PT89917B - Processo para a preparacao de um novo antibiotico bu-3862t com actividade antitumor a partir de uma estirpe de "streptomyces hygroscopicus" - Google Patents

Description

1. Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a novos antibióticos antitumorais, à sua preparação e extracção.

2. Descrição de trabalhos anteriores

A presente invenção diz respeito a um novo produto de fermentação designado por BU-3362T de fórmula

Diz também respeitoao diacetato e tados do composto BU-3862T de fórmulas, a derivados di-hidrarespectivamente, f

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Os autores da presente invenção não conhecem nenhum an tibiótico antitumoral relacionado estruturalmente com os compo.s tos de acordo com a mesma.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a um novo antibiótico antitumoral designado por BU-3862T e que exibe a fórmula estru tural

I e ao processo para a preparação, extracção e purificação do mes mo produto.

antibiótico preparado de acordo com a presente invenção obtém-se por fermentação de uma estirpe de Streptomyces hygroscoplcus produtora de BU-38Ó2T, de preferência umaestir3 . pe de Streptonyces hygroscoplcus P24-7-71 (ATCC 53709) ou una sua variante ou mutante, submersa no seio de um meie nutriente aquoso em condiçês aeróbias, até à produção substancial: de’ uma quantidade de Bu-3862T pelo organismo citado antes, no meio da cultura também citada antes, e extracção eventual do BU-38Ó2T desse meio de cultura.

A presente invenção também diz respeito ao derivado diacetílico do produto BU-3862T de fórmula geral

na qual

Ac representa um grupo CH^COque se obtém por acetilação do produto BU-3862T e.o derivado dihidro do mesmo produto, de fórmula

preparado por hidrogenação catalítica do BU-3862T.

produto BU-37Ó2T e os seus derivados diacétílico e di4 hidro inibem sistemas tumorais experimentais em animais como, por exemplo, o melanoma no murganho.

Breve descrição dos Gráficos

Á fig 1 representa o espectro de absorção no infravermelho, do produto BU-3862T (K3r).

A fig. 2 representa o espectro de ressonância magnética protónlca do Bu-38Ó2T em CDCl^ (^00 MHz).

A fig. 3 representa o espectro de RMN do BU-38Ó2T em CDCl^ ( 100 MHz) .

Descrição detalhada antibiótico BU-38^21, preparado de acordo com a presen te invenção é produzido por fermentação de uma estirpe de Streptomyces hygroscoplcus produtora de BU-38Ó2T.

Uma estirpe preferida produtora de BU-38Ó2T designa-se por estirpe P2M-7-71 e isolou-se a partir de uma amostra de um solo colhida próximo da raíz de um tamarindeiro no Monte Apo, cida de de Davao, Ilha de Mindanau nas Filipinas. Uma cultura biologicamente pura desta estirpe encontra-se depositada em The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, fazendo parte da sua colecção permanente de microrganismos com a designa ção de ATCC 53709.

Os resultados dos estudos taxonómicos realizados relativamente h estirpe P2M-7-71 indicam que a estirpe pertence ao géne ro Streptomyces e ao grupo da espécie Streptomyces hr/groscopicus

A estirpe P24-7-71 apresenta as propriedades seguintes:

ί

Morfologia

Observa-se a formação de substrato e micélio aéreo. Este apresenta-se longo, bem ramificado e não fragmentado em filamentos curtos. Sobre as hifas aéreas formam-se cadeias de artróporos. As cadeias de esporos e a morfologia desses esporos apresen tam as seguintes características: 1) cadeias de esporos em espiral com 2 a 8 voltas, 2) esporéforos ramificados encerrados em uma únic3 formação semelhante a uma vagem, 3) esporos ovais ou cilíndricos (0,5 a 0,7 por 0,5 a 1,2 jum , e M-) esporos rugosos ou lisos.

Não se observa o aparecimento de esporângios, esporos móveis e escleróclos.

Características culturais e fisiológicas

A estirpe P2^7-71 desenvolve-se bem na maior parte dos meios conhecidos. Observa-se a formação de um micélio aéreo cin zento com manchas pretas higroscópicas quando se cultiva num meio de agar-ISP excepto quando o meio utilizado é o ISP N« 6.

Quando sé utiliza como meio de cultura o agar nitrato-sacarose de Czapek, forma-se um micélio aéreo branco ou cinzento/amarelo claro. 0 micélio que forma o substracto é incolor ou castanho amarelado a amarelo acinzentado. Não se observa a produção de me lamina nem de outros pigmentos dispersáveis. Para o desenvolvimento da estirpe utiliza-se a maior parte dos açúcares. Nos Quadros le2 pode observar-se as características culturais e fisiológicas respectivamente.

As características morfológicas, culturais e fisiológi'' 6

cas da estirpe P2^7~71 indicam que estirpe pertence ao género Streptomyces. De acordo com as descrições de Pridham e Tresner^D as características principais da estirpe são, resumidamente, as seguintes: 1) micélio aéreo cinzento, 2) cadeia de esporos em espiral, 3) ausência de coloração provocada por melamina e M parede do esporo lisa. A alteração higroscópica do micélio aéreo esporulado é uma propriedade característica da estirpe. As características principais e as observadas nos Quadros 1 e 2 e referentes às estirpes P2'+7~71 permitem a sua classificação como Streptomyces hygroscoplcus (1)Pridham, T.G. e H.D. Tresner: Genus Stroptomyces Waksman e Henrici, 19^3» p. 7^8-329. R.S. Buchanan e Ν.Ξ. Gibbons (ed.). Gergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. 197^· Williams & Wilkins Co., Baltimore.

