CN1028542C - 新的抗瘤抗生素物质生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种命名为MI43-37F11物质的新的抗生素，其结构式如下
该MI43-37F11物质具有抗肿瘤活性，增加哺乳动物体内白细胞介素-1产量的活性和激活哺乳动物体内巨噬细胞的活性。MI43-37F11物质可通过培养Streptoverticillium eurocidicumMI43-37F11菌株(CCTCCNo.M90026)而产生。

Description

本发明涉及一种新的抗肿瘤抗生素及发酵生产该新的抗肿瘤抗生素的方法。具体地说，本发明是涉及一种现定名为MI43-37F11物质的新的抗肿瘤抗生素。本发明还涉及发酵生产该种抗肿瘤抗生素，即MI43-37F11物质的方法。本发明进一步涉及以MI43-37F11物质为活性成分，同时含有活性成分的载体的医药组合物。本发明还涉及该新的抗生素-MI43-37F11物质作为抗肿瘤或肿瘤杀伤剂，或作为增加哺乳动物体内白细胞介素-1产生量或激活哺乳动物体内巨噬细胞之药剂的应用。
已经知道有许多经培养不同种微生物所产生的抗生素物质可表现有抗癌或抗肿瘤活性。迄今为止，已广泛使用了某些已知的抗肿瘤抗生素或抗癌抗生素物质作为抗肿瘤或抗癌的化疗药剂，并在临床实践中为治疗肿瘤和癌提供了一种重要的治疗手段。然而，临床上使用的许多已知的抗肿瘤抗生素物质都对人体有明显的毒性，从而在应用上受到很大限制。在这个意义上说，临床上所使用的所有已知抗肿瘤抗生素均不一定是令人完全满意的抗肿瘤或抗癌剂。因此，目前仍急需找到并提供既对人体毒性低，又有高抗肿瘤或抗癌活性，而且可有效而安全地用于治疗人体肿瘤或癌症的新的物质。本发明的一个目的是提供一种用于有上述物质之抗肿瘤剂或抗癌剂的新的抗生素物质。本发明的另一个目的是提供一种现已定名为M I43-37    F11物质的新的抗肿瘤物质，其在临床实践中可用作具有上述预期性质的抗肿瘤或抗癌剂。本发明的再一个目的是提供一种发酵生产该新的抗肿瘤抗生素，即MI43-37    F11物质的方法。本发明的其他目的则将会从下面的描述中了解到。
因此，本发明人经过深入研究，以试图找到并提供一种新的抗肿瘤抗生素物质，最后终于通过培养某些新的微生物菌株而得到了这种定名为MI43-37    F11物质的新的抗肿瘤抗生素，该物质具有下列结构式：
Figure 901039926_IMG3
并已经发现这种MI43-37    F11物质表现有很高的抗肿瘤活性，但对哺乳动物没有任何明显的毒性，从而我们成功地完成了本发明。
本发明的第一个方面是提供一种新的、具有抗肿瘤活性的抗生素，即MI43-37    F11物质，其为具有下列结构式[Ⅰ]的化合物：
Figure 901039926_IMG4
本发明的新的抗生素，MI43-37    F11物质的显著特征在于对艾氏腹水癌有高度活性。
本发明的新抗生素，MI43-37    F11物质的生理化学和生物学性质如下：
（A）抗生素MI43-37    F11物质的生理化学性质
（1）外观：无色针状晶体。
（2）分子量（用FD质谱法测定），m/z：222。
（3）元素分析：测定值：C，59.40%;H，4.54%，
O，35.79%。
（4）实验式：C11H10O5。
（5）比旋光度：[α]D0°（C0.2，乙腈）。
（6）熔点：148.5～149.5℃。
（7）紫外吸收光谱（如附图1所示）：
甲醇
λmax：238nm（4.63），244nm（4.65），
256nm（sh，4.05），274nm（sh，3.82），
286nm（sh，3.67），330nm（3.78），
（括号内给出的数据具有相应的logε值）。
（8）红外吸收光谱（如附图2中所示）：
特征峰在3480，1680，1630，1570，1510，1230，1190，1170，1100，1090，980，860，840，710，690（cm-1）处。
（9）溶解度：易溶于乙腈，可溶于甲醇和氯仿，但难溶于水和己烷。
（10）质子核磁共振吸收光谱：H-NMR是在氘-乙腈中测得的，结果如附图3中所示（横座标：ppm）。用四甲基硅烷作为内标物。
此外，下列表1中显示了在氘-乙腈中测得的MI43-37 F11物质的13C-NMR数值。
表1
168.0s    167.0s    164.4s
157.9s    140.4s    104.2d
102.6d    101.5d    101.0s
61.1t    56.7q
表1中：s：单峰;d：双峰    t：三峰;q：四重峰
其中使用四甲基硅烷作为内标物。
