RO110144B1 - Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA - Google Patents

Abstract

Prezenta invenție se referă la noi rW-X-R-Y-Z-Q-AIa-(D)Ala-MeIeu-MeLeu-MeVah [1234567 8 9_______ 10 H [ RO 110144 B l ciclosporine, caracterizate prin formula: în care: W este MeBmt, dihidro-MeBmt; X este alfa-Abu,Val, Thr, NVa sau MeOThr; R este Sarx sau (D) - MeAla; Y este Me Leu, gama-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și Q este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu sau MeAla, cu condiția ca atunci când: - Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal sau MeLeu; - W este MeBmt, R este Sar si Y este gama hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val; și au activitate nonimunosupresivă, toxicitate mai mică decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică. Procedeul de semisinteză a acestor compuși implică utilizarea unei tulpini modificate, provenite de la Sebelda benihna-DSM 6182. In metoda de tratament și prevenire a SIDA, se administrează acești compuși, intravenos, în doză de 1 până la 2

Description

Ciclosporinele cuprind o clasă distinctivă structural, ciclică, poli-N-metilate undecapeptide, prelucrate în mod obișnuit din punct de vedere farmaceutic, în particular imunosupresive, cu activitate anti-inflamatorie 5 și/sau antiparazitică. Prima din ciclosporinele ce au fost izolate a fost metabolitul fungic apă2 rut natural al Ciclosporinei sau Ciclosporina, de asemenea cunoscută ca ciclosporină A și disponibilă comercial sub denumirea înregistrată de SANDIMMUN ^R sau SANDIMMUNE^R. Ciclosporina este o ciclosporină de formula A.

- MeBnrt-oCAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-AIMDlAla-MeLeu-MeLeu-MeVal — 1 2 3 4 5 fi 7 8 9 10 11 (A) în care MeBmt reprezintă restul N-metil-(4R)- 15 4-But-2E-en-1 -il-4-metil-(L)threonil deformula B

-N----CH-COI

CH, în care -x-y- este -CH=CH- (trans) 30

De la descoperirea inițială a ciclosporinei, o varietate largă de coclosporine apărute natural au fost izolate și identificate și multe alte ciclosporine nenaturale au fost preparate prin mijloace de sinteză totală sau 35 semisinteză sau prin aplicarea tehnicilor de cultură modificată. Clasa cuprinsă de ciclosporine este deci substanțială (consistentă) și include, de exemplu, ciclosporinele apărute natural, respectiv ciclosporinele de la A la Z 40 conform Traber și colaboratorii, 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber și colaboratorii, 2, Helv. Chim. Acta, 65, 16551667 (1982); Kobel și colaboratorii, Europ.

J.Applied Microbiology și Biotechnology, 14, 45 273-240 (1982); și von Wartburg și colaboratorii, Prograss in Allergy, 38, 28-45, (1986), cât și diferiți derivați ai ciclosporinei, derivați nenaturali și artificiali sau ciclosporine sintetice, incluzând dihidro-ciclosporinele (în 50 care partea -x-y- a restului MeBmt (formula B de mai sus) este saturat pentru a da -xy- = -CH₂ -CH₂-); ciclosporinele modificate (derivate) (de exemplu în care 3’ -0- din restul MeBmt este acilat sau în continuare substituent ce este introdus în moleculă la atomul de carbon alfa al restului sarcosyl la poziția 3); ciclosporinele în care restul MeBmt este prezent în forma izomerică (de exemplu în care configurația trans a pozițiilor 6’ și 7’ a restului MeBmt este mai degrabă cis decât trans); și ciclosporinele în care aminoacizii variați sunt încorporați la poziții specifice în cadrul secvenței peptidice, de exemplu utilizând metoda de sinteză totală în cadrul producerii de ciclosporine dezvoltată de R.Wenger, a se vedea Traber și colaboratorii, 1, Traber și colaboratorii, 2 și Kobel și colaboratorii, bibliografie citată mai sus; brevetele US 4108985, 4220641, 4288431, 4396542 și 4798823, European Patent Publication 34567 A, 56782 A, 300784 A, 300785 A și 414632 A; International Patent Publication WO 86/02080 și UK Patent Publication numerele 2206119 și 2207678; Wenger 1, Transpl. Proc., 15 Suppl. 1:2230 (1983);Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24 77 (1985) și Wenger 3, Progressin Chemistry of Organic Natural Products (Progrese în chimia produșilor naturali organici) 50, 123 (1986).

Clasa cuprinzând ciclosporinele este deci foarte largă în adevăratul sens al cuvântului și cuprinde, de exemplu, /Thr/²-, /Val/²-,/Nva/²-/Nva/⁵-Ciclosporine (de asemenea cunoscute ca și ciclosporine C, D, G și

M), /S-O-acetil-MeBmt/’-Ciclosporina (de asemenea cunoscută ca și ciclosporină A acetat), /dihidro-MeBmt/*-/Val/²-Ciclosporina (de asemenea cunoscută ca și dihidro-ciclosporina D), /(D)Ser/⁸ -Ciclosporină, /Melle/¹¹ -ciclosporina, /(D)MeVal/¹¹ -Ciclosporină (de asemenea cunoscută ca și ciclosporină H), /MeAla/⁶-Ciclosporina, /(D)Pro/³ -Ciclosporină și altele.

în concordanță cu nomenclatura convențională pentru ciclosporine, acestea sunt definite pe parcursul prezentei descrieri și revendicări prin structura ciclosporinei (de exemplu ciclosporină A). Aceasta se face prin indicarea mai întâi a resturilor moleculei ce diferă de cele prezente în ciclosporină și apoi aplicarea termenului Ciclosporină pentru a caracteriza restul rămas care poate fi identic celui (celor) prezent în ciclosporină. în același timp prefixul dihidro este utilizat pentru a desemna ciclosporinele în care restul MeBmt este hidrogenat (dihidro-MeBmt), de exemplu în care restul MeBmt este hidrogenat (dihidroMeBmt), de exemplu în care -x-y- în formula B este -CH₂ -CH₂ Astfel /Thr/² -Ciclosporina este ciclosporină ce are secvența prezentă în formula A, dar în care α/fa-Abu din poziția 2 este înlocuită cu Thr, și /dihidroMeBmt/¹ -/Val/² Ciclosporină este ciclosporina ce are secvența prezentată în formula A, dar în care restul MeBmt din poziția 1 este hidrogenat și alfa Abu din poziția 2 este înlocuit cu Val.

Suplimentar, resturile de amino acid prescurtate, de exemplu Ala, MeVal, a//aAbu, etc. sunt în concordanță cu practica obișnuită, înțelegând că au configurația (L) afară de cazul că se indică altfel, de exemplu ca și în cazul (D)Ala. Abrevierea restului (radicalului) precedată de Me ca și în cazul MeLeu, reprezintă resturi a//ă-N-metilate. Resturile individuale ale moleculei ciclosporinei sunt numerotate ca în literatura de specialitate, în direcția mersului ceasului și pornind de la restul MeBmt sau dihidro MeBmt în poziția 1. Aceeași secvență numerică este aplicată pe tot parcursul prezentei descrieri cât și al revendicărilor.