Deve ter-se em atenção que a presente invenção não está limitada à utilização da estirpe preferida e específica P24-7-71, citada antes, ou de organismos correspondendo inteiramente às des crições citadas antes. Pretende-se especialmente a inclusão de outras variantes produtoras de BU-38Ó2T ou mutantes do organismo citado antes que possam preparar-se por meios convencionais tais como acção dos Raios λ e das radiações ultravioleta, tratamento com mostarda nitrogenada, contacto com um bacteriófago ou outros similares.

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Quadro 2

Carcaterístlcas fisiológicas da estirpe P2Q7-7I

Hidrólise:

Utilização de

Gelatina	+		Glicerol	+
Amido: amido solúvel	+		D-Arabinose	+
amido de batata	+		L-Arabinose	+
			D-Xilose	+
Coagulação do leite	-		D-Ribose	+
peptonização	+		L-Ramanose	+
			D-Glucose	+
Produção de:			D-Galactose	+
Nitrato-redutase	-		D-Fructose	+
Tirosinase	-		D-Manose	-
			L-Sorbose	-
Tolerância relativamente a:			Sacarose	+
Lisozima, 0,01% (w/v)	-	Lactose	+
0,001%(w/v)	-	Celobiose	+
CINa, 1 %-6 % (w/v)		+	Melibiose	+
7 % (w/v)		-	Trealose	+
pH 3,5-10,5		+	Rafinose	+
5,0 e 11,0		-	D-Melezitose	—
			Amido ^solúvel	+
Temperatura:			Celulose	-

Limites que permitem o cresci-

	mento	20°C - 39°C	Dulcitol	-
Ausência de	cresci-
	mento	17°C e kl°C	Inositol	+
Crescimento	óptimo	37°C - 39°C	D-Manitol	+
			D-Sorbitol	-
			Salicina	+

Meio básico: Meio de Pridham-Gottlieb (=ISP Ns 9)

Preparação de BU-5862T produto BU-3862T obtém-se cultivando uma estirpe de Streptomyces hygroscopicus produtora desse produto, de preferên cia uma estirpe exibindo as caracteristicas da estirpe P247-71 (ATCC 537θ9) do Streptomyces higroscopicus ou uma sua variante

M * ou mutante, em condiçoes aerobias no seio de meio nutriente aquoso. Este organismo desenvolve-se no seio de um meio nutrien z

te contendo uma fonte de carbono assimilável como, por exemplo, a glicerina, a B-ribose, a B-ramnose, a B-glucose, a B-frutose, a sacarose, a lactose, a melibiose, o B-manitol ou o amido solu vel. 0 meio nutriente deve conter também uma fonte de azoto as. similável como, por exemplo, farinha de peixe, peptona, soja em po fino, farinha de amendoim, farinha de sementes de algodão ou infusão de cereais. Também se pode incorporar no meio sais ino£ gânicos nutrientes escolhidos entre sais convencionais capazes de fornecer sodio, potássio, amónio, cálcio, fosfato, sulfato, cloreto, brometo, nitrato, carbonato ou outros iões similares.

A preparação do BU-3862T pode realizar-se a uma qualquer temperatura apropriada para o crescimento do organismo, por exejn pio, 20 a 39°C θ realiza-se convenientemente, a uma temperatura próxima de 28°C.

A fermentação pode realizar-se em recipientes ou em cubas de fermentação industriais ou laboratoriais de diversas capacidades. Quando se recorre à fermentação em tanque, é conveniente preparar um inoculo vegetativo no seio de um caldo nutri, ente inoculando um volume pequeno do meio de cultura em tubo inclinado ou de cultura do solo ou de uma cultura liofilizada do organismo. Deste modo, obtém um lnóculo activo que se transfere assepticamente para o meio contido no tanque de fermentação, obtendo-sé uma produção à escala industrial de BU-38Ó2T. 0 meio no qual se obtém um lnóculo vegetatlvo pode ser igual ou diferen te do utilizado no tanque contanto que se verifique um desenvolvimento abundante do organismo produtor.

Na generalidade, consegue-se uma produção óptima de BU-3862T após períodos de incubação de 4 dias aproximadamente.

BU-38Ó2T pode extrair-se do meio de cultura e isolar-se sob uma forma substancialmente pura mediante a utilização de técnicas cromatográfica.;e de extracção com dissolventes convencionais. 0 exemplo 2, apresentado mais adiante, ilustra uma técnica de isolamento e purificação apropriada.

derivado diacetato do composto BU-3862T de fórmula II, citada antes, pode preparar-se fazendo reagir o composto BU-386ZT com um agente de acilação apropriado tal como o anidrido acético no seio de um dissolvente orgânico inerte. 0 exemplo 3_? apresen tado mais adiante, ilustra uma técnica caracteristica. 0 deriva do dihidro do composto BU-3862T, de fórmula III, citada antes, pode preparar-se hldrogenando cataliticamente o composto BU-3862T, como se descreve no exemplo L.

composto BU-3862T obteve-se sob a forma de um sólido gomoso incolor que se dissolveu facilmente no dimetilsulfóxido, na dimetilformamida, no metanol, no etanol, no acetato de etilo e no clorofórmio, sendo praticamente insolúvel em água, benzeno e outros dissolventes orgânicos.

