DK148752B - Fremgangsmaade til fremstilling af cyclosporinderivater - Google Patents

Description

148752

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporinderivater med den almene formel I

CH3V ^.ch3 CH3 . — · CH /»μ I CH3^ ^CH3 CH2 CH2 CHn- CH CH, CH3 III , i l CH..-N-CH-CO-N-CH A . . CO-N-CH-c-fj — ch2

Il l I l II

I H O

CO

ch, I co

\ I

• CH-CHj-CH L I

CH3 N-CH,

CH,-N

I H OH

I O L I L |l L I l

OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CH-N-C-CH-N-CC-CH

I I i il I I

CH3 H CH3 CH2 CH3 CH CHj

I CH3 CH3 I

CH CH

/ \ / CH3 CH3 CH3 CH3 hvor A betegner Ch3Vs II (i det efterfølgende betegnet cyclo- 5 h^c\CH2 sporin G)

H°v. _xCH

VC (R).

•R)CH CH3 f3 i eller -C-N-CH- å CH, I * CHj (i det efterfølgende betegnet di- ^Η2 hydrocyclosporin G) HO /CHv 'CH, ch3 I eller -C-N-CH-

II L

o 148752 2

CH3\ /H

C

I (i det efterfølgende betegnet iso- H ^«2 cyclosporin G).

^ (r,CH fR,XCH3 -C HN—CH—

II I L

° ' CH3

Det er kendt, jfr. dansk fremlæggelsesskrift nr. 136.780 og beskrivelserne til de danske patentansøgninger nr. 4831/76 og 1887/78, at 5 fremstille cyclosporiner betegnet cyclosporin A (også kendt som S 7481/F-1), cyclosporin B (også kendt som S 7481/F-2), cyclosporin C og cyclosporin D ved dyrkning af en stamme af svampearten Trh choderma polysporum (Link ex Pers) især NRRL 8044 og isolering af nævnte cyclosporiner fra kulturfiltratet. Nævnte stamme er nu indord-10 net under svampearten Tolypocladlum inflatum Cams.

Det har nu overraskende vist sig, at ovennævnte mikroorganismeart udover cyclosporin A, B, C og D danner et yderligere cyclosporin, nemlig cyclosporin G.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af 15 de hidtil ukendte cyclosporiner med den almene formel I er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at der

a) ud fra et kulturfiltrat vundet ved dyrkning af en cyclosporinpro-ducerende stamme af svampearten Tolypocladium inflatum Cams isoleres cyclosporin G, hvorpå det vundne cyclosporin G

20 b) eventuelt hydrogeneres til dannelse af dihydrocyclosporin G, eller c) eventuelt underkastes syrebehandling til dannelse af isocyclosporin G.

Til fremstilling af cyclosporin G kan som nævnt anvendes stammer af svampearten Tolypocladium inflatum Garns, fx NRRL 8044 eller sådanne, 3 1A87 5 2 som fås ved selektion eller mutation af svampestammen NRRL 8044 under indvirkning af ultraviolette stråler eller røntgenstråler eller ved anvendelse af andre forholdsregler, fx ved behandling af laboratoriekulturerne med egnede kemikalier.

5 En anden kultur af en cyclosporin G-producerende stamme er deponeret hos Fermentation Research Institute, I nage, Chiba City, Japan under kulturnummeret FRI FERM-P nr. 2796.

Cyclosporin G kan også isoleres på i og for sig kendt måde, fx som beskrevet i eksempel 1. Herved kan cyclosporin G skilles fra de sam-10 tidig tilstedeværende naturprodukter, fx det mindre polære cyclosporin D, det noget mere polære cyclosporin A og det polære cyclosporin B og det endnu mere polære cyclosporin C.

Det eventuelle fremgangsmådetrin b) ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres på i og for sig kendt måde, fx ved katalytisk hydro-15 genering.

Som opløsningsmiddel anvendes fortrinsvis ethylacetat eller lavere ali-phatiske alkoholer såsom methanol, ethanol eller isopropanol. Hydrogeneringen sker hensigtsmæssigt i det neutrale område ved temperaturer mellem 20°C og 30°C og ved atmosfæretryk eller svagt forøget 20 tryk. Som katalysator kan anvendes platin eller fortrinsvis palladium, fx palladium på kul.

Omlejringen ifølge det eventuelle fremgangsmådetrin c) kan udføres på i og for sig kendt måde ved syrebehandling, fx med stærke organiske syrer såsom trifluoreddikesyre, fortrinsvis methansulfonsyre eller p-25 tolu en sulfon syre.