în prezent, este bine stabilit că Ciclosporină acționează prin interferarea cu procesul activării celulelor T, prin blocarea inițiării transcrierii lui IL-2, cu toate că mecanismul precis nu a fost încă elucidat. Cefalosporina a prezentat formarea unui complex cu proteina citosolică 17kD (ciclofilina) care apare în multe tipuri de celule și s-a dovedit a fi identică cu peptidil-prolil cis-irans-izomeraza, și care este o enzimă cuprinsă în proteina de înjumătățire. Până în prezent, totuși, nu s-a clarificat dacă legarea la ciclofilină este direct corelată cu activitatea imunosupresivă din ciclosporine, sau întradevăr dacă legarea ciclofilinei este ea însăși suficient criteriu pentru activitatea imunosupresivă.

S-a descoperit că există ciclosporine care se leagă puternic de ciclofilină, dar nu sunt toate imunosupresive. Din acest motiv rezultă că legarea la ciclofilină este un orificiu necesar, dar nu și suficient pentru activitatea imunosupresivă.

Prezenta invenție asigură ciclosporine care sunt active față de replicarea HIV-1.

Virusul imunodeficienței umane (HIV) infectează preferențial limfocitele T₄/(helperajutătoare) identificate printr-un marker de suprafață T₄ (OKTA₄ recunoscute de anticorpii monoclonali OKTA₄), de unde denumirea de celule T₄/ deși se replică în diferite alte tipuri de celule, în special cele din seria monocitică. Se produce încet o boală progresivă a sistemului imunitar caracterizată prin o distrugere treptată a celulei T₄, boală denumită AIDS sau SIDA. Alte anormalități imunologice ale AIDS îl formează creșterea limfocitelor (Tg) citotoxic/supresoare, un defect în procesul prezentare antigen/recunoaștere și activarea policlonală a celulelor B. Mecanismul distrugerii celulelor T₄ este încă necunoscut până în prezent. Relativ puține celule T₄ par a fi infectate, astfel, un efect citopatic direct cauzat de un virus poate să nu fie singura cauză (motiv) de epuizare a celulelor T₄. S-a făcut ipoteza că distrugerea celulelor T₄ poate fi amplificată prin procesul autoimun declanșat de producerea HIV sau celulelor T₄ acoperite cu proteină HIV. Această stimulare antigenică continuă poate conduce la o situație de permanentă activitate a celulelor T₄ care va mări replicarea HlV-ului în acele celule și va mări clonii T-citotoxici. Celulele T₄ rămase neinfectate pot fi făcute antifenice prin legarea exogenului viral gp 120 la moleculele lui CD4 și astfel ar fi direcțiuni spre un răspuns Tcitotoxic.

Brevetul US 4814323 prezintă faptul că Ciclosporina are activitate față de AIDS, și că în general ciclosporinele cunoscute ca imunosupresori pot fi utili în această indicație. Nu se fac sugestii asupra faptului că ciclosporinele neimunosupresive pot avea o astfel de proprietate.

Surprinzător, s-a descoperit că ciclosporinele care leagă ciclophilina, dar nu sunt imunosupresive, prezintă un efect inhibitor asupra replicării lui HIV-1.

O ciclosporină este considerată ca fiind cea care se leagă Ia ciclofilină recombinant umană pe cel puțin o cincime, la fel de bine cum o face Ciclosporina în testul competitiv ELISA descris de Quesniaux în EurJ.Imunol., 1987, 17 1359-1365. în acest test, ciclosporina ce urmează a fi testată este adăugată pe parcursul incubării ciclofilinei cu Ciclosporină BSA acoperită și concentrație cerută pentru a da inhibare 50% a reacției de control ce este calculată fără competitor (ICjo). Rezultatele sunt exprimate ca viteză de legare (BR), care este logaritmul în baza 10 a raportului dintre IC» a compusului de testat și IC» într-un test simultan al însăși ciclosporinei. Astfel BR de 0,1 indică că, compusul de testat leagă ciclophilina cu un factor de zece ori mai slab decât o face ciclosporina, și valoarea negativă indică legare mai puternică decât cea a ciclosporinei.

Ciclosporinele active față de HIV au un BR mai mic de 0,7, deoarece log₁₀ 5-0,7 (aprox), preferabil egal cu sau mai mic de zero.

O ciclosporină este considerată ca fiind neimunosupresivă când are o activitate în reacția Mixtă (MLR) nu mai mult de 5%, preferabil nu mai mult de 2%, decât Ciclosporina. Reacția Limfocită mixtă este descrisă de T.Meo în Imunological Metods (Metode imunologice), L.Lefkovits și B.Peris, Eds. Academic Press, N.Y. paginile 227239,6(1979). Celulele de splină (0,5 x IO⁶) recoltate de la șoareci Balb/c (femele, 8-10 săptămâni) sunt co-incubate timp de cinci zile cu celule de splină 0,5 x IO⁶ iradiate (2000 radzi) sau tratate cu mitomicină C recoltate de la șoareci CBA (femelă, 8-10 săptămâni).

Celulele alogenice iradiate induc un răspuns proliferiativ în celulele de splină Balb/c care poate fi măsurat prin incorporarea unui precursor marcat în DNA. Cum celulele stimulator sunt iradiate (sau tratate cu mitocină C) ele nu pot răspunde la celulele Balb/c cu proliferare, dar își rețin antigenicitatea. IC» găsit pentru compusul de testat în MLR este comparat cu cel găsit pentru Ciclosporină în experimentul paralel.

Activitatea ciclosporinelor ca inhibitori ai replicării HIV-1 poate fi demonstrată în următoarele sisteme de testare:

1. Inhibarea efectului citopatic HIV-1 indus în celulele Mt4

Procedeul studiului descris de către Pauwels și colaboratorii, J. Virol. Meth., 20/309 (1988), se utilizează cu modificări minore. Linia T4-celulară HTLV-Itransformată, MT4, care a fost anterior arătată ca fiind puternic permisivă infecției HIV, este utilizată ca celulă țintă. Inhibarea HIV-1, efectul citopatic indus tulpinii HTLV-ΠΙΒ se determină prin măsurarea viabilității atât a celulelor HIV infectate cât și a celulelor simulate infectate. Viabilitatea este stabilită spectroforometric via in situ reducerea lui 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazoliumbromură (MTT). Culturi virua-infectate și neinfectate fără compus sunt incluse ca și control, cum sunt incluse și celule neinfectate tratate cu compus. Concentrația celulară este aleasă astfel, încât numărul celulelor per milimetru să fie crescută cu un factor de 10 pe parcursul a patru zile de incubare, în culturile simulat infectate. Inoculul de virus este ajustat astfel, încât să producă moartea celulei în 90% din celulele țintă după patru zile de incubare. Virusul este absorbit în suspensie de 10 ori mai concentrată de celule la 37’C, după o oră. Apoi celulele infectate sunt diluate 1:10 și adăugate pe plăci de microtitrare conținând compusul de testat.