图1是本发明MI43-37    F11物质的紫外（UV）吸收光谱。
图2是本发明MI43-37    F11物质的红外（IR）吸收光谱。
图3是本发明MI43-37 F11物质的1H-NMR吸收光谱。
基于MI43-37 F11物质的上述各种生理化学特性，按下述方法确定MI43-37 F11物质的化学结构。该物质在FD质谱检测中，于222（m/z）处显示一分子离子峰。对该物质的元素分析，结果支持C11H10O5这一实验式。图1所示的紫外线吸收光谱和图2所示的红外吸收光谱揭示，MI43-37 F11具有一个异香豆素骨架。图 3所示的1H-NMR谱提示存在基团
Figure 901039926_IMG5
和基团
Figure 901039926_IMG6
，以及三个芳环氢原子的信号并存在一个形成氢键的羟基基团。如表1所示，13C-NMR光谱显示出11个信号。取代基CH2OH、OCH3和OH在异香豆素核心上的位置是通过与异核重键连接性谱的比较而确定的[A.Bax et al.，J.Am.Soc.，108，8056-8063，（1986）]。
通过检查MI43-37    F11物质的上述不同的光谱，已确定其具有如上所示之式[Ⅰ]的结构。也进一步证实抗生素MI43-37    F11物质是一种与上述式[Ⅰ]结构相符的、未曾报导过的新的抗生素。
本发明的抗生素MI43-37    F11物质是在已知的异香豆素中首次发现有抗肿瘤活性的化合物。另外，由于对哺乳动物毒性低，故可望将抗生素MI43-37    F11物质用作治疗肿瘤病人的抗肿瘤抗生素。
应提到的是，我们已注意到日本专利公开号71076/78（1978年6月24日公开）中公开了结构式为
Figure 901039926_IMG7
的3-羟甲基-6，7-二甲氧基-8-羟基异香豆素和3-羟甲基-6，8-二 羟基-7-甲氧基异香豆素，其对环腺苷酸（CAMP）磷酸二酯酶具有抑制活性。所说的日本专利公开中述及该异香豆素衍生物可望有抗肿瘤活性、降血压活性、抗炎活性及抗变态反应活性等，但其中没有给出关于所说的异香豆素衍生物真正有抗肿瘤活性的任何实验资料和数据。
（B）抗生素MI43-37    F11物质的生物学性质
（1）MI43-37    F11物质抑制各种实验肿瘤细胞和人体癌细胞增殖的抗肿瘤活性。
在含有10%小牛血清的培养基中以1×105细胞/ml的浓度制备含小鼠白血病L1210、小鼠白血病p388、小鼠白血病EL4、小鼠IMC癌细胞或人肺癌LX-1细胞的细胞悬液，并取200μl该细胞悬液加到微量滴定板中，然后加入不同浓度的MI43-37 F11物质的溶液（溶于水与二甲亚砜（95∶5）的混合物中）。然后将加有试验化合物的细胞悬液于37℃保温2天（但LX-1细胞保温5天）。
培养后借助Coulter计数器计数处理组中L1210细胞、p388细胞、EL4细胞和IMC癌细胞的数目。按上述同样方法保温未加试验化合物的对照组（未处理的）细胞悬液并同样计数细胞数目。然后估算被处理组对对照组（未处理组）的细胞增殖抑制率（%）。
但对于人肺癌LX-1细胞，则在已保温的LX-1细胞悬液内加入10μl含5mg/mlMTT[即3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴]，然后再于37℃保温4小时。保温后，由保温的细胞 悬液中除去上清液（100μl），并在所得含LX-1细胞的残留悬液内加入150μl异丙醇和1N    HCl（25∶1）的混合物。估测所得混合物在540nm处吸光率。根据估测的540nm处的吸光率值，估算处理组对对照组（未处理的）的LX-1细胞增殖抑制率（%）。
根据按上述方法估算的抑制率（%）来估计本发明MI43-37    F11物质的IC50值（μg/ml），即使试验的各种癌细胞的增殖达到50%抑制时的MI43-37    F11物质的浓度。试验结果如下列表2中所示。
表2
试验的细胞    IC50值（μg/ml）
小鼠白血病L1210    50
小鼠白血病p388    50
小鼠白血病EL4    52
小鼠IMC癌    72
人肺癌LX-1    100
（2）用下述方法检测抗生素MI43-37    F11物质对艾氏腹水癌的抗肿瘤作用：
（a）经腹膜内注射抗生素MI43-37 F11物质，对带有艾氏腹水癌的小鼠进行治疗试验。首先在ICR小鼠（每组4只6龄雌性小鼠）的腹部皮下接种艾氏腹水癌细胞的悬液，这样每只小鼠皮下移植癌细胞的数目为2×106个细胞。移植癌细胞后，按下述给药程 序经腹膜内注射对证明有癌细胞生长的小鼠给予抗生素MI43-37    F11物质。即在移植癌细胞后第7天一次给予剂量为10mg/kg或2.5mg/kg或0.625mg/kg的MI43-37    F11物质，或者是在移植癌细胞后以2.5mg/kg或1.25mg/kg或0.625mg/kg的剂量给予MI43-37    F11物质，共给5次，但从第7天到第14天每隔一天给药一次。对照组小鼠（未处理的）（每组8只）则不给予MI43-37    F11物质，而代之以腹膜内注射生理盐水。
