PT95876A

PT95876A - Processo para a preparacao de novos polipeptidos

Info

Publication number: PT95876A
Application number: PT95876A
Authority: PT
Inventors: Toshiro Iwamoto; Akihiko Fujie; Kumiko Nitta; Yasuhisa Tsurumi; Nobuharu Shigematsu; Chiyoshi Kasahara; Motohiro Hino; Masakuni Okuhara
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date: 1989-11-13
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 1991-09-13
Also published as: NO904904L; ATE125550T1; HUT58820A; ZA908892B; DE69021176T2; IL96272A0; NO904904D0; EP0431350B1; FI905575A0; CA2029766A1; EP0431350A1; DE69021176D1; DK0431350T3; HU907105D0; US5502033A; JP3111470B2; ES2075115T3; IE904072A1; CN1051757A; KR910009729A

Description

FUJISAWA PHARMACEUTICAL CO., LTD. "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS POLIPEPTIDOS" A presente invenção refere-se a novos compostos peptídicos e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Mais particularmente refere-se a novos compostos polipeptí-dicos e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, os quais possuem actividades anti-microbianas (especialmente actividades anti-fúngicas), a um processo para a sua preparação, ãs composições farmacêuticas que os contêm e a um método para o tratamento de doenças infecciosas em seres humanos ou em animais.

Em consequência, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar compostos polipeptídicos e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou quais são extremamente activos contra diversos microrganismos patogénicos.

Constitui outro objectivo da presente invenção proporcionar um processo para a preparação dos compostos polipeptídicos dos seus sais. f -2-

Constitui ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar composições farmacêuticas que contêm como ingrediente activo, esses compostos polipeptídicos ou os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Constitui ainda outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de doenças infecciosas provocadas por microrganismos patogénicos, o qual consiste em administrar esse composto polipeptídico a seres humanos ou animais infectados.

Os compostos polipeptídicos da presente invenção são novos e podem ser representados pela fórmula geral

[I] na qual R-^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi, R-2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi, representa um grupo hidroxi ou hidroxi-sulfoniloxi, com a condição de R£ representar um átomo de hidrogénio, quando R-^ representa um átomo de hidrogénio.

Os compostos polipeptídicos de fórmula geral [I] de acordo com a presente invenção podem ser preparados recorrendo aos processos ilustrados nos esquemas que se seguem.

Processo 1 Hfl η,ί

Fermentação

uma estirpe de Coleophoma capaz de produzir um composto de fórmula geral [ Ia ] ou um seu sal

Cia] ou um seu sal

Processo 2

[Ia] [Ib] ou um seu sal ou um seu sal em que ^ e R2 têm o significado definido antes.

Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico adequados dos compostos de formula geral [I] são os mono- ou dissais nao tóxicos e englobam os sais de metais, tais como os sais de metais alcalinos [por exemplo, um sal de sódio, um sal de potássio, etc.] e os sais de metais alcalino-terrosos [por exemplo., um sal de cálcio, um sal de magnésio, etc.], os sais de amónio, os sais de bases orgânicas [por exemplo, um sal de trimetil_ amina, um sal de trietilamina, um sal de piridina, um sal de picolina, um sal de diciclo-hexilamina, um sal de N,N-dibenzil-etilenodiamina, etc.], os sais de adição de ácidos orgânicos [por exemplo, os formatos, acetatos, trifluoroacetatos, maleatos, tartaratos, metano-sulfonatos, benzeno-sulfonatos, tolueno-sulfo-natos, etc.], sais de adição de ácidos inorgânicos [por exemplo, os cloridratos, bromidratos, iodidratos, sulfatos, fosfatos, etc.] , sais de aminoácidos [por exemplo, sais de arginina, sais de ácido aspártico, sais de ácido glutâmico, etc.], e semelhantes.

Seguidamente, descreve-se em pormenor o processo para a preparação dos compostos de fórmula geral [I] ou dos seus sais, de acordo com a presente invenção.

Processo 1 É possível preparar os compostos de fórmula geral [Ia] ou os seus sais mediante um processo de fermentação.

Seguidamente, explica-se pormenorizadamente o processo de fermentação.

Pode preparar-se os compostos de fórmula geral [Ia] ou os seus sais, de acordo com a presente invenção, mediante fermentação de uma estirpe produtora de um composto de fórmula geral [Ia] ou de um seu sal, pertencendo essa estirpe ao género

Coleophoma, tal como Coleophoma sp. F-11899, num meio nutriente. (i) Microrganismo :

Os pormenores sobre o microrganismo utilizado para a produção dos compostos de formula geral [Ia] ou dos seus sais são descritos a seguir. A estirpe F-11899 foi isolada originalmente a partir de amostras de solo recolhidas em Iwaki-shi, Fukushima-ken, Japão.

Este organismo desenvolveu-se de modo bastante restrito em diversos meios de cultura, originando colónias de cor variável entre o cinzento e o cinzento acastanhado. Produziu-se anamorfos (conidiomata) sobre um segmento de folha esterilizado em vapor 1) fixado numa placa de LCA da Miura ou numa placa de agar de farinha de milho por inocuação do meio isolado, ao passo que nao se formou telemorfos nem anamorfos sobre o meio de agar. As suas características morfológicas, culturais e fisiológicas são as que se descrevem a seguir.

As características culturais de diversos meios de agar encontram-se resumidas no Quadro 1. As culturas em agar de dextrose de batata desenvolveram-se bastante rapidamente, atingindo diâmetros de 3,5-4,0 cm decorridas duas semanas à temperatura de 25°C. A superfície desta colónia apresentou-se plana, aveludada, ligeiramente rugosa e cinzento acastanhada. A cor do centro da colónia variou entre cinzento e cinzento acastanhado e apresentou-se coberta com hifas aéreas. A cor da parte complementar foi o cinzento escuro. As colónias em agar de extracto de malte cresceram mais limitadamente, atingindo o diâmetro de 2,5-3,0 cm sob as mesmas condições. A superfície apresentou-se plana, entre macia e aveludada e cor de azeitona castanho. 0 centro da colónia apresentou-se cinzento amarelado e coberto com hifas aéreas. A cor da parte complementar era o cinzento acastanhado.

