DK173335B1 - Cycliske peptolider, fremgangsmåde til fremstilling deraf, farmaceutiske præparater indeholdende de cycliske peptolider, en - Google Patents

Description

DK 173335 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte cycliske peptolider, en fremgangsmåde til fremstiling deraf, farmaceutiske præparater indeholdende disse cycliske peptolider, en fermentationsvæske samt furigusstammen NRRL 18230.

5 Udtrykket "peptolid" skal her betegne en naturlig eller syntetisk forbindelse bestående af o-hyditoxy- og a-anlnosyrer, der er bundet gasmen af både anid- og esterbindinger. Den struktur, der fås ved at erstattte en anidbincflng ned eh esterbinding 1 et peptid, er således et peptolid.

10

En vigtig klasse peptider er cyclosporineme, der er karakteriseret ved en cycllsk struktur, son normalt onfatter 11 aminosyrerester, af hvilke én er N-methyl-(4R)-4-bi»t-2E*en-l-yl-4-methyl-(L)-threonyl- resten, betegnet MeBmt, eller ét derivat deraf. Mange cyclosporiner har farmakologiske egenskaber, isar immunosuppressive og antiin-15 flammatoriske egenskaber. Den £erste cyclosporin, der blev isoleret, var den naturligt forekommende fungale metabolit cyclosporin A (Ciclosporin), der forhandles bomoercielt under det registrerede varemarke Sandimmune·. Denne forbindelse har den i forael I angivne struktur.

20

MeBnt-Abu-Sar-HeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal —. I I 1 2 3 4 5 6 7 6 9 10 11 | 25 (En komplet liste af forkortelser fremgår af tabel II i slutningen af narvarende beskrivelse.)

Konventionelt nummereres cyclosporiners aminosyrerester med uret 2Q begyndende med MeBmt-resten. Alle a-aminosyrer har (L)-konfiguration, medmindre andet er angivet: således har alanin 1 stilling 8 1 formlen I (D)-konfiguration. Symbolet Me foran forkortelsen for en aminosyre angiver, at aminosyreresten er N-methyleret på nitrogenatomet i amidbindingen.

" 35 Det cycliske peptolid ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har struktur som en cyclosporin, i hvilken en amidbinding er erstattet af en esterbinding.

2 DK 173335 B1

Det cycliske peptolid er fortrinsvis sammensat af en MeBmt-rest eller et derivat deraf, 9 andre α-aalnosyrerester og en a-hydroxysyrerest, som fortrinsvis befinder sig 1 stilling 8.

Foretrukne derivater af MeBat er 8'hydroxyderivatet (8'0HHeBmt) og 5 det nattede dihydroderlvat MeBntH2 ned de nedenfor viste strukturer ^ /H HOCK, H % il II f2

H — C—CH- c' I

I 2 ^ CH- I CH- HO fo\CH ,B,| ‘ CH-

Η0^(ΚΚ\ HO ^CK

ch3 Γ * Γ -C" CHN"h

i 3 1 — N- tH — CO — .3 1 J

— N — CH - CO-- I 1 ,ς. (S) — N — CH — CO - (S) (S)

HeBmt S'OtMeBMt NeØrntH^

De foretrukne cycliske peptollder ifelge opfindelsen har den ned formel II viste struktur

:V - Thr - X - T - Z - HeLeu - Ala - A - NeLeu - Leu - MeVal 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 / II

hvor V betegner MeBmt, S'-OHMeBmt eller MeBmtH2 X betegner Sar eller Cly Y betegner HeLeu eller Leu Z betegner Leu, Ile eller Val IS og A betegner resten af en ck-hydroxycarboxylsyre,

fortrinsvis ned formlen III

R

- 0 - ia - CO - III

hvor R er C^.^-elkyl.

3 DK 173335 B1

Here foretrukket er R i formlen III Isopropyl, så at A betegner

CH

— o — Ih- co— .

resten af en a-hydroxyisovalerianesyre, forkortet Hiv. Den mest foretrukne forbindelse ifelge opfindelsen er den forbindelse med formlen II, hvor W er KeBmt, X er Sar, Y er MeLeu, Z er Leu, og A er 5 (D)Hiv. Denne forbindelse kan vises ved den fulde strukturformel vist i formel IV