移植癌细胞后的第15天，切除肿瘤组织并称重。根据肿瘤增殖抑制率（%）（假定对照组小鼠肿瘤重量为100），估计用MI43-37    F11物质治疗组小鼠的肿瘤重量的降低率。换句话说，即根据下列公式估算对艾氏癌细胞生长的抑制率（%）：
抑制率＝ (（C-T）)/(C) ×100
其中C代表对照组（未处理的）小鼠肿瘤的重量，T代表治疗组小鼠肿瘤的重量。
试验结果如下列表3所示。
表3
抑制率（%）
MI43-37    F11物质    给药程序
的剂量（mg/kg/天）    第7天    第7至14天
（只1次）    （每两天1次，共5次）
10    59    -
2.5    51    60
1.25    -    67
0.625    12    30
（b）经口服给予MI43-37 F11物质，对带有艾氏癌的小鼠进行另一组治疗试验。在ICR小鼠（各治疗组5只6周龄雌性小鼠）的腹部皮下接种艾氏腹水癌细胞的细胞悬液，每只小鼠约移植2×106个癌细胞。以每天一次，每公斤体重6.3mg、12.5mg、25mg、50mg或100mg的剂量口服给予MI43-37 F11物质，从移植癌细胞后的第1天至第9天连续服用9天。第14天时手术切除瘤组织并称重。将治疗组各小鼠肿瘤的重量与对照组（未处理的）各小鼠肿瘤的重量相比较，按上述公式计算抑制率（%）。
试验结果如下列表4中所示。
表4
MI43-37    F11物质    肿瘤重量    抑制率（%）
的剂量（mg/kg/天）    （mg±S.D）
0    1，084±256    -
6.3    586±282＊    45
12.5    391±266＊＊    63
25.0    280±152＊＊＊    74
50.0    485±123＊＊    55
100.0    566±421＊＊    47
＊＊＊p＜0.001，＊＊p＜0.01，＊p＜0.05
（3）按下述方法进行测定MI43-37 F11物质激活腹膜巨噬细胞活性的试验。即在收获腹膜巨噬细胞前一天，对CDF1小鼠（每组3只8周龄雌性小鼠）以每公斤体重50mg、12.5mg或3.125mg的剂量经腹膜内给予抗生素MI43-37 F11物质。给药后1天由被治疗小鼠的腹膜腔内收获巨噬细胞，并以1×106细胞/ml的细胞浓度加于含培养基的塑料平皿（Falcone，No.3002，60×15cm，Decton Dikinson & Company生产）内，然后保温。向经过保温的含巨噬细胞的培养基内加入100ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbolmyristate acetate），以诱导巨噬细胞产生O- 2。根据与细胞色素C的还原反应测定O- 2的量。在收获腹膜巨噬细胞之前，对照组小 鼠只在腹腔内注射生理盐水。假定由对照组小鼠腹膜内收获的巨噬细胞产生并释放的O- 2量为100，依此估算由被处理组小鼠腹膜巨噬细胞产生的O- 2量的增加率。换句话说，即按下列公式计算被处理组小鼠腹膜巨噬细胞产生的O- 2量的增加率：
O- 2产生的增加率＝ (（C-T）)/(C) ×100
其中T代表被处理组小鼠腹膜巨噬细胞产生的O- 2量，C代表对照组（未处理的）小鼠腹膜巨噬细胞产生的O- 2量。
所得试验结果如下列表5所示。
表5
MI43-37    F11物质
的剂量（mg/kg） O- 2产生的增加率（%）
50    255
12.5    127
3.125    105
（4）按下述方法估测抗生素MI43-37    F11物质对腹膜巨噬细胞之吞噬作用的影响。在收获腹膜巨噬细胞前3天和1天时，对C DF1小鼠（每组3只8周龄雌性小鼠）以每公斤体重50mg、5mg或0.5mg的剂量腹膜内注射MI43-37 F11物质。给药后1天，由被处理组小鼠的腹膜内收获腹膜巨噬细胞，然后以5×105细胞/ml的细胞密度接种到含培养基的塑料平皿（Falcone），并进行保温。向经过保温的含巨噬细胞的培养基内加入7.5×106个细胞/ml加热处理酵母细胞，继续保温一定时间。然后加入乙醇固定巨噬细胞并用吉姆萨（Giemsa）染色法染色。计算被400个巨噬细胞吞噬的酵母细胞数。收获腹膜巨噬细胞之前，对照组小鼠（未处理的）只腹膜内注射生理盐水，以代替给予MI43-37 F11物质。假定被从对照组小鼠腹膜内收获的400个巨噬细胞吞噬的酵母细胞数为100，依此估算由被处理组小鼠腹膜内收获之巨噬细胞的吞噬作用增加率。换句话说，即按下列公式计算被处理组小鼠腹膜巨噬细胞吞噬作用的增加率（%）：