Procedeu-se à determinação das características morfológicas tomando como referência as culturas de tuna folha esterilizada fixa à placa de LAC da Miura. Os Conidiomatos formaram-se apenas sobre o segmento de folha. Apresentaram-se com um aspecto picnídio, superficial, separados, variando entre discóides e ampuliformes, alisados na base, uniloculares, de paredes finas, negros, com diâmetros compreendidos entre 90 e 160(-200) jan e com uma altura de 40 a 70 ^nn. O aspecto geral dos ostíolos era simples, circular, central, papilado, com um diâmetro de 10 a 30 Jim e com uma altura de 10 a 20 J4m· Os Conidióforos formaram-se a partir da camada inferior das paredes picnídeas internas. O seu aspecto era hialino, simples ou fracamente ramificado, septado e liso. As células conidiógenas eram enteroblãsticas, fialídicas, bem definidas, variáveis entre ampuliformes e obpiriformes, hialinas, lisas, com as dimensões de 5-8 x 4-6 Um, possuindo uma

. Os gola. Essas golas tinham um aspecto variável entre campanulado e cilíndrico, com dimensões variáveis entre 14-18 x 3-5 8- / conídios eram hialinos, cilíndricos, de paredes finas, asseptados, lisos e com dimensões de 14-16(-18) x 2-3 Jim.

As hifas vegetativas eram septadas, castanhas, lisas e ramificadas. As células das hifas eram cilíndricas com 2-7 Jm de espessura. Não havia clamidosporos. 0 intervalo de temperatura para o crescimento da estirpe F-11899 é de 0°C a 31°C e a temperatura óptima varia entre 23°C e 27°C em agar de dextrose de batata.

As características anteriores indicam que a estirpe F-11899 pertence à ordem das Coelomycetes^ , Sendo assim, atribuiu-se-lhes a designação "estirpe de Coelomycetes F-11899.

Quadro 1 Características das culturas da estirpe F-11899 j ---

Meio Características da Cultura

Agar de extracto de malte (Blakeslee 1915) G: Bastante limitadamente, 2,5-3,0 cm S: Circular, plano, entre macio e aveludado, cor de azeitona castanho (4F5), aparecimento de hifas aéreas no centro (cinzento amarelado (4B2)) R: Cinzento acastanhado (4F2) / / -9- R: Agar em solução G: de Czapeck (Raper e S: J Thom 1949) R:

Agar de dextrose G: de batata S: (Difco 0013)

Bastante rapidamente, 3,5-4,0 cm Circular, plano, aveludado, ligeiramente enrugado, cinzento acastanhado (4F2), aparecimento de hifas aéreas no centro (cinzento ténue (4B1) a cinzento acastanhado (4F2)) Cinzento escuro (4F1)

Muito limitadamente, 1,0-1,5 cm Irregular, fino, escasso, imerso, variando entre sub-hialino ebranco Variando entre sub-hialino ebranco

Agar de dextrose de Sabouraud (Difco 0109)

Agar de farinha de aveia (Difco 0552)

J G: Limitadamente, 2,0-2,5 cm S: Circular, plano, fino, branco, compartimentado, castanho claro (6D5) no centro da colónia R: Amarelo ténue (4A3) G: Bastante rápido, 4,0-4,5 cm S: Circular, plano, variando entre aveludado e algodoada, cinzento escuro (4F1) a cinzento acastanhado (4F2) R: Cinzento acastanhado (4D2)

Agar de Emerson Yp Ss (Difco 0739)

Ag ar de farinha de milho (Difco 0386) G: Limitadamente, 2,0-2,5 cm S: Variando entre circular e irregular, plano, aveludado, cinzento escuro (4F1) a cinzento acastanhado (4F2) R: Cinzento mediano (4E1) a cinzento escuro (4F1) G: Bastante limitadamente, 2,5-3,0 cm S: Circular, plano, variando entre -10-

8 * espesso e aveludado, cinzento escuro (2F1) a cor de azeitona (2F3) R: Variando entre cinzento escuro (2F1) a cor de azeitona (2F3)

Agar MY20 G: Limitadamente, 1,5-2,0 cm S: Variando entre circular e irregular, fino, compartimentado, branco amarelado (4A2) R: Amarelo ténue (4A3) a branco alaranjado (5A2)

Abreviaturas : G: crescimento, medição das dimensões da colónia pelo seu diâmetro S: superfície da colónia R: cor complementar

Estas características foram observadas decorridos 14 dias de incubação â temperatura de 25°C. As descrições sobre a cor baseiam-se na publicação Methuen Handboock of Colour^ . 1) Miura, K e Μ. Y. Kudo, "An agar-médium for aquatic Hiphomycetes.", Trans. Ycolo. Soc. Japan, 11 (1970) 116-118. 2) Arx, J. A. Von: The Genera of Fungi - Sporulating in Pure Culture, Vaduz, J. Cramer, 3§ ed., 1974, 315 p.. 3) Sutton, B. C., The Coelomycetes - Fungi Imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata., Kew, Commonwealth Mycological Institute, 1980, 696 p.. -11- -11-

4) Hawksworth, D. L., B. C. Sutton e G. C. Ainsworth, Dictionary of the Fungi, Kew, Commonwealth Mycological Institute, 7§ ed., 1983, 445 p.. 5) Kornerup, A. e Wanscher, J. H., Methuen Handbook of Colour, Londres, Methuen, 3§ ed., 1983, 252 p.. A 26 de Outubro de 1989, sob o número de registo FERM Bp-2635, depositou-se uma cultura de Coelomycetes da estirpe conhecida por F-11899 na instituição Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (1-3,

Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, IBARAKI 305 JAPAN).