Den mængde stærk syre, som anvendes til isomeriseringen, ligger fortrinsvis mellem 1 og 4 mol pr. mol cyclosporin G.

Som opløsningsmiddel kan anvendes lavere alkoholer, fx methanol, halogenerede carbonhydrider, fx chloroform eller ethere, fx dioxan.

148752 4

Reaktionstemperaturen kan variere mellem 20°C og 65°C, fortrinsvis fra 45-55°C.

Cyclosporin G, dihydrocyclosporin G og isocyclosporin G udmærker sig ved interessante kemoterapeutiske og farmakologiske egenskaber 5 og kan derfor anvendes som lægemidler.

Cyclosporin G, dihydrocyclosporin G og isocyclosporin G udmærker sig især ved en immunosuppressiv og betændelseshæmmende virkning.

Som lægemidler kan cyclosporin G, dihydrocyclosporin G og isocyclosporin G administeres alene eller i egnet lægemiddelform sammen med 10 farmakologisk inerte hjælpestoffer.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved følgende eksempler.

EKSEMPEL 1 Cyclosporin G.

15 500 liter af en næringsopløsning, som pr. liter indeholder 40 g glucose, 2,0 g natriumcaseinat, 2,5 g ammoniumphosphat, 5 g magnesiumsulfat-heptahydrat, 2 g kaliumdihydrogenphosphat, 3 g natriumnitrat, 0,5 g kaliumchlorid, 0,01 g ferrosulfat og demineraliseret vand, podes med 50 liter af en forkultur af stammen NRRL 8044 og inkuberes i en stål-20 fermenter under omrøring (170 rpm) og beluftning (1 liter luft/min./-liter næringsopløsning) i 13 dage ved 27°C (se tysk offentliggørelses-skrift nr. 2.455.859).

Dyrkningsmediet udrøres med en lige så stor mængde n-butylacetat, efter fraskillelse koncentreres den organiske fase i vakuum, og rå-25 ekstrakten affedtes ved 3-trinsfordeling mellem methanol-vand (9:1) og petroleumsether. Den methanoliske fase fraskilles og koncentreres i vakuum, og råproduktet Udfældes ved tilsætning af vand. Det efter filtrering vundne materiale chromatograferes på en 5- til 7-gange så 5 U&752 stor mængde "Sephadex"® LH-20 med methanol som elueringsmiddel. Spidsfraktionerne chromatograferes derefter på "kieselgel 60", kornstørrelse 0,063-0,2 mm (Merck) med hexan-acetone (2:1), hvorved de først eluerede fraktioner overvejende indeholder cyclosporin A og cyc-5 losporin D, de senere eluerede dele overvejende cyclosporin C. Til yderligere rensning krystalliseres de cyclosporin A- og D-holdige fraktioner af en 2- til 2,5-gange så stor mængde acetone ved -15°C og opspaltes derefter ved to ganges chromatografi på "kieselgel 60", kornstørrelse 0,063-0,2 mm (Merck), hvorhos de med hexan-acetone 10 (2:1) først eluerede fraktioner indeholder cyclosporin D i stærkt beriget form. Disse opløses i en dobbelt så stor mængde acetone og lades henstå ved -15°C til krystallisation. Det derved vundne rå-krystallisat består af særdeles stærkt beriget cyclosporin D, og moderluden indeholder foruden cyclosporin D yderligere bestanddele, 15 således cyclosporin G. Til udvinding af cyclosporin G chromatograferes den til tørhed inddampede moderlud på "kieselgel 60", kornstørrelse 0,063-0,2 mm (Merck), med vandmættet ethylacetat, hvorhos de først eluerede fraktioner indeholder cyclosporin D, og de senere eluerede fraktioner cyclosporin G i blanding med yderligere bestand-20 dele. Til yderligere berigelse chromatograferes blandingen først på "kieselgel 60", kornstørrelse 0,063-0,2 mm (Merck), med chloroform-methanol (98:2) og derefter til opspaltning med hexan-acetone (2:1); de senere eluerede fraktioner indeholder cyclosporin G i stærkt beriget form. Til renudvinding krystalliseres cyclosporin G-bestanddele to 25 gange af ether-petroleumsether (1:1) ved stuetemperatur, hvorved fås tyndtlagschromatografisk ensartet, rent (renhedsgrad > 95%) cyclosporin G i form af farveløse polyedere, smeltepunkt 193-194°C (efter tørring af krystallerne i højvakuum ved 80°C i to timer).