吞噬作用的增加率＝ (（T-C）)/(C) ×100
其中T代表被由经处理的小鼠体内收获之400个巨噬细胞吞噬的酵母细胞数，C代表被由对照组小鼠（未处理的）体内收获之400个巨噬细胞吞噬的酵母细胞数。
试验结果如下列表6所示。
表6
MI43-37    F11物质    腹膜巨噬细胞
的剂量（mg/kg）    吞噬作用的增加率（%）
50    144
5    80
0.5    102
（5）按下述方法进行检测抗生素MI43-37 F11物质提高体内白细胞介素-1产生活性的试验。为此，以每公斤体重25mg的剂量给CDF1小鼠（6周龄雌性小鼠）口服MI43-37 F11物质。给药后1天、3天、5天和7天分别由被处理组小鼠体内收获腹膜脱落细胞（PEC）和脾细胞。将收获的腹膜脱落细胞和脾细胞各自分为两类，即具有在塑料平皿内壁上自然粘附性质的粘附细胞和没有这种性质的非粘附细胞。将整个腹膜脱落细胞，PEC中的粘附细胞和脾细胞中的粘附细胞分别悬浮在等分的培养基内，使悬液中的细胞浓度分别为1×106细胞/孔、2×106细胞/孔和2.5×106细胞/孔。保温24小时后，过滤保温后的培养基收集上清，然后按Jonathan K.等人["Lymphokine Research"3（4），175-182，（1984）]的方法检测其中的白细胞介素-1活性。即，将各100μl上述上清液和伴刀豆球蛋白A（Con A）（终浓度为2.5mg/ml）加到100μl含D10，G4.1细胞的细胞悬液（1×105细胞/ml）中，当加入ConA和白细胞介素-1时，细胞将在其存在下增殖。将 所得混合物保温48小时，然后加入3H-胸苷（3H-Td R），继续保温16小时。保温后根据放射活性单位c.p.m.检测D10，G4.1细胞的3H-Td R摄入率。同时按同样方法检测对照组（未处理的）小鼠的3H-Td R摄入率。
试验结果如下列表7所示。
表7
口服MI433H-Td R的摄入（c.p.m.）
-37    F11物    总腹膜脱落细胞    粘附细胞
质后天数    （PEC）    PEC    脾细胞
（25mg/kg）    c.p.m.±SD    c.p.m.±SD    c.p.m.±SD
T/C%    T/C%    T/C%
对照    7166±752    10561±1241    2091±481
100    100    100
1天    4393±397＊＊    17510±810＊＊    1741±352
61.3    165.8    83.3
3天    5988±602    13912±1367＊＊    4868±997＊＊
83.6    131.7    232.8
5天    28072±1174＊＊＊    26759±3601＊＊＊    2140±121
391.7    253.4    102.3
7天    3906±465＊＊    17639±2699＊    2385±134
54.5    167.0    114.1
本发明的第二个方面是提供一种生产有上述结构式[Ⅰ]的抗肿瘤抗生素，MI43-37    F11物质的方法，该方法包括在含有可同化碳源和可同化氮源的培养基中培养Streptoverticillium属的MI43-37    F11物质生产菌株，直到在培养物中产生并积聚相当量的MI43-37    F11物质，然后由所得培养物中回收有上述式[Ⅰ]的MI43-37    F11物质。
可用于本发明方法中的MI43-37    F11物质生产菌的一个典型例子是定名为MI43-37    F11菌株，这个新菌株属于Streptoverticillium菌属，是由发明人在midori-ku，Yokohama    City，Kanagawa    Prefecture，Japan收集的土壤样品中分离出来的。该MI43-37    F11菌株具有下述微生物学性质。
1.形态学观察
显微镜观察显示，MI43-37    F11菌株具有分支的基底菌丝体，随着轮生体形成而由其中长出气生菌丝。观察到在气生菌丝的末端形成了有10个以上孢子的链。未观察到螺旋形成。孢子的大小约为0.7～0.8×1.1～1.3微米，且具有平滑的表面。
2.在各种培养基上的生长特性