Contudo, depois disso, efectuámos novos estudos sobre a classificação da estirpe F-11899 e descobrimos que a estirpe F-11899 se assemelhava ao genero Coleophoma empetri (Rostrup) 2) 3) 4)

Petrak 1929 , , pertencendo a ordem das Coelomycetes, mas era diferente devido a algumas características picnídeas: globose ou alisamento da base, imersa e não papilada.

Tendo em consideração estas características classificou-se esta estirpe com o maior pormenor e atribuiu-se-lhe a nova designação de "Coleophoma sp. F-11899".

Assim sendo, iniciou-se já o processo para a correcção do nome "estirpe F-11899 de Coelomycetes para Coleophoma sp. F-11899 junto da instituição Fermentation Research Intitute Agency of

Industrial Science and Technology a 21 de Setembro de 1990. (ii) Produção dos compostos de fórmula geral [Ia] ou dos seus sais.

Preparam-se os compostos de fórmula geral [Ia] ou os seus sais, de acordo com a presente invenção, quando se desenvolve uma estirpe do gênero Coleophoma produtora de um composto de fórmula geral [Ia] ou de um seu sal, num meio nutriente que contém fontes de carbono e azoto assimiláveis, sob condições aeróbias (por exemplo, em culturas agitadas, em culturas submersas, etc...).

As fontes de carbono preferenciais para o meio nutriente são os hidratos de carbono, tais como a glucose, a sacarose, o amido, a frutose ou a glicerina ou similares.

As fontes preferenciais de azoto são o estracto de levedura, a peptona, a farinha de glúten, a farinha das sementes de algodão, a farinha de soja, o licor de infusão de milho, leveduras secas, germe de trigo, etc. e também os compostos inorgânicos e orgânicos azotados, tais como os sais de amónio (por exemplo nitrato de amónio, sulfato de amónio, fosfato de amónio, etc...), a ureia ou os aminoácidos, ou similares.

As fontes de carbono e de azoto, embora possam ser utilizadas em associação, com vantagem, não necessitam de ser utilizadas na -13-

sua forma pura, uma vez que também i adequado utilizar materiais de menor pureza, que contenham traços de factores de crescimento e quantidades consideráveis de nutrientes minerais.

Sempre que desejado, pode-se adicionar ao meio sais minerais, tais como o carbonato de sódio ou de cálcio, o fosfato de sódio ou de potássio, o cloreto de sódio ou de potássio, o iodeto de sódio ou de potássio, sais de magnésio, sais de cobre, sais de zinco ou sais de cobalto ou similares.

Se necessário, especialmente nos casos em que o meio de cultura forma bastante espuma, pode adicionar-se um agente anti--espumante, tal como a parafina líquida, um óleo gordo, um óleo de origem vegetal, óleo mineral ou silicone, ou substâncias similares.

Tal como sucede no caso dos métodos preferidos utilizados para a produção de outras substâncias biologicamente activas em grandes quantidades, dá-se preferência às condições culturais aeróbias em meio submerso para a produção dos compostos de fórmula geral [Ia] ou dos seus sais em grandes quantidades.

Para a produção de pequenas quantidades, recorre-se â utilização de uma cultura agitada ou superficial num balão ou numa garrafa.

Além disso, quando se faz o crescimento em tanques grandes, é preferível utilizar a forma vegetativa do organismo para inoculação nos tanques de produção no sentido de evitar atrasos do crescimento no processo de produção dos compostos de fórmula geral [Ia] ou dos seus sais. Em consequência, é desejável produzir primeiro um inócuo vegetativo do organismo inoculando uma quantidade relativamente pequena de meio de cultura com esporos ou micélios do organismo e fazer uma cultura do referido meio inoculado e, depois, transferir esse inoculo vegetativo de cultura para os tanques grandes. 0 meio no qual se produz o inoculo vegetativo é essencialmente idêntico ou, eventualmente, diferente do meio utilizado para a produção dos compostos de fórmula geral [Ia] ou dos seus sais. A agitação e o arejamento da mistura de cultura podem ser realizados de diversos modos. A agitação pode ser feita com uma hélice ou utilizando equipamento de agitação mecânica semelhante revolvendo ou sacudindo o fermentador, utilizando diverso equipamento de bombagem ou fazendo passar ar esterilizado através do meio. Pode efectuar-se o arejamento fazendo passar ar esterilizado através da mistura de fermentação.

Normalmente, efectua-se a fermentação a uma temperatura compreendida entre 10°C e 40°C, de preferência a uma temperatura compreendida entre 20°C e 30°C, durante um período compreendido entre 50 horas e 150 horas, podendo variar de acordo com as condições de fermentação e com as quantidades,

Depois de a fermentação estar completa, submete-se o caldo de cultura, para a recuperação do composto de fórmula geral [Ia] ou de um seu sal, a diversos procedimentos utilizados convencional mente para a recuperação e purificação de substâncias biologicamente activas, por exemplo, recorre-se â extracção por dissolvente com um dissolvente adequado ou uma mistura de vários dissolventes, à cromatografia ou à recristalização em um dissolvente adequado ou em uma mistura de vários dissolventes, ou a processos semelhantes .

De acordo com a presente invenção, de um modo geral, os compostos de fórmula geral [Ia] ou os seus sais encontram-se tanto nos micélios da cultura como no caldo da cultura. Em consequência, remove-se depois o composto de fórmula geral [Ia] 'ou o seu sal do caldo integral mediante extracção com um dissolvente orgânico apropriado, tal como a acetona ou o acetato de etilo, ou uma mistura desses dissolventes, ou por processos semelhantes.

Trata-se o extracto por um processo convencional para se obter um composto de fórmula geral [Ia] ou um seu sal, por exemplo, faz-se a concentração do extracto por evaporação ou por destilação, de modo a obter uma quantidade menor e purifica-se o resíduo resultante que contêm o ingrediente activo, isto i, o -16- composto de fórmula geral [Ia] ou um seu sal, mediante procedimentos convencionais de purificação, por exemplo, cromatografia ou recristalização em um dissolvente adequado ou em uma mistura de vários dissolventes.