2. Citotoxicitatea

Suspensii de celule Jukart și U 937 sunt ajustate la 1 x IO⁵ celule/ml și incubate în prezența a diferite concentrații de compus de testat. După 48 h cantitățile de celule per milimetru sunt comparate prin colorare (tratare) cu MIT. Citotoxicitatea în celulele MT4 poate fi măsurată în același mod.

3. Inhibarea replicării HIV-1 în celulele Jurkat și U 937

Linia Jurkat celulară T4 și linia celulară monocitară U 937 se infectează prin suspendarea celulelor de zece ori mai concentrate în soluție de virus. Adsorbția se permite timp de 2 h la 37 ‘C. Celulele sunt centrifugate, inoculul este îndepărtat și celulele sunt resuspendate la concentrația lor originală în mediu de cultură proaspăt conținând compusul de testat. Astfel, substanța este adăugată după adsorbție. La zilele 2, 5, 8, 12, 15 și 19 de după infectare, cote părți (alicote) de culturi infectate sunt recoltate. Celulele sunt centrifugate și supematantul colectat. Concentrația antigenului viral p24 este determinată în supematanți prin ajutorul unei truse comerciale ELISA și servesc ca parametru pentru producerea de virus. După fiecare îndepărtare a cotelor părți, celulele sunt numărate și ajustate la 2 x IO⁵ celule/milimetru prin adăugarea de mediu proaspăt conținând compusul de test la o concentrație particulară.

Ciclosporinele, conform invenției, se caracterizează prin aceea că au formula generală I:

rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-(D)Ala-MeIea-MeLeu-MeVah I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ¹¹ | în care:

W este MeBmt, dihidro-Me Bmt;

X este a//â-Abu, Val, Thr, Nva sau MeOThr;

R este Sar sau (D) - MeAla;

Y este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal,MeThr, MeAla, Mealle sau

MeaThr;

Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și

Q este MeLeu, gazna-hidroxi-MeLeu sau MeAla, cu condiția ca atunci când:

- Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal sau MeLeu;

- W este MeBmt, R este Sar și Y este gama-hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val; și cu activitate monimunosupresivă, toxicitate mai mică decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică.

Procedeul de semisinteză a ciclosporinelor de mai sus, conform invenției, având una sau mai multe resturi de gamahidroxi MeLeu, prin biotransformarea ciclosporinei, utilizând microorganisme, cuprinde o fază de cultură a unei tulpini modificate provenite de la Sebekia benihanaDSM 6182 într-un mediu nutritiv, adăugarea unei ciclosporine care are una sau mai multe resturi MeLeu și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și purificarea acestuia pe coloană cromatografică, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă, amorfă.

Metoda de tratament și prevenire a SIDA și a bolilor derivate din SIDA, conform invenției, constă în aceea că, compuși aonimunosupresivi activi tip ciclofilinliganzi dintre ciclosporinele de mai sus, pot fi administrați prin căi convenționale pentru a face reversă deplația celulelor în asociație cu SIDA, a induce regresia bolilor derivate din SIDA și a reduce posibilitatea unor noi infestări, într-un dozaj zilnic de 1 până la 20 mg/kg, pentru administrare intravenoasă și 1 până la 50 mg/kg pentru administrare orală.

Compușii activi sunt indicați atât pentru prevenirea AIDS, la pacienții asimtotic HIV-pozitivi cât și în tratamentul pacienților suferind de AIDS. La pacienții la care AIDS a apărut, administrarea compușilor activi ar face reversă deplația celulei T4 asociată cu AIDS, ar induce regresia AIDS legată de boli, cum ar fi sarcomul lui Kaposi, și ar reduce în oarecare măsură noile infecții posibile de a apărea.

Astfel, prezenta invenție asigură un procedeu pentru tratamentul și prevenirea sindromului de imunodeficiență dobândit și alte maladii induse de virusul HIV-1 la pacientul infectat cu numitul virus, cuprinzând administrarea la numitul pacient a unei cantități efective de compus activ, conform prezentei invenții.

Din cadrul compușilor conform prezentei invenții, de exemplu neimunosupresivi, ciclofilină-legând ciclosporine active față de HIV-1 (compuși activi), unii sunt noi și alții sunt cunoscuți; totuși activitatea anti HIV a compușilor activi cunoscuți nu a fost prezentată anterior, și în multe cazuri compușii activi cunoscuți nu au fost prezentați ca având vreo activitate farmaceutică în nici o direcție.

S-a descoperit că mulți compuși activi au structuri diferite de cea a Ciclosporinei, în special la pozițiile 4 și/sau 5.

Un grup al compușilor activi îl formează ciclosporinele în care gruparea MeLeu la poziția 4 este înlocuită cu un aminoacid N-metilat diferit, de exemplu gamahidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr sau MeAla. Suplimentar față de formele Melle și Methr, formele allo Mealle și MeaThr pot fi folosite, de asemenea. în forma allo, stereochimia la poziția beta prezintă configurația opusă celei din aminoacidul natural, astfel încât forma normală și forma allo constituie o pereche de diastereoizomeri.

Un alt grup de compuși activi îl constituie cel în care Val la poziția 5 este înlocuit cu zz-alchil-, preferabil nmetil- aminoacid. Preferabil amino-acidul care este zj-alchilat este Val sau Leu. Preferabil hidrogenul grupării amino din /Val/⁵ , este înlocuit cu o grupare alchil C,^ neramificat, preferabil metil, etil sau π-propil, în mod particular metil. Ultima grupă a compușilor activi este o grupare complet nouă.

Suplimentar sau alternativ, anumiți compuși activi pot fi diferiți de Cefalosporină la pozițiile 1, 2, 3 și/sau 6. O grupă preferată de compuși activi este constituită de compuși de formula I:

_rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-(D)Ala-Meleu-MeLeu-MeVaIi I 1 2 3 4 S 6 7 8 9_10 11 [ în care W este MeBmt, dihidro MeBmt sau 8’ - hidroxi-MeBmt;

X este aZ/aAbu, Val, Thr, Na sau Ometil threonină (MeOThr);

R este Sar sau (D) - MeAla;

Y este MeLeu, gazzw-hidroxi-MeLeu,

Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr;

Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu; și Q este MeLeu, gama -hidroxi-MeLeu sau MeAla.

cu condiția ca atunci când Y este MeLeu atunci fie Z este MeVal sau MeLeu, fie W este 8’ -hidroxi-MeBmt.