各括号[]内给出的颜色是按照Container    Corporation    of    America的"Color    Harmony    Manual"中所述标准描述的。
（1）蔗糖-硝酸盐-琼脂培养基（于27℃下培养）
在无色生长的基础上形成微细的气生菌丝。没有观察到可溶性色素。
（2）莆糖糖-天冬酰氨-琼脂培养基（于27℃下培养）
在无色生长的基础上形成细微的黄白色[11/2db，Parchment]气生菌丝，后变为淡黄色[2ea，Lt    Wheat]至淡黄褐色[2gc，Bamboo]。同时也部分形成棉样气生菌丝。未见有可溶性色素。
（3）甘油-天冬酰氨-琼脂培养基（ISP-培养基5，于27℃下培养）
在无色生长的基础上形成气生菌丝，变为淡黄褐色[2ie，Lt    Mustard    Tan]。见有褐色可溶性色素。
（4）淀粉-无机盐-琼脂培养基（ISP-培养基4，于27℃下培养）
基于无色生长形成黄白色[1    1/2ca，Cream]至鲜橄榄灰色[1    1/2ge，Lt    Olive    Gray]气生菌丝，进而变为淡黄褐色[2    le，Mustard-2ne，Mustard    Gold]。未见有可溶性色素。
（5）酪氨酸-琼脂培养基（ISP-培养基7，于27℃下培养）
在淡黄褐色[2ie，Lt    Mustard    Tan]生长基础上形成白至棕白色[3ba，Pearl～2cb，Ivory    Tint]气生菌丝，进而成为亮灰褐色[2lg，Mustard    Tan]。未见有可溶性色素。
（6）营养琼脂培养基（于27℃下培养）
基于无色生长形成白色气生菌丝，后变为淡黄褐色[2ie，Lt    Mustard    Tan]。略微产生黑色可溶性色素。
（7）酵母-麦芽琼脂培养基（ISP-培养基2，于27℃下培 养）
基于无色具皱生长，形成白色至黄白色[3ba，pearl]气生菌丝，后变为淡黄褐色[2ie，Honey    Gold～3ie，Lt    Amber]。未见有可溶性色素。
（8）燕麦粉琼脂培养基（ISP-培养基3，于27℃下培养）
基于无色生长形成微细的白色至黄白色气生菌丝，后成为淡黄色[2ea，Lt    Wheat～2ca，Lt    Ivory]。未见有可溶性色素。
（9）甘油-硝酸盐-琼脂培养基（于27℃下培养）
基于无色生长，形成微细的白至黄白色[1    1/2    db，Parchment]气生菌丝，进而变成淡黄色[2ca，Lt    Ivory]。未见有可溶性色素。
（10）淀粉琼脂培养基（于27℃下培养）
基于无色生长，形成微细的白至黄白色[2    ca，Lt    Ivory]气生菌丝，进而变成淡黄色[2    ea，Lt    Wheat]至淡黄色[1    1/2    ic，Lt    Antique    Gold]。未见有可溶性色素。
（11）苹果酸钙-琼脂培养基（于27℃下培养）
基于无色且很差的生长，形成少许白色气生菌丝。未见有可溶性色素。
（12）纤维素（含有滤纸碎片的合成的试验溶液，于27℃下培养）
生长是无色的，且没有形成气生菌丝。未见有可溶性色素。
（13）明胶培养基（stab）
在15%单纯明胶培养基中（于20℃下培养），生长是无色的，但没有形成气生菌丝，且见有淡黄褐色可溶性色素。在葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基中（于27℃下培养），生长是无色的，但没有形成气生菌丝，且见有微褐色可溶性色素。
（14）脱脂乳（于37℃下培养）
生长是无色至淡褐色的，且没有形成气生菌丝。见有微黄至褐色可溶性色素。
3.生理学性质
（1）生长的温度范围
在使用淀粉-无机盐-琼脂培养基（ISP-培养基4，BACTO-INORGANIC-SALTS    STARCH    AGAR）进行的试验中，于20℃、24℃、27℃、30℃、37℃和50℃等不同温度下培养MI43-37    F11菌株，结果该菌株在除50℃外的各温度下均生长良好。良好生长的最适温度似乎在27℃左右。
（2）明胶液化作用（在15%单纯明胶培养基中，20℃下培养;在葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基中，27℃下培养）
在15%单纯明胶培养基和葡萄糖-蛋白胨-明胶培养基中均于保温后约第3天开始液化。液化作用的程度为中等至相当强。
（3）淀粉水解作用（淀粉-无机盐-琼脂培养基和淀粉-琼脂培养基，均在27℃下培养）
在淀粉-无机盐-琼脂培养基和淀粉-琼脂培养基中均于保温后约第3天开始水解，水解作用的程度相当强。
（4）脱脂乳凝固和胨化作用（脱脂乳，于37℃下培养）
于保温后约第2天出现凝结，并在保温的第3天完全凝结，然后直接开始胨化。该胨化过程缓慢，以至在保温3周后仍未完成。
（5）类黑素色素的形成（胰蛋白胨-酵母培养液，ISP-培养基1;蛋白胨-酵母-铁琼脂培养基，ISP-培养基6;酪氨酸-琼脂培养基，ISP-培养基7;均在27℃下培养）
在蛋白胨-酵母-铁琼脂培养基中类黑素生成为阳性，在胰蛋白胨-酵母培养液中为显见的阳性，但在酪氨酸-琼脂培养基中为阴性。
（6）各种碳源的利用（Pridham-Gottlieb琼脂培养基，ISP-培养基9;于27℃下培养）
生长中可利用葡萄糖、果糖和肌醇。但不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、D-甘露糖醇和乳糖。
（7）苹果酸钙的液化作用（苹果酸钙-琼脂培养基，于27℃下培养）
在苹果酸钙琼脂中对苹果酸钙的液化作用为阴性。
（8）对硝酸盐的还原作用（含有0.1%硝酸钾的蛋白胨水溶液，ISP-培养基8;于27℃下培养）
该还原作用呈相当微弱的阳性。
（9）纤维素分解作用（含滤纸碎片的合成的试验溶液，于27℃下培养）
对纤维素分解作用为阴性。
综合上述微生物学性质，可知MI43-37    F11菌株的形态学特征在于，气生菌丝有回轮，但未见有螺旋形成。孢子表面平滑。在 各种培养基中，基于无色至淡黄褐色生长，形成白色至褐白色或黄白色气生菌丝，或有时形成鲜橄榄灰色气生菌丝。不产生可溶性色素，或有时可观察到褐色可溶性色素。在酪氨酸-琼脂培养基中类黑素色素生成为阴性，但在胰蛋白胨-酵母培养液及蛋白胨-酵母-铁琼脂培养基中为阳性。蛋白质分解活性的程度为中度至相当强，淀粉水解活性的程度也相当强。存在于细胞壁中的，2，6-二氨基庚二酸是LL型的。
从上述的微生物学性质看，我们判断MI43-37    F11菌株属于Streptoberticillium属。
我们参照MI43-37    F11菌株的性质，检索了类似的已知菌种，认为似乎Streptoverticillium    eurocidicum[Internation    al    Journal    of    Systematic    Bacteriology，Vol.22，p.293（1972）;ditto，Vol.30，p408（1980）;The    Journal    of    Antibiotics，Ser.A，Vol.7，p98（1954）]和Streptoverticillium    albireticuli（International    Journal    of    Systematic    Bacteriology，Vol.18，p80（1968）;ditto，Vol.30，p407（1980）]似乎与MI43-37    F11菌株很相似。
然后，我们将MI43-37    F11菌株的性质与上列文献中描述的Streptoverticillium    eurocidicum和S.albireticuli的性质作了比较研究。研究的结果总结于下列表8中。
Figure 901039926_IMG8
Figure 901039926_IMG9
Figure 901039926_IMG10
由上面表8可以看出，MI43-37    F11菌株与Streptoverticillium    eurocidicum和Streptoverticillium    albireticuli十分相似。然而，从MI43-37    F11菌株的气生菌丝呈亮橄榄灰色、在ISP培养基7中类黑素色素的生成可能为“阴性”、可能能利用D-果糖等性质看，可以为该菌株更相似于Streptoverticillium    eurocidicum。因此，现已将MI43-37    F11菌株鉴定为Streptoverticillium    eurocidicum    MI43-37    F11。
菌株MI43-37    F11已于1990年7月10保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC    No.M90026。
在根据本发明的第二个方面，完成生产抗肿瘤抗生素MI43-37    F11物质的方法中，可按照培养放线菌属（Actinomyces）微生物的已知和常规方法培养属于Streptoverticillium菌属的MI43-37    F11物质生产菌株。为此，可将一定量的MI43-37    F11物质生产菌株接种到含有可同化之碳源和氮源的适当培养基中，然后在通气条件下，且最好在深层通气条件下培养，从而在培养液中产生并积聚MI43-37    F11物质。
用于培养的培养基可含有通常用于培养放线菌的碳源、氮源和无机盐等。氮源包括商业上可得到的已知物质，如胨、肉汁、玉米糖浆、棉籽饼、花生粉、大豆粉、酵母膏、NZ胺、酪蛋白水解 物、硝酸钠、硝酸铵及硫酸铵。碳源包括各种可利用的已知物质，如甘油、淀粉、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和废糖蜜等碳水化合物，以及脂肪和油。无机盐可包括氯化钠、磷酸盐、碳酸钙、硫酸镁等。
可用于商业生产MI43-37    F11物质的生产培养基可以含有少量的一种或多种无机盐，还可含有作为消泡剂的动物油、植物油或矿物油。此外，在培养基中还可含有其它一些有利于微生物增殖和MI43-37    F11物质产生的已知的有机物质作为添加剂。
可在深层、通气条件下培养用于MI43-37    F11物质之商业化生产目的的MI43-37    F11菌株，培养温度可在利于MI43-37    F11物质生产菌的生长并大量产生MI43-37    F11物质的温度范围内，一般为27℃至37℃。可根据MI43-37    F11物质生产菌的微生物学和生理学性质选择其它培养条件。
可以按下述方法由MI43-37    F11物质生产菌的培养物中回收MI43-37    F11物质。抗生素MI43-37    F11物质主要积聚在培养液的液相中、因此可首先过滤得到的培养液，将滤液调到微酸性pH，并用不与水混溶的有机溶剂如乙酸乙酯提取之。除使用上述提取方法外，也可使用其它分离亲油物质的常规方法分离和纯化MI43-37    F11物质，如吸附层析、凝胶过滤层析、高效液相层析及这些层析法的联合使用。
本发明还包括MI43-37    F11物质在医药组合物中的应用。
基于上述MI43-37    F11物质的有用生物学性质，本发明的第三个方面涉及以有上述结构式[Ⅰ]的抗生素MI43-37    F11物质 为活性成分，同时含有一种或几种药物上可接受之载体的医药组合物。本发明的医药组合物可用作哺乳动物包括人的制癌或抗肿瘤剂。
可按常规方法将本发明的医药组合物配制成适于口服、腹膜内给药或胃肠道外给药的各种常用制剂、如注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆、栓剂和软膏。使用的医药上可接受的载体可以是任何已知的常规载体。所用载体的性质和组成可根据给药途径和方式而定，其可以是有机和无机物质，可以是固体和液体，通常为已知的、医药上可利用的惰性载体和赋形剂。这类载体的一些具体实例包括微晶纤维素、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物和动物脂和油，树胶及聚亚烷基二醇等。本发明的医药组合物中活性制癌或抗肿瘤成分，MI43-37    F11物质的浓度可占组合物总重量的0.2至100%，最好为1至90%。除MI43-37    F11物质外，本发明的医药组合物还可含有一种或多种其它药理学活性成分，包括具有制癌、抗肿瘤及其他药理学活性的成分。
本发明医药组合物的给药剂量应为即能产生预期的药理学活性，又不会伴有任何可能的付作用。在特定情况下使用的特定剂量是由医学专家择定的，但一般说来，在治疗成年病人的癌症和恶性肿瘤时活性成分MI43-37    F11物质的剂量范围为每天10mg～10g，最好是20mg～5g。为此，可将本发明的医药组合物作为含有1mg～5g。且最好含有3mg～1g活性成分，MI43-37    F11物质的单位制剂给药。
因此，根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种治疗哺乳 动物，包括人的癌症或恶性肿瘤的方法，该方法包括对患有癌症或肿瘤的哺乳动物给予治疗有效量的、通常为医药组合物形成的、有上述结构式[Ⅰ]的MI43-37    F11物质。
如上所述，MI43-37    F11物质的剂量可由临床专家根据病人的年龄、体重、症状及预期的治疗目的而定。对上述有效剂量可作连续或间断给药，只要总剂量不超过这样一个根据动物试验结果及各种环境条件所确定的特定水平即可。
另外，本发明的其它方面包括上文限定的式[Ⅰ]抗生素，即MI43-37    F11物质作为抗癌剂或灭癌剂或抗肿瘤剂的应用，或在制造这些制剂中的应用。本发明还包括MI43-37    F11物质作为提高哺乳动物（包括人）体内白细胞介素-1产生之药剂的药学应用，以及在制造这些药剂中的应用。这些药剂可以是医药组合物形式的，其中包括了作为活性成分的MI43-37    F11物质，以及该活性成分的医药上可接受的载体。
