KR0135600B1

KR0135600B1 - 항암 항생물질 mi43-37f11, 그 제조방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR0135600B1
Application number: KR1019900007810A
Authority: KR
Inventors: 마사아끼 이시즈까; 히로유끼 구마가이; 쓰도무 사와; 히로시 나가나와; 히로노부 이이누마; 구니오 이시끼; 마사 하마다; 겐지 마에다; 도미오 다께우찌
Original assignee: 이찌가와 도꾸지; 자이단 호진 비세이부쓰 가가꾸 겐뀨가이
Priority date: 1989-05-31
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1998-04-23
Also published as: CN1047696A; EP0401138A2; US5096924A; EP0401138B1; DE69020645T2; EP0401138A3; ES2074148T3; DK0401138T3; JPH032177A; DE69020645D1; CA2017767A1; ATE124691T1; CN1028542C; KR900017582A; JP2802097B2; GR3017577T3; CA2017767C

Abstract

요약 없음.

Description

항암 항생물질 MI43-37F11, 그 제조방법 및 그 용도

제 1 도는 본원 발명의 항생물질MI43-37F11의 자외부 흡수 스펙트럼도.

제 2 도는 본원 발명의 항생물질MI43-37F11의 적외부 흡수 스펙트럼도.

제 3 도는 본원 발명의 항생물질MI43-37F11의 프리톤 핵자기 공명흡수 스펙트럼도.

본원 발명은 신규의 항암 항생제 및 이 신규의 항암 항생제의 배양 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본원 발명은 MI43-37F11물질로서 명령된 신규의 항암 항생물질에 관한 것이다. 본원 발명은 또한 신규의 항암 항생물질 MI43-37F11의 배양 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본원 발명은 활성성분에 대한 담체와 결합하는 활성성분으로서 Ml43-37F11 물질을 함유하는 제약 조성물을 포함한다. 또한, 본원 발명은 항암 또는 살암제로서 또는 포유동물의 생체내에서의 인터루킨-1(interleukin-1)의 생성을 돕는 약제로서, 또는 포유류의 생체내에서의 매크로파치의 활성제로서의 신규 항생물질 MI43-37F11의 약제용도에 관한 것이다.

미생물이 생산하는 항암 항생물질은 지금까지 많이 알려져 있으며, 현재 임상에서 암치료방법으로서 중요한 치료수단의 하나로 되어 있다. 그러나, 그러한 임상실습에 사용되어 왔던 공지의 항암 항생물질의 대부분은 인체에 대해 강한 독성이 있으므로, 그 사용에 있어서 커다란 제약이 되고 있다. 그래서, 독성이 낮고 또한 보다 강한 항암 또는 항종양 활성을 가진 사람의 암치료에 유효한 물질이 요망되고 있다. 본원 발명의 목적은 상기한 바람직한 특성을 가지는 항암제 또는 항종양제로서 유용한 신규의 항생물질을 제공하는 것이다.

본원 발명의 다른 목적은 임상실습에서 상기한 바람직한 특성을 가지는 항암제나 살암제로서 또는 항종양제로서 이용 가능한 MI43-37F11로서 명명된 신규의 항암 항생물질을 제공하는 것이다.

본원 발명의 다른 목적은 신규의 항암 항생물질 MI43-37F11의 배양 제조방법을 제공하는 것이다.

본원 발명이 또 다른 목적은 다음 설명으로부터 명백해질 것이다.

이와 같이, 본원 발명자는 신규의 항암 항생물질을 발견 및 제공하기 위하여 널리 연구해 왔으며, 어떤 새로운 미생물 균사를 배양하여 이제 MI43-37F11 물질로 명명되는 다음 식[1]의 신규의 항암항생제를 얻는데 성공하였다.

이 MI43-37F11 물질은 포유류에 대하여 아무런 독성이 없이 매우 유용한 항암 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

이에 따라, 본원 발명자는 본원 발명을 완성하였다.

본원 발명의 제 1 의 발명에 있어서, 다음 식[1]로 표시되는 화합물인 항암 활성을 나타내는 신규의 항생 물질 MI43-37F11를 제공한다.

본원 발명에 의한 항생물질 MI3-37F11은 에를리히 카시노마(Ehrlich carcinoma)에 대하여 높은 활성을 나타낸다는 점에서 뚜렷한 특징이 있다.

다음에, 본원 발명의 항생물질 MI43-37F11의 화학적 성질 및 생물학적 성질에 대해서 기재한다.

(A) 항생물질 MI3-37F11의 이화학적 성질

(1) 형상 : 무색침상

(2) 분자량 : 222(m/z,FD메스스펙트로메트리에 의함)

(3) 원소분석(실측치) : 탄소 59.40%, 수소 4.54%, 산소 35.79%

(4) 분자식 : C₁₁H₁₀O₅

(5) 비선광도 : [α]υ O°(c0.2, 아세토니트릴)

(6) 융점 : 148.5-149.5℃

(7) 자의부 흡수스펙트럼(첨부 도면의 제 1 도) : λmethoanol max : 238nm(4.63),244nm(4.65),256nm(sh, 4.05),274nm(sh, 3.82),286nm(sh 3.67),330nm(3.78)(괄호안의 데이타는 loge값)

(8) 적의부 흡수스펙트럼(첨부 도면의 제 2 도) : 3480, 1680, 1630, 1570, 1510, 1230, 1190, 1170, 1100, 1090, 980, 860, 840, 710, 690(cm^-1)에 특징적인 흡수대를 갖는다.

(9) 용해성 : 아세토니트릴에 쉽게 용해, 메탄올 및 클로로포름에 가용, 물 및 핵산에 난용.