e*,

C

CM3\ /ch> Cl I

CH «0. ^CM· CH, I Vscm3 I t

cm, CM, Cm Ch, |,β> CH—OH CM j 1V

H-M-CH-CO-M —in—C—-M . CH—-CO—M—Ih—-C—I CH,

| * ‘4 1 i i 4 ; I

CO 10 H 1 3 3 I

e-\ i r

Ch-Cm.-Cm i 9 /1 1 CHj I N-CH,

CH..N 9 7 6 5 * I

’ I Q 1 H O H

( o I I i I i I i I

OC-CH O —CO-Ch—n——CO—Ch — N—— C—Ch-—H-CO—CH

^CM CH, CH, Ch, Ih, Cm, cm, VcM* /«k ^ CH, Ch, CH, CH, Ch, Ch, 10 eller ved at anvende den nu konventionelle nomenklatur for cyclo-sporiner, som er baseret på strukturen af Ciclosporin (cyclosporin A), der er vist i formel I. Dette geres ved i rakkefelge at anfere hver rest i molekylet, som afviger fra, hvad der findes i Ciclosporin, og tilfeje udtrykket "Ciclosporin*. Forbindelsen med formlen 15 IV kan således betegnes som (Thr)2 (Leu)5 (D-Hiv)· (Leu)*° - Ciclosporin, *· 4 DK 173335 B1 det vil sige Ciclosporin, hvor Thr erstatter Abu i stilling 2, Leu erstatter Val i stilling 5, (D)Hiv erstatter D(Ala) i stilling 8, og Leu erstatter MeLeu i stilling 10, idet de andre rester er identiske ned resterne i Ciclosporin.

5

Ifølge opfindelsen kan de cycliske peptider fremstilles ved, at man dyrker en producerende mikroorganismestamme i nærværelse af et næringsmedium. Foretrukne mikroorganismer er fungusstammer af arten Cvlindrotrichum Bonorden, især stammen NRRL 18230, der producerer cycliske peptolider med formlen li 10

Stammen er isoleret fra en bladprøve fra tfaldenburg i schweizisk

Jura, og en levedygtig kultur af stammen er deponeret den 17. juni 1987 hos "US Department of Agriculture" (North Central Region,

Northern Regional Research Centre), Peoria, 111. og har fået nummeret NRRL 18230. Kulturen kan også fås fra Sandoz Ltd., Basel, Schweiz.

15

Fungus5tamnien NRRL 18230 er en hyphomycet, og når den inkuberes ved 21-24*C på 21 oaltekstrakt/agar (-MA; 2X maltekstrakt, 0,4X gærings -ekstrakt, 21 agar 1 demineraliseret vand), producerer den aseptatp. eller ofte 1-septate bacilliforme hyaline conidier med størrelsen 6-20 15 μη x 1,5-2,7 μη (for det meste 9,5-13,5 μη).

De conidiogene celler er almindeligvis cylindriske og har en udtalt colarette; nogle celler fremtræder sympodial-polyphlalldiske. Ifølge identifikationsnøglen af M.B. Elles (Denatiaceous Hyphomycetes; 25 Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1971) kan stammen bedst klassificeres som hørende til arten Cylindrotrichupi Bonorden.

Fungusstammen NRRL 18230 vokser relativt langsomt, og efter 10 dages 2Q inkubation ved en temperatur på 21*C danner den kolonier med en diameter på 4-7 mm med et fløjsgråt luftmycelium. Den optimale

vaksttemperatur er mellem 18*C og 27*C, og ved temperaturer over 33*C

sker der ingen vækst. Det forgrenede og septate luftmycelium hos kolonier, der dyrkes på MA ved 21"C er sædvanligvis 1,5-3,5 μια (sædvanligvis 2-3 μηι) brede; i substratet kan der observeres 35 myceliumhyphae med en bredde på op til 5,5 μια.

5 DK 173335 B1

Opfindelsen angår også fermentationsvæsljer, der er vundet ved dyrkning af en cyclisk peptolid-producerende fungusstamme af ^rten Cvlindrotrichum Bonorden. Den hidtil ukendte stamme NRRL 18230 kan dyres v$d en aerob overflade- eller en Immersions-proces ved egnede temperaturer i en langj række forskellige næringsmedier indehol-5 dende næringsmidlerne og mineralerne i udnyttelig form.

Mediet ber således indeholde en assfmilerbar kilde for carbon og evt. mineralsalte og vakstfaktorer. Alle disse bestanddele kan tilsattes 1 form af veldefinerede simple forbindelser eller i form af komplekse 10 blandinger fremstillet fra biologiske kilder. Dyrkningen udføres i i overensstemmelse med konventionelle:metoder, og de cycliske peptoli-der, der dannes under fermentationeh, kan til slut isoleres fra dyrkningsmediet ved anvendelse af køndte chromatografiske metoder. De cycliske peptolider ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved 15 dyrkning af variant* eller mutantstAmaer fremstillet ved selektion eller ved Indvirkning af mutationsinducerende midler, fx UV-lys, røntgenbestråling eller kemiske mutégener på en NRRL 18230 eller andre stammer af Cvlindrotrichum Bohorden.