Quando se isola o composto pretendido sob a forma de um sal de um composto de fórmula geral [Ia], ê possível convertê-lo no composto livre de fórmula geral [Ia] ou noutro sal do composto de fórmula geral [Ia] de um modo convencional.

Processo 2 É possível preparar os compostos de fórmula geral [Ib] ou os seus sais submetendo um composto de fórmula geral [Ia] ou um seu sal a uma reacção de eliminação do grupo sulfo.

Consideram-se adequados como sais dos compostos de fórmula geral [Ib] os sais de adição de ácido, tal como exemplificado para os compostos de fórmula geral [I].

Essa reacção de eliminação é efectuada por um método convencional utilizando neste domínio da técnica, tal como a reacção com uma enzima ou semelhantes.

Pode efectuar-se a reacção com uma enzima fazendo reagir um composto de fórmula geral [Ia] ou um seu sal com uma enzima adequada para a reacção de eliminação do grupo sulfo. / -17-

Como exemplo adequado da referida enzima refere-se a sulfa-tase, tal como a sulfatase de Tipo IV produzida pela Aerobacter aerogenes, ou semelhantes.

Normalmente, efectua-se essa reacção de eliminação no seio de um dissolvente, tal como tampão de fosfato, tampão Tris-HCl ou qualquer outro dissolvente que não influencie prejudicialmente a reacção. A temperatura de reacção não é crítica e a reacção pode ser efectuada à temperatura ambiente ou sob aquecimento.

Propriedades biológicas dos compostos de fórmula geral [I]

Para demonstração da actividade biológica dos compostos de fórmula geral [I], apresenta-se seguidamente alguns resultados biológicos.

Ensaio 1 : Actividade anti-microbiana (1) :

Mediu-se a actividade anti-microbiana da substância FR901379 [o composto do Exemplo 1(1)] pelo método da microdiluição do caldo de cultura em tabuleiros múltiplos de 96 cavidades utilizando um meio de dextrose à base de levedura azotada. A uma amostra de 50 j$- de uma solução com diluições sequenciais de razão 2, adicionou-se 50 ul de uma suspensão de microrganismos em / -18- solução salina até se obter uma concentração final de 1 x 10“* unidades formadoras de colónias/ml. Fez-se a incubação das culturas de Candida e de Aspergillus à temperatura de 37°C durante 22 horas e fez-se a incubação das culturas de Cryptococcus à temperatura de 30°C durante 48 horas. Após a incubação determinou-se o desenvolvimento de microrganismos em cada cavidade medindo a turvação. Os resultados são apresentados sob a forma de valores de CI^q, a concentração a que correspondeu uma turvação de metade da observada na cavidade sem amostra. Os resultados estão representados no Quadro 2. QUADRO 2

Organismo CI50 Candida albicans FP578 ^ 0,025 Candida albicans FP582 <£0,025 Candida albicans FP629 0,05 Candida albicans FP633 0,025 Candida krusei YC109 0,2 Candida utilis YC123 0,05 Candida tropicalis YC118 0,1 Cryptococcus neoformans YC203 >25 Cryptococcus albidus YC201 >12,5 Aspergillus niger ATCC9642 0,05 Aspergillus fumigatos FD050 0,8 '-19-

Ensaio 2 : Efeito protector da substância FR901379 contra a infecção sistémica de Candida albicans

Injectaram-se por via intravenosa murganhos ICR (fêmeas com £ 4 semanas de idade, 5 animais por grupo) com 2,5 x 10° Candida albicans FP633. A terapia foi efectuada subcutaneamente 1 hora após a injecção e uma vez por dia durante tris dias consecutivos. Os resultados foram observados decorridos 9 dias após a infecção. Esses resultados estão representados no Quadro 3. QUADRO 3

Dose (mg/kg) Sobreviventes/tratados 30 5/5 3 5/5 0,3 3/5 0 0/5

Ensaio 3 : Toxicidade aguda da substância FR901379 :

Determinou-se a toxicidade aguda da substância FR901379 em murganhos ICR (fêmeas com 4 semanas de idade) através de uma única injecção por via intraperitoneal. Não foram observados quaisquer sintomas tóxicos para a dose de 500 mg/kg. #-20-

Ensaio 4 : Actividade anti-microbiana (2) :

Hediu-se a actividade anti-microbiana da substância FR901379 e da substância FR133302 (o composto do Exemplo 2) recorrendo ao método do ensaio de difusão em disco de polpa contra Candida albicans FP633 sobre meio de agar YNBD â temperatura de 37°C durante 16 horas. Os resultados indicam-se a seguir em termos de diâmetro da zona de inibição apresentada por um disco contendo 2 jig de cada um dos compostos utilizados. Esses resultados encontram-se representados no Quadro 4. QUADRO 4

J

Composto Diâmetro (mm) FR901379 21 FR133302 16 A partir dos resultados dos ensaios verificou-se que os compostos polipeptídicos de formula geral [I], de acordo com a presente invenção, têm actividade anti-microbiana (especialmente actividade anti-fúngica).

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas sob a forma de preparação farmacêu- -21- tica, por exemplo, numa forma sólida, semi-sólida ou líquida, a qual contém o composto polipeptídico de fórmula geral [I] ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico como ingrediente activo em mistura com um veículo ou excipiente orgânico ou inorgânico adequado para administração externa, oral ou paren-teral. 0 ingrediente activo pode ser misturado, por exemplo, com os habituais veículos não tóxicos aceitáveis do sob o ponto de vista farmacêutico utilizados para comprimidos, grânulos ("pellets"), cápsulas, supositórios, soluções, emulsões, suspensões, e ainda em quaisquer outras formas adequadas para utilização. Alem disso, se necessário, pode-se utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, espessantes, corantes e odorizantes.