[a]j^ = -245° (c = 1,00 i chloroform) 30 -191° (c = 1,04 i methanol) UV-spektrum i methanol: slutabsorption.

IR-spektrum i methylenchlorid: se fig. 1.

148752 6 ^H-NMR-spektrum i CDCI^ ved 90 MHz med tetramethylsilan som intern standard: se fig. 2.

Bruttoformel: EKSEMPEL 2 5 Dihydrocyclosporin G.

700 mg palladium-kul (10% palladium) forhydrogeneres i 20 ml ethanol i 30 minutter. Til denne palladiumkatalysatorsuspension sættes en opløsning af 4,55 g cyclosporin G opnået som i eksempel 1 i 60 ml ethanol, og derefter hydrogeneres ved 21 °C og et tryk på 742 mm Hg 10 indtil afslutning af hydrogenoptagelsen. Derefter frafiltreres katalysatoren; og filtratet inddampes i vakuum ved 20-40°C til tørhed. Remanensen består af tyndtlagschromatografisk ensartet dihydrocyclosporin Gi form af et hvidt amorft pulver, smeltepunkt 150-153°C (efter tørring i højvakuum i fire timer ved 80°C).

15 Bruttoformel: ^63*^115^*11 *^12' [a]^ = -232° (c = 0,64 i chloroform) UV-spektrum i methanol: slutabsorption IR-spektrum i methylenchlorid: se fig. 3.

H-NMR-spektrum i CDCIg ved 90 MHz og med tetramethylsilan som in-20 tern standard: se fig. 4.

EKSEMPEL 3 Isocyclosporin G.

Til en opløsning af 6,08 g cyclosporin G opnået som i eksempel 1 i 40 ml absolut dioxan sættes en opløsning af 1,20 g methansulfonsyre i 148752 7 20 ml dioxan, og blandingen holdes ved 50°C under udelukkelse af fugt. Reaktionens forløb følges ved tyndtlagschromatogram (polygram SIL G-folier, chloroform-methanol-iseddike (90:6:4), Ioddamp til syn-liggørelse). Efter 16 timer afkøles til stuetemperatur. Ved tilsætning 5 af 1,13 g vandfrit natriumacetat neutraliseres syren, efter 45 minutters omrøring isoleres det udfældede salt ved sugefiltrering, og filtratet inddampes i vakuum ved 45°C. Herved fås 8,1 g remanens, som chromatograferes på 500 g "kieselgel", Merck, kornstørrelse 0,063-0,2 mm, hvorhos der som elueringsmiddel anvendes chloroform-methanol 10 (98:2). De praktisk taget af rent isocyclosporin G bestående frak tioner forenes og inddampes i vakuum ved 50°C, og remanensen krystalliseres af ether ved 7°C, hvorved fås isocyclosporin G, smeltepunkt 143-146°C.

Bruttoformel: £33^113^1-|0-|2' o Π 15 [α]^ = "196° (c = 0,72 i chloroform) -128° (c = 0,73 i methanol) UV-spektrum i methanol: slutabsorption IR-spektrum i methylenchlorid: se fig. 5.

H-NMR-spektrum i CDCIg ved 90 MHz og med tetramethylsilan som 1 intern standard: se fig. 6.

Claims (4)

148752

1. Fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporinderivater med den almene formel I CH3^ ^013 . ^h3 "" ?H ch3 ch, fH2 CHj ch3- ch CH^ ch3 CH--N-CH-CO-1·-CH-A-CO-N—CH—C-M-CH;

3. L L 1 1 il I H O CO CH3^ I -CO • CH-CH,-CH L * ^ /1 CH3 I N-CHj CH-—N I H o H jo L I U II «· I l OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CH-N-C-CH-N — CO-CH I I i I I ! I CH3 H CH3 CHj CH3 ^CH Ch2 L Ih. / \ / CH3 CH3 CH3 Cw3 hvor A betegner C«3N ^/H

5 I (her betegnet cyclosporin G) h"^ \h2 H° .CH wch |riXch3 I eller -C-N-CH- II L O CH3v^ ch, I ‘ ch2 (her betegnet dihydrocyclosporin G) V^'CH2 HO /CHX ‘RI νΗι CB)Cm ch3 ch3 eller i I -C-N-CH- II ί ο