A reacção do composto BU-3862T com iodo, ácido ãulfúri co-mcUbdato de amónio (AMS) e reagente de Rydone-Smith é .positi va, enquanto a reacção com ninidrlna, antrona e cloreto fárrico á negativa. No Quadro 3 pode observar-se o resumo das propriedades físico-químicas do BU-3862T. Este composto não exibe absorção característica no U.V..

As fig. 1,72 e 3 ilustram, respectivamente, o espectro no infravermelho e os espectros RMN e RMN do BU-38Ó2T.

Quadro 3

Propriedades físico-químicas do composto BU-38Ó2T

Aspecto :	Sólido gomoso colorido
	+32 +2°C (c=0,5, metanol)
EI & FDMS :	m/z 399 (M+-H)+	C	H	N
Análise elementar :	Cale, para C^H^N^:	60,28	8,60	7,03
	Encontrado:	60 ,18	8,82	6,60
CCF, S102 :	CH2Cl2-MeOH (9:1)		Rf 0	,37
(Merck F2^)	EtOAc-MeOH (4-:1)		0	,59
	Metiletilcetona-XIleno	-metanol
	(10:10:2)	0	,35

Estudos relativos à estrutura do BU-3862T

BU-3862T exibe absorções intensas a 3300 (grupo hidroxi), 1720 (grupo carbonilo), 1650 e 1530 ^{cm 1} (função amida) no espectro do infravermelho o que indica, para o antibiótico, uma estrutura peptídica. 0 espectro de RMN ¹^C demonstrou a existência de 20 átomos de carbono, identificados como pertencentes aos grupos C-CH^ (2), =C-CH^ (D, -CH₂ (8), -CK (3), y C < ( 1) > 7C=ÇH₂ (1) e C=0 ( 3) · Com base na análise ele u

( mentar, nos dados respeitantes ao espectro de massa

Z”(M+-H)⁺ : m/z 399 J à análise do espectro de RMN de , esta beleceu-se a fórmula molecular do composto BU-38Ó2T como sendo . No espectro de RMN de observaram-se 3^ protões. Os dois núcleos protónicos que aparecem desdobrados em dobletos ( zÇ 7_}O3^e 6,4-8 ppm, em CDCl^) e que desaparecem gradualmente pela adição de óxido de deutário, foram atribuídos aos dois grupos -NH-C0. Os dois protões singuletos largos (£ 4- ,83 e 4-,79) e os dois protões dobletos do tipo AB (<$3,35 e 3,12,

J: 5,0 Hz) foram designados por protões exometileno ^-(CH^)C=CR^ J e epóxido (

) , respectivamente. As conectividades destes protões foram determinadas pelo método de Coqy e conduziram às estruturas parciais apresentadas mais adiante. Outras conectividades das estruturas parciais foram estabelecidas pelos métodos de COSY - ^H é de longa distância. Analisaram-se estas conectividades como se pode observar mais adiante, tendo-se assim determinado a estrutura total do BU-3862T. Constituíram ainda outras provas desta estrutura o espectro de massa e experiências de degradação. 0 espeç tro EI-EM exibiu abundantes iões fragmentados a m/z 127 ( iso-octanoílo), 21+ ( iso-octanoíl-serilo) e 325 ( iso-octanoíl-seril-4-,5-didesidroleucilo) como suporte de estrutura. Por idrólise ácida o BU-3862T forneceu um aminoácido e um ácido gordo.

C aminoácido isolado foi identificado como L-serinapor.CLEP e o ácido gordo como ácido iso-octanóico por cromatografia gasosa do seu éster metílico. 0 BU-3862T forneceu o derivado diacetato mediante tratamento com anidrido acético no seio de piridina. Mediante hidrogenação com paládio sobre carvão, o BU-3862T forneceu dois produtos de redução, o BU-362T di-hidratado e o BU-3862T tetra-hidratado, cujas estruturas se determinam com base nos seus dados espectrais. 0 diacetato e o composto didratado conservaram a actividade biológica mas o derivado tetra hidratado não exibe essa actividade.

composto BU-3862T, que pode designa-se por 1,2-epoxi-2-hidroximetil-¹+-(N-iso-octanll-L-serllamino)-6-metll-hept-6-eno-3-ona, é um póptido invulgar contendo um grupo epóxido e exometileno.