Os compostos polipeptídicos de fórmula geral [I] ou os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são incorporados nas composições farmacêuticas em uma quantidade suficiente para proporcionar o efeito anti-microbiano desejado em conformidade com o processo ou com o estado da doença.

Para aplicação das composições aos seres humanos é preferível recorrer â via intravenosa, intramuscular ou oral. Embora a dosagem de quantidade terapeuticamente eficaz do composto polipeptídico de fórmula geral [I] varie e dependa da idade e do estado de cada paciente individual que se pretende tratar, no caso da administração intravenosa, aplica-se uma dose diária compreendida entre 0,01 e 10 mg de composto polipeptídico de fórmula geral [I] por kg de peso do ser humano correspondente, no caso da adminis- -22- -22-

tração intramuscular aplica-se uma dose diária compreendida entre 0,1 e 10 mg de composto polipeptídico de fórmula geral [I] por kg de peso do ser humano correspondente, e no caso da administração oral aplica-se uma dose diária compreendida entre 0,5 e 50 mg de composto polipeptídico de fórmula geral [I] por kg de peso do ser humano em causa, para o tratamento de doenças infec-ciosas.

Os exemplos que se seguem têm como objectivo ilustrar a presente invenção com maior pormenor.

Exemplo 1 1) Em cada um de dois balões de Erlenmeyer com a capacidade de 500 ml verteu-se um meio de cultura (160 ml) constituído por 4% de sacarose, 11 de farinha de semente de algodão, 1% de levedura seca, 1% de peptona, 0,2% de KEL^PO^, 0,2% de CaCO^ e 0,1% de Tween 80 (preparado pela NAKARAI CHEMICALS LTD.) e depois esterilizou-se à temperatura de 121°C durante 30 minutos. A partir de uma cultura de Coleophoma sp. F-11899, em cunha, procedeu-se á inoculação de cada um dos meios preparados e manteve-se a cultura sob condições de agitação à temperatura de 25°C durante 4 dias.

Verteu-se num fermentador de 30 litros um meio (20 litros) constituído por 3% de Pine Dex^jO (preparado pela Matsutani -23-

Chimical Ltd.), 1% de glicose, 1% de germe de trigo, 0,5% de farinha de sementes de algodão, 2% de KI^PO^, 1,5% de Na2HP0^· 12H20, 0,001% de ZnS0^*7H20 e 0,05% de Adekanol (agente anti-espu-mante preparado pela Asahi Denka Co., Ltd.) e depois esterilizou-se à temperatura de 121°C durante 30 minutos. 0 caldo de cultura resultante (320 ml) foi inoculado no meio de produção e manteve-se a cultura à temperatura de 25°C durante 4 dias, sob agitação a 200 rpm e com arejamento de 20 litros por minuto. Ao caldo de cultura assim obtido (20 litros) adicionou-se igual volume de acetona. Após agitação ocasional à temperatura ambiente durante alguns instantes, filtrou-se o caldo de cultura. Lavou-se o filtrado aquoso (10 litros) com igual volume de acetato de etilo e extraiu-se duas vezes com n-butanol (10 litros). Concentrou-se in vacuo a camada de n-butanol combinada e introduziu-se o resíduo num coluna (300 ml) de gel de sílica (fabricada pela E. Merck) e eluiu-se com uma mistura progressiva de dissolventes orgânicos constituída por dicloro-metano/metanol. Procedeu-se â eluição das fracções que possuíam actividade anti-Candida no intervalo de concentrações da mistura dissolvente compreendido entre 3:1 e 1:1. Reuniu-se as fracções activas e concentrou-se in vacuo até â secura. Dissolveu-se o resíduo numa solução aquosa de metanol a 50% (15 ml) e introduziu-se uma coluna (250 ml) da ODS YMC GEL (fabricada por Yamamura Chemical Lab.). Lavou-se a coluna com uma solução aquosa de metanol a 50% e eluiu-se com uma solução aquosa de metanol a 80%.

Concentrou-se o eluido e purificou-se depois por separação croma-tográfica centrífuga (CPC) utilizando um sistema dissolvente constituído por n-butanol/butanol/água (4:1:5), da fase estacionária superior e da fase móvel inferior, em modo descendente. Juntou-se as fracções que continham o composto pretendido (componente principal) e fez-se a concentração in vacuo e depois introduziu-se numa coluna (35 ml) de gel de sílica 60. Fez-se a eluição da coluna com uma mistura de n-butanol·/ácido acético/ água (6:1:1). Reuniram-se as fracções activas e concentrou-se in vacuo até à secura e depois dissolveu-se num pequeno volume de uma solução aquosa de metanol a 50%. Fez-se passar a solução através de uma coluna (3,5 ml) de ODS YMC GEL. Lavou-se a coluna com uma solução aquosa de metanol a 50% e eluiu-se com metanol. Concentrou-se o eluido até à secagem, dissolveu-se num pequeno volume de água e ajustou-se o valor do pH para 7,0 com NaOH 0,01 N. Liofilizou-se a solução para se obter um pó branco do referido composto sob a forma do seu sal de sódio (adiante designado por substância FR901379) (11 mg).

As fracções que continham os dois componentes secundários após a CPC foram concentradas in vacuo e purificadas preliminarmente por cromatografia em líquido de alta eficiência (HPLC), em coluna de LiChrosorb RP-18 (Marca comercial, fabricada pela Merck; 250 xt|>25 mm), utilizando uma fase móvel constituída por uma solução aquosa contendo 45% de 01^01^/0,5% de NH^I^PO^ com um caudal de 9,9 ml/minuto. A fracção que continha um dos dois

.1¾

J '5 componentes foi diluida com igual volume de água e fez-se passar através de uma coluna (1 ml) de ODS YMC Gel. Lavou-se a coluna com uma solução aquosa de MeOH a 40% e eluiu-se com MeOH. Concentrou-se o eluido in vacuo até à secura e depois dissolveu-se num pequeno volume de água e liofilizou-se para se obter o referido componente sob a forma do seu sal de amónio com o aspecto de um. pó branco (2,2 mg) (adiante designado por substância FR901381).

