NO310028B1 - Cyklosporiner, deres anvendelse og fremstilling samt en biologisk ren kilde - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører cyklosporiner, deres anvendelse som farmasøytika og farmasøytiske preparater omfattende disse forbindelser, så vel som fremgangsmåter for deres fremstilling.

Cyklosporinene omfatter en klasse av strukturelt disting-tive, cykliske, poly-N-metylerte undekapeptider som felles har en farmakologisk, spesielt immunosuppressiv,antiinflam-matorisk og/eller antiparasittisk aktivitet. Det første av cyklosporinene som ble isolert var den naturlig forekommende fungale metabolitt "Ciklosporin" eller " Cyklospori-ne", også kjent som cyklosporin A og som er kommersielt tilgjengelig under handelsnavnet SANDIMMUN<R> eller SAND-IMMUNE<R>. "Ciklosporin" er cyklosporinet med formel A.

hvori MeBmt representerer N-metyl-(4R)-4-but-2E-en-l-yl-4-metyl-(L)treonyl-resten med formel B hvori -x-y- er -CH=CH- (trans). Etter den opprinnelige oppdagelse av "Ciklosporin" er det blitt isolert og identifisert en bred varietet av naturlig forekommende cyklosporiner og mange ytterligere ikke-naturlige cyklosporiner er blitt fremstilt ved hjelp av totalsyntetiske eller halvsyntetiske metoder eller ved anvendelse av modifiserte dyrkingsmetoder. Den klasse som omfattes av cyklosporinene er således nå stor og inkluderer f.eks. de naturlig forekommende cyklosporiner A til Z [jfr. Traber et al., 1, Heiv. Chim. Acta, 60, 1247-1255 (1977); Traber et al., 2, Heiv. Chim. Acta, 65, 1655-1567 (1982); Kobel et al., Europ. J. Applied Microbiology and Biotech-nology, 14, 273-240 (1982); og von Wartburg et al., Progress in Allergy, 38, 28-45, (1986)] såvel som forskjellig ikke-naturlige cyklosporinderivater og kunstige eller syntetiske cyklosporiner inkluderende dihydrocyklosporiner [hvori delen -x-y- i MeBmt-resten (formel B i det foregående) er mettet til å gi -x-y- = CH2-CH2-]; derivatiserte cyklosporiner (hvori f.eks. 3'-0-atometi MeBmtresten er acylert eller en ytterligere substituent er innført ved a-karbonatomet av sarkosylresten ved 3-stillingen); cyklosporiner hvori MeBmt-resten er tilstede i isomer form (f.ek.s. hvori konfigurasjonen over 6'-posisjonen og 7'-posisjonen av MeBmt-resten er cis snarere enn trans); og cyklosporiner hvori varierende aminosyrer er innlemmet ved spesifikke stillinger i peptidsekvensen, f.eks. ved å anvende den totalsyntetiske metode for produksjon av cyklosporiner utviklet av R. Wenger -se f.eks. Traber et al. , 1, Traber et al., 2 og Koble et al., loe. eit.; US patentskrifter 4.108.985, 4.220.461, 4.288.431, 4.554.351, 4.3 96.542 og 4.798.823, europeiske patent publikasjoner 34.567A, 56.782A, 300.784A, 300.785Aog 414.632A; inter-nasjonal patentpublikasjon WO 86/02080 og UK patentpubli-kasjoner 2.206.119 og 2.207.678; Wenger 1, Transpl. Proe, 15 Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2., Angew. Chem.Int. Ed. 24 77 (1985) og Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic natural Products, 50, 123 (1986).

Den klasse som nå omfattes av cyklosporinene er således nå virkelig stor og inkluderer f.eks. [Thr]2-, [Val]2-, [Nva]2-og [Nva]2-[Nva] 5-Ciklosporin (også kjent som cyklosporiner, henholdsvis C, D, G og M, ) , [3-O-acetyl-MeBmt] ^Ciklosporin (også kjent som cyklosporin A acetat), [dihydro-MeBmt]<1->

[Val] 2-ciklosporin (også kjent som dihydro-cyklosporin D), [ (D) Ser] 8-Ciklosporin, [Melle] "-ciklosporin, [ (D) MeVal]11-Ciklosporin (også kjent som cyklosporin H), [MeAla]^ciklosporin, [ (D) Pro] 3-Ciklosporin osv.

I samsvar med den konvensjonelle nomenklatur for cyklosporiner er disse i hele den foreliggende fremstilling og krav definert med henvisning til strukturen av Ciklosporin (dvs. cyklosporin-A). Dette gjøres ved først å indikere de rester i molekylet som er forskjellig fra dem som er tilstede i Ciklosporin og deretter å anvende betegnelsen "Ciklosporin" for å karakterisere de resterende rester som er ident-iske med dem som er tilstede i Ciklosporin. Samtidig anvendes forstavelsen "dihydro" for å betegne cyklosporiner hvori MeBmt-resten er hydrogenert (dihydro-MeBmt) dvs. hvor

-x-y- i formel B er -CH2CH2-. Således er [Thr] 2-Ciklospori-net med sekvensen vist i formel A, men hvori aAbu ved 2-stillingen er erstattet med Thr, og [dihydro-MeBmt)<1->

[Val]<2->Ciklosporin er cyklosporinet med sekvensen vist i formel A, men hvori MeBmt-resten ved- 1-stillingen er hydrogenert og aAbu ved 2-stillingen er erstattet med Val.

I tillegg er aminosyrerestene benevnt ved forkortelser, f.eks. Ala, MeVal, aAbu, etc. i samsvar med konvensjonell praksis, som forståes å ha (L)-konfigurasjonen med mindre annet er indikert, f.eks. som i tilfellet med "(D)Ala". Forkortelser for rester som foregåes av "Me" som i tilfellet med "MeLeu" representerer a-N-metylerte rester. Individuelle rester av cyklosporinmolekylet er nummerert som

vanlig på dette område i retning med urviseren og begynner med resten Me-Bmt eller dihydro-MeBmt i 1-stillingen. Den

samme nummersekvens anvendes i hele den foreliggende fremstilling og krav.