Grupurile W, X, Y, Z, Q și R au, independent, următoarele semnificații preferate:

W este preferabil W’ unde W’ este MeBmt sau dihidro-MeBmt;

X este preferabil X’ unde X’ este αΖ/âAbu sau Nva, mai preferabil X” unde

X” este aZ/aAbu;

R este preferabil R’ unde R’ este Sar;

Y este preferabil Y’ unde Y’ este gazzia-hidroxi-MeLeu,¹ MeVal, MeThr sau

Mells;

Z este preferabil Z’ unde Z’ este Val sau MeVal; și

Q este preferabil Q’ unde Q’ este

MeLeu.

Un grup preferat în mod special de compuși activi este cel al compușilor de formula I în care W este W’, X este X’, Y este Y’, Z este Z’, Q este Q’ și R este R’.

Compușii preferați, în mod particular, de formula I sunt compușii:

a) /dihidro-MeBmt/¹ -/gazzza-hidroxiMeLeu/⁴ -Ciclosporină;

b) /MeVal/⁴ -Ciclosporină;

c) /Melle/⁴ -Ciclosporină;

d) /MeThr/⁴ -Ciclosporină;

e) /gazzia-hidroxi-MeLeu/⁴ -Ciclosporină;

fj/Nva/² -/gazzia-hidroxi-MeLeu/⁴ -Ciclosporină;

g) /gazzia-hidroxi-MeLeu/⁴ -Îgama-hidroxi-MeLeu/⁶ -Ciclosporină;

h) /MeVal/⁵ -Ciclosporină;

i) /MeOThr/² -/(D)MeAla/³ /MeVal/⁵ -Ciclosporină;

j) /S’-hidroxi-MeBmt/¹ -Ciclosporină.

Suplimentar, unii compuși nu în cadrul celor de formula I sunt compuși activi, de exemplu:

k) /MeAla/⁶ -Ciclosporină și

l) /gazzia-hidroxi-MeLeu/⁹ -Ciclosporină.

Invenția asigură, de asemenea, noi compuși activi, care sunt compuși conform formulei Π :

t-W-X-R-Y· Z -MeLeu-Ala-IHAIa-MeLeu-MeLeu-WeVai -i

2 3 4 S t T 8 3 10 11 [ gg unde W’, X, R, Y și Z sunt asemenea celor definiți anterior, cu condiția că: 1) când este

MeLeu sau MeAla, atunci Z este MeVal sau

MeLeu și 2) când W’ este MeBmt, R este Sar,

Producerea tulpinii

Compusul c) este obținut prin fermentarea tulpiniii fungice Tolypocladium inflatum Cy E 4556, depozitată în Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, conform prevederilor tratatului de la Budapesta din 24 iulie 1991, sub numărul de acces DSM 6627. Această tulpină este un mutant al tulpinii NRRL 8044 și speciei Tolypocladium inflatum gama, și este taxonomic identică cu o tulpină similară, care a fost complet descrisă, de exemplu în brevetul GB 1491509.

1. Cultura de pornire pe agar: Plăci conținând tulpini de DSM 6627 sunt incubate o perioadă de 14 zile, la temperatura de 27’C pe următorul mediu de agar:

Extract de drojdie (Gistex) 4 g;

Extract de malț (Wander) 20 g;

Agar 20 g;

Apă demineralizată până la 1000 ml.

Mediul are unpH de 5,4.. .5,6 și a fost sterilizat timp de 20 min, la temperatura de 120’C.

2. Precultura: Spori de la miceliul din culturile de pornire se suspendă în 40 ml de soluție salină 0,9 %. O serie de baloane Erlenmeyer fiecare conținând câte 100 ml de mediu de precultură sunt inoculate cu câte 20 ml de suspensie de acest tip. Compoziția preculturii (mediului de precultură) este următoarea:

Caseină (Amber EHC) 25 g;

Maltoză 75 g;

KH₂PO₄ 1 g;

KC1 2,5 g;

Apă demineralizată până la 1000 ml.

Mediul este adus lapHz5,2 ... 5,5 cu acid clorhidric, apoi sterilizat pe perioadă de 20 min la 120‘C. Preculturile sunt fermentate timp de 24 h la 27’C, într-un agitator rotativ cu 200 rot/min^cu o exectricitate de 50 mm.

3. Cultura intermediară'. într-un fermentator de oțel, de capacitate 25 1 conținând 20 1 de mediu de precultură, se inoculează 200 ml de precultură. Cultura intermediară este fermentată pe parcursul a 5 zile la 27’C, cu o viteză de rotație de 150 rot/min și un debit de curgere al aerului de 0,5 pe minut, per litru de medium, la presiunea de 0,5 bari.

4. Mediul de cultură principal: 100 1 de mediu de precultură se inoculează cu 10 1 de cultură intermediară și se fermentează întrun fermentator de oțel de capacitate de 120 1. La acest mediu se adaugă 4 g/1 D-Threonină, sterilizată prin filtrare. Fermentația se efectuează la 27’C, timp de 14 zile, cu viteza de agitare de 70 rot/min și un debit de curgere a aerului de 0,4 1/min per litru de mediu, la presiunea de 0,5 bari, în primele 5 zile, apoi viteza de agitare fiind crescută la 100 rot/min și debitul de aer la 0,5 1/min pentru restul perioadei de fermentație rămase.

Izolarea'. Miceliul este separat din mediul de cultură și extras în aparat Turrax prin măcinare și agitare de 3 ori cu câte 10 1 de amestec prin filtrare prin sucțiune și filtratele combinate sunt concentrate prin evaporare la vacuum la o temperatură de 40’C, până ce vaporii ce se degajă consistă numai din vapori de apă. Amestecul obținut este extras de patru ori, utilizând câte 2 1 de

1,2-dicloretan la fiecare extracție și soluțiile cu

1,2-dicloretan combinate se concentrează prin evaporare la vacuum la temperatura de 40’C.

Reziduul este supus cromatografiei pe coloană cromatografică (10 kg silicagel, granule de dimensiunea 0,02 ... 0,045 mm, Grace) utilizând amestec de acetat de etil/apă ca eluent (fracțiuni de 2,5 1). Fracțiunile 20 -23, conținând /Melle/⁴-Ciclosporină sunt extrase și separate în continuare pe coloană cromatografică cu silicagel (600 gr de silicagel, granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm, Merck), utilizând cloroform/metanol (98:2 voi) ca eluent (frecțiuni de 300 ml). în continuare, purificarea este atinsă prin cromatografie pe coloană cu silicagel (400 g silicagel, granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm, Merck) utilizând clorură de metilen/metanol (98:2 voi) ca eluent (fracțiuni de 200 ml) obținând /Melle/⁴ -Ciclosporină ca pulbere amorfă de culoare albă: punctul de topire 155 ... 158’C; lalfal_D™ = -235 (c=0,68 în CHC1₃) și -198 (c=0,74 în CH₃OH).