Por um processo idêntico, obteve-se o outro componente secundário sob a forma do seu sal de amónio e com o aspecto de um pó branco (1,2 mg) (adiante designado por substância FR901382). A substância FR901379 obtida possui as seguintes propriedades físico- químicas.

Aspecto : Pó branco Natureza :

Substância neutra Ponto de fusão : 215°-221°C (decomposição)

Rotação específica : [v]^3 -20.3 (C: 0,5, H20) Fórmula molecular : C51H81N8°21SNa Análise elementar :

Cale : para C51H81N8S021Na -26-

4Τ C 51,17, Η 6,77, Ν 9,36, S 2,68 (%) Encontrado : C 49,61, Η 7,58, Ν 7,65, S 2,14 (%)

Peso molecular : HRFAB-MS 1219,5078 (Cale para C51H82N8S021 + 2Na - H: 1219,5032) Solubilidade : solúvel em metanol e em água

Ligeiramente solúvel em acetato de etilo e em acetona Insolúvel em cloroformio e em n-hexano.

Reacção de cor : positiva : reacção ao vapor de iodo, reacção ao sulfato de cério, reacção ao cloreto fèrrico, reacção à ninidrina. negativa : reacção de Dragendorff, reacção de Ehrlick

Cromatografia de camada fina (TLC) :

Fase estacionária Dissolvente de desenvolvimento Valor de Rf gel de sílica n-butanol/ácido acético/água (3:1:1) 0,36 acetato de etilo/álcool isopropílico/água (5:3:1) 0,31 •L Gel de sílica 60 (preparado pela E. Merck) 27-

Espectro de absorção ultravioleta : ^metanol (E^. ) . 207(169), 276(13,5), 225(sh), max 1 cm 283(sh) nm λ metano1+0,OlN-NaOH Amax (El%cm) : 209 (232)’ 244(59’5)’ 284(13,5), 294(sh) nm

Espectro de absorção de infravermelhos : °maí : 3350’ 2920> 2840’ 1660’ 1625, 1530> 1510, 1435, 1270, 1240, 1070, 1045, 800, 755, 710 cm'1

Espectro de ressonância magnética nuclear 1H: í(CD30D, 400 MHz) $ : 7,30 ( 1H, d, J=2Hz), 7,03 (1H, dd, J=8 e 2Hz), 6,85 ( 1H, d, J=8Hz), 5,23 (1H, d, J=3Hz), 5,06 ( 1H, d, J=4Hz), 4,93 (1H, d, J=3Hz), 4,59-4,51 (3H, m), 4,47-4,35 (5H, m), 4,29 (1H, dd, J=6 e 2Hz), 4,17 (1H, m), 4,07 (1H, m), 3,95-3,89 (2H, m), 3,76 (1H, d largo, J=llHz), 3,36 (1H, m), 2,75 (1H, dd, J=16 e 4Hz), 2,50 (1H, m), 2,47 (1H, dd, J=16 e 9Hz), 2,38 (1H, m), 2,21 (2H, m), 2,03-1,93 (3H, m), 1,57 (2H, m), 1,45-1,20 (24H, m), 1,19 (3H, d, J=6Hz), 1,08 (3H, d, J=6Hz), 0,90 (3H, t, J=7Hz)

Pela análise das propriedades físicas e químicas anteriores e pelos resultados de investigação adicional sobre a identifi- cação da estrutura química, a estrutura química da substância FR901379 foi identificada como sendo a seguinte :

HO. OH

A substância FR901381 obtida possui as seguintes propriedades físico-químicas.

Aspecto : Pó branco Natureza :

Substância neutra Ponto de fusão : 218°-223°C (decomposição) Rotação específica : [*]p3 -10,5° (C: 0,5, MeOH) Fórmula molecular : 29-

H

Peso molecular : EM-RHBAR 1203,5100 (Calcd para C51H82Hg02()S + 2Na - H : 1203,5083) Solubilidade :

Solúvel em metanol e em etanol Ligeiramente solúvel em água e em acetona Insolúvel em clorofórmio e em n-hexano Reacção de cor :

Positiva : reacção ao vapor de iodo, reacção ao sulfato de cério

Negativa : reacção de Dragendorff, reacção de Ehrlich

Cromatografia de camada fina (TLC) :

Fase estacionária Dissolvente de Desenvolvimento Valor de Rf * * gel de sílica n-butanol/ácido acético/água (3:1:1) 0,34 acetato de etilo/álcool isopropílico/água (5:3:1) 0,67

Gel de sílica 60 (preparado pela E. Merck)

Espectro de absorção de infravermelhos : ^maxan01 (Ε1%^ : 206<196)> 278(4), 243(sh), 284(sh) nm &\lm) : 208(252), 290(5), 241(sh) nm

Espectro de absorção de infravermelhos : KBr ^max : 3300> 2900’ 2840> 1680> 166°» 1640, 1620, 1510, 1460, 1430, 1330, 1240, 1040, 960 cm'1

Espectro de ressonância magnética nuclear :

J (GD30D, 400 MHz) S : 7,18 (1H, d, J=2Hz), 6,90 (1H, dd, J=2 e 8,5Hz), 6,81 (1H, d, J=8,5Hz), 5,29 (1H, d, J=3Hz), 5,08 (1H, d, J=3,5Hz), 4,98 (1H, d, J=3Hz),