De cycliske peptolider ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved syntetiske eller semisyntetiske metoder fx ved cycliserlng af et lineart peptolid eller et lineart peptid med en terminal-OH-gruppe i stedet for en terminal-NH2-gruppe; eller ved at erstatte en amid-binding i en naturlig syntetisk eller semisyntetisk cyclosporin med en esterbinding.

25

Totalsyntesen af de foretrukne forbindelser med formlen II kan udføres analogt med totalsyntesen af cyclosporin A og analogt med, hvad der er beskrevet i fx EP-34 567 og af R.Uenger i "Transplantation Proceedings", vol. XV s. 2230-2241 (1983). Ved denne metode 30 fremstilles først det C-beskyttede heptapeptid med formlen V

V - Thr - X - Y - 2 - MeLeu Ala - OBr V

1 2 3 4 5 6 7 35 6 DK 173335 B1 hvor Bz er en benzylgruppe og W, X, Y og Z har de ovenfor anferte betydninger, og denne forbindelse omsattes derefter med et tetrapep-tid svarende til sekvensen 8*11.

Dette tetrapeptid, som har formlen VI

HO - A - HeLeu - Leu - KeVal VI

5 8 9 10 11 indeholder 3 normale peptidbindinger, men har en O-terminal 1 stedet for en N-terminal, da resten i stilling 6 er afledt af en a-hydroxy-syre i stedet for af en o-aminosyre.

Tetrapeptidet kan fremstilles efter den strategi, der fremgår af 10 nedenstående reaktionsskema: BOC - HeLeu * Leu - OBz , j BOC - HeLeu - Leu - OBz 9 I 10 Ψ B2/Pd BOC * HeLeu - Leu - OH 9 10

♦ KeVal - OBz V

BOC - HeLeu - Leu - KeVal - OBz 9 I 10 11 B - HeLeu - Leu - HeVal - OBz 9 10 il

! + R' - A - OH

R' - A - HeLeu - Leu - HeVal - OBz 8 9 i 10 11 ί H:/Pd

R' - A - HeLeu - Leu - HeVal - OH

89 10 11 7 DK 173335 B1

hvor BOC betegner N-beskyttelsesgruppen t-butyloxycarbonyl, og R' betegner en egnet O-beskyttelsesgruppe. Det reagens, der er vist ovenfor sod R' - A - OH, er siledes en OH-beskyttet a-hydroxycarboxyl-syre, der, nAr A har formlen III, hjar foralen VII

R

5 I

R' - 0 - CH - COOH VII

hvor R har den ovenfor anførte betyjdning.

Det foretrakkes, at R' er valgt blandt grupperne , C2H50 - CH - , CH30CH2 - and ^ ch3 tBuSi(CH3)2*. De foretrukne forbindelser med formlen VII kan fremstilles ved at omsatte a-hydroxysyren, i carbonylbeskyttet form, 10 fx som benzylesteren, med henholdsvis dihydrodofuran, ethoxyethylen, t-butyldimethylchlorsilan eller chlordimethylether.

Ved ODsatning af det COOH-beskyttede heptapeptid V med hydroxytetra-peptidet VI, i den OH-beskyttede form, fAs et lineart hydroxyundeca-peptld med formlen VIII med sekvensen 6-7.

R'-A-MeLeu-Leu-HeVal-V-Thr-jK-Y-Z-HeLeu-Ala-OBz VIII

15 89 10 11 1 2 6 5 6 7

Til sidst kan cycliseringen af dette lineare hydroxypeptid udføres ved at fjerne beskyttelsesgrupperne ved sur eller basisk hydrolyse og koble resten 8 til 7 under dannelse; af en esterbinding. Koblingsreaktionen udføres fortrinsvis i me'thylenchlorid under anvendelse af 20 et carbodiimidreagens fx N-ethyl-N'-(3-dimethyl-anino)propylcarbodii-* mid.

Heptapeptidet med formlen V og tetrapeptidet ned formlen VI kan ogsA fremstilles ved kontrolleret hydrolyse af cycliske peptolider med 8 DK 173335 B1 formlen II, der er fremstillet ved fermentation. Denne behandling med trifluoreddikesyre ved lav temperatur spalter bindingen mellem resterne 11 og 1 og giver et lineart undecapeptolid indeholdende resterne 1 (N-terminal) til og med 11 (C-terminal) med en esterbin-5 ding ved 7-8. Alkalisk hydrolyse giver 1-7 heptapeptidet og 8*11 hydroxytetrapeptidet. Derefter kan semisyntetiske cycliske peptolider fremstilles, fx ved at omsatte det på denne måde fremstillede hydroxytetrapeptid med et syntetiske heptapeptid, eller vice versa, og cyclisere det lineare produkt.