Estruturas parciais do BU-38Ó2T

Ç=0

C=0 OH (CH₃)₂0Η-(0Η₂)^-0=0 , -NH-CH-CH₂0H

-NH-CH-CH₂-C=CH₂ ,

e -CH₂0H

BU-38Ó2T

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BU-3862T diacetilado

Derivado d±-hidratado de BU-3862T

Derivado tetrahidratado de BU-38Ó2T

Espectro de RMN de longa distância

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Actividade biológica do BU-3862T

In vitro ensaiou-se a citotoxicidade do BU-38Ó2T e dos seus derivados diacetato, di-hidrato e tetra-hidrato, contra di versas linhas de células tumorais humanas e murinas e/ou a activi dade antitumoral in vivo no murganho. Como composto de referência utilizou-se a mitomicina C quer nas experiências ln vitro quer nas experiências ln vivo. As células de Bló-FlO (melanoma murino), P388 (leucémia murina), L1210 (leucémia murina) e de Moser (arcinoma colerectal humano) desenvolveram-se até à fase logarítmica em meio essencial mínimo de Eagle enriquecido (ΜΞΜ) a que se adicionou soro de feto de vitela (FCS, 10 %) e canamicina (6o mcg/ml); e células de HCT-116 (carcinoma do cólon huma no) em meio 5 A de Maccoy a que se adicionou FCS (10 %), penicilina ( ICO p/ml) e estreptomicina (100 mcg/ml), semearam-se e ino cularam em compartimentos de placas para cultura de tecidos com 2^ a 96 compartimento com compostos em ensaio nas concentrações de 1,5 * 10^, 1,2 x 10^, 1,2 x 1θ\ 2,5 x 10^ e 3,0 x 10^ célu las/ml, respectivamente. Incubaram-se à temperatura de 37°C ^em

ί uma atmosfera humidificada de 5 % de 00^ e 95 % de ar durante 72 horas. Apos coloração de células viáveis com uma solução de vermelho neutro a 0,006 %, determinou-se colorimetricamente, a 540 nm, a acção citotoxica contra células B16-P10, células de

Λ, X X moser e HCT-116. Por outro lado, a acçao citotoxica contra ce lulas P388 e L1210 determinou-se mediante contagem do numero de células viáveis. No quadro 4 pode observar-se o sumário dos re sultados. Comparando com a mitomicina C, o BU-3862T exibiu uma citotoxicidade muito mais potente quer contra células murinas quer contra células humanas. Relativamente aos valores de Cl _θ, a potência foi aproximadamente 50 a 120 vezes superior à da mitomicina C. Os derivados diacetilo e dihidratado exibiram também, de um modo equivalente, potenciais citotéxicos pode x

rosos contra células humanas e murinas, aproximadamente metade dos do ΒΠ-3862Τ. Por outro lado, o derivado tetrahidratado foi significativamente menos activo do que os compostos citados antes .

Os efeitos inibitórios do BU-3862T na sintese de macromoleculas (ADN, ARN e proteínas) foram determinados em células cultivadas de melanoma B16-F10. À temperatura de 37°^ incubaram-se células B16-F10 (lO⁵ células/ml) com BU-3862T durante

3,5 horas (para a sintese de proteínas e de ADN) ou 4 horas (para a sintese de proteínas e de ARN). Ã mistura a cultivar adicionou-se como precursor isotopicamente marcado

H-timidina, C-uridina ou χί-leucina e continuou-se a incubação durante 30 minutos (para a síntese de ADN) ou 60 minutos (para a síntese de proteínas e de ARN). Apés lavagem com uma solução gelada a 5 % de acido tricloroacetico, determinou-se a radioactividade incorporada na fracção das células tumorais insolúveis no ácido, utilizando um contador de cintilação nos líqui dos. Como se pode observar no quadro 5, o BU-38Ó2T inibiu, de um modo similar, quer a síntese de proteínas quer a do ADN e, re laticamente à síntese do ABN a potência foi superior a 100 vezes em termos de valores de CI^_Q

As actividades antitumorais do BU-38Ó2T e dos derivados diacetilo e di-hldrato determinaram-se, in vivo,em murganhos

CDF^ ou BDF^ com tumores. Por via intraperitoneal inocularam-se murganhos BDF^ machos com 0,5 ml de tecido tumoral melanótico a % retirado de um melanoma Bló, tendo-se Inoculado também, por via intraperitonea, murganhos CDF^ fêmeas com 0,4 ml de líquido ti ascítico diluído contendo 10' de células linfóides de leucémia L1210 ou 10^ de células linfocíticas de leucémia P388· Utilizan do quatro esquemas diferentes de tratamento administraram-se os compostos em ensaio, no rato, por via intraperitoneal: 1 vez por dia nos dias 1, 2 e 3 ( QD ^χ 3 ), nos dias 1, 4 e 7 (Q3^ ^x 3)? nos dias 1, 5 e 9 (Q4d x 3) e nos dias 1 a 9 (QD x 9). C omo se pode observar no quadro 6, o BU-38Ó2T demonstrou uma excelente eficácia terapêutica contra o melanoma Bló. Quando administrado mediante o esquema de tratamento Q4d x 3, a potência (dose eficaz mínima) do BU-38Ó2T foi igual à da mitomicina C . 0 mesmo composto exibiu uma acção antitumoral mais elevada e uma acção terapêutica mais ampla durante a administração intermitente.

(Q4d x 3) do que durante a administração consecutiva (QD x 9) em termos de valor de T/C máximo e índice quimioterapêutico (razão entre a dose éptima e a dose eficaz mínima), respectivamente.