J •y metano 1+0, OlN-NaOH 'max 4,63 (1H, dd, J=7 e 11Hz), 4,58-4,51 (3H, m), 4,46-4,38 (3H, m), 4,37 (1H, d, J=2Hz), 4,16 (1H, dd, J=2 e 5Hz), 4,07 (1H, dd, J=7,5 e 9,5Hz), 4,02-3,94 (2H, m), 3,78 (1H, d largo, J=llHz), 3,38 (1H, t, J=9,5Hz), 2,69 (1H, dd, J=4,5 e 15Hz),. 2,63-2,50 (3H, m), 2,46 (1H, m) , 2,43 (1H, dd, J=9 e 15Hz), 2,21 (2H, t, J=7,5Hz), 2,07-1,95 (3H, m), 1,58 (2H, m), 1,29 (24H, m), 1,16 (3H, d, J=6,5Hz), 1,07 (3H, d, J=7Hz), 0,89 (3H, t, J=6,5Hz). 13

Espectro de ressonância magnética nuclear C : (CD3OD, 100MHz) S : 176,7 (s), 175,9 (s), 174,4 (s), 174,0 (s), 172,8 (s), 172,5 (s), 172,5 (s), 169,4 (s), 149,1 (s), 141,1 (s), 131,1 (s), 128,0 (d), 125,3 (d), 118,3 (d), 75,9 (d), 74,0 (d), 73,9 (d), 71,3 (d), 70,7 (d), 70,5 (d), 70,2 (d), 68,2 (d), 62,4 (d), 58,6 (d), 58.4 (d), 57,2 (t), 55,5 (d), 52,9 (t), 51.4 (d), 40,8 (t), 39,9 (t), 39,1 (d), 39,0 (t), 36,7 (t), 35,0 (t), 33,1 (t), 30,8 (t X 5), 30,7 (t), 30,7 (t), 30,5 (t), 30.4 (t), 30,3 (t), 27,0 (t), 23,7 (t), 19.5 (q), .14,4 (q), 11,1 (q).

Pela análise das propriedades físicas e químicas anteriores e pelos resultados de investigação adicional sobre a identificação da estrutura química, a estrutura química da substância FR901381 foi identificada como possuindo a fórmula seguinte.

A substância FR901382 obtida possui as seguintes propriedades físico-químicas. Í3'

Aspecto :

Po branco Natureza :

Substancia neutra Ponto de fusão : 208°-217°C (decomposição) Rotação especifica : [*]£3 "9,4° (C: 0,5, MeOH) Fórmula molecular : NH, C51H81N8°19S'

Peso molecular : EM-RHBAR 1187,5139 (Cale. para C5]H82N8019S + 2Na - H 1187,5134) Solubilidade :

Positiva : reacção ao vapor de iodo, reacção ao sulfato de cério

Negativa : reacção de Dragendorff, reacção de Ehrlich -33- 'κ~Κ

Cromatografia de camada fina (TLC) :

Fase estacionária Dissolvente de Desenvolvimento Valor de Rf gel de sílica n-butanol/ácido acético/água (3:1:1) 0,43 acetato de etilo/álcool isopropílico/água (5:3:1) 0,9

Gel de sílica 60 (preparado pela E. Merck)

Espectro de absorção de ultravioletas : ^maxan01 : 205<180)’ 276(13), 224(sh), 283(sh) nm -metanol+0,01N-NaOH (E1% } . 208(262), 281(12),

Amax 1 cm 241(sh), 295(sh) nm

Espectro de absorção de infravermelhos KBr max 3350, 2900, 2840, 1680, 1660, 1640, 1620, 1510, 1430, 1330, 1245, 1080, 1140, 960 cm -1

Espectro de ressonância magnética nuclear H ; (CD30D, 400MHz) & : 7,18 (1H, d, J=2Hz), 6,90 (1H, dd, J=2 e 8,5Hz), 6,80 (1H, d, J=8,5Hz), 5,37 (1H, dd, J=3 e 11Hz), 5,08 (1H, d, J-3,5Hz), 5,00 (1H, d, J=3Hz), 4,61 (1H, dd, J=7 e 11Hz), 4,59 (1H, d, J=2Hz), -34-

4,58-4,52 (2Η, m), 4,46-4,35 (3H, m), 4,29 (1H, d, J=2Hz), 4,12 (1H, dd, J=2 e 4,5Hz), 4,07 (1H, dd, J=8 e 9,5Hz), 4,01 (1H, dd, J=3 e 11Hz), 3,77 (1H, d largo, J=llHz), 3,37 (1H, t, J=9,5Hz), 2,69 (1H, dd, J=4,5 e 15,5Hz), 2,63-2,50 (3H, m), 2,45 (1H, m), 2,43 (1H, dd, J=9 e 15,5Hz), 2,24 (2H, m), 2,09-1,95 (3H, m), 1,76-1,66 (2H, m) , 1,59 (2H, m), 1,29 (24H, m), 1,15 (3H, d, J=6,5Hz), 1,06 (3H, d, J=7Hz), 0,89 (3H, t, J=7Hz). - - 13

Espectro de ressonância magnética nuclear C : (CD3OD, 100MHz) δ : 176,7 (s), 176,0 (s), 175,1 (s), 174,0 (s), 172.8 (s), 172,6 (s), 172,5 (s), 169,1 (s), 149,1 (s), 141,1 (s), 131,1 (s), 128,1 (d), 125,3 (d), 118,2 (d), 76,1 (d), 74,0 (d), 71.8 (d), 71,3 (d), 70,5 (d), 70,3 (d), 68,3 (d), 62,5 (d), 58,5 (d), 58,2 (d), 57,2 (t), 55.4 (d), 52,9 (t), '52,1 (d), 40,8 (t), 39,8 (t), 39,1 (d), 38,9 (t), 36,8 (t), 33,1 (t), 30.9 (t), 30,8 (t X 5), 30,7 (t), 30,7 (t), 30.5 (t), 30,4 (t), 30,3 (t), 27,3 (t), 26,9 (t), 23,7 (t), 19,4 (q), 14,4 (q), 11,1 (q).