Spectrul IR în CH₂CL2 este prezentat în fig.l, și protonul din spectrul RMN în

CDC1₃ este prezentat în fig. 2.

și Y este gama-hidroxi-MeLeu, apoi Z este altul decât Val.

Un grup preferat de noi compuși activi constă din compușii de formula II în care X este X”, Y este Y’ și Z este Z’, cu condiția ca atunci când W’ este MeBmt, Y’ este altul decât gama-hidroxi-MeLeu.

Compușii activi noi preferați sunt compușii a), b), c), d), f) și h) de mai sus. Unii din acești compuși, de exemplu compușii b) și c), au fost găsiți că blochează activitatea imunosupresivă a Cefalosporinei prin blocarea liganzilor ei cu o ciclofilina, și astfel acționează cu antagoniști ciclosporinici.

Compușii activi pot fi obținuți în diferite moduri, care pot fi clasificate după cum ar fi:

1) Fermentare.

2) Biotransformare.

3) Derivatizare.

4) Sinteză parțială.

5) Sinteză totală.

1) Unii compuși activi sunt produși ca produse secundare ale fermentației tulpinilor originale sau modificate ale organismului producător de Ciclosporină, cum ar fi Tolypocladium inflatum gama, așa cum este exemplificat pentru producerea compusului c), descris în exemplul 1 de mai jos.

2) Alți compuși activi, inclusiv compușii cunoscuți j) și 1) sunt metaboliți ai Cefalosporinei, și pot fi izolați prin metode cromatografice din urina umană sau animală, dozați ca Ciclosporină. Mai mult, aceste și alte transformări metabolice sunt posibile utilizând microorganisme, de exemplu producerea conpușilor e) și g) prin biotransformarea ciclosporinei A, cum se descrie în exemplele 2 și 3, sau a compusului f) prin biotransformarea ciclosporinei G (exemplul 4). Aceste exemple demonstrează noul procedeu pentru prepararea ciclosporinelor, având unul sau mai multe resturi gawa-hidroxi-MeLeu, cuprinzând etapele de cultivare a noii tulpini modificate de Sebekia benihana, adăugând o ciclosporină având unul sau mai multe resturi MeLeu, și izolarea produsului din bulionul de fermentare.

3) Prin derivatizare se înțelege că ciclosporinele naturale sau sintetice pot fi transformate în compuși activi, prin una sau mai multe reacții chimice în care unul sau mai mulți amino-acizi sunt modificați fără deschiderea și reformarea legăturilor peptidice. De exemplu, clasa compușilor activi în care Val la poziția 5 este n-alchilată pot fi obținute prin reacționarea corespunzătoarei ciclosporine având Val în poziția 5 cu butillitiu, urmată de reacția cu un agent de alchilare, cum este exemplificat în cadrul compusului h) din exemplul 5 și pentru compusul i) din exemplul

6.

Ca alte exemple, compusul a) poate fi preparat prin hidrogenarea compusului e) (Exemplul 7), și compusul j), care este, de asemenea, un metabolit al ciclosporinei, poate fi preparat din compusul cunoscut ciclosporinacetat, conform descrierii din exemplul 8.

4) Termenul sinteză parțială, așa cum este utilizat, se referă la o serie de reacții chimice în care inelul ciclosporinei naturale este deschis, unul sau mai mulți amino-acizi sunt îndepărtați, diferiți aminoacizi sunt adăugați, și inelul este închis din nou.

5) Sinteza totală a ciclosporinelor poate fi efectuată prin construirea unei undecapeptide liniare și ciclizarea ei, așa cum se descrie de către Wenger (10c.cit), a se vedea de asemenea brevetele US 4396542 și 4798823. în principiu, orice ciclosporină poate fi preparată prin sinteza totală, deși acolo unde există o altă metodă disponibilă, aceasta poate fi mai convenabilă decât sinteza totală. Sinteza totală poate fi utilizată pentru prepararea compusului d) (Exemplul 9), și pentru compusul metabolit cunoscut 1).

Compusul k) este o substanță cunoscută ale cărei proprietăți au fost descrise de Quesniaux și colaboratorii (Mol. Immunol., 24 1159 1987) și care poate fi, de asemenea, preparat prin sinteză totală. De exemplu, o sinteză totală a acestui compus este descrisaă în brevetul US 4914188.

Se dau, în continuare, 12 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1...3, care reprezintă:

- fig. 1, spectrul IR în CHjCL, a Melle-Ciclosporina;

- fig. 2, protonul din spectrul NMR în

CDC1₃;

- fig. 3, spectrul NMR în CDC1₃ a MeVal-Ciclosporina.

Exemplul 1. /Mellefl -Ciclosporină (Compusul c)

Exemplul 2. /gama-hidroxiMeLeufi -Ciclosporină (compusul e)

Compusul e) este obținut din biotransformarea ciclosporinei de către microrganismul Sebekîa benihana. Tulpina originală utilizată este condiționată NRLL lllll și aparține speciilor Sebekîa benihana (Dietz și Li; Sebekîa, un gen nou al familiei Actinoplanaceae. Abstr 82nd. ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 163, Atlanta, 1982). Această tulpină este capabilă să hidrocileze novobiocina. Tulpina subcultivată utilizată pentru prepararea compusului e) și compușii înrudiți a fost, depozitată în German Collection of Microorganisms (D-3300 Braunschweig) sub numărul DSM 6182.

1. Cultura de pornire pe agar; Lame cu culturi de tulpină DSM 6182 sunt crescute pe termen de 10 zile, la 27’C, pe următorul mediu de agar:

Glucoză 10 g;

Amidon (solubil) 20 g;

Extract de drojdie (Gistex) 5 g;

Peptonă (N-Z-Amină tip A, Sheffield) 5 g;

CaCO₃ 1 g;

Agar (Bacto) 18 g;

Apă demineralizată la 1 litru;

pH. neutralizat la 7 cu NaOH/H2SO₄; Sterilizare: 120’C/20min.

2. Precultura; Spori și miceliu de cultură de pornire sunt suspendați în 10 ml de soluție salină 0,9 %. O serie de baloane Erlemnayer, de capacitate 200 ml, fiecare conținând câte 50 ml mediu de precultură, se inoculează fiecare cu câte 5 ml suspensie de acest gen. Compoziția mediului de precultură este următorul:

Glucoză 7 g;

Amidon (solubil) 10 g;

Extract de drojdie (Gistex) 4,5 g;

Extract de malț (lichid, Wander) 10 g;

Peptonă (N-Z-Amină tip A, Sheffield) 2,5g; Carbonat de calciu 1 g;

Soluție marcată nr. 235 1 ml;

Apă demineralizată la 1 litru;

pH neutralizat la 7 cu NaOH/H2SO₄; Sterilizare: 120’C/20min.

Soluția marcată nr. 235

Acid boric 0,lg;

FeSO₄.7H₂O 5 g;

KI 0,05 g;

CoC1.6H₂O 2 g;

CuSO₄.5H₂O 0,2 g;

MnCl₂.4H₂O 2 g;

ZnSO₄.7H₂O 4 g;

Apă demineralizată până la 999 ml și H₂SO₄ (97%) 1 ml.

Preculturile sunt fermentate timp de 4 zile, la 27’C, pe un agitator rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm.

3. Cultura intermediară; O serie de baloane Erlenmeyer, de capacitate 200 ml, conținând fiecare 50 ml de mediu de precultură, sunt inoculate fiecare cu câte 5 ml de precultură. Cultura intermediară este fermentată timp de 3 zile, la 27’C, pe agitatorul rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm.

4. Cultura principală: O serie de baloane Erlenmeyer, de capacitate 500 ml, conținând fiecare 50 ml de mediu principal (total 12 1), sunt inoculate fiecare cu câte 5 ml de cultură intermediară. Aceste culturi sunt fermentate timp de 3 zile, la 27’C, pe agitatorul rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm. După 24 h-, ciclosporină A (7,5 mg) solubilizată în metanol este adăugată la fiecare mediu de cultură (= 150 mg/litru).

Compoziția mediului de cultură este după cum urmează:

Celuloză 10 g;

Dextrină 10 g;

Amidon (solubil) 10 g;

Extract de drojdie (Gistex) 2,5 g;

Făină de soia (Nurupan, Edesoya) 12,5 g;

K₂HPO₄ 0,25 g;

KH₂PO₄ 0,12 g;

MgSO₄.7H₂O 0,10 g;

CaCI₂.6H₂O 0,05 g;

Urme de element de soluție AC-1 1 ml;

Apă demineralizată până la 1 litru; pH: ajustat la 7,2-7,5 (KOH/H₂SO₄); Sterilizare: 120*C/20 min.

Soluția cu urme de elemenet AC-1:

Această soluție are aceeași compoziție ca și soluția nr. 235 cu adăugarea în plus a (NH₄)

6Mo7024 în cantitate de 0,2 g.

5. Izolarea; Miceliul este separat din mediul de cultură și cultura rezultată este filtrată (13 1) și este extrasă de trei ori cu 1,2diclormetan, utilizând câte 1,5 1 la fiecare extracție. Soluții cu 1,2-dicloretan combinate se evaporă la vacuum, la temperatura de 40*C. Reziduul brut este supus filtrării pe gel Sephadex LH-20, utilizând ca eluent metanolul. Aceste fracții ce conțin compușii ciclosporinici (525 mg) sunt extrași și cromatografiate pe silicagel (50 g, dimensiunea granulelor 0,04 - 0,063 mm, Merck), utilizând ca eluent amestec cloroform/metanol. Cromatografierea repetată, utilizând același sistem, duce la compusul pur/go/nn-hidroxiMeLeu/⁴ -Ciclosporină sub forma unei pulberi amorfe de culoare albă, cu punctul de topire de 150- 153*C, lalfal^ =-225*C (c=0,53 în cloroform), și -171*C (c=0,44 în metanol).

Exemplul 3. /gama-hidroxiMeLeufi -/gama-hidroxi-MeLeuJ⁶ -Ciclosporină (compusul g)

Fracțiunile cele mai polare rezultate din purificarea (go/na-hidroxi-MeLeu)⁴Ciclosporinei sunt, în continuare, separate prin cromatografieri repetate pe silicagel (granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm), utilizând acetona cu hexanul în proporție de 2:1 ca eluent, urmată de cromatografierea pe silicagel, utilizând ca eluent amestecul de tbutil eter/metanol/apă în proporția de 90:9:1. Primele fracțiuni conțin /gozna-hidroxiLeu/⁴ -Ciclosporină care este în continuare purificată prin decolare cu cărbune activ, obținându-se compusul pur sub forma unei pulberi amorfe albe, cu punctul de topire de 162„.164*C. lalfalj® =-211*C (c=0,50 în CHClj), -157'C (c=0,52 în CH₃OH).

Fracțiunile din urmă de la cromatografierea pe silicagel de mai sus conțin /gnma-hidroxi-MeLeu/⁴ -/gama-hidroxiMeLeu/⁶ -Ciclosporină și sunt în continuare purificate prin decolorare cu cărbune activ, obținându-se compusul din titlu pur sub forma de pulbere amorfă albă, cu punctul de topire de 157...160*C. lalfal^ =-217*C (c=0,54în CHC1₃), -176*C (c=0,42 în CH₃OH).

Exemplul 4. /Nva/² - /gama-hidroxiMeLeufi -Ciclosporină (compusul f)

Acest compus se prepară prin procedeul analog celui de la prepararea compusului e) (/gama-hidroxi-MeLeu/⁴

-Ciclosporină), dar utilizând ciclosporină G (/Nva/² -Ciclosporină) ca material de plecare. După purificare repetată pe coloană cu silicagel, utilizând pentru eluare acetat de etil saturat cu apă și amestec de acetonă/hexan în proporție de 2:1, se obține compusul din titlu ca pulbere amorfă albă, cu punctul de topire de 138...141-C. lalfal^ =-213*C (c=0,69în CHC1₃), -168*C (c=0,70 în CH₃OH).

Exemplul 5. /M.eValf' -Ciclosporină (compusul h)

Ciclosporină A (0,60 g = 0,5 mmoli) dizolvată în tetrahidrofuran (20 ml) este incubată cu 0,63 ml de soluție 1,6 M butillitiu (1,0 mmol) în hexan. Soluția rezultată este supusă reacției cu dimetil-sulfat (0,1 ml; 1,5 mmoli) la 78’C. Amestecul de reacție se încălzește ușor la temperatura camerei și se agită peste noapte.

Izolarea prin cromatografiere (SiO₂, 5% metanol/eter), urmtă de cromatografierea KPLC (fază reversă) dă compusul din titlu. Compusul este caracterizat prin spectrul ^lN RMN 300 MHz în CDC1₃ care este prezentat în fig. 3.

Exemplul 6. /MeOTTuf -/(D)MeAlaf /MeValf -Ciclosporină (Compusul i)

Un amestec de 480 ml tetrahidrofuran (absolut) și 6,96 g (49,2 mmoli) diizopropilamină se răcește la -80* C, și i se adaugă

33,5 ml de soluție 1,33 M de butillitiu în hexan ( =44,5 mmoli), încet cu ajutorul unei seringi. Amestecul este agitat timp de 30 min la-80*C, apoi soluției i se adaugă 8 g (6,6 mmoli) ciclosporină C (/Thr/² -Ciclosporină) în 120 ml tetrahidrofuran (absolut), cu o seringă, pe parcursul a 2...3 min. Soluția clară este agitată încă o oră, la -80’C, apoi i se adaugă, încet, 2,06 ml iodură de metil.

Amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei pe parcursul a două ore, apoi i se adaugă 40 ml apă și solvenții sunt evaporați pe un evaporator rotativ la 30’C și presiunea 15 mm Hg. Reziduul, este proporționat între apă și eter, și stratul eteric este spălat de patru ori cu saramură semisaturată, uscat pe sulfat de magneziu și evaporat, pentru a se obține un reziduu de 8,1 g·

Reziduul este cromatografiat pe 1200 g Kieselgel, cu acetat de etil saturat cu apă, obținându-se un produs care este cromato110144 gr aflat în continuare pe 200 g Kieselgel, cu 5% metanol/CH₂Cl₂, obținându-se compusul pur din titlu, lalfalg⁰ = -195*C (c=l,0 în CHC1₃).

FxvmpXuM Jdihidro-MeBmt)¹ -Igamahidroxi-MeLeu/¹ -Ciclosporină, (compusul a)

La o suspensie de 200 mg prehidrogenat 10% paladiu/cărbune în 4 ml etanol se adaugă 1,2 gr de /gam-hidroxiMeLeu/⁴ -Ciclosporină (compusul e) în 10 ml etanol și se efectuează hidrogenarea la temperatura camerei, până ce nu se mai degajă hidrogen. După îndepărtarea catalizatorului prin filtrare, soluția este evaporată obținând compusul din titlu sub forma unei pulberi amorfe de culoare albă, cu punctul de topire de 154...156’C. lalfal»™ =-225*C (c=0,87 în CHClj), -169 C (c=0,70 în CH₃OH).

Exemplul 8. /8’-dihidroMeBmt)¹ -Coclosporină, (compusul j)

1. /O-acetil-Omega-bromo-MeBmt/¹ Ciclosporină: Un amestec de 25,0 g (20 mmoli) de /-acetil-MeBmt/¹ -Ciclosporină (Traber și colaboratorii, Helv. Chim. Acta, 1982, 65, 1653), 4,4 g (25 mmoli) de Nbromo-succinimidă și 400 mg de azbosisobutironitril în 250 ml de tetraclorură de carbon se încălzesc la reflux timp de 2,5 h. Solventul este evaporat și înlocuit cu eter, filtrat de solide, spălat cu apă, uscat pe sulfat de magneziu și evaporat la sec. Reziduul se cromatografiază pe silicagel cu etileter/acetilat de etil (4:1), pentru a se obține 10,7 g (40%) de produs amorf care cristalizează din eter/hexan, obținându-se 8,4 g de substanță pură; punctul de topire 207 ... 209* C. Ultimele fracțiuni de la cromatografiere conțin suplimentar 11,2 g de produs ușor, de altă calitate, mai slabă.

2. /O-acetil-omega-acetoxiMeBmt/¹ -Ciclosporină: Un amestec de 4,31 g (3,3 mmoli) de produs din etapa 1 (conținând

15...20% material de pornire, estimat) și 2,1 g (8 mmoli) de tetraetil amoniu acetat tetrahidrat în 30 ml de metil etil cetonă, conținând o cantitate catalitică de clorură de sodiu, se încălzește pe baie de ulei, la 105’C, timp de 3 h, și se ține la temperatura camerei pe perioada weekend-ului. Solventul este diluat cu metil f-butil-eter și splălat cu apă și saramură. Stratul organic este uscat pe sulfat de magneziu și evaporat pentru a se obține 4,0 g de produs brut care este purificat pe coloană cu fază reversă RP-18 (240 g), pentru a se obține 3,07 g de produs din titlu: punctul de topire 191 ... 192*C.

3. /omega-hidroxi-MeBmt/¹ -Ciclosporina: O soluție de 1,72 g (1,3 mmoli) de produs din etapa 2 în 75 ml de metanol și o soluție de 1,2 g sodiu în 50 ml metanol se amestecă și se ține la temperatura camerei timp de 2,5 h. Soluția se acidulează cu acid acetic. Solventul se evaporă la presiune redusă și reziduul se dizolvă în metil r-butil-eter, se spală secvențial cu apă, saramură, și soluție de bicarbonat de sodiu, se usucă pe sulfat de magneziu, și se evaporă. Produsul brut (1,6 g) se eluează de pe coloana RP-18 (240 g) cu metanol/apă 75:15 pentru a se obține 1,5 g produs pur. O probă este cristalizată din eter/hexan obținând produsul pur cu punctul de topire 181...183’C.

Exemplul 9. /MeThrf -Ciclosporină (compusul d)

Sinteza totală a ciclosporinei este descrisă în brevetele US 4396542 și 4798823 și este efectuată utilizând MeThr în locul în poziția 4 a MeLeu. Produsul are talfatg⁰ =249,6*C (c= 1,0 în CHClj).

Exemplul 10. /MeVal/* -Ciclosporină (compusul b)

Sinteza totală a ciclosporinei este descrisă în brevetele US 4396542 și 4798823 și este efectuată utilizând MeVal în locul în poziția 4 a MeLeu. Produsul are lalfal_o™ =226*C (c=0,358 în CHC1₃).

Exemplul 11. Imunosuprimarea și legarea ciclofilinei din compușii activi față de Ciclosporină

Tabelul 1 prezintă exemple de: (1) raportul de legare ciclofilină (BR) a compușilor activi așa cum se măsoară prin studiul ELISA și (2) activitatea imunosupresivă a compușilor activi față de Ciclosporină, așa cum se înregistrează în studiul MLR și exprimată în procente de activitate relativă față de Ciclosporină (Raportul imunosupresiv sau IR).

Alte explicații ale semnificației acestor valori și metodelor ce conduc la aceste teste sunt date mai sus.

22

Tabelul 1

Compusul ί	BR(loclO) !	IR (%)
a) /dihidro-MeBmt/1 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 ciclosporină	θ’1	sub 1
b) /MeVal/4 -Ciclosporină	0,1	sub 1
c) /Melle/4 -Ciclosporină	4).2	sub 1
e) /gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină	j -0,3	sub 1
f) /Nva/2 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină	| 0,4	sub 1
h) /MeVal/5 -Ciclosporină	ί 0,4	5,3
j) /S’-hidroxi-MeBmt/'-Ciclosporină	1 0,35	1,8
k) /MeAla/6 -Ciclosporină	-0,4	3,2
1) /gazzza-hidroxi-MeLeu/9 -Ciclosporină	0,15	2,9

Exemplul 12. Activitatea cmti-HIV și citotoxicitatea compușilor activi

Exemple ale activității compușilor activi și ciclosporinei ca inhibitori ai replicării HIV-1 în celulele MT₄ și ale citotoxicității compușilor activi și ciclosporinei în celulele MT₄ sunt prezentate în tabelul 2. Semnificația acestor numere și metodelor corespunzătoare sunt prezentate mai sus.

Tabelul 2

Compus	Citotoxicitate /ig/ml	Anti-HIV (IC^)
a) /Dihidro-MeBmt/1 -/gazzza-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină	16,3	0,12
b) /MeVal/4 -Ciclosporină	5,4	0,064
c) /Melle/4 -Ciclosporină	4,5	0,056
e) /gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină	15,5	0,34
f) /Nva/2 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină	14,0	0,85
h) /MeVal/5 -Ciclosporină	4,4	0,45
i) /MeOThr/2 -/(D)MeAla/3 -/MeVal/5 -Ciclosporină	sub 10	0,45
j) /S’-hidroxi-MeBmt/'-Ciclosporină	10,6	0,56
k) /MeAla/6 -Ciclosporină	5,2	1,34
1) /gazzza-hidroxi-MeLeu/9 -Ciclosporină	sub 10	0,31
Ciclosporină	8,45	0,53

Compusul activ poate fi administrat prin oricare din căile convenționale de administrare, în particular enteral, de exemplu, oral, de exemplu sub formă de soluții buvabile, tablete, capsule sau suspensii, sau parenteral, de exemplu sub forma soluțiilor sau suspensiilor injectabile. Pe calea intravenoasă o doză zilnică indicată poate fi de la 1 la 20 mg/kg, preferabil de la 3 la 10 mg/kg, și calea orală poate utiliza doza de la 1 la 50 mg/kg, preferabil de la 7 la 20 mg/kg.

Toxicitatea compușilor activi se crede că este similară cu cea a Ciclosporinei. Cum compușii activi nu sunt imunosupresivi, anumite efecte secundare ale Ciclosporinei față de fenomenul imunosupresiv sunt înlăturate. Alte efecte secundare asociate cu Ciclosporina, totuși, în mod particular nefrotoxicitatea în utilizarea pe termen lung, poate fi de asemenea asociată cu compuși activi.

Formulările galenice preferate pentru compușii activi cuprind și pe cele bazate pe microemulsii, așa cum se descrie în British Patent Application 2222770 A, care includ formele topice cât și formele orale, de asemenea formele orale și injectabile obținute din soluții solide cuprinzând monoesterzaharida unui acid gras, de exemplu monolauratul zaharozei, așa cum se descrie în cererea de brevetul din GB 2209671 A. Forme de dozaj corespunzătoare pentru administrarea orală cuprind, de exemplu, de la 25 la 200 mg compus activ per doză.

Exemplu de formulare A:

Produs din ex. 1 50,0 m;

Glycofurol 75 180,0 m;

Mygliol 812 90,0 m;

Cremophor RH40 180,0 m;

αΖ/ΰ-Tocoferol 0,5 m;

Exemplu de formulare B:

Produs din ex. 1 100,0 m;

Tetraglicol 20,0 m;

Captex 800 20,0 m;

Nikkol HCO-40 860,0 m;

Butilhidroxitoluen (BHT) 1,0 m;

Exemplu de formulare C:

Produs din ex. 1 25,0 m;

Glycofurol 75 100,0 m;

Mygliol 812 35,0 m;

Cremophor RH40 90,0 m;

Butilhidroxitoluen (BHT) 0,2 m;

Exemplu de formulare D:

Produs din ex. 1 10,0 m;

Tetraglicol 10,0 m;

Miritol 5,0 m;

Cremophor RH 40 75,0 m;

a//ă-tocoferol 0,1 m.

Componenții individuali din aceste formulări, cât și metodele de preparare a lor, sunt complet descrise în British Patent Application nr. 2222770.

Claims (7)

1. Revendicări

   1. Ciclosporine caracterizate prin aceea că au formula generală I:

   rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-țDJAIa-Meleu-MeLeu-MeVab I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 | (I) în care:

   W este MeBmt, dihidro-Me Bmt;

   X este αΖ/ά-Abu, Val, Thr, Nva sau

   MeOThr;

   R este Sar sau (D) - MeAla;

   Y este MeLeu, gozna-hidroxi-MeLeu,

   Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr;

   Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și Q este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu sau MeAla, cu condiția ca atunci când:

   - Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal sau MeLeu;

   - W este MeBmt, R este Sar și Y este γ-hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val;

   și cu activitate monimunosupresivă, toxicitate mai mică decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică.
2. 2. Ciclosporinele, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt:

   a) /dihidro-MeBmt/¹ -/gowza-hidroxiMeLeu/⁴ -Ciclosporină;

   b) /MeVal/⁴ -Ciclosporină;

   c) /MeThr/⁴ -Ciclosporină;

   d) /ga/na-hidroxi-MeLeu/⁴ -Ciclosporină;

   e) /Nva/² -/gawa-hidroxiMeLeu/⁴ -Ciclosporină;

   f) /gama-hidroxi-MeLeu/⁴ -Igamahidroxi-MeLeu/⁶ -Ciclosporină;

   g) /MeVal/⁵ -Ciclosporină;

   h) /MeOThr/² -/(D)MeAla/³-/MeVal/⁵ -Ciclosporină; 5

   i) /S’-hidroxi-MeBmt/¹ -Ciclosporină.
3. 3. Ciclosporină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este (Melle)⁴ -ciclosporină.
4. 4. Ciclosporine, conform revendi- 10 cărilor 1 sau 2, caracterizate prin aceea că sunt utilizate pentru obținerea de medicamente și compoziții farmaceutice pentru tratarea și prevenirea AIDS și a bolilor derivate din AIDS. 15
5. 5. Procedeu de biosinteză a ciclosporinei, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, cuprinde o fază de cultură a tulpinii fungice Tolypocladium implantum Gams -DSM 6627 într-un mediu 20 nutritiv și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și final purificarea acestuia prin metode cromatografice, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă amorfă. 25
6. 6. Procedeu de semisinteză a ciclo26 sporinelor de la revendicarea 1 sau 2, având una sau mai multe resturi de go/nn-hidroxiMeLeu, prin biotransformarea ciclosporinei utilizând microorganisme, caracterizat prin aceea că, cuprinde o fază de cultură a unei tulpini modificate provenite de la Sebekia benihana DSM 6182 într-un mediu nutritiv, adăugarea unei ciclosporine care are una sau mai multe resturi MeLeu și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și purificarea acestuia pe coloană cromatografică, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă amorfă.
7. 7. Metodă de tratament și prevenire a SIDA și a bolilor derivate din SIDA, caracterizată prin aceea că, compuși neimunosupresivi activi tip ciclofilin - lingazi dintre ciclosporinele descrise la revendicarea 1 sau 2, pot fi administrați prin căi convenționale pentru a face reversă deplația celulelor în asociație cu SIDA a induce regresia bolilor derivate din SIDA și a reduce posibilitatea unor noi infestări, într-un dozaj zilnic de 1 până la 20 mg/kg, pentru administrare intravenoasă și 1 până la 50 mg/kg pentru administrare orală.