Os derivados diacetilo e di-hidratado exibiram ambos também uma acção significativa contra o melanoma Bló mediante o esquema de tratamento QM-D ^χ 3 mas foram aproximadamente dez vezes menos ac tivos do que o composto original no que representa à dose eficaz mínima, como se pode observar no quadro 7· Por outro lado, a ac ção antileucémlca do BU-3862T foi muito fraca. Este composto exibiu uma acção antitumoral moderada contra leucémia L1210 ccm um valor T/C máximo de 14-5 mas não exibiu prolongamento slgni ficatlvo da vida de murganhos com leucémia P388 nas doses ensai das (quadros 8 θ 9).

Quadro 4Citotoxicidade, in vitro, contra células tumorais humanas e murlnas ^CI50

Composto	B16-F10	P388	L1210	HCT-II6	Moser
BUs3âó2T	0,0017	0,031	0,01	0,0097	0,016
BU-38Ó2T diacetilado	0,0030	ND*	ND	0,017	0,04-4
BU-38Ó2T dihidratado	0,0032	ND	ND	0,013	0,038
BU-38Ó2T-tetrahidratado	0,53	ND	ND	>1,0	>i,c
Mitomiclna C	0,50	ND	ND	0,80	4,2

*ND: Não determinado.

Qua22

Quadro 5

Inibição da síntese de macromoléculas em células de melanona Bló

CIç^q (mcg/ml)

Composto	DNA	BNA	Proteínas
BU-38Ó2T	0 ,10	11	o,c6o
Mitomicina C	1,6	11	6o
	Quadro	6
Acção antitumoral	de BU-3862T	contra me	lanoma Bl6 (ip)

Composto

Esquema de Alteração do

XL

Dose tratamento MST T/C peso corporal (mg/kg/dia) (ip) (dia) (%) no ^dia ( g)

BU-38Ó2T

Mitomicina C

8,0	Q*+D	X	3	20,0	167*2	-2,3
^,0		If		19,0	158* 2	-1,3
2,0		II		18,0	150*2	-0,5
i,o		II		17,0	192*	+0,3
o,5		H		. 15,5	129* 2	+o,5
0,25		II		14-,0	117	+o ,5
2,0	Q5-D	X	3	29,0	292*2	+0,3
1,0		II		18,5	159* 2	+0,5
0,5		11		15,0	125* 2	+0,5
0,25		ir		13,0	108	+0,3

Quadro 6 (Continuação) ζ’

Composto	Dose (mg/kg/dia)	Esquema de tratamento (ip)	MST*1 T/C	Alteração do peso corporal no (5a dia (g)
(dia)	(%)
Veículo	-	Qi+D X 3	12,0	-	+ 1,1
BU-3862T	2,0	QD x 9	Tox	Tox	-
	i,o	tt	1^,5	97	-3,3
	0,5	tr	20,0	133*2	-2,3
	0,25	tt	20,0	133*2	0,3
	0,13	tr	18,5	123	+0,8
	o,í3	tt	18,0	113	+ 1,3
Veículo	-	QD x 9	i5,o	-	+ 1,3

*1 Tempo médio de sobrevivência * Acção antitumoral significqtiva (T/C s 125 0)

Qua21

Quadro 7

Acção antitumora dos derivados diacetilo e dihidrato de'

BU-38Ó2T contra melanoma Bló ( ip)

Alteração do T/C peso corporal (%) no5^s dia ( g)

Escala de * 1

Dose tratamento: MST (mg/kg/dia) (ip) (dia)

Composto

BU-38Ó2T diacetilado	8,0	Q4D	* 3	24,0	141* 2	-2,0
	4,0		II	23,0	135*2	+o,5
	2,0		II	20,5	121	+ 1,0
	1,0		tf	20,0	118	+0,3
	0,5		II	19,0	122	+ 1,3
BU-38Ó2T dihidratado	8,0	Q4d	* 3	22,5	132*2	-1,0
	4,0		II	20,0	118	-0,5
	2,0		H	21,0	124	+0,5
	1,0		II	19,5	115	+o,5
	0,5		11	19,0	112	+o,5
Mitomicina C	2,0	Q4D	* 3	>33,0^19^*2	0,0
	1,0		II	23,0	135* 2	+ 1,0
	0,5		II	22,0	129*2	+0,3
	0,25		II	20,0	lis	+0,3
Veículo	-	Q4d	x 3	17,0	-	+0,8

•Μ 1

Tempo médio de sobrevivência *² Acção antitumoral significativa (T/C 12? %).

Qua22

Quadro 8

Acção antitumoral do BU-3862T contra a leucémia L1210(ip)

Composto	_ *1 Dose (mg/kg/dia)	MST*2 (dia)	T/C (0)	Alteração do peso corporal no 5a dia (g)
BU-38Ó2T		Tox.	Tox.	—
	2,0	11,5	l44*3	-3,5
	1,0	10,0	125*3	-2,8
	0,5	9,5	119	-0,8
	0,25	9,5	119	0,0
Mitomicina C	2,0	13,0	163*3	-0,5
	1,0	11,0	138*3	-0,3
	o,5	10,5	131*3	0,0
	0,25	10,0	125*3	-0,8
Veículo	-	8,0	-	+ 1,1
Q3D x, ip para	o BU-38Ó2T e	QD X 3,	ip para	a mitomicina C

iK P

Tempo médio de sobrevivência *3 Acção antitumoral significativa (T/C. 125 0).