10 Til cycliseringsreaktionen kan peptidet om ønsket vare i O-beskyttet form, dvs hydroxygruppeme i 1-MeBmt eller derivat deraf og/eller i 2-threoninresten kan bare beskyttelsesgrupper, således som det er beskrevet i EP-34 567. Disse 0-beskyttelsesgrupper fjernes derefter ved gangse metoder efter ringslutningen. Fjernelsen af fx en 15 benzylgruppe ved hydrogenering vil også føre til hydrogenering af MeBmt til MeBmtH2· og i alle tilfalde kan de først fremstillede cycliske peptolider Indeholdende en MeBmt-rest i stilling 1 omdannes til den tilsvarende MeBmtH2-forbindelse ved hydrogenering.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et 20 cyclisk peptolid med den ovenfor angivne formel II, hvilken fremgangsmåde omfatter a) fjernelse af 0-beskyttelsesgrupperne fra et cyclisk peptolid med formlen II i O-beskyttet form; b) cycliserlng af et ligekadet hydroxy-endecapeptid med formlen 25 VIII, 1 ubeskyttet form eller O-beskyttet ved den ene af eller begge resterne 1 og 2, og, om nødvendigt, udførelse af trin (a); og, om ønsket, c) hydrogenering af et på denne måde vundet cyclisk peptolid med formlen II, hvor W er HeBmt, til dannelse af det tilsvarende 30 cycliske peptolid, hvor W er HeBatl^.

De cycliske peptolider ifølge opfindelsen udviser farmakologisk virkning og kan derfor anvendes som farmaceutika. Forbindelserne 9 DK 173335 B1 udviser iser immunosupprimerende virkning, antiinflammatorisk virkning og antiparasltxr virkning ved følgende tests: IN VITRO MODELS (1-3) 1. Interleukin 2 (IL-2>-inhibition 5 Interleukin 2 induceres ved mitogenstimulering af musemilt· celler. 48 timer gamle su^ematanter samles og underkastes assay til bestemmelse af deres indhold af IL-2 ved anvendelse af en IL-2-afhangig cellelinie (CTTL). Disse cellers vakst bestemmes efter 48 timer ved anvendelse af en enzymatisk assay, der måler 10 mltochondrie-aktivitet.

[T. Mosmann J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983)]

Forbindelserne Ifølge opfindelsen har en inhiberende virkning ved koncentrationer fra ICjq 0,01 til ca. 0,1 μg/ml.

15 2. Lymfocytters proliferative tespons på allogen stimulering

Murin "blandet lymfocyt"-reaktion (MLR)

Miltceller (0,5 x 106) fra Balb/c mus (hunlige, 8-10 uger) co-inkuberes i 5 dage med 0,5 x 106 bestrålede (2000 rad) eller mitomycin C-behandlede miltceller fra CBA-mus (hunlige, 8-10 20 uger). De bestrålede allogene celler inducerer en proliferativ respons i Balb c-miltcelleme, hvilken respons kan måles ved market precursor-inkorporering i DNA. Da stioulatorcelleme er bestrålede (eller behandlet med mitomycin C) responderer de ikke på Balb/c-cellerne med proliferation, men de bevarer deres 25 antigenicitet.

]T. Meo "Immunological Methods", L. Lefkovits og B. Pemis, red., Academic Press, N.Y, s. 227-239 (1979)]

Forbindelserne ifølge opfindelsen har en Inhiberende virkning ved koncentrationer på fra IC5Q - 0,0001 til ca. 0,001 μg/ml.

10 DK 173335 B1 3. Prinuer humoral imaunrespons in vitro på røde blodlegemer fra fAr (Mishell-Dutton Assav)

Musemiltceller (OFI, hunlige, 8-10 uger, 1 x 107) dyrkes sammen med fåreerythrodyter (SRBC, 3 x 107) i 3 dage i et slutruafang 5 på 1 ml i 24 brøndplader. Lymfocytter hestes, vaskes og udsås med en cached på 1 x 10® celler på blød agar med frisk antigen (SBRC). Komplement (marsvineserum) tilsattes efter en inkubationsperiode på 60-90 minutter, og Inkubationen fortsattes i yderligere 60 minutter, hvorefter testresultatet vurderes ved at 10 talle antal plaques under mikroskop. Under de 3 dages lnkubering er lymfocytterne blevet gjort følsomme over for antigenet (SRBC). Når de inkuberes med antigenet igen, secernerer B-lymfocytterne specifikt antistof, som binder til antigenet i narheden af den sekretorlske lymfocyt. Ved tilsatning af 15 komplement sker der lysering af de antlstof-coatede eryth- rocyter, hvilket resulterer i en plaque. Hver plaque reprasen-terer en enkelt antistofproducerende celle.