Pela análise das propriedades físicas e químicas anteriores e pelos resultados de investigação adicional sobre a identificação -35- -35-

da estrutura química, identificou-se a estrutura química da substancia FR901382 como sendo a seguinte :

Exemplo 2 A uma solução da substância FR901379 (60 mg) em tampão de Tris-HCl 50 mM (pH 7,1; 30 ml) adicionou-se sulfatase (200 U) de Tipo VI proveniente de Aerobacter aerogenes (SIGMA.No.S-1629). Após incubação à temperatura de 37°C durante 30 horas, a substância FR901379 dessulfonada que se formou (adiante designada por substância FR133302) foi extraída com igual volume de n-butanol e lavou-se uma vez com água. Concentrou-se o extracto sob vazio e introduziu-se numa coluna de LiChroprep RP-18 (40-63 Jtoi) previa-mente carregada, de tamanho B fabricada pela Merck) equilibrada com uma solução aquosa de acetonitrilo a 47% contendo 0,5% de NH^H^PO^ e desenvolveu-se com a mesma solução. A fracção que -36 / continha a substância FR133302 foi diluída com igual volume de água e fez-se passar directamente através de uma coluna de ODS YMC Gel fabricada por Yamamura Chemical Lab.). Lavou-se a coluna com água e eluiu-se com metanol. Evaporou-se o eluido sob vazio para se remover o metanol e liofilizou-se para se obter um p5 branco da substância FR133302 (26 mg). A substância FR133302 obtida possui as seguintes propriedades físico-químicas.

Aspecto : Pó branco Natureza :

Substância neutra Ponto de fusão : 218°-222°C (decomposição)

Rotação específica : [d]^2 -30° (C: 1,0, MeOH) Fórmula molecular : C51H82N8°18 Peso molecular : EM-RHBAR 1117,5659 (Cale. para C^I^NgO^g+Na 1117,5645)

Solubilidade :

Solúvel em metanol e em etanol -37-

Ligeiramente solúvel em água e em acetato de etilo Insolúvel em clorofórmio e em n-hexano

Reacção de cor :

Positiva : reacção aos vapores de iodo, reacção ao sulfato de cerio

Negativa : reacção de Dragendorff, reacção de Molish

Cromatografia de camada fina (TCL) :

Fase estacionária Dissolvente de Processamento Valor de Rf mim gel de sílica" n-butanol/ácido acético/água (6:1:1) 0,35 Gel de Sílica 60 (preparado pela E. Merck)

Espectro de absorção de ultravioletas : 2 metanol . 207(353), 282(25), 232(sh) nm \ metano1+0,0IN-NaOH (£1% } . 208(462), 246(54,5), Λ max I cm 293(31,2) nm

Espectro de absorção de infravermelhos : ^KBr max 3350, 2925, 2825, 1660, 1630, 1530, 1445, 1285, 1250, 1065 cm"1 -38- -38-

ϊ

Espectro de ressonância magnética nuclear :

(CD30D, 400MHz) 5 : 6,79 (1H, d, J=2Hz), 6,71 (1H, d, J=8Hz), 6,61 (1H, dd, J=8 e 2Hz), 5,25 (1H, d, J=2,5Hz), 5.06 (1H, d, J=4Hz), 4,96 (1H, d, J=3Hz), 4,60-4,20 (9H, m) , 4,15 (1H, m), 4,08 (1H, m), 3,99 (1H, m), 3,91 (1H, m), 3,77 (1H, m), 3,34 (1H, m), 2,80 (1H, dd, J=15 e 3Hz), 2,54-2,40 (3H, m), 2,20 (2H, t, J=7Hz), 2,05-1,96 (3H, m), 1,56 (2H, m), 1,35-1,20 (24H, m), 1,15 (3H, d, J=6Hz), 1,02 (3H, d, J=7Hz), 0,89 (3H, t, J=7Hz).

Espectro de ressonância magnética nuclear JC : (CD30D, 100MHz) 6 : 177,2 (s), 175,8 (s), 174,5 (s), 173,4 (s), 172,7 (s), 172,6 (s), 172,5 (s), 169,1 (s),

J 146.4 (s), 146,3 (s), 133,7 (s), 120,1 (d), 116,2 (d), 115,3 (d), 76,9 (d), 75,9 (d), 75.8 (d), 74,0 (d), 71,3 (d), 70,6 (d), 70.6 (d), 70,1 (d), 68,2 (d), 62,5 (d), 58.4 (d), 57,1 (t), 56,4 (d), 55,6 (d), 53,0 (t), 51,5 (d), 39,5 (t), 39,0 (d), 38.5 (t), 36,7 (t), 34,8 (t), 33,1 (t), 30.8 (t x 5), 30,7 (t), 30,6 (t), 30,5 (t) , 30,4 (t), 30,3 (t), 26,9 (t), 23,7 (t), 19.7 (q), 14,4 (q), 11,1 (q). -39- ff

ΰ .¾ A estrutura química da substância FR133302 e a seguinte :

Claims

J REIVINDICAÇÕES J Processo para a preparação de um composto polipeptídico de fórmula geral

na qual R^' representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi, R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi e R3 representa um grupo hi droxi ou hidroxi-sulfoniloxi, com a condição de quando R^ representa um átomo de hidrogénio R^ representar um átomo de hidrogénio, ou de um seu sal, caracterizado pelo facto: i) de se fermentar uma estirpe pertencente ao género Coleophoma que é susceptível de produzir um composto de fórmula [Ia] ou um seu sal:

na qual R^ e R2 têm os significados definidos antes num meio nutriente e de se recolher o composto de fórmula [la] ou um seu sal, para se obter o compo£ to de fórmula [Ia] ou um seu sal, ou ii) de se submeter um composto de fórmula [Ia] ou um seu r 42 sal assim obtido a uma reacção de eliminação do grupo sulfo pa ra se obter um composto de fórmula geral

J na qual R^ e R2 têm os significados definidos antes, ou um seu sal. J Lisboa, 13 de Novembro de \ 1990