Qua23

Quadro 9

Acção antitumoral do BU-38Ó2T contra a leucémia (ip)

Alteração do

Composto	T-S *1 Dose (mg/kg/dia)	MST*2 (dia)	T/C ] (%) í	peso corporal >3 dia (g)
BU-38Ó2T	^,0	11,0	io5	-2,3
	2,0	11,0	io5	-2,8
	1,0	11,5	110	-0,8
	0,5	13,0	124	.t©,3
	0,25	12,5	119	+ 0,8
Mitomicina C	2,0	17,0	1Ó2*3	+ i,5
	1,0	15,0	143*3	+ 1,8
	o,5	13,0	124	+ 1,8
	0,25	13,0	124	+ 2,3
Veículo	-	10,5	-	+ 2,4
*1 Q4D x 3, ip
Tempo ©^diò de	sobrevivência

*³ Acção antitumoral significativa (TC 123 %)·

Dô a.qordo com as indicações fornecidas pelos dados citados antes, o BU-3862T e os seus derivados dihidratados e diacetilo são úteis como agentes antitumorais permitindo a inibi, ção de tumores malignos nos mamíferos tais como o melanona Bl6.

A presente invenção inclui no seu âmbito composições

2U <3 farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz, que permite inibir tumores, do BU-38Ó2T, do BU-3862T dihidratado ou do BU-3862T diacetilado, em associação com um veículo ou diluente inerte aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Estas com posições podem conter também outros agentes antitumorais activos e podem preparar-se de um modo convencional em fármácia atendendo à via de administração pretendida. Exemplos destas composições incluem composições sólidas para administração oral tal como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós e grânulos; compo ções líquidas para administração oral como soluções, suspensões, xaropes.'ou~çlixires''e composições para administração parentérica tal como soluções estéreis, suspensões ou emulsões. Podem também preparar-se composições sólidas estéreis que se podem dissolver em água estéril, soro fisiológico ou outro meio injeç tável estéril apropriado imediatamente antes de se utilizarem.

Os entendidos na matéria podem calcular facilmente as doses ]5timas e a posologia do BU-3862T ou dos seus derivados di hidratadce diacetilo, .. quando se pretende administrá-los a um mamífero como agentes antitumorais. E evidente que se deve ter em atenção que a dose real do composto utilizado deve variar de acordo com a fórmula galénica administrada, o modo e o local de aplicação e o hospedeiro e a doença a tratar. Deve ter-se em atenção muitos dos factores que modificam a acção do composto, incluindo a idade, o peso, o sexo, a dieta, o período de ad minist ração ,a via de administração, a taxa de excreção, a situação cb doente, as associações com o composto, as sensibilidades reaccionais e a gravidade da doença.

Fornecem-se os exemplos seguintes apenas para a presen te invenção não com a intenção de limitar o âmbito da mesma.

í

Exemplo 1

Fermentação de BU-38^2T

Para inocular um meio vegetativo constituído por 3 % de farinha de soja (Nikko SeiYu) , 0,5 % de Pharmamedia (iraders, EUA), 3 % de glucose, 0,1 % de extracto de levedura (Oriental) e 0,3% de carbonato de cálcio, utilizou-se uma cultura inclinada em agar de Streptomyces hygroscoplcus com um desenvolvimento apreciável, ajustando-se o pH atá 7,0 antes de esterilização. Incu bou-se o meio vegetativo à temperatura de 28°C durante b- dias num agitador rotativo (200 rpm) e transferiu-se 5 ml da cultura para um balão de Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml do meio de fermentação que tem uma composição similar à do meio vegetativo.

A fermentação realizou-se à temperatura de 2Q°C durante *+ a 5 bdias com agitação no agitador rotativo

A produção de antibiótico antitumoral no caldo de fermen tação foi avaliada in vitro pela acção citotóxica contra células de melanoma Bló. A fermentação realiza-se também num tanque de fermentação. Do Erlenmeyer de fermentação transferiram-se 2 li tros da cultura vegetativa para o tanque de fermentação contendo 120 litros de meio de fermentação. A fermentação decorreu à temperatura de 28°C com uma agitação de 250 rpm e o fornecimento de uma corrente de ar de 120 litros por minuto. A concentração de antibiótico antitumoral atingiu um máximo de 50 ^ug/ml cerca de 90 horas depois do início da fermentação.