[R.I. Mishell & R.V. Dutton J. Exp. Med. 126:243-442 (1967))

Suppressionen af plaquedannende celler iagttages ved kon-20 centrationer af forbindelsen ifølge opfindelsen på fra ICjg 0,01 til ca. 0,1 pg/ml.

IN VIVO MODELLER (4-9) 4. Frembringelse af plaquedannende celler (humoral lnmunrespons)

Hunrotter (OFA) immuniseres ved intravenøs injektion af (1 x 25 10®) fåreerythrocyter (SRBC) og behandles i 3 på hinanden følgende dage med de medikamenter, der undersøges. Miltcelle-suspensioner fremstilles 6 dage efter immunisering, og 1 x 10® lymfocyter udsås på blød agar i narvzrelse af Indikatorceller (SRBC) og komplement. Lysering af indikatorcelierne på grund af 30 sekretion af specifikt antistof og narvarelsen af komplement 11 DK 173335 B1 giver plaques. Antallet af plaques pr. plade talles og korrigeres for antallet af plaques pr. milt.

[N.K. Jern og A.A. Hordih Science 140:405 (1969); N.K. Jerne, A.A. Nordin & C. Henry (1)563) I: "Cell Bound Antibodies", B.

5 Amos & H. Koprowski, red., Ulster Inst. Press, Philadelphia, s.

109-125 (19963)).

Forbindelserne ifelge opfindelsen giver denne effekt i rotter, når de indgives oralt ved en ED50 på ca. 6,0-8,0 mg/kg.

5. Lokaliseret graft-versus-host-reaktion 10 Miltceller (1 x 10^) fra ,6-uger gamle hunlige Wistar/Furth (UF) rotter injiceres subkutant på dag 0 1 den venstre bagpote hos hunlige (F344 x WF)FI-rot‘ter, der vejer ca. 100 g. Dyrene behandles i 4 på hinanden følgende dage, og poplitea-lymfeknuderne fjernes og vejes på dag 7. Forskellen i vegt mellem 15 de 2 lymfeknuder galder søm parameter for vurdering af reaktio nen.

[U.L. Ford, U. Burr & M. Simonsen Transplantation 10:258-266 (1970)]

Forbindelser ifølge opfindelsen har en oral EDjq ved denne test 20 på ca. 20-30 mg/kg.

6. Freunds adiuvans-arthritip O FA- og Uistarrotter (hanlige og hunlige, vagt 150 g) injiceres intracutant ved halens bajsls eller i bagpoten med 0,1 ml mineralolie indeholdende 0,6 mg lyofiliseret, varmedrabt 25 Mycobacterium smegmatls. behandlingen påbegyndes på dag 14, når den sekundåre Inflammation er godt udviklet (dagene 14-20). Ved slutningen af forsøget må|les leddenes hævning ved hjalp af en micro-caliper. ED5Q er deb orale dosis i mg/kg oralt, som reducerer havningen (primer eller sekundar) til halvdelen af 12 DK 173335 B1 havningen for kontrolrotterne. For forbindelser ifelge opfindelsen er det orale ED50 op til 30 mg/kg.

[C.A. Winter & G.W. Nuss Arthritis og Rheumatism 9:394-404 (1966)] S 7. Nvre-allograft reaktion 1 rotter

En nyre fra en hunlig Fischer 344 rotte transplanteres pi det renale kar af en unllateralt (venstre side) nephrectooeret Wlstar/Furth-reclpientrotte under anvendelse af ende-til-ende-anastomosis. Ureter-anastomosis ér ogsi ende-til-ende. Be-10 handlingen begynder pi transplantationsdagen og fortsattes i 14 dage. En kontralateral nephrectoml udføres 7 dage efter transplantationen, så recipienten er overladt til donomyrens funktion. Recipientens overlevelse tages som parameter for en funktionel graft.

15 [P.C. Hiestand, al Immunology ££ 249-255 (1985)]

Forbindelserne ifølge opfindelsen er effektive i rotter ved en oral ED5Q på fra 6 til ca. 9 mg/kg.

8. UV-Ervthem-test

Testen udføres på hunlige albinomarsvin med en vagt pi ca. 150 20 g. Dyrene barberes på begge sider under anvendelse af en mikrobarbermasklne fra Braun og uden at forårsage hudirritation.

