäßen Cyclosporine Anwendung finden können, sind solche, für die die Behandlung mit Cyclosporinen in der Literatur bereits vorgeschlagen worden.ist, z. B. Schistomosomiasis, Filariasis, Leishmania, Coccidioidomycosis und insbesondere Malaria.

Für die oben genannten Indikationen liegt die tägliche Dosis bei etwa 75 bis etwa 5000, vorzugsweise bei etwa 2000, ganz bevorzugt bei etwa 1500 mg. Bei Verwendung einer Einheitsdosis, z. B. für die orale Verabreichung,, ist eine Dosis von etwa 25 bis etwa 2500, vorzugsweise etwa 1jQ00, ganz bevorzugt etwa 800mg eines erfindungsgemäßen Cyclosporins geeignet, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger.

Die erfindungsgemäßen Cyclosporine können auf irgend einem konventionellen Weg verabreicht werden, insbesondere in Übereinstimmung mit geläufigen Methoden bei der Verabreichung von Cyclosporin A, insbesondere durch intravenöse Infusion,

z. B. im Falle einer Organtransplantation, vor und sofort nach der Transplantation, wie auch bei Auftreten einer gastrointestinalen Störung, welche sonst die Absorbtion verschlechtern würde oder oral, ζ. B. im Form einer oralen Lösung.

Wie vorstehend beschrieben sind auch die Cyclosporine der Formel IHa neu. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Zwischenprodukte zeigen sie eine pharmakologische Wirkung und/oder Profil, insbesonder im Verhältnis zur immunosuppressiven Aktivität und insbesondere im Verhältnis zu ihrer Verwendung bei der Verhinderung der Transplantatabstoßung. Dies macht sie besonders interessant in Beziehung zu anderen Cyclosporinen wie sie spezifisch im Europäischen Patent Nr. 0056782 offenbart sind. Die pharmakologische Wirkung von Cyclosporinen der Formel IHa kann beispielsweise gezeigt werden in den oben beschriebenen Testmethoden 1.1,1.2,1.3,2 oder 3. Die Cyclosporine der Formel IMa sind in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung aktiv:

In Test 1.1 bei Konzentrationen von 0,01 bis10^g/ml;

in Test 1.2 bei Konzentrationen von 0,001 bis 10/ng/ml;

in Test 1.3 bei Konzentrationen von 0,001 bis 10jug/ml1

in Test 2 in Dosen von 10bis30mg/kg/Tag p.o.; und

in Test 3 in Dosen von 50 bis 100mg/kg/Tags.c.

In Anbetracht ihrer immunosuppressiven Wirkung sind Cyclosporine der^f ormel ill a nützlich zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten und Konditionen, die eine Reduktion der Immmunantwort fordern, z. B. zur Unterdrückung der Proliferation von Lymphozyten und Immunozyten, z. B. bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, z. B. in der Behandlung spezifischer Autoimmmunkrankheiten wie sie vorstehend aufgeführt wurden in Zusammenhang mit der Verwendung der erfindungsgemäßen Cyclosporine oder bei der Vorbeugung der Transplantatabstoßung, z. B. bei den vorstehend zitierten verschiedenen spezifischen Arten im Zusammenhang mit der Verwendung von den erfindungsgemäßen Cyclosporinen.

Im Hinblick auf ihre entzündungshemmende Wirkung sind Cyclosporine der Formel III a auch nützlich für die Behandlung von Entzündungszuständen, insbesondere von Entzündungszuständen mit einer Aetiologie umfassend oder einschließend eine Auto-Immunkomponente, z. B. für die Behandlung von Arthritis und rheumatischen Erkrankungen₍wie Polyarthritis chronica

progrediens.

Im Hinblick auf ihre antiparasitäre Wirkung sind Cyclosporine der Formel IHa auch nützlich als antiparasitäre Mittel, z. B. für die Behandlung parasitärer Infektionen verschiedener Typen, insbesondere wie vorstehend beschrieben im Zusammenhang mit der Verwendung von den erfindungsgemäßen Cyclosporinen.

Für die oben erwähnten Indikationen bewegt sich die tägliche Dosis im Bereich von etwa 75 bis etwa 5000 mg und bei Verwendung einer Einheitsdosis, z. B. für die orale Verabreichung, ist eine Dosis von etwa 25 bis etwa 2500mg Cyclosporin der Formel III a geeignet, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger.

Die Cyclosporine der Formel III a können auf irgend einem konventionellen Weg verabreicht werden, insbesondere in Übereinstimmung mit geläufigen Methoden bei der Verabreichung von Cylosporin, insbesondere durch intravenöse Infusion,

z. B. im Falle einer Organtransplantation, vor und sofort nach der Transplantation, wie auch bei Auftreten einer gastrointestonalen Störung, welche sonst die Absorbtion verschlechtern würde oder oral, ζ. B. in Form einer oralen Lösung.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins, worin der Amionsäurerest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-a-amino-säurerestist, gekennzeichnet dadurch,

a) daß man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 8 ein (D)-Hydroxy-a-aminosäurerest ist, acyliert, oder

b) daß man ein Cyclosporin, worin der Aminosäurerest in Stellung 1 -MeBmt- ist und der Rest in Stellung 8 ein (D)-Acyloxy-aaminosäurerest ist, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin der Rest in Stellung 1 -Dihydro-MeBmt-ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Cyclosporins der Formel I,

"X«Y-Sar-MeLeu-Z-Meleu-Ala-Q-MeLeu-MeLeu-VaI-123 456789 10 11

(D

X -MeBmt- oder -Dihydro-MeBmt- bedeutet,

Y -aAbu-,-AIa-,-Thr-,-VaI-oder-Nva-bedeutet,

Z -VaI- oder -Nva- bedeutet und

Q -einen Rest der Formel Il bedeutet.

R₁-CO-O-CH(S)

-HH-CH-CO-(D)

R₁ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet und R₂ für Wasserstoff oder Methyl steht, gekennzeichnet dadurch,

a) daß man ein Cyclosporin der Formel III,

IX-Y-Sai^MeLeu-Z-MeLeu-Ala-W-Meleü-MeLeu-MeYal · 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11

(ID (III)

X -MeBmt- oder -Dihydrö-MeBmt- bedeutet,

Y -aAbu-, -AIa-, -Thr-, -VaI- oder -Nva- bedeutet,

Z -VaI- oder -Nva- bedeutet und

W für einen Rest der Formel IV steht.

HO-CH

-HH-CH-CO-(D)

worin R₂ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

acyliert, indem man eine R_rCO-Gruppe, worin Ri Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Phenyl bedeutet, in ß-Stellung einführt, oder

b) daß man ein Cyclosporin der Formel I, worin X für -MeBmt- steht, reduziert, wobei man das entsprechende Cyclosporin erhält, worin X-Dihydro-MeBmt-bedeutet.