Exem26

Lz· ι

Exemplo 2

Isolamento e purificação do BU-38Ó2T

Utilizando uma centrífuga do tipo Sharpless (Kokusan *+A) , desdobrou-se o caldo de fermentação (23 litros, pH 7Λ) obtido pela técnica geral descrita no exemplo 1, no bolo micelial e no sobrenadante. Extralu-se o micélio em forma de bolo com 6 li tros de metanol. Após eliminação dos materiais insolúveis por filtração, concentrou-se o extracto metanóllco no vazio até à obtenção de uma solução aquosa. Esta solução aquosa reuniu-se com o sobrenadante proveniente do caldo de cultura e extrairam-se com 20 litros de acetato de etilo. Evaporou-se o extracto, no vazio, até à secagem obtendo-se 21,1 g do complexo antibióti co impuro. Submeteu-se este sólido impuro a uma cromatografia utilizando uma coluna de gel de sílica (0cm de diâmetro x x 75 cm) previamente lavada com cloreto de metileno e, como agente de eluição, utilizou-se uma mistura de cloreto de metileno/metanol, na qual se aumentou, pouco a pouco, a concentração do metanol (2 a 10 % v/v). Controlou-se o liquido eluído avaliando a citotoxicidade contra o melanoma Bló e por reacção corada com Iodo numa cromatografia em camada fina (CCF). As primeiras fracçóes eluídas com metano a 2 % que reagiram positlvamente com o iodo foram reunidas e mais tarde purificadas por cromatografia utilizando uma resina Sephadex LH-20. Identificou-se o componente purificado como sendo a 9-metilestreptlmidona com base nos seus dados espectrais. As fracçóes positivas ao iodo que se eluiram depois com metanol a 5 % foram reunidas e evaporadas no vazio obtendo-se um sólido·semi-puro constituído por BU-3862T que se cromatograf ou seguidanente so21 bre gel de sílica utilizando como agente de eluição uma mistura de acetato de etilo/metanol. A eluição com uma mistura na propoção de 50:1 (v/v) forneceu fracções activas que exibiram intensa cjtotoxicidade contra o melanona Bló. Após concentração no vazio, purificou-se ainda o resíduo por cromatografia com Sephadex LH-20 utilizando como agente de eluição metanol. Obtiveram- 34-1 mg de BU-3862T sob a forma de um sólido homogéneo .

Exemplo 3

Preparação do BU-38Ó2T dlacetilado

À'temperatura ambiente agitaram-se, durante 18 horas, mg de BU-3862T com 0,1 ml de anidrido acético e 0,5 ml de piridina anidra. Diluiu-se a misture- reaccional com 10 ml acetato de etilo e lavou-se com 10 ml de ácico clorídrico diluído e depois com 10 ml de água. Secou-se a solução orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se no vazio obtendo-se 13 mg de BU-38Ó2T diacetilado sob a forma de um produto oleoso. Nos quadros 9 θ 10 que se seguem podem observar-se as propriedades físico-químicas.

1) Saito, N.; F. Kitame, M. Kikuchi and N. Ishida: Studies on a new antlviral antiblotic, 9-methilstreptimidona

1. Physicochemical and biological properties, J. Antibiotics 27: 206-214-, 1974.

Qua<3

Quadro 9

Propriedades físico-químicas dos derivados do BU-38Ó2T

	BU-3862T acetiladc	di- 3	BU-3862T dihidratado	BU-38Ó2T tetra hidratado
Natureza	Gomoso incolor	Gomoso incolor	Gomoso incolor
		sólido		sólido	sólido
SIMS	m/ z	^83 (M+H)+	b-01 (M+H)+	L03 (M+H)+
ElMS	m/z	^23 (M-	-COOCH^I	+ 370 (M+-H-CH20Hb- 372
		L30		299	299
		25 8		2lL	2lL
		127		127	127
IV	1 _i KBr cm	3300		3300	3300
	max	3070		3070	3O7O
		2950		2950	2950
		1750		1720	1710
		1650		I6L0	lóLO
		1550		1530	1530
		12M-0		1050	1050
		ÍOM-O
CCF,	SiO2	Rf 0,78		0,37	0,21

^CH2^C12-Me°^H (9:1)

Qua29

Quadro 10

Dados do espectro de BMN do BU-3862T e dos seus derlV.ados (4-00 em CDCl^)

Posição N²

BU-38Ó2T

3,75 (d) 4-,21 (d)

4-,61 (ddd) 7,03

4,48 (ddd)

6,4-8 (d)

2,21 (t) 1,6c (m)

1,28 (m)

1,16 (m) 1,52 (m) 0,86 (d) 3,12 (d) 3,35 (d)

BU-3862T dl acetliado

4-,01 (d) 4-,87 (d)

4-,61 (ddd) 6,53

4-,70 (ddd)

6,22 (d) 2.,21 (t) 1,59 (m)

1,28 (ml

1,18 (m) 1,52 (m) 0,86 (d) 3,09 (d) 3,38 (d)

BU-38Ó2T di hidratado

3,73 (d)

4.21 (d)

4-,51 (m)

7.10 (d) 4-,4-9 (ddd)

6.51 (d)

2.22 (t)

1,6o (m)

1,28 (m)

1,16 (m)

1.52 (m) 0,85 (d)

3.10 (d) 3,31 (d)

BU-3862T tetrahidratado

3,74 (dd)^a) 3,90 (m)

3,15 (m)

4,58 (m)^b)

7.31 (d)

4-,54- (m)^b)

6.52 (d)

2,24- (t)

1,61 (m)

1,29 (m)

1,19 (m)

1.52 (m)

0,86 (d)