Det er nå veletablert at Ciklosporin virker ved å inter-ferere med prosessen med T-celleaktivering ved å blokkere transkripsjonsinitiering av IL-2, selv om den nøyaktige mekanisme ennå ikke er blitt oppklart. Ciklosporin er blitt vist å danne et kompleks med et 17kD cytosolisk protein (cyklofilin) som forekommer i mange celletyper og er blitt vist å være identisk med peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase, et enzym som er involvert i protein-folding. Hittil har det imidlertid ikke vært klart om binding til cyklofilinet er direkte korrelert med immunosuppressiv aktivitet i cyklosporiner, eller faktisk om cyklofilinbindingen i seg selv er et tilstrekkelig kriterium for immunosuppressiv aktivitet.

Det er nå funnet at det forekommer cyklosporiner som binder sterkt til cyklofilin, men over hodet ikke er immunosuppressive. Det følger derfor at binding til cyklofilin er en nødvendighet, men ikke et tilstrekkelig kriterium for immunosuppressiv aktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer cyklosporiner som er aktive mot HIV-1 replikasjon.

Humant immun difisient virus (HIV) infiserer foretrukket T-hjelpe (T4) lymfocytter, selv om det også replikerer i forskjellige andre celletyper, særlig slike med monocyttiske linjer. Det bevirker en sakte fremskridende sykdom i im-munsystemet karakterisert ved en gradvis T4-celledestruk-sjon, benevnt AIDS. Andre immunologiske unormaliteter av AIDS er økning av cytotoksiske/suppressor (T8) lymfocytter, en defekt i antigen presentasjons/gjenkjennelsesprosessen og polyklonal aktivering av B-celler. Mekanismen med T4-celledestruksjon er fremdeles ikke klar. Forholdsvis få T4-celler synes å være infisert og en direkte cytopatisk effekt bevirket av viruset behøver således ikke være den eneste grunn til T4-celledeplesjon. Det er fremsatt den hypotese at T4-celledestruksjonen kunne forsterkes ved en autoimmun prosess utløst ved HIV-produserende eller HIV-proteinbelagte T4-celler. Ved denne kontinuerlige antigeniske stimulasjon kan føre til en tilstand med permanent aktivering av T4-celler som ville øke HIV-replikasjonen i disse celler og ekspandere T-cytotoksiske kloner. Uinfiserte T4-celler kan gjøres antigeniske ved å binde eksogent viralt gpl2 0 til deres CD4-molekyler og ville således være et mål for et T-cytotoksisk respons.

US patentskrift 4.814.323 viser at Ciklosporin har en aktivitet mot AIDS og at generelt "cyklosporiner kjent som im-munosuppresorer" kan være nyttige ved denne indikasjon. Der er intet forslag om at ikke-immunosuppressive cyklosporiner kunne forventes å ha denne egenskap.

Overraskende er det nå funnet at cyklosporiner som binder til cyklofilin, men som ikke er immunosuppressive, frem-viser en inhiberende virkning på HIV-1 replikasjon.

Et cyklosporin ansees å binde til cyklofilin hvis det binder til humant rekombinant cyklofilin i det minste en femtedel så mye som Ciklosporin ved den konkurrerende ELISA-test beskrevet av Quesniaux i Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365. Ved denne test blir cyklosporinet som testes tilsatt under inkubasjonen av cyklofilin med belagt BSA-Ciklosporin og konsentrasjonen nødvendig til å gi en 50 % inhibering av kontrollreaksjonen uten konkurrent beregnes (IC50) . Resultatene uttrykkes som bindingsforhold (BR) , som er den 10-baserte log av forholdet mellom IC50 for testforbindelsen og IC50 ved en samtidig test med Ciklosporin i seg selv. Således indikerer et BR på 1,0 at testforbindelsen binder cyklofilin en tier-faktor mindre bra enn Ciklosporin, og en negativ verdi indikerer en sterkere binding enn bindingen av Ciklosporin.

Cyklosporinene som er aktive mot HIV har et BR under 0,7 (ettersom log10 5 = omtrent 0,7), foretrukket lik eller mindre enn 0.

Et cyklosporin ansees å være ikke-immunosuppressivt når det har en aktivitet ved den blandede lymfocyttreaksjon (MLR) på ikke mer enn 5 %, foretrukket ikke mere enn 2 %, av aktiviteten av Ciklosporin. Den blandede lymfocyttreaksjon er beskrevet av T. Meo i "Immunological methods", L. Lefko-vits og B. Peris, utgivere, Academic Press, N.Y. 227-239

(1979). Miltceller (0,5 x IO<6>) fra Balb/c mus (hunmus 8-10 uker) blir koinkubert i 5 døgn med 0,5 x IO<6> bestrålte (2000 rad) eller mitomycin C behandlede miltceller fra CBA mus (hunmus 8-10 uker). De bestrålte allogeniske celler induserer en proliferativ respons i Balb c miltceller som kan måles ved hjelp av en innlemmelse av merket forløper i DNA. Ettersom stimulatorcellene bestråles (eller mitomy-cinbehandles) responderer de ikke til Balb/c-celler med formering, men bibeholder sin antigenisitet.

IC50 funnet for testforbindelsen ved MLR sammenlignes med IC50 funnet for Ciklosporin i et parallelt forsøk.

Aktiviteten av cyklosporiner som inhibitorer for HIV-1 replikasjon kan påvises i de følgende testsystemer: 1. Inhibering av HIV- 1- indusert cytopatisk effekt i MT4-celler

Analyseprosedyren beskrevet av Pauwels et al., Virol. meth. 20/309 (1988) anvendes med små modifikasjoner. Den HTLV-I-transformerte T4-cellelinje, MT4, som tidligere ble vist å være meget gunstig for HIV-infeksjon, anvendes som målcel-le. Inhibering av HIV-1, stamme HTLV-IIIB-indusert cytopatisk effekt bestemmes ved å måle viabiliteten av både HIV-infiserte og mock-infiserte celler. Viabiliteten be-dømmes spektrofotometrisk via in situ reduksjon av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbormid (MTT). Virusinfiserte og uinfiserte kulturer uten forbindelsen inkluderes som kontroller i likhet med uinfiserte celler behandlet med forbindelsen. Cellekonsentrasjonen velges slik at antall celler pr ml øker med en faktor på 10 under den 4 døgns inkubasjon i de narreinfiserte kulturer. Virusinokulat innstilles slik at det bevirker celledød i 90 % av målcellene etter 4 døgns inkubasjon. Viruset adsor-beres på en 10 gangers konsentrert cellesuspensjon ved 37°C i 1 time. Deretter forynnes de infiserte celler 1:10 og tilsettes mikrotiterplater inneholdende testforbindelsen.