(10) 프로톤 핵자기공명 스펙트럼 : 중(重)아세토니트릴중에서 측정한¹H-NMR을 제 3 도에 도시한다. 횡측은 ppm을 나타내며, 내부 기준은 테트라메틸실란이다.

그리고, 중아세토니트릴중에서 측정한 항생물질 MI43-37F11의¹³C-NMR을 표 1에 나타낸다.

[표 1]

주 : s는 1중선

b는 2중선

c는 3중선

d는 4중선

내부기준 : 테트라메틸실란

상기한 항생물지 MI43-37F11의 여러가지 이화학적 성질에 근거하여 항생물질 MI43-37F11의 화학적 구조가 다음과 같이 결정되었다. FD매스스펙트럼은 222(m/z)에서 분자이온피크를 나타내고, 원소분석의 결과 분자식 C₁₁H₁₀O₅를 지지했다. 자외부흡수스펙트럼(제 1 도) 및 적외부 흡수스펙트럼(제 2 도)은 항생물질 MI3-37F11 이 이소쿠마린(isocumarin)골격을 가지고 있음을 입증했다.¹H-NMR 스펙트럼은 제 3 도에 도시한 바와 같이

기, 3개의 방향족 수소원자 시그날 및 수소결합하고 있는 수산기 1개가 있음을 나타냈다.¹³C-NMR스펙트럼은 표 1에 나타낸 바와 같은 11개의 시그날을 나타냈다. 이소쿠마린 핵에 결합하는 각 치환기 CH₂OH, OCH₃, OH의 위치는 스펙트럼 HMBC[heteronuclear multiple bond connectivity(문헌 : A. Bax의 저, J. Am. Chem. Soc. 108, 8056-8063(1986))]에 의해 결정할 수 있었다.

이상의 각종 스펙트럼을 검토한 결과, MI3-37F11 물질은 상기 식[Ⅰ]의 화학적 구조를 갖는다는 것이 결정되었다. 이 구조에 일치하는 공지물질은 보고되어 있지 않으므로, 항생물질 MI43-37F11은 신규의 항생 물질이라고 결정되었다.

본원 발명에 의한 항생제 MI43-37F11 물질은 기지의 이소쿠마린중에서 항암 활성을 나타내는 최초의 화합물이다. 또한, 포유류에 대하여 독성이 낮으므로 항생제 MI43-37F11 물질은 암환자들의 화학요법치료에 유용한 항암 항생제로서 기대할 수 있다.

그런데, 일본국 특허공개공보 제1978-71076호(1978년 6월 24일 공개)에는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(CAMP)포스포디에스터라체에 대한 억제활성을 갖는 3-히드록시메틸-6,8-디히드록시-7-메톡시이 소쿠마린 및 다음 식의 3-히드록시메틸-6,7-디메록시-8-히드록시이소쿠마린이 개시되어 있다.

상기 일본국 특허공개공보에는, 그 공보에 기재된 이소쿠마린 유도체는 항암활성, 절형압성, 항염증활성 및 항암레르기활성 등을 나타내는 것으로 기재되어 있으나, 그곳에 기재된 이소쿠마린 유도체가 실제적으로 항암 활성을 나타낼 수 있다는 것을 입증하는 실험 데이타는 전혀 나타내지 않고 있다.

(B) 항생물질 MI43-37F11의 생물학적 성질

(1) 항생물질 MI43-37F11의 각종 실험적인 종양세포 및 사람의 암세포에 대한 증식을 저해하는 항종양 활성 10% 송아지 혈청을 함유하는 배지에서 마우스 백혈병 L1210, 마우스 백혈병 P388, 마우스 백혈병 EL4, 마우스 IMC-카시노마 및 사람 폐암 LX-1 세포를 배지중 세포밀도가 1×10⁵개/ml가 되도록 세포 현탁액을 제조하고, 그와 같이 제조된 세포 현탁액 200μ1부를 마이크로플레이트에 넣고, 여러 농도(물과 디메틸 슬록사이드(95 : 5)의 혼합물로 용해)의 MI43-37F11 물질의 용액을 첨가하였다. 첨가된 실험용 화합물을 가한 세포현탁액을 37℃로 2일간(LX-1 세포에 대하여서는 5일간)배양시켰다.

배양 후, 실험용 화합물로 처리된 L1210 세포, P388 세포, EL4 세포 및 IMC-카시노마세포의 세포수를 콜터카운터(Coulter counter)로 측정하엿다. 실험용 화합물로 처리하지 않은 세포현탁액의 미처리 대조군을 상기와 동일한 방법으로 배양한 다음 세포수를 동일한 방법으로 측정하였다. 미처리 대조군의 세포증식억제에 대한 처리군의 세포증식억제율(%)을 평가하였다.

단, 사람 폐암 LX-1 세포의 배양된 세포현탁액에 MTT(3-(4,5-디메틸리아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)를 5mg/ml로 함유한 용액 10μl를 첨가하고, 이어서 37℃로 4시간동안 더 배양시켰다. 배양 후, 배양된 세포현탁액으로부터 상등액(100μl)을 제거하고, LX-1 세포를 함유하는 남아 있는 현탁액에 이소프로판을 및 1N-HC1(25 : 1)의 혼합물 150μl를 첨가하였다. 얻어진 혼합물에 대하여 549nm에서 홉광도를 측정하였다. 미처리 대조군의 세포증식억제에 대한 처리군의 LX-1세포의 세포증식억제율(%)를 540nm에서의 흡광도로서 측정하였다.

상기와 같이 측정한 어제율0(%)의 갑으로부터 본원 발명의 MI43-37F11 물질의 IC₅₀(㎍/ml)의 값, 즉 시험된 각종 암세포의 증식을 50%억제할 수 있는 MI43-37F11 물질의 농도를 평가하였다. 실험결과를 다음의 표 2에 요약한다.

[표2]

(2) 에를리히 카시노마상의 항생제 MI3-37F11 물질의 항종양 효과를 다음 과정에 의하여 평가하였다.

(a) 항생물질 MI43-37F11의 에를리히 카시노마 마우스에 대한 치료실험은 항생제 MI3-37F11물질을 복강내에 주사하는 방법으로 행하였다. 즉, ICR마우스(암컷, 6주 성장, 1군 4마리)에 에를리히복수(腹水) 아세포의 현탁액을 세포수가 2×10⁶개/마우스가 되도록 복측(復側)피하에 이식한다. 암세포의 이식 후에, 항생제 MI43-37F11믈질을 다음의 투여 스케줄에 따라서, 이식한 후 확실하게 성장한 암세포르 가지는 마우스에 복강내 주사하여 투여시켰다. 즉, MI43-37F11물질을 세포 이식 후 제7일째에 10mg/kg, 1.25mg/kg, 0.625mg/kg의 토여량으로 격일로 총 5회를 복강내 주사했다. 대조준의 마우스에는 MI43-37F11 물질을 투여하지 않은 대신 생리식염수를 복강내 주사하였다.(대조군 8마리).

세포 이식 후 15일째에 카시노마를 꺼내어 그 중량을 측정하고, 생리식염수를 투여한 대조군의 마우스의 카시노마이 중량을 100으로 했을 때의 MI3-37F11 투여군의 카시노마의 중량의 감소비율을 억제율(%)로서 구하였다. 즉, 에르리히 카시노마 성장억제율(%)은 다음 식에 따라서 계산하였다.

식중, C는 마우스의 대조군에서의 종양의 중량이며, T는 마우스의 처리군의 종양의 중량이다.

얻어진 실험결과는 다음의 표 3에 나타낸다.

[표 3]

(b) 에를리히 카시노마 마우스의 치료방법을 위한 또 다른 실험을 MI43-37F11 물질의 경구투약에 의하여 행하였다. 이에 따라 에를리히 복수암세포의 현탁액을 ICR마우스(암컷, 6주 성장, 1군 5마리)이 복부에 피하접종하여, 피하 이식된 카시노마 세포의 수가 2×10⁶개/마우스가 되도록 하였다. MI43-37F11 물질이 카시노마 세포의 이식 후 1일째부터 9일째까지 연속 9일동나 1일 1회씩 6.3mg/kg, 12.5mg/kg, 25mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg의 투여량으로 처리군의 마우스에 경구 투약하였다. 카시노마세포 이식 후 14일째 종양(카시노마)을 외과수술에 의해 꺼내서 그 중량을 측정하였다. 마우스의 처리군으로부터 얻어진 종양의 중량은 상기와 동일한 식에 의하여 마우스의 대조군으로부터 얻어진 종양의 중량과 비교하여 억제유(%)을 계산하였다.

얻어진 실험결과는 다음의 표 4에 나타낸다.

[표4]

* * * P0.001

* * P0.01

* P0.05

(3) 항생물질 MI43-37F11의 복강내 매크로파지(macrophage)의 활성화 실험은 다음과 같이 행했다. 즉, CDF₁마우스(암컷, 8주 성장, 1군 3마리)에 항생물질 MI43-37F11을 매크로파지 채취 하루전에 50mg/kg, 12.5mg/kg, 3.125mg/kg의 퉁량이 되도록 복강내에 투여했다. 1주일 후에 복강내에서 매크로파지를 채취하고, 배치중 세포농도가 1×10⁶개/ml가 되도록 하여 플라스틱 샤얄레(Falcone, No.3003, 60×15cm, Decton Dikinson Copany 제품)에서 배양한 후 포볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate)100mg/ml를 가하여 메크로파지를 활성화시켰다. 그리고, 생성된 O₂ ^-이 양을 시토크롬 C의 환원반응으로 측정했다. 결과는 대조군으로서 생리식염수를 투여한 마우스의 복강내 매크로파지의 O₂ ^-생성량을 100으로 했을 때의 O₂ ^-생성증가율(%)로 평가하였다. 즉, 마우스의 복강내 매크로파지의 처리군의 O₂ ^-생성증가율(%)은 다음 식에 의하여 계산하였다.

식중, T는 마우스의 처리군의 복강내 매크로파지에서 생성된 O₂ ^-의 양이며, C는 제어군의 복강내 매크로파지에서 생성된 O₂ ^-의 양이다.

실험 결과는 다음의 표 5에 요약하였다.

[표 5]

(4) 항생물질 MI3-37F11의 복강내 매크로파지의 식작용(食作用)에대한 효과를 조사하는 실험은 다음과 같이 행했다. 즉, CDF₁마우스(암컷, 8주 성장, 1군 3마리)에 MI3-37F11물질을 매크로파지 채취 3일전 1일전에 50mg/kg, 5mg/kg, 0.5mg/kg을 복강내에 투여했다. 그리고, 복강내에서 매크로파지를 채취하여 배지중 세포농도가 5×10⁵개/ml가 되도록 하여 플라스틱 샤알레에서 배양한 후, 그 속에 열처리된 효모 7.5×10⁶개/ml를 첨가하여 일정시간 더 배양시켰다. 배양된 매크로파지에 메탄올을 가하여 고정시키고, 김자(Giemsa)염색을 하여 400개의 매크로파지에 의해 식작용을 받은 효모의 수를 조사했다. 결과는 대조군으로서 생리식염수를 투여한 마우스의 복강내 매크로파지 400개에 의해 식작용을 받은 효모의 수를 100으로 했을 때의 식작용 증가율(%)로 평가하였다. 즉, 마우스의 복강내 매크로파지의 식작용 증가율(%)은 다음 식에 의하여 계산하였다.

식중, T는 마우스의 처리군에서 채취한 매크로파지 400개에 의해 식작용을 받은 효모의 수이며, C는 대조군에서 채취한 매크로파지 400개에 의해 식작용을 받은 효모의 수이다.

실험 결과는 다음의 표 6에 나타낸다.

[표 6]

(5) 생체내에서 인터루킨-1의 생성을 상승시키는 항생물질 MI43-37F11의 활성평가를 위한 실험은 다음과 같이 행했다. 즉, MI43-37F11 물질 25mg/kg을 CDF₁마우스(암컷, 6주 성장)에 경구 투약하였다. 투약 1일, 3일, 5일 및 7일 후에 PEC(peritoneal exduate cells) 및 비장세포를 처리군의 마우스에서 각각 채취하였다. 채취된 PEC 및 비장세포는 별도로 두 부류, 즉 플라스틱 샤알레의 벽에 생리적으로 부착하는 부착 세포류와, 비부착세포류로 구분하였다. 구분하지 않은 PEC세포와, PEC의 부착세포와, 비장세포의 부착세포를 각각 배치중 세포농도 1×10⁶개/웰(well), 2×10⁶개/웰, 및 2.5×10⁶개/웰로 되도록 적당한 양의 배치에 현탁하였다. 24시간 배양 후에, 여과에 의하여 배지상등액을 분리하고 조나단(Jonathan)등에 의한 방법(Lymphokine Research 3(4), 175-182, 1984)으로 인터루킨-1(1L-1)의 활성을 평가하였다. 즉, 상기와 같이 얻어진 각 상등액 100μl 및 콘카나발린 A(Concanavalin A, 최종농도가 2.5㎍/ml가 되도록 첨가)를 인터루킨-1 화합물이 있을 때 콘카나발린 A+인터루킨-1의 존재하에서 증식하는 D10.G4.1. 세포 1×10⁵개/ml의 세포현탁액 100μl에 첨가하였다. 상기와 같이 얻어진 혼합물을 48시간 배양시킨 다음³H-티미딘(³H-TdR)을 첨가하고, 16시간 더 배양시켰다. 그 다음, D10.G4.1. 세포의³H-TdR 소비율을 c.p.m.의 방사능 단위로 측정하였다. 대조군의 마우스의³H-TdR소비율도 상기와 동일한 방법으로 측정하였다. 시험결과는 다음의 표 7에 요약하였다.

[표 7]

본원 발명이 제2의 발명에 있어서, 상기 식 [Ⅰ]의 항암 항생물질 MI3-37F11의 제조방법을 제공한다. 그 방법은 스트렙토버티실륨(Streptoverticllium)속에 속하는 MI43-37F11물질의 생산균주를 동화가능 탄소원 및 동화가능 질소원을 함유하는 배지에 접종하여 배양액내에 MI43-37F11 물질이 실질적으로 생성되어 축적될 때까지 배양하고, 배양액으로부터 상기 식 [Ⅰ]의 항생물질 MI43-37F11을 채취하는 것이다.

스트렙토버티실륨속에 속하는 MI43-37F11 생산균주의 일례는 MI3-37F11 균주로 명명되는 새로운 균주이며, 이것은 일본국 가낙와껜요꼬하마시 미도리구이 토양에서 본원 발명자에 의해 채취된 방사균이다.

이 MI3-37F11 균주의 미생물학적 특징은 다음과 같다.

1. 형태

MI3-37F11 균주는 현미경하에서 관찰하면 분지된 기중균사(基中菌絲)로부터 윤생지(輪生枝)를 가진 기균사(基菌絲)가 신장되어 있다. 기균사의 선단에는 10개 이상의 포자연쇄가 형성되어 있고, 나선형성은 관찰되지 않는다. 포자의 크기는 약 0.7-0.8×1.1-1.3 미크론이며, 포자의 표면은 평활하다.

2. 각종 배지에 있어서의 생육상태

색의 기재에 있어서, [ ]내에 표시한 표준은 콘테이너 코포레이션 오브 아메리카(Container Corporation of America)의 컬러하모니매뉴얼(Color Harmony Manual)을 사용했다.

(1) 수크로오즈 질산염 한천배지(27℃ 배양)

무색의 발육상에 기균사가 백새으로 얇게 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않느다.

(2) 글루코우즈 아스파라긴 한천배지(27℃ 배양)

무색-엷은 황색 [2ea, Lt Wheat]-엷은 황갈색[2gc,Bamboo]의 발육상에 황백색[1 1/2db, Parchmeat]의 기균사가 얇게 형성된다. 또한, 부분적으로 백색의 면(綿)형상의 기균사가 형성된 것도 보이며, 용해성 색소는 보이지 않느다.

(3) 글리세린 아르파라긴 한천배지(ISP-배지 5, 27℃ 배양)

무색-엷은 황색 [2ie, Lt Mustard Tan]의 발육상에 무색의 기균사가 형성된다. 용해성 색소는 약간의 갈색을 나타낸다.

(4) 스타치무기염한천배지(ISP-배지 4, 27℃ 배양)

무색-엷은 황갈색[2 le,Mustard-2ne,Mustard Gold]의 발육상에 황백색[1 1/2 ca, Cream]-밝은 올리브 회색[1 1/2ge, Lt Olive Gray]의 기균사가 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(5) 티로신 한천배지(ISP-배지 7, 27℃ 배양)

엷은 황갈색[2ie, Lt Mustard Tan]-밝은 회갈색[2 lg, Mustard Tan]의 발육상에 백-갈백색[3ba, Pearl-2cd, Ivory Tint]의 기균사가 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(6) 영양 한천배지(27℃ 배양)

무색-엷은 황갈색[2ie, Lt Mustard Tan]의 발육상에 백색의 기균사가 얇게 형성되고, 검은 용해성 색소를 약간 볼 수 있다.

(7) 이스트 맥아 한천배지(ISP-배지 2, 27℃ 배양)

무색-엷은 황갈색[2ic, Honey Gold-3ic, Lt Amber]의 주름이 있는 발육상에 백-갈백색[3ba, pearl]의 기균사가 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(8)오트밀 한천배지(ISP-배지 3, 27℃ 배양)

무색-연한 황색[2ea, Lt Wheat-2ca, Lt Ivory]의 발육상에 백-황백색의 기균사가 얇게 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(9)글리세린질산연 한천배지(27℃ 배양)

무색-연한 황색[2ca, Lt Ivory]의 발육상에 백-황백색[1 1/2db, Parchment]의 기균사가 얇게 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(10) 스타치 한천배지(27℃ 배양)

무색-연한 황색[2ea, Lt Wheat]-연한 황갈색[1 1/2 ic, Lt Antique Gold]의 발육상에 백-황백색[2ca, Lt Ivory]의 기균사가 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(11) 칼슘 말레이트 한천배지(27℃ 배양)

무색이며 생육이 매우 부진한 발육상에 백색 기균사가 약간 형성된다. 용해성 색소는 보이지 않는다.

(12)셀룰로우즈(여과지편을 첨가한 합성용액, 27℃ 배양)

무색의 발육상에 기균사가 형성되지 않고, 용해성 색소도 보이지 않는다.

(13) 젤라틴 천자(穿刺)배양

15% 단순 젤라틴 배지(20℃ 배양)에서는 발육은 무색, 기균사는 형성되지 않고, 엷은 황갈색의 용해성 색소가 관찰되었다. 또한, 글루코우즈 펩톤 젤라틴 배지(에서는 발육은 무색, 기균사는 형성되지 않고, 용해성 색소는 약간의 갈색을 나타낸다.

(14) 탈지우유(37℃ 배양)

무색-연한 갈색의 발육상에 기균사는 형성되지 않고, 용해성 색소는 약간 연한 황-갈색을 띈다.

3. 생리적 성질(3)

(1) 생육온도범위

스타치무기염한천배지(ISP-배지 4, BACTO-INORGANIC-SALTS STARCH AGAR)를 사용하여, 20℃, 24℃, 27℃, 30℃, 37℃, 50℃의 각 온도에서 실험한 결과, 50℃를 제외한 모든 온도에서 발육하였으나, 최적 생육온도는 27℃부근이라고 생각된다.

(2) 젤라틴의 액화(15% 단순 젤라틴 배지, 20℃배양, 글루코우즈 펩톤 젤라틴 배지, 27℃ 배양)

15% 단순 젤라틴 배지 및 글루코우즈 펩톤 젤라틴 배지 모두 배양 후 약 3일째부터 액화가 시작되며, 그 액화작용은 중 정도-강한편이다.

(3) 스타치의 가수분해(스타치 무기염 한천배지 및 스타치 한천배지, 모두 27℃ 배양)

스타치 무기염 한천배지 및 스타치 한천배지 모두 배양 후 약 3일째부터 가수분해가 시작되고, 그 가수분해 작용은 강한편이다.

(4) 탈지우유의 응고 및 펩톤화(탈지우유, 37℃ 배양)

배양 후 2일째에 응고가 시작되고, 3일째에 완료되어, 즉시 펩톤화가 시작된다.펩톤화의 진행은 매우 느리며, 배양 후 3주가 지나도 완료되지 않는다.

(5) 멜라노이드 색소의 생성(트립톤 이스트 액체배지, isp-배지 1; 펩톤 이스트 철 한천배지, ISP-배지 6; 티로신 한천배지, ISP-배지 7; 모두 27℃ 배양)

펩톤 이스트 철 한천배지에서는 양성, 티로신 한천배지에서는 음성, 트립톤 이스트 액체배지에서는 뚜렷한 양성이다.

(6)탄소원의 이용성(프리드햄 고트리프(Pridham Gottlieb)

한천배지, ISP-배지 9, 27℃ 배양)

글루코우즈, 프럭토우주, 이노시틀을 이용해서 발육하고, L-아라비노스, D-크실로스, 수크로우즈, 람노스, 라피노스, D-만니톨, 락토오즈는 이용하지 않는다.

(7) 칼슘 말레이트의 용해(칼슘 말레이트 한천배지, 27℃ 배양) 칼슘 말레이트 한천배지에서와 칼슘 말레이트의 용해는 음성이다.

(8) 질산염의 환원반응(0.1% 질산칼륨을 함유한 펩톤 수용액, ISP-배지 8, 27℃ 배양)

(9) 셀룰로우즈의 분해(여과지편을 첨가한 합성용액 27℃ 배양)

셀룰로우즈의 분해는 음성이다.

이상의 성상을 요약하면, MI43-37F11 균주의 기균사는 윤생지를 가지고, 나선형성은 관찰되지 않고, 포자 이 표면은 평활하다. 여러 배지에서 무색-연한 황갈색의 발육상에 백-갈백색, 또는 황백색 또는 때로 밝은 올리브회색의 기균사가 형성된다. 용해섣 색소는 생성되지 않으나, 때로 갈색 기미를 띄는 용해성 색소가 관찰된다. 멜라노이드 색소의 생성은 티로신 한천 배지에서는 음성, 트립톤 이스트 액체 배지 및 펩톤 이스트철 한천배지에서는 양성이다.

단백질 분해력을 중 정도-강한편이며, 스타치의 가수분해작용도 강한편이다. 또한, 세포벽에 포함된2,6-디아미노피메린산은 LL형이다.

상기한 이들의 미생물학적인 성상으로부터, MI43-37F11균주는 스트렙토버티실륨속에 속하는 것이라고 생각된다.

더욱이, 유사한 공지의 균종을 검색하면, 스트렙토버티실륨유로시디쿰(Srteptoverticillium eurocidicum)[문헌 1 : International Journal of Systematic Bacteriology, 22권, p293(1972); 문헌 2 : 동지, 30권, p.408(1980); 문헌 3: The Journal of Antibiotics, Ser. A. 7권, p.98(1954)] 및 스트렙토버티실륨 알비레티큐리(Streptoverticillium albireticuli)[문헌 1 : International Journal of Sysematic Bacteriology. 18권 p,80(1968); 문헌 2 : 동지, 30권, p.407(1980]를 들 수 있다.

따라서, MI43-37F11 균주와 이들 균종에 대해 실지로 비교검토하고, 결과를 정리하면 다음의 표 8과 같다.

[표 8]

주 :

: 가능-, ? : 의심스럽다, (+) : 가능 +

탄소원의 이용성^*+ : 이용하고 있다. (+) : 이용 가능하다,

± : +인지 -인지 의심스럽다.

? : 결과가 가변적이다.

- : 이용하지 않는다.

문헌×1 : International Journal of Systematic Bacteriology 22권, p293(1972).

문헌×2 : The Journal of Antibiotics Ser. A 7권, p.98(1954).

문헌×3 : International Journal of Systematic Bacteriology 18권, p.80(1968).

문헌×4 : S.A. Waksman, The Actionomycetes 2권, p.169(1961).

표 8에서 명백한 바와 같이, MI43-37F11 균주와 스토렙토버티실륨 유로시디쿰 및 스트렙토버티실륨 알비레티큐리와는 모두가 유사한 성질을 갖는다. 그러나, MI43-37F11균주와 가장 유사한 종류는 기균사가 밝은 오리브 회색을 나타낸 점, ISP-배지 7에 있어서의 멜라노이드색소의 생성이 음성 가능인 점, 프럭토우즈를 이용 가능한 점 등에서, 스트렙토버티실륨 유로시디쿰이다. 따라서, MI3-37F11 균주가 스트렙토 버티실륨 유로시티쿰 MI43-37F11으로 확인되었다.

또한, MI43-37F11 균주를 일본국 공업기술원의 미생물공업기술연구소(일본국 이바라기껜쓰쿠바시 소재)의 일본국 기탁기관에 기탁 신청하여, 1989년 1월 27일 FERM(微工硏菌寄) P-10513로 수락되었음, 지금은 부다페스트조약으로 FERM BP-2783으로 수락되어 있다.

본원 발명의 제 2 의 발명에 의한 항암 항생물질 MI3-37F11의 제조과정으로 수행함에 있어서, 스트렙토버티실륨속에 속하는 MI43-37F11 물질의 생산균주는 방선균(放線菌)이 미생물 배양을 위한 기지의 보통 방법에 의하여 배양된다. 즉, MI43-37F11 물질의 생산균주를 동화가능 탄소원 및 질소원을 함유하는 적합한 배지에 접종한 다음, 호기적으로 바람직하게는 액체배지에서 호기적으로 배양하여, 배양액내에 MI43-37F11 물질이 생성되어 축적되도록 한다.

배양에 사용되는 배지는 탄소원, 질소원, 무기염 등 보통 방선균의 배양에 사용되는 것이 사용된다. 질소원으로서는, 시판되고 잇는 펩톤, 고기 에기스, 콘 스티프 리쿼, 면실부, 낙화생분, 대두분, 효모 엑기스, NZ-아민, 카제인 가수분해물, 질산소다, 질산암모늄, 황산암모늄 등이다. 탄소원으로서는, 시판되고 있는 글리세린, 저누, 글루코우즈, 갈락토우즈, 만노스, 당밀 등의 탄수화물, 또는 지방 및 기름이다. 무기염으로서는, 식염, 인산염, 탄산칼륨, 황산마그네슘 등이다.

시판용으로 사용될 MI43-37F11 물질의 배지는 기타 필요에 따라서 미량의 무기염 및 소포제로서의 동·식·광물유 등을 첨가할 수 있다. 또한, 미생물에 유용하고, 항생물 MI43-37F11의 생산에 도움이 되는 공지의 유기 및 무기물질을 배지에 더 첨가하여 사용할 수 있다.

항생물질 MI43-37F11의 대량생산을 위한 MI43-37F11이 배양은 액체배양에서 호적으로 하는 것이 바람직하며, 배양온도는 MI43-37F11 물질 생산균이 발육하여 항생물질 MI43-37F11을 생산하는 범위에서 사용할 수 있으며, 통상 27℃-37℃이다. 배양은 이상 설명한 조건을 사용하는 항생물질 MI43-37F11 생산균주의 성질에 따라 적당히 선택해서 행할 수 있다.

MI43-37F11 물질 생산균주 배양액으로부터 MI43-37F11을 다음과 같은 방법으로 채취한다. 즉, 배양액을 여과시켜 여과액의 pH를 약산선으로 조정하여 아세트산 에틸 등의 수불혼화성(水不混和性) 유기용제로 수출할 수 있다. 이 추출법외에, 지용성(脂溶性) 물질의 분리에 사용되는 공지의 방법, 예를들면 흡착 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, 고소 액체크로마토그래피 등을 적당히 조합함으로써 항생물질 MI43-37F11을 순수하게 분리 및 정제할 수 있다.

또한, 본원 발명은 약학적 조성물로서의 MI43-37F11 물질의 용도를 포함한다.

상기한 바와 같은 MI43-37F11 물질의 유용한 생물학적 특성에 따라서, 본원 발명의 제 3 의 발명은 활성성분에 대하여 약학적으로 인용할 수 있는 담체와 결합하는 활성성분으로서의 상기 식 [Ⅰ]의 MI43-37F11 물질을 포함하는 약학적 조성물이다. 본원 발명에 의한 약학적 조성물은 사람을 포함한 포유동물에게 항암제 또는 항종양제로서 효과적이며 유용하다.

본원 발명에 의한 약학적 조성물은 예를 들면 주사제, 정제, 캡슐, 과립, 시럽, 좌약 및 연고 등의 경구, 복강내 또는 삽입투여용 의약조제품의 편리한 형태로 종래의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 약학적으로 인용할 수 있는 담체로서는, 필요에 따라 공지된 종래의 것을 사용할 수 있다. 사용될 담체의 성질 및 조성은 투약의 경로 및 방법에 따라 다르며, 약학적 목적으로 공지되고 이용 가능한 유기 및 무기, 고체 및 액체, 보통 불활성 담체 및 부형제를 포함한다. 이러한 담체의 구체적이 예는 결정질 세룰로우즈, 젤라틴, 락토오즈, 스타치, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 식물성 및 동물성 지방 및 기름, 고무 및 폴리알킬렌글리콜 등이다. 본원 발명의 약학적 조성물에 있어서, 활성항암 또는 항종양 성분, MI43-37F11물질의 노도는 조성물의 총중량을 기초로 하여 02 내지 100중량%, 바람직하게는 1 내지 90중량%이다. 필요에 따라, 본원 발명의 약학적 조성 물은 MI43-37F11 물질외에 항암, 항종양 및 기타 약학적 활성을 가지는 하나 이상의 기타 약학적 활성성분을 함유할 수 있다.

본원 발명에 의한 약학적 조성물은 어떠한 부작용도 수반하지 않는 바람직한 약학적 활성을 나타낼 수 있는 투여량으로 투여될 수 있다. 특정 투여량은 각각의 경우에 외약 전문가에 의하여 정해져야 할 것이나, 활성성분 MI3-37F11 물질의 투여량은 일반적으로 카시노마 및 악성종양의 치료방법으로 성인환자에 대하여 하루에 10mg-10g, 바람직하게는 20gm-5g의 범위로 한다. 이 경우에, 보누언 발명의 약학적 조성물은 활성성분 MI43-37F11 물질 1mg-5g,바람직하게는 3mg-1g을 함유하는 단위조제로서 편리하게 투여될 수 있다.

따라서, 본원 발명의 제 4 의 발명에 의하면, 보통 약학적 조성물의 형태로 상기 식[Ⅰ]의 MI43-37F11 물질을 치료요법상 유효량으로 투여하여 사람을 포함한 포유동물의 카시노마 또는 악성종양을 억제하는 치료 방법을 제공한다.

이미 간단히 설명한 바와 같이, MI43-37F11 물질의 투여량은 환자의 연령, 체중, 증상 및 소기의 치료 목적에 따라서 의약 전문가에 의하여 적적하게 결정될 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같은 유효투여량은 총투여량이 동물실험 및 여러 조건에 따른 결과로부터 결정된 특정수준을 초과하지 아ㅎ는 범위에서 계속적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.

또한, 본원 발명의 또 다른 특징은 항암제 또는 살암제로서 또는 항종양제로서 또는 그들의 제조에 있어서, 상기한 식 [Ⅰ]의 항생물질 MI43-37F11의 약학적 용도를 포함한다. 본원 발명은 또한 사람을 포함한 포유류의 생체내에서 인터루킨-1의 생성을 돕는 약제 또는 상기 약제의 제조로서의 항생물질 MI43-37F11의 약학적 용도를 포함한다. 이러한 약제는 활성성분에 대하여 약학적으로 인용할 수 있는 담체와 결합하는 활성성분으로서의 MI43-37F11 물질을 포함하는 약학적 조성물의 형태로 될 수 있다.

또한, 상기한 바와 같이, 본원 발명의 MI43-37F11 물질은 복강내 매크로파지가 O₂ ^-의 생성을 증가시키도록 하는 데 유효하며, 또한 매크로파지의 식균작용 뿐만 아니라 인터루킨-1의 생체내 생성을 돕는데 유효하며, 따라서 본원 발명의 MI43-37F11 물질은 결국 포유류의 생체내에서 매크로파지의 활성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본원 발명의 또 다른 특징은 포유류의 생체내에서 매크로파지를 활성화시키는 약제로서의 MI43-37F11의 용도를 포함한다.

실시예

다음에, 본원 발명의 실시예에 대하여 설명하지만, 본원 발명은 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1

한천사면배지에서 배양한 스트렙토버티실륨 유로시디쿰 MI43-37F11 균주(FERM BP-2783)를, 갈락토우즈 2.0%, 덱스트린 2.0%, 소이-펩톤(디프코사제품의 Bacto Soyton) 1.0%, 콘스트프 리쿼(일본 식품화공(주)제품) 0.5%, 황산암모늄 0.2%, 탄산칼슘 0.2%, 소포용 실리콘 오일(신에쓰 화학공옵(주)제품의 Silicon ㅏㅡ70)0.003%를 함유하는 멸균된 액체배지(pH 7.4 110ml씩 들어 있는 3각 플라스크 3개에 접종하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양하여 이것을 종(種)배양액으로 사용하였다.

글리세린 2.0%, 에스산미트(아지노모도(주)제품) 1.5%, 인산 1칼륨 0.1%, 염화코발트 6수화물 0.0005%, 소포용 실리콘 0.03%를 함유하고 인산 2칼륨으로 pH 6.2 로 조정한 액체배지 125ml씩 들어 있는 사까구찌(坂口)플라스크 80개에 상기 종배양액을 2.5ml씩 접종하고, 28℃에서 4일간 배양했다. 배양액을 여과시켜 여과액을 규체로부터 분리하고, 여과액을 pH5로 하여 같은 양의 아세트산 에틸로 추출했다. 에틸아세테이트 추출액을 감압 농축하여 2.0g의 갈색유상(由狀)물질을 얻었다. 이 물질을 10g의 실리카겔과 혼합하여 감압상태에서 건조시키고, 이 건조된 물질은 n-헥산으로 충전한 60ml의 실리카겔 컬럼 상부에 충진시켜 크로마토그래피를 행했다. 그후, n-헥산과 아세트산 에틸의 혼합용액(8 : 2, V/V)300ml로 세정하고, 이어서 n-헥산과 아세트산 에틸의 혼합용액(1 : 1, V/V)으로 용출시켰다. 용출액을 감압 농축하여 MI43-37F11 물질을 포함하는 0.2g의 갈색유상물질을 얻었다.

이 갈색 유상물질을 2g의 실리카겔과 혼합하여 감압하에서 건조시키고, 이 건조된 물질을 n-헥산과 아세트산 에틸의 혼합용액(7 : 3, V/V) 100ml로 세정하고, 이어서 n-헥산과 아세트산 에틸의 혼합용액(6 : 4, V/V)100ml로 용출하고, 5ml 씩 분획하였다. 그리고, MI43-37F11 물질을 포함하는 활성획분을 모아 감압 농축해서, 115mg의 황색 유상물질을 얻었다.

이 황색 유상물질을 소량의 아세토니트릴에 용해시켜 고속액체 크로마토그래피의 옥라도대실 라나이드로 코팅된 실리카겔의 역상 컬럼(20mm직경×300mm높이, 일본(주)센슈과학제품, 센슈팩ODS 330IN)에 걸어, 물을 용매로 한 20% 아세토니트릴 내지 50% 아세토니트리까지의 직선농둑배로 4ml/분의 유속으로 용출하여, 4ml씩 분획했다. 이 분회중, MI43-37F11물질을 포함하느 활서을 가진 분획을 감압 농축하여, MI43-37F11 물질을 포함하는 황색 분말상 물질을 50mg얻었다.

이 황색 분말상 물질을 다시 고속 액체 크로마토그래피의 실리카겔컬럼(20mm직경×250mm 높이, 일본(주)야마무라화학연구소 제품, YMC-Pack, A-043SIL)에 걸어, n-헥산과 크로로포름의 혼합용액(1 : 9, V/V)으로 4ml분의 유속으로 용출하고, 4ml씩 분획했다. MI43-37F11 물질을 포함하는 활성을 가진 획분을 모아 감압 농축하여, MI43-37F11물질을 포함하여 담황색 분말상 물질 20mg을 얻었다. 이 분말상 물질을 다시 소량의 클로로포름과 메탄올의 혼합용액(100 : 1, V/V)에 용해하고, n-헥산을 서서히 가한 후 여과, 건조시켜 MI43-37F11 물질을 포함하는 융점 148.5-149.5℃의 결정 10mg을 얻었다. 이 결정은 실리카겔 박충 크로마토그래피(미합중국 머크사 제품, Art. 5715)에 클로로포룸과 메탄올의 혼합용액(15 : 1, V/V)으로 전개하여 단일 스포트를 나타내어, 순수한 항생물질 MI43-37F11을 얻을 수 있었다.

Claims

다음 식[1]

으로 표시되는 화합물인 항암 활성을 나타내는 항생물질 MI43-37F11.
스트렙토비티살롬속에 속하는 MI43-37F11 물질의 생산균주를 동화가능 탄소원 및 동화기능 질소원을 함유하는 배지에 접종하여 배약액 내에 MI43-37F11 물질이 실질적으로 생산되어 축적될 때까지 배양하고, 배양액으로부터 항생물질 MI43-37F11을 채취하여 이루어지는 제1항에 기재된 식[Ⅰ]의 항생물질 MI43-37F11의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 MI43-37F11물질 생산균주는 일본국 기탁기관 미생물공업기술연구소에 기탁 번호 FERM BP-2783으로 수탁된 스트렙토버티실륨 유로시디쿰 MI43-37F11균주인 것을 특징으로 하는 항생물질 MI43-37F11의 제조방법.
활성성분에 대하여 약학적으로 허용할 수 있는 담체와 결합하는 활성성분으로서의 제 1 항에 기재된 식[Ⅰ]의 MI43-37F11물질을 포함하는 항암제 또는 항종양제용 약학적 조성물.
제 1 항에 기재된 식[Ⅰ]의 MI43-37F11을 포함하는 항암 또는 살암제 또는 항종양제.
제 1 항에 기재된 식[Ⅰ]의 MI43-37F11을 포함하는 포유류의 생체내에서 인터루킨-1의 생성을 돕는 약제.
제 1 항에 기재된 식[Ⅰ]의 MI43-37F11을 포함하는 포유류의 생체내에서의 매크로파지의 활성화를 위한 약제.