For hvert teststof tinderkastes 5 testdyr en defineret intensitet af UV-bestråling i 10 sekunder på hvert af fire hudarealer (diameter 10 mm). Umiddelbart efter påføres 50 mlcroliter af en 25 opløsning af teststoffet i ethanol/propylenglycol/dimethylacet- amld (19:19:2 v/v) på to af de bestrålede arealer på hvert dyr, og 50 mlkroliter af opløsningsmiddelblandingen påføres de andre to som kontrol. Fire timer efter påføringen bedømmes graden af erythem visuelt. 1 [Raake, W. Arzneim.-Forsch. 34(1) nr. 4 (1984)] 13 DK 173335 B1

Forbindelserne Ifølge opfindelsen er effektive 1 en koncentration på fra 1 til 10X.

9. Antlmalarlatest

Hus (OFI, hanlige) inficeres intraperitonealt på dag 0 med 0,2 5 ml af en suspension af erythfocyter Indeholdende 10^ celler, der er parasitiseret af Plasmodiup Berghei (Stamme NK 65). Teststoffet administreres subkutant ved varierende doser, idet der anvendes 5-10 mus pr. dosis. 'Overlevelsestiden registreres, og den minimale effektive dosis (MED) beregnes ved sammenligning 10 af overlevelsestiden med overlevelsestiden for ubehandlede kontroldyr. For kontroldyrenej er overlevelsestiden ca. 7 dage.

MED er den dosis, hvorved overlevelsestiden fordobles.

[L. Rane i "Chemotherapy and'Drug Resistance in Malaria", red.

W. Feters, Academic Press, Nejw York, (1979)] 15 På grund af deres Immunosuppressive virkning er forbindelserne indiceret til anvendelse ved profylakse og behandling af tilstande og sygdomme, der kraver en suppression af immunresponsen, fx ved behandling af autoimmune sygdomme, forebyggelsen af vøvsafstødning ved transplantationer, fx knoglemarvs- og nyretransplantationer.

20 Specifikke autoimmune sygdomme, t^l hvilke forbindelserne ifølge opfindelsen kan anvendes, er fx a^lastisk anaeml, ren rød blodcelle anaemi, idiopatisk thrombocytopenl, systemisk lupus erythematosls, polychondritis, sclerodermi, Wegners granulomatosis, dermatomyosi-tis, kronisk aktiv hepatitis, myasthenia gravis, Steven-Johnson 25 ' syndrom, psoriasis, ideopatisk spifue, Crohns sygdom, Graves’ opthalmopati, sarcoidosis, multipel sclerosis, primer bilier cirrhosis, primer Juvenil diabetes, posterior uveitis, interstitial pulmoner fibrosis og psoriasis-arthritis.

På grund af deres antiinflammator^ske virkninger er forbindelser 30 ifølge opfindelsen indiceret til anvendelse til behandling af inflammatoriske tilstande, iser inflammatoriske tilstande med en i 14 DK 173335 B1 ætiologi, der omfatter en autoimmun komponent, fx behandlingen af arthritis og rheumatlske sygdomme såsom kronisk progressiv arthritis.

På grund af deres antiparasitiske virkning er forbindelserne også indiceret til anvendelse ved behandling af parasitiske sygdomme, fx 5 ved schistosomiasis, filariasis, leishmaniasis, coccidioidomycosis og isar malaria.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er også indiceret til anvendelse til behandling af visse hudsygdomme og 'tilstande, der foruden de ovennævnte omfatter alopecia areata, urticaria, vasculitis, erythem, 10 atopisk dermatitis, eksem, cutan eosinophilia og angioderma.

Til disse tilstande er en indiceret daglig dosis 1 området fra ca. 70 til ca. 3000 mg af en forbindelse ifølge opfindelsen, som hen-sigtsmassigt administreres 1 inddelte doser op til 4 gange dagligt.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan administreres ad en hvilken som 15 helst konventionel vej, fx oralt, fx i form af tabletter eller kapsler, parenteralt i form af injicerbare opløsninger eller suspensioner eller topisk 1 form af lotion, creme eller gel.

Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater indeholdende en forbindelse ifølge opfindelsen sammen med mindst en farmaceutisk 20 barer eller mindst et farmeceutisk fortyndingsmiddel. Sådanne præparater kan fremstilles på konventionel måde. Enhedsdosisformer indeholder fx fra ca. 20 mg til ca. 1500 mg af en forbindelse Ifølge opfindelsen.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler: 1 EKSEMPEL 1

Dyrkning af stamme NBHL l5_230_i_ Erlenmeverkolbe

Udgangskulturer af stammen NRRL 18230 inkuberes ved 21*C i 14 dage på AM i skråkultur. En prakultur fremstilles derefter ved at homogeni- 15 DK 173335 B1 sere dec samlede Indhold af en udgangskultur under sterile betingelser, overfere det til en 50Q ml Erlenmeyerkolbe indeholdende * . i 200 ml naringsopløsning Μ (2X maltekstrakt, 0,4X g*rekstrakt i demineraliseret vand) og inkubere på et roterende rysteapparat ved 5 200 rpm i 10 dage ved 21*C. 1

Intermediate kultures fås derpå ved at overføre 20 ml af forkulturen til en 500 ml Erlenmeyerkolbe indeholdende 200 ml naringsopløsning H og inkubere på et roterende rysteipperat ved 200 rpm i 7 dage ved 21"C.

10 Til opnåelse af en produktionskultur podes til slut 100 Erlen-meyerkolber (hver 500 ml), som hver indeholder 200 ml naringsop-løsning M med 20 ml af de interstellare kulturer. Kolberne Inkuberes ved 21*C i et roterende rysteappatat ved 200 rpm. Efter 10 dages forløb kombineres de 20 liter fenjentationsvaske med henblik på 15 ekstraktion af produktet.

EKSEMPEL 2

Isolering af (Thr’l2 (Leu)5 (D-Hiv)8 (Leul^-Ciclosporin

De 20 liter dyrkningsmedium, der blev fremstillet i eksempel 1, underkastes blanding under betingelser med høj forskydning 1 en 20 stangblander (Lutz, Verthelm, Germany) til at bryde cellerne op, hvorpå der ekstraheres tre gange ljied 20 liter ethylacetat. De 60 liter organisk fase kombineres og tørres over vandfrit natriumsulfat og Inddampes til tørhed under vakuum, hvorved der fås en remanens på 17,4 g. 1 2 3 4 5 6

Remanensen opløses 1 80 ml methanol og chromatograferes på en søjle 2 med diameter 90 mm indeholdende 1$00 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine 3

Chemicals AB, Uppsala, Sverige). $er udtages fraktioner på 100 ml, 4 hvorved (Thr)^ (Leu)^ (D-Hiv)8 (Léu)^-Ciclosporin fremkommer i 5 fraktionerne 22-30, Disse fraktioner kombineres og Inddampes under 6 vacuum, hvorved fås 8400 mg af et svagtfarvet fast skum. Denne remanens opløses i vådt ethylacetat og chromatograferes på en søjle 16 DK 173335 B1 ned diameter 55 mm indeholdende 500 g kieselgel (Merck) ned partikel-størrelse 0,04-0,063 mm. Det ønskede produkt påvises 1 fraktionerne 9-14 (fraktionssterrelse 100 ml). Ved lnddampning fås en bleggul remanens (4200 mg). Ved behandling med aktivt kul (Merck) i diethyl-5 ether og filtrering gennem et tyndt lag talkum fås (Thr)2 (Leu)^ (D-Hiv)® (Leu)^®-Ciclosporin som et hvidt pulver, der omkrystalliseres af ether.

smp. 163-164’C (senderdeling); [o]20 - -186\ (c - 1 i MeOH); [a]20 --223' i CHClj).

10 EKSEMPEL 3-7

Ved modifikation af de ovenfor beskrevne chromatografiske metoder kan følgende forbindelser isoleres i mindre mangder fra produktions-fermentationsnaringsvasken:

Eks.nr. Forbindelse 3 (Thr)J (D-Hiv)· (Leu)ie-Ciclosporin 4 (Thr)J (Ile)5 (D-Biv)· (Leu)le-Ciclosporin 5 (Thr)2 (Leu)4 (Leu)5 (D-Biv)· (Leu)10-Ciclosporin 6 (Thr)2 (Gly)J (Leu)5 (D-Biv)· (L«u)ie-Cyclosporin 7 (8'-0HHeBmt)1 (Thr)2 (Leu)5 (D-Hiv)· (Leu)l0-Ciclosporin 1

Forbindelserne har de egenskaber, der fremgår af tabel I: DK 173335 B1

Tabel I

17

Forbindelse beregnet fundet smelte- [a)^0

ifelge eks.nr. formel molekyl- aolekyl- punkt *C (c-1 i MeO

vagt vagt* 3 C«sBti,N|0Ol4 1233,$ 1233,9 164 ** -184» 4 C„Hll4KxoOx« 1247,7 1247,6 151,3 ** -180» 5 Ce3Bli2N10Ol4 1233,6 1233,6 166,8 ** -174· 6 CoHujNioOu 1233,6 1233.6 140,43 ** ' -154· 7 C^HIuNmOxs 1263,7 1263 158 *** -174· 195 ** 5 * ved FAfi (Fast Atomic Bombardment) massespektrometri ** - senderdeling *** - sintre EKSEMPEL 8

Syntese af (Thr)2 (Leu)5 (D-Hlv)8 (Leu)lO-Clclosporln ved cycll-10 serlng.

Ved stuetemperatur opløses 2,4 g (2,20 mmol) af det ubeskyttede hydroxy-undecapeptld HO-(D)Blv-MeLeu-L«u-M*Val-MeBmt-iThr-Sar-MeLeu-Leu-MeLeu-Ala-OH, 0,84 g (6,88 mmol) af 4-dlaethylaalhopyrldln og 0,66 g (1,5 akvi valenter , 3,44 amol) af N-ethyl-N-(3-4imethylamlno)propylcarbodiimid 15 opløses 1 145 ml methylenchlorld og omsattes 1 3 dage under omrøring og udelukkelse af fugtighed. Den resulterende opløsning fortyndes med 300 ml methylenchlorld, rystes med 1,00 al vand, der er syrnet til pH 2 aed IN HC1, filtreres gennem talkum og inddampes. Remanensen chroaatograferes på 100 g slllcagel under anvendelse af 10X Me-20 OH/CH2CI2. hvorved fås titelforbindelsen (2,55 g, 89%). Identitet med forbindelsen ifølge eksempel 2 påvises ved HHR-spektroskopi og [α]^0 (-220·, c-1 i CHCI3).

18 DK 173335 B1

Tabel II Forkortelser

Abu a-aminosmørsyre

Ala alanin BOC t-butyloxycarbonyl

Bz benzyl

Gly glycin

Hiv a-hydroxyisovalerianesyre

Ile isoleucin

Leu leucin

MeBmt N-methyl-(4R)-4-but-2£-en-l-yl-4-Bethyl-(L)-threonin

HeBmtHj N-aethyl-(4R)-4-but-l-yl-4-Bethyl-(L)-threenin 8'0HMeBBt N-Bethyl-(4R)-4-(4'-hydroKybut-2E-en-l-yl)-4-

Bethyl-(L)-threonin Sar sarcosin

Thr threonin

Val valin

Claims (10)

1. Cycllsk peptolid, kendetegnet ved, at det har struktur som en cyclosporin, 1 hvilken en amldblnding er erstatjtet af en esterbinding.

2. Cycllsk peptolid Ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af en MeBmt-rest, eller et derivat deraf, 9 andre o-amlnosyrerester og en a-hydroxysyrerest.

3. Cycllsk peptolid Ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det har formlen II — V-Thr-X-Y-Z - MeLeu - Ala - A - HeLeu - Leu - MeVal—. 1 2 3 4 5 6 7 8 9_10 11 | II 10 hvor V betegner MeBmt, 8'-0HMeBn|t eller MeBmtH2 X betegner Sar eller Gly Y betegner HeLeu eller Leu Z betegner Leu, Ile eller Vel og A betegner resten af en o-hydroxycarboxylsyre.

4. Cycllsk peptolid ifølge krav 3, kendetegnet ved, at A er (D)Hlv. 5. (Thr)2 (Leu)5 (D-Hlv)1 2 3 <Leu)44-Ciclosporin.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et cycllsk peptolid Ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, 20 kendetegnet ved, at man dyrker en producerende mikroorganisme i ncrvcrelse af et naringsmedium. Fremgangsmåde til fremstilling af et cycllsk peptolid Ifølge et 2 hvilket som helst af kravene 3-5, 3 kendetegnet ved, at njan dyrker en producerende f ungus s tam -25 me af arten Cyllndrotrlchum Bonorden i narvareIse af et naringsme- 4 dium. DK 173335 B1

8. Fermentationsveske, der er vundet ved dyrkning af en cyclisk peptolid-producerende fungusstamme af arten Cvlindrotrlchum Bonorden.

9. Farmaceutisk prsparat indeholdende et cyclisk peptolid ifølge et hvilket som helst af kravene 1*5 sammen med et farmaceutisk accepta- 5 belt fortyndingsmiddel eller en farmaceutisk acceptabel barer.

10. Biologisk ren kultur af fungusstammen NRRL 18230.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et cyclisk peptolid ifelge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man cycliserer et lineart peptolid 10 eller et peptid med en hydroxyterminal- i stedet for en aminoterminalgruppe .

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et cyclisk peptolid med den i krav 3 angivne formel II, kendetegnet ved, at den omfatter 15 a) fjernelse af O-beskyttelsesgrupperne fra et cyclisk peptolid med formlen II 1 O-beskyttet form; b) cycliserlng af et llgekadet hydroxy-endecapeptid med formlen VIII I ubeskyttet form eller O-beskyttet på den ene af eller begge resterne 1 og 2, og, om nødvendigt, udførelse af trin (2); 20 og, om ønsket, c) hydrogenering af et således vundet peptolid med formlen II, hvor V er MeBmt, til dannelse af det tilsvarende cycliske peptolid, hvor W er MeBmtl^. t