2. Cytotoksisitet

For å bedømme anti-HIV-potensialet i ytterligere cellelinjer og særlig i en monocytisk cellelinje (U937) bedømmes først cellulær toksisitet av testforbindelsen overfor disse cellelinjer. Jurkat og U937 cellesuspensjoner innstilles til 1 x IO<5> celler/ml og inkuberes i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse. Etter 48 timer sammenlignes mengden av celler pr ml ved farging med MTT. Cytotoksisitet i MT4-celler kan måles på samme måte.

3. Inhibering av HIV- 1 replikasjon i Jurkat og U937- celler T4-cellelinjen Jurkat og den monocytiske cellelinje U937 infiseres ved å suspendere cellene 10-ganger konsentrert i virusoppløsning. Adsorpsjon tillates i 2 timer ved 37°C. Cellene blir så sentrifugert ned, inokulatet fjernes og cellene resuspenderes med sin opprinnelige konsentrasjon i friskt dyrkingsmedium inneholdende testforbindelse. Således tilsettes substansen etter adsorpsjon. Ved døgn 2, 5, 8, 12, 15 og 19 etter infeksjon blir delprøver av de infiserte kulturer fjernet. Cellene sentrifugeres ned og supernatantene samles. Konsentrasjonen av viral p24 antigen bestemmes i supernatantene ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett og tjener som en parameter for virusproduksjon. Etter hver fjernelse av delprøver telles cellene og innstilles til 2 x IO<5> celler/ml ved å tilsette friskt medium inneholdende testforbindelsen ved den spesielle konsentrasjon.

Av forbindelsene i samsvar med oppfinnelsen, dvs. ikke immunosuppressive, cyklofilinbindende cyklosporiner som var aktive mot HIV-1 (aktiv forbindelse) er noen nye og andre er kjent. Anti-HIV-aktiviteten av de kjente aktive forbindelser er imidlertid ikke tidligere åpenbaret og i mange tilfeller har de kjente aktive forbindelser overhodet ikke vært vist å ha noen som helst farmasøytisk aktivitet.

Det er funnet at mange av de aktive forbindelser har struk-turer som er forskjellige fra strukturen av Ciklosporin spesifikt ved 4- og/eller 5-stillingéne.

En gruppe av aktive forbindelser er cyklosporiner hvori MeLeu-gruppen ved 4-stillingen er erstattet med en annen N-metylert aminosyre, f.eks. y-hydroksy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr eller MeAla. I tillegg til Melle og meThr kan også allo-formene Mealle og MeaThr anvendes. I allo-formen er stereokjemien ved S-stillingen motsatt konfigurasjonen av den naturlige aminosyren, slik at den normale form og allo-formen utgjør et par av diastereoisomerer.

En ytterligere gruppe av aktive forbindelser er den hvori Val ved 5-stillingen er erstattet med en N-alkyl-, foretrukket N-metyl-, aminosyre. Foretrukket er aminosyren som er N-alkylert Val eller Leu. Foretrukket blir hydrogenet av iminogruppen i [Bal]<5> erstattet med en ikke-forgrenet C-L-galkyl-gruppe, foretrukket metyl, etyl eller n-propyl, spesielt metyl. Den sistnevnte foretrukne gruppe av aktive forbindelser er samtlige nye.

Ytterligere eller alternativt kan viss aktive forbindelser være forskjellig fra Ciklosporin ved 1-, 2-, 3- og/eller 6-stillingene. Foreliggende oppfinnelse omfatter en forbindelse kjennetegnet ved formel I:

hvori

W er MeBmt, dihydro-MeBmt eller 8'hydroksy-MeBmt

X er aAbu, Val, Thr, Nva eller O-metyltreonin (MeOThr)

R er Sar eller (D)-MeAla

Y er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla,

Mealle eller MeaThr

Z er Val, Leu, MeVal eller MeLeu, og

Q er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu eller Meala

med den betingelse at når Y er MeLeu er Z enten MeVal eller MeLeu, eller W er 8'-hydroksy-MeBmt, for anvendelse som et farmasøytisk middel.

Gruppene W,X,Y,Z,Q og R har uavhengig de følgende foretrukne betydninger: W er foretrukket W hvor W er MeBmt eller dihydro-MeBmt

X er foretrukket X' når X' er aAbu eller Nva, mer

foretrukket X" hvor X" er aAbu

R er foretrukket R' hvor R<1> er Sar

Y er foretrukket Y<1> hvor Y<1> er y-hydroksy-MeLeu, MeVal, MeThr eller Melle,

Z er foretrukket Z' hvori Z' er Val eller MeVal, og

Q er foretrukket Q<1> hvor Q' er MeLeu.

En spesielt foretrukket gruppe av aktive forbindelser er forbindelsene med formel I hvori W er W, X er X', Y er Y', Z er Z', Q er Q' og R er R'.

Oppfinnelsen omfatter en forbindelse kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen omfattende:

a) [dihydro-MeBmt]<1-> [y-hydroksy-MeLeu] 4-cyklosporin

b) [MeVal]<4->cyklosporin

c) [Melle]"-cyklosporin

d) [MeThr]"-cyklosporin

e) [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin

f) [Nva]<2-> [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin

g) [y-hydroksy-MeLeu]<4-> [y-hydroksy-MeLeu] <6->cyklosporin

h) [MeVal]<5->cyklosporin

i) [MeOThr]<2>- [ (D) MeAla]3- [MeVal] <5>-cyklosporin

j ) [8 ' -hydroksy-MeBmt] ^cyklosporin

k) [y-hydroksy-Me-Leu] 9-cyklosporin,

for anvendelse som et farmasøytisk middel.