3.31 (dd)^a) 3,90 (m)

3Ç

Quadro 10 (Continuação)

Posição N5	BU-3862T	BU-3862T di acetilado	BU-38Ó2T di hidratado	BU-3862T tetrahidratado
17	2,08 (dd)	2,07 (dd)
	2,59 (dd)	2,6c (dd)	1,28 (m)	1,29 (m)
18	-	-	1,66 (m)	1,70 (m)
19	1,75 (s)	1,76 (s)	0,94 (d/)c)	0,96 (d)d)
20	4,79 (brs)	4,80 (brs)	0,95 (d)c)	0,97 (d)d)
	4,83 (brs)	4,88 (brs)
21	3,58 (dd)	4,18 (dd)	3,58 (dd)	3,59 (dd)
	4,02 (dd)	4,37 (dd)	4,03 (dd)	4,c6 (dd)
22	0,86 (d)	0,8$ (d)	0,85 (d)	0,86 (d)
OCOCH^		2,05, 2,09
a) , b)	, c) e d)	indicam pares	de designações	! que se po-

dem permutar.

Exemplo 4

Preparação do BU-38Ó2T di-hidratado e tetrahidratado

À pressão atmosférica, hidrogenaram-se, durante 20 horas e na presença de 15 mg de paládio a 20 0 sobre carvão, mg de BU-3862T dissolvidos em 10 ml de metanol. Filtrou-se a mistura reaccional e evaporou-se o filtrado a pressão reduzida obtendo-se 27 mg de uma mistura de dois produtos provenientes da hidrogenação. Separaram-se os dois produtos por cromatografia preparativa em camada fina sobre óxido de silício utilizan32 do-como agente de eluição uma mistura de CH₂Cl₂/Me0H (9:1, v/v) e purificaram-se também por cromatografia sobre Sephadex LH-20, obtendo-se 13,4 mg do BU-38Ó2T di-hidratado e 4,7 mg do BU-38Ó2T tetrahidratado. Nos quadros 9 e 10 citados antes, po dem observar-se as propriedades físico-químicas.

Rei32

Espectro de absorção no infra-vermelho do BU-3862T (KBr)

(%) oBSSTuisurai

Numero de onda (cm

Espectro de RMN H do BU-3862T (CDC1

ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΓΤΤΤΤΤΤΤΤΓΤΤΓΓΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ o>

Espectro de RMN C do BU-3862T (CDC1 |·ΐηιιιιΐ|ΐιιΙιιΤπριιιιιιυρηι||ιιΐ|ΐ|πυΐΙΙ|Ιιιι|ΙΙιΙ|ΐ||ι|ΐΐΗρηπιηρπΐΐυΐ||Ι>||1ΙΙΙΙ,ΙΠΤΙΙΐη|ηΐΙΠηΐρΐ1ΠΙΙΙ|ΙΙΙΠΙΠΙ|1ΙΠΐηΐΐρΐΐυΐΙΙ>ρΠ1ΙΙ1Ιΐ|ΐΙΗΠ|1Ι|1Ι»ΐυΐΗ|ΙΙΙ|ΙΙΙΙΙ|ΙΙ||ΙΙΙΙΙ1ΠΠΠΠη

2/0 200 /90/00/70 /60 /50 /40 /30 /20 //0 /00 90 00 70 60 50 40 30 20 /0 0 ~/C

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação do antibiótico BU-3862T de fórmula caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de Streptomyes hygroscopicys produtora de BU-3862T, no seio de um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e azoto, em condições aerõbias submersas, até que uma quantidade substancial de antibiótico BU-3862T seja produzida pelo organismo citado antes, no referido meio de cultura, e de

   -36se extrair depois desse meio de cultura o antibiótico citado antes e designado por BU-3862T.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como estirpe produtora de

   BU-3862T uma estirpe de Streptomyces higroscopicus depositada na ATCC sob o numero de admissão 53709, ou uma sua variante ou mutante.
3. 3. - Cultura biologicamente pura de uma estirpe de Streptomyces hygroscopicus depositada na ATCC sob o número de admissão 53709, caracterizada pelo facto de produzir, mediante cultura em um meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e azoto, o antibiótico BU-3862T em quantidades que permitem a sua extracção.
4. 4. - Processo para a preparação do derivado di-acetilado de BU-3862T de fórmula geral na qual

   Ac representa um grupo CH^CO-, caracterizado pelo facto de se fazer reagir o composto BU-3362T

   -37de fórmula cora um agente de acetilação no seio de um dissolvente orgânico inerte.
5. 5.- Processo para a preparação do derivado di-hidro de BU-3862T de fórmula caracterizado pelo facto de se submeter o composto BU-3862T de fórmula a uma hidrogenação catalítica.
6. 6.-38

   6.- Processo para a preparação de composições farmacêuti cas apropriadas para o tratamento de tumores malignos nos mamífe ros, caracterizado pelo facto de se misturar, como ingrediente activo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do antibiótico BU-3862T ou dos seus derivados di-acetilado e di-hidro preparados, respectivamente, pelos processos de acordo com as reivindicações 1, 4 e 5, e que inibem o crescimento de tumores malignos em animais experimentais, com um veiculo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico,