RO110144B1 - Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA - Google Patents
Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA Download PDFInfo
- Publication number
- RO110144B1 RO110144B1 RO92-200153A RO92200153A RO110144B1 RO 110144 B1 RO110144 B1 RO 110144B1 RO 92200153 A RO92200153 A RO 92200153A RO 110144 B1 RO110144 B1 RO 110144B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- cyclosporine
- meleu
- hydroxy
- meval
- mebmt
- Prior art date
Links
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 title claims abstract description 124
- 108010036941 Cyclosporins Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims abstract description 69
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 31
- XJODGRWDFZVTKW-LURJTMIESA-N (2s)-4-methyl-2-(methylamino)pentanoic acid Chemical compound CN[C@H](C(O)=O)CC(C)C XJODGRWDFZVTKW-LURJTMIESA-N 0.000 claims abstract description 30
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims abstract description 21
- AHQFCPOIMVMDEZ-UNISNWAASA-N (e,2s,3r,4r)-3-hydroxy-4-methyl-2-(methylamino)oct-6-enoic acid Chemical group CN[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C AHQFCPOIMVMDEZ-UNISNWAASA-N 0.000 claims abstract description 20
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims abstract description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 126
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 8
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000921533 Nonomuraea dietziae Species 0.000 claims description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 claims description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 claims description 2
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 13
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 10
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 9
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N N-Butyllithium Chemical compound [Li]CCCC MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- 229920002690 Polyoxyl 40 HydrogenatedCastorOil Polymers 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 241001149960 Tolypocladium inflatum Species 0.000 description 3
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N (3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-30-propyl-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,1 Chemical compound CCC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-VSROPUKISA-N 0.000 description 2
- CTPDSKVQLSDPLC-UHFFFAOYSA-N 2-(oxolan-2-ylmethoxy)ethanol Chemical compound OCCOCC1CCCO1 CTPDSKVQLSDPLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N NVa2 cyclosporine Natural products CCCC1NC(=O)C(C(O)C(C)CC=CC)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O ZMKGDQSIRSGUDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001330507 Sebekia Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004913 chyme Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 108010019249 cyclosporin G Proteins 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-JLPRAAIDSA-N (3r,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-ethyl-33-[(e,1r,2r)-1-hydroxy-2-methylhex-4-enyl]-1,4,7,10,12,15,19,25,28-nonamethyl-6,9,18,24-tetrakis(2-methylpropyl)-3,21-di(propan-2-yl)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-undecazacyclotritriacontane-2,5,8,11,14,17 Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-JLPRAAIDSA-N 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- IRCMYGHHKLLGHV-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3,3-dimethyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-5-yl methanesulfonate Chemical compound C1=C(OS(C)(=O)=O)C=C2C(C)(C)C(OCC)OC2=C1 IRCMYGHHKLLGHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N D-threonine Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- 229930182822 D-threonine Natural products 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000809257 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001134635 Micromonosporaceae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N Novobiocin Natural products O1C(C)(C)C(OC)C(OC(N)=O)C(O)C1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010082756 SDZ 33-243 Proteins 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100038463 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Human genes 0.000 description 1
- KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N [(2r,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl dodecanoate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@]1(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- LDVVMCZRFWMZSG-UHFFFAOYSA-N captan Chemical compound C1C=CCC2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)C21 LDVVMCZRFWMZSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000001271 cephalosporin group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010019251 cyclosporin H Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N novobiocin Chemical compound O1C(C)(C)[C@H](OC)[C@@H](OC(N)=O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CC=C(C(O)=C(NC(=O)C=2C=C(CC=C(C)C)C(O)=CC=2)C(=O)O2)C2=C1C YJQPYGGHQPGBLI-KGSXXDOSSA-N 0.000 description 1
- 229960002950 novobiocin Drugs 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010040933 progressin Proteins 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940063122 sandimmune Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 229940032085 sucrose monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- QNOAKQGNSWGYOE-UHFFFAOYSA-M tetraethylazanium;acetate;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.CC([O-])=O.CC[N+](CC)(CC)CC QNOAKQGNSWGYOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001239 threonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Prezenta invenție se referă la noi
rW-X-R-Y-Z-Q-AIa-(D)Ala-MeIeu-MeLeu-MeVah
[1234567 8 9_______ 10 H [
RO 110144 B l
ciclosporine, caracterizate prin formula:
în care:
W este MeBmt, dihidro-MeBmt; X este
alfa-Abu,Val, Thr, NVa sau MeOThr;
R este Sarx sau (D) - MeAla; Y este
Me Leu, gama-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal,
MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr
Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și Q
este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu sau MeAla,
cu condiția ca atunci când:
- Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal
sau MeLeu;
- W este MeBmt, R este Sar si Y este
gama hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val; și au
activitate nonimunosupresivă, toxicitate mai mică
decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică.
Procedeul de semisinteză a acestor compuși implică
utilizarea unei tulpini modificate, provenite de la
Sebelda benihna-DSM 6182. In metoda de
tratament și prevenire a SIDA, se administrează
acești compuși, intravenos, în doză de 1 până la 2
Description
Ciclosporinele cuprind o clasă distinctivă structural, ciclică, poli-N-metilate undecapeptide, prelucrate în mod obișnuit din punct de vedere farmaceutic, în particular imunosupresive, cu activitate anti-inflamatorie 5 și/sau antiparazitică. Prima din ciclosporinele ce au fost izolate a fost metabolitul fungic apă2 rut natural al Ciclosporinei sau Ciclosporina, de asemenea cunoscută ca ciclosporină A și disponibilă comercial sub denumirea înregistrată de SANDIMMUN R sau SANDIMMUNER. Ciclosporina este o ciclosporină de formula A.
- MeBnrt-oCAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-AIMDlAla-MeLeu-MeLeu-MeVal — 1 2 3 4 5 fi 7 8 9 10 11 (A) în care MeBmt reprezintă restul N-metil-(4R)- 15 4-But-2E-en-1 -il-4-metil-(L)threonil deformula B
-N----CH-COI
CH, în care -x-y- este -CH=CH- (trans) 30
De la descoperirea inițială a ciclosporinei, o varietate largă de coclosporine apărute natural au fost izolate și identificate și multe alte ciclosporine nenaturale au fost preparate prin mijloace de sinteză totală sau 35 semisinteză sau prin aplicarea tehnicilor de cultură modificată. Clasa cuprinsă de ciclosporine este deci substanțială (consistentă) și include, de exemplu, ciclosporinele apărute natural, respectiv ciclosporinele de la A la Z 40 conform Traber și colaboratorii, 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber și colaboratorii, 2, Helv. Chim. Acta, 65, 16551667 (1982); Kobel și colaboratorii, Europ.
J.Applied Microbiology și Biotechnology, 14, 45 273-240 (1982); și von Wartburg și colaboratorii, Prograss in Allergy, 38, 28-45, (1986), cât și diferiți derivați ai ciclosporinei, derivați nenaturali și artificiali sau ciclosporine sintetice, incluzând dihidro-ciclosporinele (în 50 care partea -x-y- a restului MeBmt (formula B de mai sus) este saturat pentru a da -xy- = -CH2 -CH2-); ciclosporinele modificate (derivate) (de exemplu în care 3’ -0- din restul MeBmt este acilat sau în continuare substituent ce este introdus în moleculă la atomul de carbon alfa al restului sarcosyl la poziția 3); ciclosporinele în care restul MeBmt este prezent în forma izomerică (de exemplu în care configurația trans a pozițiilor 6’ și 7’ a restului MeBmt este mai degrabă cis decât trans); și ciclosporinele în care aminoacizii variați sunt încorporați la poziții specifice în cadrul secvenței peptidice, de exemplu utilizând metoda de sinteză totală în cadrul producerii de ciclosporine dezvoltată de R.Wenger, a se vedea Traber și colaboratorii, 1, Traber și colaboratorii, 2 și Kobel și colaboratorii, bibliografie citată mai sus; brevetele US 4108985, 4220641, 4288431, 4396542 și 4798823, European Patent Publication 34567 A, 56782 A, 300784 A, 300785 A și 414632 A; International Patent Publication WO 86/02080 și UK Patent Publication numerele 2206119 și 2207678; Wenger 1, Transpl. Proc., 15 Suppl. 1:2230 (1983);Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24 77 (1985) și Wenger 3, Progressin Chemistry of Organic Natural Products (Progrese în chimia produșilor naturali organici) 50, 123 (1986).
Clasa cuprinzând ciclosporinele este deci foarte largă în adevăratul sens al cuvântului și cuprinde, de exemplu, /Thr/2-, /Val/2-,/Nva/2-/Nva/5-Ciclosporine (de asemenea cunoscute ca și ciclosporine C, D, G și
M), /S-O-acetil-MeBmt/’-Ciclosporina (de asemenea cunoscută ca și ciclosporină A acetat), /dihidro-MeBmt/*-/Val/2-Ciclosporina (de asemenea cunoscută ca și dihidro-ciclosporina D), /(D)Ser/8 -Ciclosporină, /Melle/11 -ciclosporina, /(D)MeVal/11 -Ciclosporină (de asemenea cunoscută ca și ciclosporină H), /MeAla/6-Ciclosporina, /(D)Pro/3 -Ciclosporină și altele.
în concordanță cu nomenclatura convențională pentru ciclosporine, acestea sunt definite pe parcursul prezentei descrieri și revendicări prin structura ciclosporinei (de exemplu ciclosporină A). Aceasta se face prin indicarea mai întâi a resturilor moleculei ce diferă de cele prezente în ciclosporină și apoi aplicarea termenului Ciclosporină pentru a caracteriza restul rămas care poate fi identic celui (celor) prezent în ciclosporină. în același timp prefixul dihidro este utilizat pentru a desemna ciclosporinele în care restul MeBmt este hidrogenat (dihidro-MeBmt), de exemplu în care restul MeBmt este hidrogenat (dihidroMeBmt), de exemplu în care -x-y- în formula B este -CH2 -CH2 Astfel /Thr/2 -Ciclosporina este ciclosporină ce are secvența prezentă în formula A, dar în care α/fa-Abu din poziția 2 este înlocuită cu Thr, și /dihidroMeBmt/1 -/Val/2 Ciclosporină este ciclosporina ce are secvența prezentată în formula A, dar în care restul MeBmt din poziția 1 este hidrogenat și alfa Abu din poziția 2 este înlocuit cu Val.
Suplimentar, resturile de amino acid prescurtate, de exemplu Ala, MeVal, a//aAbu, etc. sunt în concordanță cu practica obișnuită, înțelegând că au configurația (L) afară de cazul că se indică altfel, de exemplu ca și în cazul (D)Ala. Abrevierea restului (radicalului) precedată de Me ca și în cazul MeLeu, reprezintă resturi a//ă-N-metilate. Resturile individuale ale moleculei ciclosporinei sunt numerotate ca în literatura de specialitate, în direcția mersului ceasului și pornind de la restul MeBmt sau dihidro MeBmt în poziția 1. Aceeași secvență numerică este aplicată pe tot parcursul prezentei descrieri cât și al revendicărilor.
în prezent, este bine stabilit că Ciclosporină acționează prin interferarea cu procesul activării celulelor T, prin blocarea inițiării transcrierii lui IL-2, cu toate că mecanismul precis nu a fost încă elucidat. Cefalosporina a prezentat formarea unui complex cu proteina citosolică 17kD (ciclofilina) care apare în multe tipuri de celule și s-a dovedit a fi identică cu peptidil-prolil cis-irans-izomeraza, și care este o enzimă cuprinsă în proteina de înjumătățire. Până în prezent, totuși, nu s-a clarificat dacă legarea la ciclofilină este direct corelată cu activitatea imunosupresivă din ciclosporine, sau întradevăr dacă legarea ciclofilinei este ea însăși suficient criteriu pentru activitatea imunosupresivă.
S-a descoperit că există ciclosporine care se leagă puternic de ciclofilină, dar nu sunt toate imunosupresive. Din acest motiv rezultă că legarea la ciclofilină este un orificiu necesar, dar nu și suficient pentru activitatea imunosupresivă.
Prezenta invenție asigură ciclosporine care sunt active față de replicarea HIV-1.
Virusul imunodeficienței umane (HIV) infectează preferențial limfocitele T4/(helperajutătoare) identificate printr-un marker de suprafață T4 (OKTA4 recunoscute de anticorpii monoclonali OKTA4), de unde denumirea de celule T4/ deși se replică în diferite alte tipuri de celule, în special cele din seria monocitică. Se produce încet o boală progresivă a sistemului imunitar caracterizată prin o distrugere treptată a celulei T4, boală denumită AIDS sau SIDA. Alte anormalități imunologice ale AIDS îl formează creșterea limfocitelor (Tg) citotoxic/supresoare, un defect în procesul prezentare antigen/recunoaștere și activarea policlonală a celulelor B. Mecanismul distrugerii celulelor T4 este încă necunoscut până în prezent. Relativ puține celule T4 par a fi infectate, astfel, un efect citopatic direct cauzat de un virus poate să nu fie singura cauză (motiv) de epuizare a celulelor T4. S-a făcut ipoteza că distrugerea celulelor T4 poate fi amplificată prin procesul autoimun declanșat de producerea HIV sau celulelor T4 acoperite cu proteină HIV. Această stimulare antigenică continuă poate conduce la o situație de permanentă activitate a celulelor T4 care va mări replicarea HlV-ului în acele celule și va mări clonii T-citotoxici. Celulele T4 rămase neinfectate pot fi făcute antifenice prin legarea exogenului viral gp 120 la moleculele lui CD4 și astfel ar fi direcțiuni spre un răspuns Tcitotoxic.
Brevetul US 4814323 prezintă faptul că Ciclosporina are activitate față de AIDS, și că în general ciclosporinele cunoscute ca imunosupresori pot fi utili în această indicație. Nu se fac sugestii asupra faptului că ciclosporinele neimunosupresive pot avea o astfel de proprietate.
Surprinzător, s-a descoperit că ciclosporinele care leagă ciclophilina, dar nu sunt imunosupresive, prezintă un efect inhibitor asupra replicării lui HIV-1.
O ciclosporină este considerată ca fiind cea care se leagă Ia ciclofilină recombinant umană pe cel puțin o cincime, la fel de bine cum o face Ciclosporina în testul competitiv ELISA descris de Quesniaux în EurJ.Imunol., 1987, 17 1359-1365. în acest test, ciclosporina ce urmează a fi testată este adăugată pe parcursul incubării ciclofilinei cu Ciclosporină BSA acoperită și concentrație cerută pentru a da inhibare 50% a reacției de control ce este calculată fără competitor (ICjo). Rezultatele sunt exprimate ca viteză de legare (BR), care este logaritmul în baza 10 a raportului dintre IC» a compusului de testat și IC» într-un test simultan al însăși ciclosporinei. Astfel BR de 0,1 indică că, compusul de testat leagă ciclophilina cu un factor de zece ori mai slab decât o face ciclosporina, și valoarea negativă indică legare mai puternică decât cea a ciclosporinei.
Ciclosporinele active față de HIV au un BR mai mic de 0,7, deoarece log10 5-0,7 (aprox), preferabil egal cu sau mai mic de zero.
O ciclosporină este considerată ca fiind neimunosupresivă când are o activitate în reacția Mixtă (MLR) nu mai mult de 5%, preferabil nu mai mult de 2%, decât Ciclosporina. Reacția Limfocită mixtă este descrisă de T.Meo în Imunological Metods (Metode imunologice), L.Lefkovits și B.Peris, Eds. Academic Press, N.Y. paginile 227239,6(1979). Celulele de splină (0,5 x IO6) recoltate de la șoareci Balb/c (femele, 8-10 săptămâni) sunt co-incubate timp de cinci zile cu celule de splină 0,5 x IO6 iradiate (2000 radzi) sau tratate cu mitomicină C recoltate de la șoareci CBA (femelă, 8-10 săptămâni).
Celulele alogenice iradiate induc un răspuns proliferiativ în celulele de splină Balb/c care poate fi măsurat prin incorporarea unui precursor marcat în DNA. Cum celulele stimulator sunt iradiate (sau tratate cu mitocină C) ele nu pot răspunde la celulele Balb/c cu proliferare, dar își rețin antigenicitatea. IC» găsit pentru compusul de testat în MLR este comparat cu cel găsit pentru Ciclosporină în experimentul paralel.
Activitatea ciclosporinelor ca inhibitori ai replicării HIV-1 poate fi demonstrată în următoarele sisteme de testare:
1. Inhibarea efectului citopatic HIV-1 indus în celulele Mt4
Procedeul studiului descris de către Pauwels și colaboratorii, J. Virol. Meth., 20/309 (1988), se utilizează cu modificări minore. Linia T4-celulară HTLV-Itransformată, MT4, care a fost anterior arătată ca fiind puternic permisivă infecției HIV, este utilizată ca celulă țintă. Inhibarea HIV-1, efectul citopatic indus tulpinii HTLV-ΠΙΒ se determină prin măsurarea viabilității atât a celulelor HIV infectate cât și a celulelor simulate infectate. Viabilitatea este stabilită spectroforometric via in situ reducerea lui 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazoliumbromură (MTT). Culturi virua-infectate și neinfectate fără compus sunt incluse ca și control, cum sunt incluse și celule neinfectate tratate cu compus. Concentrația celulară este aleasă astfel, încât numărul celulelor per milimetru să fie crescută cu un factor de 10 pe parcursul a patru zile de incubare, în culturile simulat infectate. Inoculul de virus este ajustat astfel, încât să producă moartea celulei în 90% din celulele țintă după patru zile de incubare. Virusul este absorbit în suspensie de 10 ori mai concentrată de celule la 37’C, după o oră. Apoi celulele infectate sunt diluate 1:10 și adăugate pe plăci de microtitrare conținând compusul de testat.
2. Citotoxicitatea
Suspensii de celule Jukart și U 937 sunt ajustate la 1 x IO5 celule/ml și incubate în prezența a diferite concentrații de compus de testat. După 48 h cantitățile de celule per milimetru sunt comparate prin colorare (tratare) cu MIT. Citotoxicitatea în celulele MT4 poate fi măsurată în același mod.
3. Inhibarea replicării HIV-1 în celulele Jurkat și U 937
Linia Jurkat celulară T4 și linia celulară monocitară U 937 se infectează prin suspendarea celulelor de zece ori mai concentrate în soluție de virus. Adsorbția se permite timp de 2 h la 37 ‘C. Celulele sunt centrifugate, inoculul este îndepărtat și celulele sunt resuspendate la concentrația lor originală în mediu de cultură proaspăt conținând compusul de testat. Astfel, substanța este adăugată după adsorbție. La zilele 2, 5, 8, 12, 15 și 19 de după infectare, cote părți (alicote) de culturi infectate sunt recoltate. Celulele sunt centrifugate și supematantul colectat. Concentrația antigenului viral p24 este determinată în supematanți prin ajutorul unei truse comerciale ELISA și servesc ca parametru pentru producerea de virus. După fiecare îndepărtare a cotelor părți, celulele sunt numărate și ajustate la 2 x IO5 celule/milimetru prin adăugarea de mediu proaspăt conținând compusul de test la o concentrație particulară.
Ciclosporinele, conform invenției, se caracterizează prin aceea că au formula generală I:
rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-(D)Ala-MeIea-MeLeu-MeVah I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 | în care:
W este MeBmt, dihidro-Me Bmt;
X este a//â-Abu, Val, Thr, Nva sau MeOThr;
R este Sar sau (D) - MeAla;
Y este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal,MeThr, MeAla, Mealle sau
MeaThr;
Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și
Q este MeLeu, gazna-hidroxi-MeLeu sau MeAla, cu condiția ca atunci când:
- Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal sau MeLeu;
- W este MeBmt, R este Sar și Y este gama-hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val; și cu activitate monimunosupresivă, toxicitate mai mică decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică.
Procedeul de semisinteză a ciclosporinelor de mai sus, conform invenției, având una sau mai multe resturi de gamahidroxi MeLeu, prin biotransformarea ciclosporinei, utilizând microorganisme, cuprinde o fază de cultură a unei tulpini modificate provenite de la Sebekia benihanaDSM 6182 într-un mediu nutritiv, adăugarea unei ciclosporine care are una sau mai multe resturi MeLeu și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și purificarea acestuia pe coloană cromatografică, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă, amorfă.
Metoda de tratament și prevenire a SIDA și a bolilor derivate din SIDA, conform invenției, constă în aceea că, compuși aonimunosupresivi activi tip ciclofilinliganzi dintre ciclosporinele de mai sus, pot fi administrați prin căi convenționale pentru a face reversă deplația celulelor în asociație cu SIDA, a induce regresia bolilor derivate din SIDA și a reduce posibilitatea unor noi infestări, într-un dozaj zilnic de 1 până la 20 mg/kg, pentru administrare intravenoasă și 1 până la 50 mg/kg pentru administrare orală.
Compușii activi sunt indicați atât pentru prevenirea AIDS, la pacienții asimtotic HIV-pozitivi cât și în tratamentul pacienților suferind de AIDS. La pacienții la care AIDS a apărut, administrarea compușilor activi ar face reversă deplația celulei T4 asociată cu AIDS, ar induce regresia AIDS legată de boli, cum ar fi sarcomul lui Kaposi, și ar reduce în oarecare măsură noile infecții posibile de a apărea.
Astfel, prezenta invenție asigură un procedeu pentru tratamentul și prevenirea sindromului de imunodeficiență dobândit și alte maladii induse de virusul HIV-1 la pacientul infectat cu numitul virus, cuprinzând administrarea la numitul pacient a unei cantități efective de compus activ, conform prezentei invenții.
Din cadrul compușilor conform prezentei invenții, de exemplu neimunosupresivi, ciclofilină-legând ciclosporine active față de HIV-1 (compuși activi), unii sunt noi și alții sunt cunoscuți; totuși activitatea anti HIV a compușilor activi cunoscuți nu a fost prezentată anterior, și în multe cazuri compușii activi cunoscuți nu au fost prezentați ca având vreo activitate farmaceutică în nici o direcție.
S-a descoperit că mulți compuși activi au structuri diferite de cea a Ciclosporinei, în special la pozițiile 4 și/sau 5.
Un grup al compușilor activi îl formează ciclosporinele în care gruparea MeLeu la poziția 4 este înlocuită cu un aminoacid N-metilat diferit, de exemplu gamahidroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr sau MeAla. Suplimentar față de formele Melle și Methr, formele allo Mealle și MeaThr pot fi folosite, de asemenea. în forma allo, stereochimia la poziția beta prezintă configurația opusă celei din aminoacidul natural, astfel încât forma normală și forma allo constituie o pereche de diastereoizomeri.
Un alt grup de compuși activi îl constituie cel în care Val la poziția 5 este înlocuit cu zz-alchil-, preferabil nmetil- aminoacid. Preferabil amino-acidul care este zj-alchilat este Val sau Leu. Preferabil hidrogenul grupării amino din /Val/5 , este înlocuit cu o grupare alchil C,^ neramificat, preferabil metil, etil sau π-propil, în mod particular metil. Ultima grupă a compușilor activi este o grupare complet nouă.
Suplimentar sau alternativ, anumiți compuși activi pot fi diferiți de Cefalosporină la pozițiile 1, 2, 3 și/sau 6. O grupă preferată de compuși activi este constituită de compuși de formula I:
rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-(D)Ala-Meleu-MeLeu-MeVaIi I 1 2 3 4 S 6 7 8 9_10 11 [ în care W este MeBmt, dihidro MeBmt sau 8’ - hidroxi-MeBmt;
X este aZ/aAbu, Val, Thr, Na sau Ometil threonină (MeOThr);
R este Sar sau (D) - MeAla;
Y este MeLeu, gazzw-hidroxi-MeLeu,
Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr;
Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu; și Q este MeLeu, gama -hidroxi-MeLeu sau MeAla.
cu condiția ca atunci când Y este MeLeu atunci fie Z este MeVal sau MeLeu, fie W este 8’ -hidroxi-MeBmt.
Grupurile W, X, Y, Z, Q și R au, independent, următoarele semnificații preferate:
W este preferabil W’ unde W’ este MeBmt sau dihidro-MeBmt;
X este preferabil X’ unde X’ este αΖ/âAbu sau Nva, mai preferabil X” unde
X” este aZ/aAbu;
R este preferabil R’ unde R’ este Sar;
Y este preferabil Y’ unde Y’ este gazzia-hidroxi-MeLeu,1 MeVal, MeThr sau
Mells;
Z este preferabil Z’ unde Z’ este Val sau MeVal; și
Q este preferabil Q’ unde Q’ este
MeLeu.
Un grup preferat în mod special de compuși activi este cel al compușilor de formula I în care W este W’, X este X’, Y este Y’, Z este Z’, Q este Q’ și R este R’.
Compușii preferați, în mod particular, de formula I sunt compușii:
a) /dihidro-MeBmt/1 -/gazzza-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină;
b) /MeVal/4 -Ciclosporină;
c) /Melle/4 -Ciclosporină;
d) /MeThr/4 -Ciclosporină;
e) /gazzia-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină;
fj/Nva/2 -/gazzia-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină;
g) /gazzia-hidroxi-MeLeu/4 -Îgama-hidroxi-MeLeu/6 -Ciclosporină;
h) /MeVal/5 -Ciclosporină;
i) /MeOThr/2 -/(D)MeAla/3 /MeVal/5 -Ciclosporină;
j) /S’-hidroxi-MeBmt/1 -Ciclosporină.
Suplimentar, unii compuși nu în cadrul celor de formula I sunt compuși activi, de exemplu:
k) /MeAla/6 -Ciclosporină și
l) /gazzia-hidroxi-MeLeu/9 -Ciclosporină.
Invenția asigură, de asemenea, noi compuși activi, care sunt compuși conform formulei Π :
t-W-X-R-Y· Z -MeLeu-Ala-IHAIa-MeLeu-MeLeu-WeVai -i
2 3 4 S t T 8 3 10 11 [ gg unde W’, X, R, Y și Z sunt asemenea celor definiți anterior, cu condiția că: 1) când este
MeLeu sau MeAla, atunci Z este MeVal sau
MeLeu și 2) când W’ este MeBmt, R este Sar,
Producerea tulpinii
Compusul c) este obținut prin fermentarea tulpiniii fungice Tolypocladium inflatum Cy E 4556, depozitată în Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, conform prevederilor tratatului de la Budapesta din 24 iulie 1991, sub numărul de acces DSM 6627. Această tulpină este un mutant al tulpinii NRRL 8044 și speciei Tolypocladium inflatum gama, și este taxonomic identică cu o tulpină similară, care a fost complet descrisă, de exemplu în brevetul GB 1491509.
1. Cultura de pornire pe agar: Plăci conținând tulpini de DSM 6627 sunt incubate o perioadă de 14 zile, la temperatura de 27’C pe următorul mediu de agar:
Extract de drojdie (Gistex) 4 g;
Extract de malț (Wander) 20 g;
Agar 20 g;
Apă demineralizată până la 1000 ml.
Mediul are unpH de 5,4.. .5,6 și a fost sterilizat timp de 20 min, la temperatura de 120’C.
2. Precultura: Spori de la miceliul din culturile de pornire se suspendă în 40 ml de soluție salină 0,9 %. O serie de baloane Erlenmeyer fiecare conținând câte 100 ml de mediu de precultură sunt inoculate cu câte 20 ml de suspensie de acest tip. Compoziția preculturii (mediului de precultură) este următoarea:
Caseină (Amber EHC) 25 g;
Maltoză 75 g;
KH2PO4 1 g;
KC1 2,5 g;
Apă demineralizată până la 1000 ml.
Mediul este adus lapHz5,2 ... 5,5 cu acid clorhidric, apoi sterilizat pe perioadă de 20 min la 120‘C. Preculturile sunt fermentate timp de 24 h la 27’C, într-un agitator rotativ cu 200 rot/min^cu o exectricitate de 50 mm.
3. Cultura intermediară'. într-un fermentator de oțel, de capacitate 25 1 conținând 20 1 de mediu de precultură, se inoculează 200 ml de precultură. Cultura intermediară este fermentată pe parcursul a 5 zile la 27’C, cu o viteză de rotație de 150 rot/min și un debit de curgere al aerului de 0,5 pe minut, per litru de medium, la presiunea de 0,5 bari.
4. Mediul de cultură principal: 100 1 de mediu de precultură se inoculează cu 10 1 de cultură intermediară și se fermentează întrun fermentator de oțel de capacitate de 120 1. La acest mediu se adaugă 4 g/1 D-Threonină, sterilizată prin filtrare. Fermentația se efectuează la 27’C, timp de 14 zile, cu viteza de agitare de 70 rot/min și un debit de curgere a aerului de 0,4 1/min per litru de mediu, la presiunea de 0,5 bari, în primele 5 zile, apoi viteza de agitare fiind crescută la 100 rot/min și debitul de aer la 0,5 1/min pentru restul perioadei de fermentație rămase.
Izolarea'. Miceliul este separat din mediul de cultură și extras în aparat Turrax prin măcinare și agitare de 3 ori cu câte 10 1 de amestec prin filtrare prin sucțiune și filtratele combinate sunt concentrate prin evaporare la vacuum la o temperatură de 40’C, până ce vaporii ce se degajă consistă numai din vapori de apă. Amestecul obținut este extras de patru ori, utilizând câte 2 1 de
1,2-dicloretan la fiecare extracție și soluțiile cu
1,2-dicloretan combinate se concentrează prin evaporare la vacuum la temperatura de 40’C.
Reziduul este supus cromatografiei pe coloană cromatografică (10 kg silicagel, granule de dimensiunea 0,02 ... 0,045 mm, Grace) utilizând amestec de acetat de etil/apă ca eluent (fracțiuni de 2,5 1). Fracțiunile 20 -23, conținând /Melle/4-Ciclosporină sunt extrase și separate în continuare pe coloană cromatografică cu silicagel (600 gr de silicagel, granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm, Merck), utilizând cloroform/metanol (98:2 voi) ca eluent (frecțiuni de 300 ml). în continuare, purificarea este atinsă prin cromatografie pe coloană cu silicagel (400 g silicagel, granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm, Merck) utilizând clorură de metilen/metanol (98:2 voi) ca eluent (fracțiuni de 200 ml) obținând /Melle/4 -Ciclosporină ca pulbere amorfă de culoare albă: punctul de topire 155 ... 158’C; lalfalD™ = -235 (c=0,68 în CHC13) și -198 (c=0,74 în CH3OH).
Spectrul IR în CH2CL2 este prezentat în fig.l, și protonul din spectrul RMN în
CDC13 este prezentat în fig. 2.
și Y este gama-hidroxi-MeLeu, apoi Z este altul decât Val.
Un grup preferat de noi compuși activi constă din compușii de formula II în care X este X”, Y este Y’ și Z este Z’, cu condiția ca atunci când W’ este MeBmt, Y’ este altul decât gama-hidroxi-MeLeu.
Compușii activi noi preferați sunt compușii a), b), c), d), f) și h) de mai sus. Unii din acești compuși, de exemplu compușii b) și c), au fost găsiți că blochează activitatea imunosupresivă a Cefalosporinei prin blocarea liganzilor ei cu o ciclofilina, și astfel acționează cu antagoniști ciclosporinici.
Compușii activi pot fi obținuți în diferite moduri, care pot fi clasificate după cum ar fi:
1) Fermentare.
2) Biotransformare.
3) Derivatizare.
4) Sinteză parțială.
5) Sinteză totală.
1) Unii compuși activi sunt produși ca produse secundare ale fermentației tulpinilor originale sau modificate ale organismului producător de Ciclosporină, cum ar fi Tolypocladium inflatum gama, așa cum este exemplificat pentru producerea compusului c), descris în exemplul 1 de mai jos.
2) Alți compuși activi, inclusiv compușii cunoscuți j) și 1) sunt metaboliți ai Cefalosporinei, și pot fi izolați prin metode cromatografice din urina umană sau animală, dozați ca Ciclosporină. Mai mult, aceste și alte transformări metabolice sunt posibile utilizând microorganisme, de exemplu producerea conpușilor e) și g) prin biotransformarea ciclosporinei A, cum se descrie în exemplele 2 și 3, sau a compusului f) prin biotransformarea ciclosporinei G (exemplul 4). Aceste exemple demonstrează noul procedeu pentru prepararea ciclosporinelor, având unul sau mai multe resturi gawa-hidroxi-MeLeu, cuprinzând etapele de cultivare a noii tulpini modificate de Sebekia benihana, adăugând o ciclosporină având unul sau mai multe resturi MeLeu, și izolarea produsului din bulionul de fermentare.
3) Prin derivatizare se înțelege că ciclosporinele naturale sau sintetice pot fi transformate în compuși activi, prin una sau mai multe reacții chimice în care unul sau mai mulți amino-acizi sunt modificați fără deschiderea și reformarea legăturilor peptidice. De exemplu, clasa compușilor activi în care Val la poziția 5 este n-alchilată pot fi obținute prin reacționarea corespunzătoarei ciclosporine având Val în poziția 5 cu butillitiu, urmată de reacția cu un agent de alchilare, cum este exemplificat în cadrul compusului h) din exemplul 5 și pentru compusul i) din exemplul
6.
Ca alte exemple, compusul a) poate fi preparat prin hidrogenarea compusului e) (Exemplul 7), și compusul j), care este, de asemenea, un metabolit al ciclosporinei, poate fi preparat din compusul cunoscut ciclosporinacetat, conform descrierii din exemplul 8.
4) Termenul sinteză parțială, așa cum este utilizat, se referă la o serie de reacții chimice în care inelul ciclosporinei naturale este deschis, unul sau mai mulți amino-acizi sunt îndepărtați, diferiți aminoacizi sunt adăugați, și inelul este închis din nou.
5) Sinteza totală a ciclosporinelor poate fi efectuată prin construirea unei undecapeptide liniare și ciclizarea ei, așa cum se descrie de către Wenger (10c.cit), a se vedea de asemenea brevetele US 4396542 și 4798823. în principiu, orice ciclosporină poate fi preparată prin sinteza totală, deși acolo unde există o altă metodă disponibilă, aceasta poate fi mai convenabilă decât sinteza totală. Sinteza totală poate fi utilizată pentru prepararea compusului d) (Exemplul 9), și pentru compusul metabolit cunoscut 1).
Compusul k) este o substanță cunoscută ale cărei proprietăți au fost descrise de Quesniaux și colaboratorii (Mol. Immunol., 24 1159 1987) și care poate fi, de asemenea, preparat prin sinteză totală. De exemplu, o sinteză totală a acestui compus este descrisaă în brevetul US 4914188.
Se dau, în continuare, 12 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1...3, care reprezintă:
- fig. 1, spectrul IR în CHjCL, a Melle-Ciclosporina;
- fig. 2, protonul din spectrul NMR în
CDC13;
- fig. 3, spectrul NMR în CDC13 a MeVal-Ciclosporina.
Exemplul 1. /Mellefl -Ciclosporină (Compusul c)
Exemplul 2. /gama-hidroxiMeLeufi -Ciclosporină (compusul e)
Compusul e) este obținut din biotransformarea ciclosporinei de către microrganismul Sebekîa benihana. Tulpina originală utilizată este condiționată NRLL lllll și aparține speciilor Sebekîa benihana (Dietz și Li; Sebekîa, un gen nou al familiei Actinoplanaceae. Abstr 82nd. ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 163, Atlanta, 1982). Această tulpină este capabilă să hidrocileze novobiocina. Tulpina subcultivată utilizată pentru prepararea compusului e) și compușii înrudiți a fost, depozitată în German Collection of Microorganisms (D-3300 Braunschweig) sub numărul DSM 6182.
1. Cultura de pornire pe agar; Lame cu culturi de tulpină DSM 6182 sunt crescute pe termen de 10 zile, la 27’C, pe următorul mediu de agar:
Glucoză 10 g;
Amidon (solubil) 20 g;
Extract de drojdie (Gistex) 5 g;
Peptonă (N-Z-Amină tip A, Sheffield) 5 g;
CaCO3 1 g;
Agar (Bacto) 18 g;
Apă demineralizată la 1 litru;
pH. neutralizat la 7 cu NaOH/H2SO4; Sterilizare: 120’C/20min.
2. Precultura; Spori și miceliu de cultură de pornire sunt suspendați în 10 ml de soluție salină 0,9 %. O serie de baloane Erlemnayer, de capacitate 200 ml, fiecare conținând câte 50 ml mediu de precultură, se inoculează fiecare cu câte 5 ml suspensie de acest gen. Compoziția mediului de precultură este următorul:
Glucoză 7 g;
Amidon (solubil) 10 g;
Extract de drojdie (Gistex) 4,5 g;
Extract de malț (lichid, Wander) 10 g;
Peptonă (N-Z-Amină tip A, Sheffield) 2,5g; Carbonat de calciu 1 g;
Soluție marcată nr. 235 1 ml;
Apă demineralizată la 1 litru;
pH neutralizat la 7 cu NaOH/H2SO4; Sterilizare: 120’C/20min.
Soluția marcată nr. 235
Acid boric 0,lg;
FeSO4.7H2O 5 g;
KI 0,05 g;
CoC1.6H2O 2 g;
CuSO4.5H2O 0,2 g;
MnCl2.4H2O 2 g;
ZnSO4.7H2O 4 g;
Apă demineralizată până la 999 ml și H2SO4 (97%) 1 ml.
Preculturile sunt fermentate timp de 4 zile, la 27’C, pe un agitator rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm.
3. Cultura intermediară; O serie de baloane Erlenmeyer, de capacitate 200 ml, conținând fiecare 50 ml de mediu de precultură, sunt inoculate fiecare cu câte 5 ml de precultură. Cultura intermediară este fermentată timp de 3 zile, la 27’C, pe agitatorul rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm.
4. Cultura principală: O serie de baloane Erlenmeyer, de capacitate 500 ml, conținând fiecare 50 ml de mediu principal (total 12 1), sunt inoculate fiecare cu câte 5 ml de cultură intermediară. Aceste culturi sunt fermentate timp de 3 zile, la 27’C, pe agitatorul rotativ la 200 rot/min, cu o excentricitate de 50 mm. După 24 h-, ciclosporină A (7,5 mg) solubilizată în metanol este adăugată la fiecare mediu de cultură (= 150 mg/litru).
Compoziția mediului de cultură este după cum urmează:
Celuloză 10 g;
Dextrină 10 g;
Amidon (solubil) 10 g;
Extract de drojdie (Gistex) 2,5 g;
Făină de soia (Nurupan, Edesoya) 12,5 g;
K2HPO4 0,25 g;
KH2PO4 0,12 g;
MgSO4.7H2O 0,10 g;
CaCI2.6H2O 0,05 g;
Urme de element de soluție AC-1 1 ml;
Apă demineralizată până la 1 litru; pH: ajustat la 7,2-7,5 (KOH/H2SO4); Sterilizare: 120*C/20 min.
Soluția cu urme de elemenet AC-1:
Această soluție are aceeași compoziție ca și soluția nr. 235 cu adăugarea în plus a (NH4)
6Mo7024 în cantitate de 0,2 g.
5. Izolarea; Miceliul este separat din mediul de cultură și cultura rezultată este filtrată (13 1) și este extrasă de trei ori cu 1,2diclormetan, utilizând câte 1,5 1 la fiecare extracție. Soluții cu 1,2-dicloretan combinate se evaporă la vacuum, la temperatura de 40*C. Reziduul brut este supus filtrării pe gel Sephadex LH-20, utilizând ca eluent metanolul. Aceste fracții ce conțin compușii ciclosporinici (525 mg) sunt extrași și cromatografiate pe silicagel (50 g, dimensiunea granulelor 0,04 - 0,063 mm, Merck), utilizând ca eluent amestec cloroform/metanol. Cromatografierea repetată, utilizând același sistem, duce la compusul pur/go/nn-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină sub forma unei pulberi amorfe de culoare albă, cu punctul de topire de 150- 153*C, lalfal^ =-225*C (c=0,53 în cloroform), și -171*C (c=0,44 în metanol).
Exemplul 3. /gama-hidroxiMeLeufi -/gama-hidroxi-MeLeuJ6 -Ciclosporină (compusul g)
Fracțiunile cele mai polare rezultate din purificarea (go/na-hidroxi-MeLeu)4Ciclosporinei sunt, în continuare, separate prin cromatografieri repetate pe silicagel (granule de dimensiunea 0,04 ... 0,063 mm), utilizând acetona cu hexanul în proporție de 2:1 ca eluent, urmată de cromatografierea pe silicagel, utilizând ca eluent amestecul de tbutil eter/metanol/apă în proporția de 90:9:1. Primele fracțiuni conțin /gozna-hidroxiLeu/4 -Ciclosporină care este în continuare purificată prin decolare cu cărbune activ, obținându-se compusul pur sub forma unei pulberi amorfe albe, cu punctul de topire de 162„.164*C. lalfalj® =-211*C (c=0,50 în CHClj), -157'C (c=0,52 în CH3OH).
Fracțiunile din urmă de la cromatografierea pe silicagel de mai sus conțin /gnma-hidroxi-MeLeu/4 -/gama-hidroxiMeLeu/6 -Ciclosporină și sunt în continuare purificate prin decolorare cu cărbune activ, obținându-se compusul din titlu pur sub forma de pulbere amorfă albă, cu punctul de topire de 157...160*C. lalfal^ =-217*C (c=0,54în CHC13), -176*C (c=0,42 în CH3OH).
Exemplul 4. /Nva/2 - /gama-hidroxiMeLeufi -Ciclosporină (compusul f)
Acest compus se prepară prin procedeul analog celui de la prepararea compusului e) (/gama-hidroxi-MeLeu/4
-Ciclosporină), dar utilizând ciclosporină G (/Nva/2 -Ciclosporină) ca material de plecare. După purificare repetată pe coloană cu silicagel, utilizând pentru eluare acetat de etil saturat cu apă și amestec de acetonă/hexan în proporție de 2:1, se obține compusul din titlu ca pulbere amorfă albă, cu punctul de topire de 138...141-C. lalfal^ =-213*C (c=0,69în CHC13), -168*C (c=0,70 în CH3OH).
Exemplul 5. /M.eValf' -Ciclosporină (compusul h)
Ciclosporină A (0,60 g = 0,5 mmoli) dizolvată în tetrahidrofuran (20 ml) este incubată cu 0,63 ml de soluție 1,6 M butillitiu (1,0 mmol) în hexan. Soluția rezultată este supusă reacției cu dimetil-sulfat (0,1 ml; 1,5 mmoli) la 78’C. Amestecul de reacție se încălzește ușor la temperatura camerei și se agită peste noapte.
Izolarea prin cromatografiere (SiO2, 5% metanol/eter), urmtă de cromatografierea KPLC (fază reversă) dă compusul din titlu. Compusul este caracterizat prin spectrul lN RMN 300 MHz în CDC13 care este prezentat în fig. 3.
Exemplul 6. /MeOTTuf -/(D)MeAlaf /MeValf -Ciclosporină (Compusul i)
Un amestec de 480 ml tetrahidrofuran (absolut) și 6,96 g (49,2 mmoli) diizopropilamină se răcește la -80* C, și i se adaugă
33,5 ml de soluție 1,33 M de butillitiu în hexan ( =44,5 mmoli), încet cu ajutorul unei seringi. Amestecul este agitat timp de 30 min la-80*C, apoi soluției i se adaugă 8 g (6,6 mmoli) ciclosporină C (/Thr/2 -Ciclosporină) în 120 ml tetrahidrofuran (absolut), cu o seringă, pe parcursul a 2...3 min. Soluția clară este agitată încă o oră, la -80’C, apoi i se adaugă, încet, 2,06 ml iodură de metil.
Amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei pe parcursul a două ore, apoi i se adaugă 40 ml apă și solvenții sunt evaporați pe un evaporator rotativ la 30’C și presiunea 15 mm Hg. Reziduul, este proporționat între apă și eter, și stratul eteric este spălat de patru ori cu saramură semisaturată, uscat pe sulfat de magneziu și evaporat, pentru a se obține un reziduu de 8,1 g·
Reziduul este cromatografiat pe 1200 g Kieselgel, cu acetat de etil saturat cu apă, obținându-se un produs care este cromato110144 gr aflat în continuare pe 200 g Kieselgel, cu 5% metanol/CH2Cl2, obținându-se compusul pur din titlu, lalfalg0 = -195*C (c=l,0 în CHC13).
FxvmpXuM Jdihidro-MeBmt)1 -Igamahidroxi-MeLeu/1 -Ciclosporină, (compusul a)
La o suspensie de 200 mg prehidrogenat 10% paladiu/cărbune în 4 ml etanol se adaugă 1,2 gr de /gam-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină (compusul e) în 10 ml etanol și se efectuează hidrogenarea la temperatura camerei, până ce nu se mai degajă hidrogen. După îndepărtarea catalizatorului prin filtrare, soluția este evaporată obținând compusul din titlu sub forma unei pulberi amorfe de culoare albă, cu punctul de topire de 154...156’C. lalfal»™ =-225*C (c=0,87 în CHClj), -169 C (c=0,70 în CH3OH).
Exemplul 8. /8’-dihidroMeBmt)1 -Coclosporină, (compusul j)
1. /O-acetil-Omega-bromo-MeBmt/1 Ciclosporină: Un amestec de 25,0 g (20 mmoli) de /-acetil-MeBmt/1 -Ciclosporină (Traber și colaboratorii, Helv. Chim. Acta, 1982, 65, 1653), 4,4 g (25 mmoli) de Nbromo-succinimidă și 400 mg de azbosisobutironitril în 250 ml de tetraclorură de carbon se încălzesc la reflux timp de 2,5 h. Solventul este evaporat și înlocuit cu eter, filtrat de solide, spălat cu apă, uscat pe sulfat de magneziu și evaporat la sec. Reziduul se cromatografiază pe silicagel cu etileter/acetilat de etil (4:1), pentru a se obține 10,7 g (40%) de produs amorf care cristalizează din eter/hexan, obținându-se 8,4 g de substanță pură; punctul de topire 207 ... 209* C. Ultimele fracțiuni de la cromatografiere conțin suplimentar 11,2 g de produs ușor, de altă calitate, mai slabă.
2. /O-acetil-omega-acetoxiMeBmt/1 -Ciclosporină: Un amestec de 4,31 g (3,3 mmoli) de produs din etapa 1 (conținând
15...20% material de pornire, estimat) și 2,1 g (8 mmoli) de tetraetil amoniu acetat tetrahidrat în 30 ml de metil etil cetonă, conținând o cantitate catalitică de clorură de sodiu, se încălzește pe baie de ulei, la 105’C, timp de 3 h, și se ține la temperatura camerei pe perioada weekend-ului. Solventul este diluat cu metil f-butil-eter și splălat cu apă și saramură. Stratul organic este uscat pe sulfat de magneziu și evaporat pentru a se obține 4,0 g de produs brut care este purificat pe coloană cu fază reversă RP-18 (240 g), pentru a se obține 3,07 g de produs din titlu: punctul de topire 191 ... 192*C.
3. /omega-hidroxi-MeBmt/1 -Ciclosporina: O soluție de 1,72 g (1,3 mmoli) de produs din etapa 2 în 75 ml de metanol și o soluție de 1,2 g sodiu în 50 ml metanol se amestecă și se ține la temperatura camerei timp de 2,5 h. Soluția se acidulează cu acid acetic. Solventul se evaporă la presiune redusă și reziduul se dizolvă în metil r-butil-eter, se spală secvențial cu apă, saramură, și soluție de bicarbonat de sodiu, se usucă pe sulfat de magneziu, și se evaporă. Produsul brut (1,6 g) se eluează de pe coloana RP-18 (240 g) cu metanol/apă 75:15 pentru a se obține 1,5 g produs pur. O probă este cristalizată din eter/hexan obținând produsul pur cu punctul de topire 181...183’C.
Exemplul 9. /MeThrf -Ciclosporină (compusul d)
Sinteza totală a ciclosporinei este descrisă în brevetele US 4396542 și 4798823 și este efectuată utilizând MeThr în locul în poziția 4 a MeLeu. Produsul are talfatg0 =249,6*C (c= 1,0 în CHClj).
Exemplul 10. /MeVal/* -Ciclosporină (compusul b)
Sinteza totală a ciclosporinei este descrisă în brevetele US 4396542 și 4798823 și este efectuată utilizând MeVal în locul în poziția 4 a MeLeu. Produsul are lalfalo™ =226*C (c=0,358 în CHC13).
Exemplul 11. Imunosuprimarea și legarea ciclofilinei din compușii activi față de Ciclosporină
Tabelul 1 prezintă exemple de: (1) raportul de legare ciclofilină (BR) a compușilor activi așa cum se măsoară prin studiul ELISA și (2) activitatea imunosupresivă a compușilor activi față de Ciclosporină, așa cum se înregistrează în studiul MLR și exprimată în procente de activitate relativă față de Ciclosporină (Raportul imunosupresiv sau IR).
Alte explicații ale semnificației acestor valori și metodelor ce conduc la aceste teste sunt date mai sus.
22
Tabelul 1
| Compusul ί | BR(loclO) ! | IR (%) |
| a) /dihidro-MeBmt/1 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 ciclosporină | θ’1 | sub 1 |
| b) /MeVal/4 -Ciclosporină | 0,1 | sub 1 |
| c) /Melle/4 -Ciclosporină | 4).2 | sub 1 |
| e) /gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină | j -0,3 | sub 1 |
| f) /Nva/2 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină | | 0,4 | sub 1 |
| h) /MeVal/5 -Ciclosporină | ί 0,4 | 5,3 |
| j) /S’-hidroxi-MeBmt/'-Ciclosporină | 1 0,35 | 1,8 |
| k) /MeAla/6 -Ciclosporină | -0,4 | 3,2 |
| 1) /gazzza-hidroxi-MeLeu/9 -Ciclosporină | 0,15 | 2,9 |
Exemplul 12. Activitatea cmti-HIV și citotoxicitatea compușilor activi
Exemple ale activității compușilor activi și ciclosporinei ca inhibitori ai replicării HIV-1 în celulele MT4 și ale citotoxicității compușilor activi și ciclosporinei în celulele MT4 sunt prezentate în tabelul 2. Semnificația acestor numere și metodelor corespunzătoare sunt prezentate mai sus.
Tabelul 2
| Compus | Citotoxicitate /ig/ml | Anti-HIV (IC^) |
| a) /Dihidro-MeBmt/1 -/gazzza-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină | 16,3 | 0,12 |
| b) /MeVal/4 -Ciclosporină | 5,4 | 0,064 |
| c) /Melle/4 -Ciclosporină | 4,5 | 0,056 |
| e) /gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină | 15,5 | 0,34 |
| f) /Nva/2 -/gazzza-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină | 14,0 | 0,85 |
| h) /MeVal/5 -Ciclosporină | 4,4 | 0,45 |
| i) /MeOThr/2 -/(D)MeAla/3 -/MeVal/5 -Ciclosporină | sub 10 | 0,45 |
| j) /S’-hidroxi-MeBmt/'-Ciclosporină | 10,6 | 0,56 |
| k) /MeAla/6 -Ciclosporină | 5,2 | 1,34 |
| 1) /gazzza-hidroxi-MeLeu/9 -Ciclosporină | sub 10 | 0,31 |
| Ciclosporină | 8,45 | 0,53 |
Compusul activ poate fi administrat prin oricare din căile convenționale de administrare, în particular enteral, de exemplu, oral, de exemplu sub formă de soluții buvabile, tablete, capsule sau suspensii, sau parenteral, de exemplu sub forma soluțiilor sau suspensiilor injectabile. Pe calea intravenoasă o doză zilnică indicată poate fi de la 1 la 20 mg/kg, preferabil de la 3 la 10 mg/kg, și calea orală poate utiliza doza de la 1 la 50 mg/kg, preferabil de la 7 la 20 mg/kg.
Toxicitatea compușilor activi se crede că este similară cu cea a Ciclosporinei. Cum compușii activi nu sunt imunosupresivi, anumite efecte secundare ale Ciclosporinei față de fenomenul imunosupresiv sunt înlăturate. Alte efecte secundare asociate cu Ciclosporina, totuși, în mod particular nefrotoxicitatea în utilizarea pe termen lung, poate fi de asemenea asociată cu compuși activi.
Formulările galenice preferate pentru compușii activi cuprind și pe cele bazate pe microemulsii, așa cum se descrie în British Patent Application 2222770 A, care includ formele topice cât și formele orale, de asemenea formele orale și injectabile obținute din soluții solide cuprinzând monoesterzaharida unui acid gras, de exemplu monolauratul zaharozei, așa cum se descrie în cererea de brevetul din GB 2209671 A. Forme de dozaj corespunzătoare pentru administrarea orală cuprind, de exemplu, de la 25 la 200 mg compus activ per doză.
Exemplu de formulare A:
Produs din ex. 1 50,0 m;
Glycofurol 75 180,0 m;
Mygliol 812 90,0 m;
Cremophor RH40 180,0 m;
αΖ/ΰ-Tocoferol 0,5 m;
Exemplu de formulare B:
Produs din ex. 1 100,0 m;
Tetraglicol 20,0 m;
Captex 800 20,0 m;
Nikkol HCO-40 860,0 m;
Butilhidroxitoluen (BHT) 1,0 m;
Exemplu de formulare C:
Produs din ex. 1 25,0 m;
Glycofurol 75 100,0 m;
Mygliol 812 35,0 m;
Cremophor RH40 90,0 m;
Butilhidroxitoluen (BHT) 0,2 m;
Exemplu de formulare D:
Produs din ex. 1 10,0 m;
Tetraglicol 10,0 m;
Miritol 5,0 m;
Cremophor RH 40 75,0 m;
a//ă-tocoferol 0,1 m.
Componenții individuali din aceste formulări, cât și metodele de preparare a lor, sunt complet descrise în British Patent Application nr. 2222770.
Claims (7)
- Revendicări1. Ciclosporine caracterizate prin aceea că au formula generală I:rW-X-R-Y-Z-Q-Ala-țDJAIa-Meleu-MeLeu-MeVab I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 | (I) în care:W este MeBmt, dihidro-Me Bmt;X este αΖ/ά-Abu, Val, Thr, Nva sauMeOThr;R este Sar sau (D) - MeAla;Y este MeLeu, gozna-hidroxi-MeLeu,Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle sau MeaThr;Z este Val, Leu, MeVal sau MeLeu și Q este MeLeu, gama-hidroxi-MeLeu sau MeAla, cu condiția ca atunci când:- Y este MeLeu sau MeAla, Z este MeVal sau MeLeu;- W este MeBmt, R este Sar și Y este γ-hidroxi-MeLeu, Z este altul decât Val;și cu activitate monimunosupresivă, toxicitate mai mică decât a ciclosporinei A și activitate farmacologică.
- 2. Ciclosporinele, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că sunt:a) /dihidro-MeBmt/1 -/gowza-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină;b) /MeVal/4 -Ciclosporină;c) /MeThr/4 -Ciclosporină;d) /ga/na-hidroxi-MeLeu/4 -Ciclosporină;e) /Nva/2 -/gawa-hidroxiMeLeu/4 -Ciclosporină;f) /gama-hidroxi-MeLeu/4 -Igamahidroxi-MeLeu/6 -Ciclosporină;g) /MeVal/5 -Ciclosporină;h) /MeOThr/2 -/(D)MeAla/3-/MeVal/5 -Ciclosporină; 5i) /S’-hidroxi-MeBmt/1 -Ciclosporină.
- 3. Ciclosporină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este (Melle)4 -ciclosporină.
- 4. Ciclosporine, conform revendi- 10 cărilor 1 sau 2, caracterizate prin aceea că sunt utilizate pentru obținerea de medicamente și compoziții farmaceutice pentru tratarea și prevenirea AIDS și a bolilor derivate din AIDS. 15
- 5. Procedeu de biosinteză a ciclosporinei, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că, cuprinde o fază de cultură a tulpinii fungice Tolypocladium implantum Gams -DSM 6627 într-un mediu 20 nutritiv și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și final purificarea acestuia prin metode cromatografice, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă amorfă. 25
- 6. Procedeu de semisinteză a ciclo26 sporinelor de la revendicarea 1 sau 2, având una sau mai multe resturi de go/nn-hidroxiMeLeu, prin biotransformarea ciclosporinei utilizând microorganisme, caracterizat prin aceea că, cuprinde o fază de cultură a unei tulpini modificate provenite de la Sebekia benihana DSM 6182 într-un mediu nutritiv, adăugarea unei ciclosporine care are una sau mai multe resturi MeLeu și izolarea produsului din bulionul de fermentație prin extracție, filtrare și purificarea acestuia pe coloană cromatografică, obținându-se produsul pur sub formă de pulbere albă amorfă.
- 7. Metodă de tratament și prevenire a SIDA și a bolilor derivate din SIDA, caracterizată prin aceea că, compuși neimunosupresivi activi tip ciclofilin - lingazi dintre ciclosporinele descrise la revendicarea 1 sau 2, pot fi administrați prin căi convenționale pentru a face reversă deplația celulelor în asociație cu SIDA a induce regresia bolilor derivate din SIDA și a reduce posibilitatea unor noi infestări, într-un dozaj zilnic de 1 până la 20 mg/kg, pentru administrare intravenoasă și 1 până la 50 mg/kg pentru administrare orală.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO92-200153A RO110144B1 (ro) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO92-200153A RO110144B1 (ro) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO110144B1 true RO110144B1 (ro) | 1995-10-30 |
Family
ID=20098373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO92-200153A RO110144B1 (ro) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO110144B1 (ro) |
-
1992
- 1992-02-13 RO RO92-200153A patent/RO110144B1/ro unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6255100B1 (en) | Cyclosporin fermentation process | |
| US4639434A (en) | Novel cyclosporins | |
| US4764503A (en) | Novel cyclosporins | |
| US4914188A (en) | Novel 6-position cyclosporin analogs as non-immunosuppressive antagonists of cyclosporin binding to cyclophilin | |
| EP0056782B1 (en) | Novel cyclosporins | |
| US5116816A (en) | Cyclosporin peptolides having an α-hydroxycarboxylic acid at position 8 | |
| MXPA00013019A (es) | Ciclosporina novedosa con perfil de actividad mejorado. | |
| Sakamoto et al. | FR901459, A NOVEL IMMUNOSUPPRESSANT ISOLATED FROM Stachybotrys chartarum No. 19392 TAXONOMY OF THE PRODUCING ORGANISM, FERMENTATION, ISOLATION, PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES AND BIOLOGICAL ACTIVITIES | |
| GB2207678A (en) | Novel immunosuppressive fluorinated cyclosporin analogs | |
| RU2085589C1 (ru) | Циклоспорины | |
| RO110144B1 (ro) | Noi ciclosporine, procedeu de sinteză a acestora și metodă de tratament și prevenire a SIDA | |
| AU596071B2 (en) | Novel cyclosporins | |
| HK1005741B (en) | Cyclosporins | |
| NO310028B1 (no) | Cyklosporiner, deres anvendelse og fremstilling samt en biologisk ren kilde | |
| JPH0338280B2 (ro) |