I tillegg er visse forbindelser som ikke er innenfor rammen av formel I aktive forbindelser, f. eks. 1) [MeAla] ^cyklosporin og m) [y-hydroksy-MeLeu] 9-cyklosporin.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en forbindelse med formel II:

hvori W er MeBmt eller dihydro-MeBmt,

X er aAbu, Val, Thr, Nva eller MeOThr

R er Sar eller (D)-MeAla

Y er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla,

Mealle eller MeaThr og

Z er Val, Leu, MeVal eller MeLeu,

med den betingelse at

1) når Y er MeLeu eller MeAla er Z MeVal eller MeLeu, og 2) når W er MeBmt er R Sar og Y er y-hydroksy-MeLeu, har da Z en annen betydning enn Val.

En foretrukket gruppe av nye aktive forbindelser består av forbindelser med formel II hvori Y er Y' og Z er Z', med den betingelse av når W er MeBmt har Y' en annen betydning enn y-hydroksy-MeLeu.

Spesielt foretrukne nye aktive forbindelser er forbindelsene a), b), c), d) , f) og h) i det foregående. Visse av disse forbindelser, f.eks. forbindelsene b) og c) finnes å blokkere den immunosuppressive virkning av Ciklosporin ved å blokkere dets binding til cyklofilin og således virke som Ciklosporinantagonister.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en forbindelse kjennetegnet ved at den er valgt fra følgende gruppe: [dihydro-MeBmt]1- [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [MeVal]"-cyklosporin

[Melle]"-cyklosporin

[MeThr]"-cyklosporin

[Nva]<2-> [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin

[y-hydroksy-MeLeu]"- [y-hydroksy-MeLeu] 6-cyklosporin [MeVal]<5->cyklosporin, og

[MeOThr]<2-> [ (D) MeAla]3- [MeVal] 5-cyklosporin.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av [Melle] "-cyklosporin, kjennetegnet ved å dyrke soppstammen DSM 6627 i et næringsmedium og isolere produktet fra fermenteringsvæsken.

Videre omfatter oppfinnelsen en biologisk ren kultur av en Tolyplocadium inflatum Cy E 4556, kjennetegnet ved at stammen er Tolyplocadium inflatum, DSM 662 7.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av cyklosporiner med en eller flere y-hydroksy-MeLeu-rester, kjennetegnet ved å dyrke soppstammen DSM 6182 i et næringsmedium, tilsette et cyklosporin som har en eller flere MeLeu-rester og isolere produktet fra fermenteringsvæsken.

De aktive forbindelser kan oppnås på en rekke forskjellige måter som kan klassifiseres som:

1) gjæring

2) biotransformasjon

3) derivatisering

4) partiell syntese

5) total syntese

1) Visse av de aktive forbindelser fremstilles som bipro-dukter ved gjæring av opprinnelige eller modifiserte stam-mer av cyklosporinproduserende organismer som Tolypocladium inflatum Gams, som eksemplifisert ved fremstilling av forbindelse c) beskrevet i det etterfølgende eks. 1. 2) Andre aktive forbindelser, inkluderende de kjente forbindelser j) og 1) er metabolitter av cyklosporin og kan isoleres ved hjelp av kromatografiske metoder fra urin av mennesker eller dyr som er tilført cyklosporin. Videre er disse og andre metaboliske transformasjoner mulige under anvendelse av mikroorganismer, f.eks. produksjon av forbindelse e) og g) ved biotransformasjon av cyklosporin A, som beskrevet i eksemplene 2 og 3, eller fremstilling av forbindelse f) ved biotransformasjon av cyklosporin G (eks. 4). Disse eksempler demonstrerer den nye fremgangsmåte for fremstilling av cyklosporiner med en eller flere y-hydroksy-MeLeu-rester, omfattende trinnene med å dyrke en ny modifisert stamme av Sebekia benihana, tilsetning av cyklosporin med en eller flere MeLeu-rester og isolering av produktet fra gjæringsvæsken. 3) Ved derivatisering menes at naturlige eller syntetiske cyklosporiner kan omdannes til aktive forbindelser ved hjelp av en eller flere kjemiske reaksjoner hvori en eller flere av aminosyrene modifiseres uten at peptidbindingene åpnes og omdannes. F.eks. kan klassen av aktive forbindelser hvori Val ved 5-stillingen N-alkyleres oppnås ved å omsette det tilsvarende cyklosporin med Val ved 5-stillingen med butyllitium, etterfulgt av reaksjon med et alkyler-ende middel, som eksemplifisert for forbindelsen h) i eks.

5 og for forbindelsen i) i eks. 6.

Som ytterligere eksempler kan forbindelsen a) fremstilles ved hydrogenering av forbindelsen e) (eks. 7) og forbindelsen j) som også er en hovedmetabolitt av Ciklosporin, kan fremstilles fra den kjente forbindelse Ciklosporinacetat som beskrevet i eks. 8. 4) Betegnelsen partiell syntese anvendes for å angi en rekke kjemiske reaksjoner hvori ringen av naturlig cyklosporin åpnes, en eller flere aminosyrer fjernes og forskjellige aminosyrer tilsettes, og ringen lukkes på nytt. 5) Den totale syntese av cyklosporiner kan gjennomføres ved å .bygge opp et lineært undecapeptid og ringslutning som beskrevet av Wenger (loe. eit.), se også US patentskrifter 4.3 96.542 og 4.798.823. I prinsippet kan et hvilket som helst cyklosporin fremstilles ved den totale syntesemåte, selv hvor en av de andre metoder er tilgjengelig, kan denne være mer fordelaktig enn total syntese. Total syntese kan anvendes for fremstilling av forbindelsen d) (eks. 9) og for den kjente metabolittforbindelse 1) .

Forbindelsen k) er en kjent substans med egenskaper beskrevet av Quesniaux et al., (Mol. Immuno. 24 1159 1987) og kan også fremstilles ved total syntese. F.eks. er en total syntese av denne forbindelse beskrevet i USP 4.914.188.

Eksempel 1 [Melle]<4->Ciklosporin (forbindelse c)

Produserende stamme

Forbindelse c) oppnås ved gjæring av soppstammen Tolypocladium inflatum Cy E 4556, deponert ved Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen under betingelsene for Budapest overens-komsten den 24. juli 1991 under tilgjengelighetsnummer DSM 6627. Denne stamme er en mutant av stammen NRRL 8044 av species Tolypocladium inflatum Gams, og er taksonomisk identisk med den parentale stamme som er blitt fullstendig beskrevet f.eks. i britisk patent 1.491.509.

Kultur 1. Agar- utqanqskultur:

Agar skråkulturer av stammen DSM 6627 dyrkes i 14 døgn ved 2 7°C på følgende agarmedium:

Mediet har en pH på 5,4-5,6 og steriliseres i 20 min. ved 120°C.

2. Forkultur:

Sporer fra myceliet av 4 utgangskulturer suspenderes i 4 0 ml av en 0,9 % saltoppløsning. En serie på 500 ml Erlenmeyerkolber hver inneholdende 100 ml forkulturmedium inokuleres hver med 2 0 ml av denne suspensjon. Sammensetningen av forkulturmediet er som følger:

avmineralisert vann til 1000 ml

Mediet innstilles til pH 5,2-5,5 med HC1 og steriliseres så i 2 0 min. ved 12 0°C. Forkulturene fermenteres i 24 timer ved 2 7°C på en roterende rystemaskin ved 2 00 omdr. pr min. med en eksentrisitet på 50 mm.

3. Intermediær kultur:

En 25 liters stålfermentor inneholdende 20 1 forkulturmedium inokuleres med 2 00 ml forkultur. Den intermidiære kultur fermenteres i 5 døgn ved 27°C med en omrøringstakt på 150 omdr. pr min. og en luftstrøm på 0,5 l/min. pr 1 medium ved 0,5 bar trykk.

4. Hovedkultur:

10 0 1 forkulturmedium inokuleres med 10 1 intermediær kultur og fermenteres i en 120 1 stålfermenter. Til dette medium tilsettes 4 g/l D-Threonin, sterilisert ved filtrering.

Fermentering gjennomføres ved 2 7°C i 14 døgn med en omrør-ingstakt på 70 omdr. pr min. og en luftstrøm på 0,4 l/min. pr 1 medium ved 0,5 bar trykk anvendt for de første 5 døgn idet omrøringstakten deretter økes til 100 omdr. pr min. og luftstrømmen til 0,5 l/min. for resten av fermenterings-perioden.

Isolering:

Mycelet som separeres fra dyrkingsmediet og ekstraheres i et Turrax-apparat ved knusing og omrøring 3 ganger med 10 1 metanol/vann (9:1 volumbasis). Det knuste mycelium separeres fra løsningsmidlet ved sugefiltrering og de kombinerte filtrater konsentreres ved inndamping under vann ved en temperatur på 40°C inntil dampen hovedsakelig består av vann alene. Den oppnådde blanding ekstraheres 4 ganger under anvendelse av 2 1 1,2-dikloretan ved hver ekstraksjon og de kombinerte 1,2-diklormetan-oppløsninger konsentreres ved inndamping under vakuum ved en temperatur på 4 0°C.

Resten underkastes silikagelkolonne-kromatografi (10 kg silikagel, granulatstørrelse 0,02 - 0,045 mm, "Grace") under anvendelse av etylacetat/vann som elueringsmiddel (fraksjoner på 2,5 1). Fraksjonene 20 - 23 inneholdende

[Melle] "-Ciklosporin samles og separeres da videre ved hjelp av silikagelkolonnekromatografi (600 g silikagel, granulatstørrelse 0,04 - 0,063 mm, "Merck") under anvendelse av kloroform/metanol (98:2 volumbasis) som elueringsmiddel (fraksjonsstørrelse 3 00 ml). Ytterligere rensing oppnås ved hjelp av silikagel-kolonnekromatografi (400 g silikagel, granulatstørrelse 0,04 - 0,063 mm, "Merck") under anvendelse av metylenklorid/metanol (98:2 volumbasis) som elueringsmiddel (fraksjonsstørrelse 200 ml) som gir rent [Melle]"-Ciklosporin som et amorft hvitt pulver med smp. 155-188°C [<x]20/D = -235° (c = 0,68 i CHCl3) og -193°

(c 0 0, 74 i CHjOH) .

IR-spektrum i CH2C12 som vist i fig. 1 og proton NMR-spektrum i CDC13 er som vist i fig. 2.

Eksempel 2 [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin (forbindelse e)

Forbindelse e) oppnås ved biotransformasjon av Ciklosporin ved hjelp av mikroorganismen Sebikia benihana. Den opprinnelige stamme som anvendes er benevnt NRLL 11111 og hører til slekten Sebikia benihana (Dietz og Li: Sebekia, en ny slekt av familien Actinoplanaceae. Abstrs. 82nd Ann.Meet:-Amer.Soc. Microbiol., 163, Atlanta, 1982). Denne stammen er istand til å hydroksylere novobiocin. Den subdyrkede stamme som anvendes for fremstillingen av forbindelsen e) og beslektede forbindelser er deponert ved German Collec-tion of Microorganism (D-3300 Braunschweig) under nummer DSM 6182.

1. Aqar- utqangskultur:

Agar skråkulturer av stammen DSM 6182 dyrkes i 10 døgn ved

2 7°C på følgende agarmedium:

Avmineralisert vann opp til 1 1.

pH: nøytralisert ved 7 med NaOH/H2S04

sterilisering 120°C/20 min.

Sporstoffoppløsning nr 235:

Avmineralisert vann opp til 999 ml

H2S04 1 ml

Forkulturene fermenteres i 3 døgn ved 2 7°C på en rotasjonsrystemaskin ved 200 omdr. pr min. med en eksentrisitet på 5 0 mm.

3. Intermediær kultur:

En serie på 200 ml Erlenmeyer-kolber hver inneholdende 5 0 ml av forkulturmediet inokuleres hver med 5 ml forkultur. Den intermidiære kultur fermenteres i 3 døgn ved 2 7°C på en rotasjonsrystemaskin ved 2 00 omdr. pr min. med en eksentrisitet 50 mm.

4. Hovedkultur:

En serie på 500 ml Erlenmeyer-kolber hver inneholdende 5 0 ml av hovedmediet (totalt 12 1) inoforkulturkuleres hver med 5 ml intermidiær kultur. Disse kulturer fermenteres i 3 døgn ved 2 7°C på en rotasjonsrystemaskin ved 2 00 omdr. pr min. med en eksentrisitet 50 mm. Etter 24 timer tilsettes cyklosporin A (7,5 mg) oppløseliggjort i metanol til hver hovedkultur (= 150 mg/l).

Sammensetningen av hovedkulturmediet er som følger:

Avmineralisert vann opp til 1 1.

pH: innstilt til 7,2-7,5 (KOH/H2S04)

sterilisering: 120°C/20 min.

Sporstoffoppløsning av AC-1: Denne oppløsning har samme sammensetning som oppløsning nr 235 med tilsetning av (NH4)6Mo7024 0 , 2 g.

5. Isolering:

Mycelet separeres fra dyrkingsmediet og det resulterende dyrkingsfiltrat (13 1) ekstraheres tre ganger med 1,2-di-kloroetan under anvendelse av 1,5 1 ved hver ekstraksjon. De kombinerte 1,2-dikloroetan-oppløsninger inndampes under vakuum ved en temperatur på 40°C. Den rå rest underkastes Sephadex LH-20 gelfiltrering under anvendelse av metanol som elueringsmiddel. De fraksjoner som inneholder cyklo-sporinforbindelser (52 5 mg) samles og kromatograferes på silikagel (50 g, granulatstørrelse 0,04-0,063 mm, "Merck") under anvendelse av kloroform/metanol som elueringsmiddel. Gjentatt kromatografi under anvendelse av det samme system gir rent [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin som et amorft hvitt pulver med smp 150-153°, [a] D20 = -2 2 5° (c = 0,53 i CHC13) , -171° (c = 0,44 i CH3OH) .

Eksempel 3 [y-hydroksy-MeLeu]4- [y-hydroksy-Leu] 6-Ciklosporin

(forbindelse g)

De mer polare sidefraksjoner som skriver seg fra rensingen fra [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin separeres videre ved hjelp gjentatt silikagel-kolonnekromatografi (granulat-størrelse 0,04 - 0,0063 mm) under anvendelse av aceton/heksan 2:1' som elueringsmiddel etterfulgt av kromatografi på silikagel under anvendelse av metyl-t-butyleter/metanol/- vann 90:9:1 som elueringsmiddel. De første fraksjoner inneholder [y-hydroksyLeu] "-ciklosporin som renses videre ved avfarging med trekull og gir den rene forbindelse som et amorft hvitt pulver, smp. 162-164°C, [a] 20D = -211° (c = 0,50 i CHCI3) , -157° (c = 0,52 i CH30H) .

De senere fraksjoner fra den ovennevnte silikagel-kolonnekromatografi inneholder [y-hydroksy-MeLeu]"-[y-hydroksy-MeLeu] 6-Ciklosporin og renses videre ved avfarging med trekull og gir den rene i overskriften forbindelse som et amorft hvitt pulver med smp 157-160°C, [a] <20>D -217° (c = 0,54 i CHCI3) , - 176°(c = 0,42 i CH3OH) .

Eksempel 4 [Nva]2- [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin

(forbindelse f)

Denne forbindelse fremstilles ved hjelp av en prosedyre analog med fremstillingen av forbindelsen e ( [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin) , men ved å anvende cyklosporin G

([Nva] 2-Ciklosporin) som utgangsmaterial. Etter rensing ved hjelp av gjentatt silikagel-kolonnekromatografi under anvendelse av etylacetat mettet med vann henholdsvis ace-ton/heksan 2:1 som elueringsmiddel oppnås den i overskriften nevnte forbindelse som et amorft hvitt pulver med smp. 138-141°C, [a]<20>D -213° (c = 0,69 i CHCl3), -168° (c = 0,70

i CHjOH) .

Eksempel 5 [MeVal] 5-Ciklosporin (forbindelse h)

Cyklosporin A (0,60 g = 0,5 mmol) oppløst i tetrahydrofuran (20 ml) inkuberes med 0,63 ml av 1,6 M oppløsning av butyllitium (1,0 mmol) i heksan. Den resulterende oppløsning omsettes med dimetylsulfat (0,1 ml, 1,5 mmol) ved -7 8°C. Reaksjonsblandingen oppvarmes sakte til romtemperatur og omrøres over natten.

Isolering ved hjelp av hurtigkromatografi (Si02, 5 % metanol/eter) , etterfulgt av HPLC (revers fase) ga den i overskriften nevnte forbindelse. Forbindelsen karakteriseres ved et 300 MHz <*>H NMR spektrum i CDC13 som vist i fig. 3.

Eksempel 6 [MeOThr]2- [ (D) MeAla]3- [MeVal] 5-Ciklosporin

(forbindelse i)

En blanding av 480 ml THF (absolutt) og 6,96 g (49,2 mMol) diisopropylamin avkjøles til -80°C og 33,5 ml av en 1,33 M oppløsning av butyllitium i heksan (= 44,5 mMol) tilsettes sakte gjennom en sprøytenål. Blandingen omrøres i 3 0 min. ved -80°C og deretter tilsettes en oppløsning av 8 g

(6,6 mMol) cyklosporin C ( [Thr] 2-Cyklosporin) i 120 ml absolutt THF gjennom en sprøytenål i løpet av 2 - 3 min.Den klare oppløsning omrøres i ytterligere en time ved -80°C og deretter tilsettes sakte 2,06 ml metyljodid.

Blandingen blir oppvarmet til romtemperatur i løpet av 2 timer og deretter tilsettes 40 ml vann og løsningsmidlene avdampes på en rotasjonsfordamper ved 3 0°C /15 mm hg. Resten fordeles mellom vann og eter og eterlaget vaskes fire ganger med halvmettet saltløsning, tørkes over MgS04 og inndampes til å gi en rest på 8,1 g.

Resten kromatograferes på 1200 g kieselgel med vannmettet etylacetat til å gi et råprodukt som etter en ytterligere kromatografi på 200 g kiselgel med 5 % MeOH /CH2Cl2 gir det rene i overskriften nevnte produkt, [a] <20>D = -195°C (c = 1,0 i CHCI3) .

Eksempel 7 [dihydro-MeBmt]x-[y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin

(forbindelse a)

Til en suspensjon av 200 mg forhåndshydrogenert 10 % palla-dium/trekull i 4 ml etanol tilsettes 1,2 g [y-hydroksy-MeLeu] "-Ciklosporin (forbindelse e) i 10 ml etanol og hydrogenering gjennomføres ved romtemperatur inntil hydrogen ikke lenger opptas. Etter fjernelse av katalysatoren ved filtrering inndampes oppløsningen og gir den i overskriften nevnte forbindelse som et amorft hvitt pulver med smp. 154-156°C, [a]<20>D -225° (c = 0,87 i CHCl3) , -169° (c = 0,70 i CH3OH) .

Eksempel 8 [8 1 -hydroksy-MeBmt] ^Ciklosporin (forbindelse j)

1. [ Q- acetvl- cobromo- MeBmt] ^ Ciklosporin

En blanding av 25,0 g (20 mMol) [O-acetyl-MeBt] ^Ciklosporin (Traber et al, Heiv. Chim. Acta 1982, 65, 1653), 4,4 g (25 mMol) N-bromosuccinimid og 400 mg azobisisobutyronitril

1 250 ml karbontetraklorid oppvarmes under tilbakeløp i 2,5 time. Løsningsmidlet avdampes og erstattes med eter, fast-stoffet frafiltreres, vaskes med vann, tørkes over magnesi-umsulfat og inndampes til tørrhet. Resten kromatograferes

over silikagel med etyleter/etylacetat (4:1) til å gi 10,7 g (40 %) amorft produkt som krystalliseres fra eter/heksan til å gi 8,4 g ren substans med smp 207-209°C. Senere fraksjoner av kromatogrammet inneholdt ytterligere 11,2 g produkt med noe mindre kvalitet.

2 . [ O- acetvloo- acetoksv- MeBmtl ^ Ciklosporin:

En blanding av 4,31 g (3,3 mMol) av produktet fra trinn 1 (forurenset med anslått 15-20 % utgangsmaterial) og 2,1 g (8 mMol) tetraetylammoniumacetat-tetrahydrat i 30 ml metyl-etylketon, inneholdende en katalytisk mengde natriumjodid, oppvarmes i et oljebad ved 105°C i 3 timer og holdes ved romtemperatur over weekenden. Løsningsmidlet fortynnes med metyl-t-butyleter og vaskes med vann og saltløsning. Det organiske lag tørkes over MgS04 og inndampes og etterlater 4,0 g råprodukt som renses på en RP-18 reversfasekolonne (240 g) til å gi 3,07 g av det i overskriften nevnte produkt med smp 191-192°C.

3 . [ co- hydroksy- MeBmt 1 ^ Ciklosporin:

En oppløsning av 1,72 g (1,3 mMol) av produktet fra trinn 2 i 75 ml metanol og en oppløsning av 1,2 g natrium i 50 ml metanol blandes og holdes ved romtemperatur i 2,5 time. Deretter surgjøres oppløsningen med eddiksyre. Løsnings-midlet avdampes under redusert trykk og resten oppløses i metyl-t-butyleter, vaskes i rekkefølge med vann, saltløs-ning og natriumbikarbonatoppløsning, tørkes og MgS04 og inndampes. Råproduktet (1,6 g) elueres fra en RP-18 kolon-ne (240 g) med metanol/vann 75:15 til å gi 1,5 g råprodukt. En prøve krystalliseres fra eter/heksan til å gi et kry-stallinsk produkt med smp 181-183°C. Eksempel 9 [MeThr] "-Ciklosporin (forbindelse d) Totalsyntesen av Ciklosporin som beskrevet i USP 4.3 96.542 og 4.798.823 gjennomføres under anvendelse av MeThr i 4-stillingen i stedet for MeLeu. Produktet har [a] 20D = -249, 6° (c = 1,0 i CHC13) .

Eksempel 10 [MeVal] "-Ciklosporin (forbindelse b)

Totalsyntesen av Ciklosporin som beskrevet i USP 4.3 96.542 og 4.798.823 gjennomføres under anvendelse av MeVal i 4-stillingen i stedet for MeLeu. Produktet har [a] 20D = -226°

(c = 0,358 i CHCI3.

Eksempel 11 immunosuppresjon og cyklofilinbinding av aktive forbindelser i forhold til Ciklosporin

Tabell I gir eksempler på (1) cyklofilin-bindingsforhold (BR) av aktive forbindelser som målt ved en ELISA-analyse og (2) den immunosuppressive aktivitet av aktive forbindelser i forhold til Ciklosporin som målt ved hjelp av en MLR-analyse og uttrykt som en prosentvis aktivitet i forhold til Ciklosporin (Immunosuppressivt forhold eller IR).

Ytterligere forklaring av betydningen av disse verdier og fremgangsmåtene for å gjennomføre disse tester er angitt i det foregående.

Forbindelse 12 Anti-HIV-aktivitet og cytotoksisitet av aktive forbindelser

Eksempler på aktiviteten av aktive forbindelser og Ciklosporin som inhibitorer av HIV-1-replikasjon i MT4-celler og cytotoksisiteten av aktive forbindelser og Ciklosporin i MT4-celler er angitt i tabell II. Betydningen av disse verdier og angjeldende metoder er drøftet i det foregående.

De aktive forbindelser er indikert både for prevensjon av AIDS i asymptomatiske HIV-positive pasienter og ved behandling av pasienter som lider av AIDS. I pasientene hvori AIDS er utviklet skulle tilførsel av den aktive forbindelse reversere T4-celledeplesjonen assosiert med AIDS, indusere regresjon av AIDS-relaterte forstyrrelser som f.eks. Kapo-sis sarcom, og redusere sannsynligheten for nye anlednings-vise infeksjoner.

Fremgangsmåte for behandling og prevensjon av ervervet im-minodefisiens-syndrom og andre forstyrrelser indusert av HIV-1 virus i en pasient som er smittet av det nevnte virus kan anvendes, omfattende at pasienten tilføres en effektiv mengde av en aktiv forbindelse i samsvar med oppfinnelsen.

Den aktive forbindelse kan tilføres på en hvilken som helst konvensjonell måte, spesielt enteralt, f.eks. oralt, f.eks. i form av oppløsninger for drikking, tabletter eller kaps-ler for parenteral tilførsel, f.eks. i form av injiserbare oppløsninger eller suspensjoner. Ved den intravenøse måte kan en indikert daglig dose være fra 1 til 20 ml/kg, foretrukket fra 3 til 10 mg/kg og ved den orale måte fra 1 til 50 mg/kg, foretrukket fra 7 til 20 mg/kg.

Toksisiteten av de aktive forbindelser antaes å være lign-ende Ciklosporin. Ettersom de aktive forbindelser ikke er immunosuppresive, unngås visse bivirkninger av Ciklosporin i forbindelse med immunosuppresjon. Andre bivirkninger assosiert med Ciklosporin kan imidlertid, særlig nefro-toksisiteten ved langvarig bruk, også være assosiert med de aktive forbindelser.

Galeniske preparater for de aktive forbindelser som kan anvendes, inkluderer preparater basert på mikroemulsjoner som beskrevet i britisk patentansøkning 2.222.770A som inkluderer topiske så vel som orale former. Også orale og injiserbare former oppnådd fra faste oppløsninger omfattende en fettsyre sakkaridmonoester, f.eks. sakkarose-monolaurat, som beskrevet i britisk patentansøkning 2.209.671A kan anvendes. Passende enhetsdoseformer for oral tilførsel omfatter f.eks. fra 25 til 200 mg aktiv forbindelse pr dose.

Sammensetningseksempel A:

Sammensetninqseksempel B:

Sammensetningseksempel C:

Sammensetningseksempel D:

De individuelle komponenter av disse sammensetninger, så vel som metodene for deres fremstilling, er fullstendig beskrevet i britisk patentsøknad 2.222.770 idet innholdet av disse er innlemmet heri som referanse.

Claims (10)

1. En forbindelse, karakterisert ved at den har formel I hvori W er MeBmt, dihydro-MeBmt eller 8<1>hydroksy-MeBmt X er aAbu, Val, Thr, Nva eller O-metyltreonin (MeOThr) R er Sar eller (D)-MeAla Y er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle eller MeaThr Z er Val, Leu, MeVal eller MeLeu, og Q er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu eller MeAla med den betingelse at når Y er MeLeu er Z enten MeVal eller MeLeu, eller W er 8'-hydroksy-MeBmt, for anvendelse som et farmasøytisk middel.

2 . En forbindelse som angitt i krav 1, karakteriser t v e d at den har formel I' hvori W er MeBmt eller dihydro-MeBmt X<1> er a-Abu eller Nva, Y' er y-hydroksy-MeLeu, MeVal, MeThr eller Melle, og Z' er Val eller MeVal for anvendelse som et farmasøytisk middel.

3 . En forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen omfattende: [dihydro-MeBmt]<1-> [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [MeVal] "-cyklosporin [Melle]"-cyklosporin [MeThr] "-cyklosporin y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [Nva]<2-> [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [y-hydroksy-MeLeu]"- [y-hydroksy-MeLeu]<6->cyklosporin [MeVal]<s->cyklosporin [MeOThr]<2-> [ (D) MeAla]3- [MeVal] "-cyklosporin [8 1 -hydroksy-MeBmt]1-cyklosporin, og [y-hydroksy-MeLeu] 9-cyklosporin for anvendelse som et farmasøytisk middel.

4 . Anvendelse av en forbindelse som angitt i krav 1, 2 ,eller 3 ved fremstilling av et medikament for behandling og prevensjon av AIDS og AIDS-relaterte forstyrrelser.

5 . En forbindelse med formel II, hvori W er MeBmt eller dihydro-MeBmt, X er aAbu, Val, Thr, Nva eller MeOThr R er Sar eller (D)-MeAla Y er MeLeu, y-hydroksy-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MeAla, Mealle eller MeaThr og Z er Val, Leu, MeVal eller MeLeu, med den betingelse at

1) når Y er MeLeu eller MeAla er Z MeVal eller MeLeu, og

2) når W er MeBmt er R Sar og Y er y-hydroksy-MeLeu, har da Z en annen betydning enn Val.

6. En forbindelse som angitt i krav 5, karakterisert ved at den har formel II 1 hvori W MeBmt eller dihydro-MeBmt Y' er y-hydroksy-MeLeu, MeVal, MeThr eller Melle og Z' er Val eller MeVal, med den betingelse at når W er MeBmt, har Y' en annen betydning enn y-hydroksy-MeLeu.

7 . En forbindelse karakterisert ved at den er valgt fra følgende gruppe: [dihydro-MeBmt]<1-> [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [MeVal] "-cyklosporin [Melle] "-cyklosporin [MeThr] "-cyklosporin [Nva]2- [y-hydroksy-MeLeu] "-cyklosporin [y-hydroksy-MeLeu]"- [y-hydroksy-MeLeu] 6-cyklosporin [MeVal] 5-cyklosporin, og [MeOThr]<2-> [ (D) MeAla]3- [MeVal] 5-cyklosporin.

8 . En fremgangsmåte for fremstilling av [Melle] "-cyklosporin, karakterisert vedå dyrke soppstammen DSM 6627 i et næringsmedium og isolere produktet fra fermenteringsvæsken.

9. En biologisk ren kultur av en Tolyplocadium inflatum Cy E 4556, karakterisert ved at stammen er Tolyplocadium inflatum, DSM 6627.

10 . En fremgangsmåte for fremstilling av cyklosporiner med en eller flere y-hydroksy-MeLeu-rester, <k>arakteri-sert vedå dyrke soppstammen DSM 6182 i et næringsmedium, tilsette et cyklosporin som har en eller flere MeLeu-rester og isolere produktet fra fermenteringsvæsken.