如前所述，本发明的MI43-37 F11物质可有效地使腹膜巨噬细胞增加O- 2的产生，并有效地提高巨噬细胞的吞噬作用及体内白细胞介素-1的产生，从而本发明的MI43-37 F11物质能最终提高哺乳动物体内巨噬细胞的活力。因此，本发明的再一个方面包括MI43-37 F11物质作为哺乳动物体内巨噬细胞激活剂的应用。
现结合下列实施例进一步阐述本发明，这些实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例1
由其琼脂斜面培养物中取一菌环量的Streptoverticillium eurocidicum    MI43-37    F11菌株（CCTCC    No.M90026），接种到3个各含110ml灭菌之培养基的锥形瓶内，所说的培养基含有2.0%半乳糖、2.0%糊精、1.0%大豆蛋白胨（“Bacto    Soyton”，Difco    Co.Ltd.生产）、0.5%玉米浆（Nihon    Shokuhin    Kako    Co.Ltd.生产）、0.2%硫酸铵、0.2%碳酸钙及0.003%消泡剂，硅油（“Silicon    KM70”，Shinetsu    Chemicals    Co.Ltd.生产），并将pH调到7.0。然后已接种的培养基搅拌下30℃保温2天，从而制得种子培养物。
将如此制得的种子培养物以2.5ml等份接种到各含有125ml培养基的80    Sakaguchi培养瓶内，所说的培养基含有2.0%甘油、1.5%“Esusan    Meat”（Ajinomoto    Co.Ltd.生产的大豆粉的商品名）、0.1%磷酸氢钾、0.0005%氯化钴6水合物和0.003%消泡剂（硅油），用磷酸氢二钾将pH调到6.2。然后将MI43-37    F11菌株于28℃下培养4天。过滤除去所得培养物中的菌丝体，并用等体积乙酸乙酯提取回收的滤液（调到pH5）。于减压下浓缩所得的提取物，得到含MI43-37    F11物质的褐色油状物（2.0g）。
将该MI43-37    F11物质的粗提物与10g硅胶混合，然后减压干燥。将干燥的混合物加到60ml硅胶柱的顶部，进行硅胶柱层析。该硅胶柱是预先借助正己烷装入硅胶的。首先用正己烷和乙酸乙酯（8∶2，v/v）的混合物（300ml）洗其顶部加有所说之混合物的硅胶柱，然后用含正己烷和乙酸乙酯（1∶1，v/v）的混合溶剂洗脱。减压下浓缩所得洗脱物，得到含MI43-37    F11物质的褐色油状物 （0.2g）。
该油状物与2g硅胶混合，然后于减压下干燥。将经过干燥的混合物加到预先借助正己烷装填了20ml硅胶的柱顶部，然后进行柱层析。层析后，先用100ml正己烷-乙酸乙酯（7∶3，v/v）混合物洗顶部加有所说的预干燥之混合物的硅胶柱，然后用100ml正己烷-乙酸乙酯（6∶4，v/v）混合物洗脱。以每管5ml收集洗脱物。合并含MI43-37    F11物质的活性部分并于减压下浓缩，得到115mg黄色的油状物。
将该黄色油状物溶解在小体积乙腈中，并在含Octadodecyl    Silanide之硅胶（商品名"Senschu    Pack"ODS    3301    N    Senshu    Kagaku    Co.Japan生产）的反相柱（20mm×300mm）上对所得溶液进行高效液相层析。用20%至50%乙腈水溶液线性梯度，以4ml/分钟的流速洗脱，并以每管4ml收集洗脱物。合并含MI43-37    F11物质的各活性部分并于真空下浓缩，得到50mg含MI43-37    F11物质的黄色粉末。
在"YMC-Pack，A-043SIL"（Yamamura    Kagaku    Kenkyjo    Co.，Japan生产）柱（20mm×250mm）上，对该黄色粉末物质再次进行高校液相层析，用正己烷-氯仿（1∶9，v/v）的混合溶剂作洗脱液以4ml/分钟的流速洗脱，并以每管4ml收集洗脱物。合并含MI43-37    F11物质的活性部分并真空浓缩，得到20mg含MI43-37    F11物质的淡黄色粉末状物质。将该粉末状物质溶解在小体积氯仿-甲醇（100∶1，v/v）的混合物中，并向所得溶液内缓慢加入正己烷，从而沉积出结晶物质。过滤收集该结晶产物，干燥后 得到10mg熔点为148.5-149.5℃的MI43-37    F11的结晶产物。
该结晶产物在硅胶板（商品名"Art.5715"，为Merck    Co.U.S.A.的产品）进行硅胶薄层层析，用氯仿-甲醇（15∶1，v/v）展开后出现一个单一点，此表明MI43-37    F11物质是以纯化形式得到的。

Claims (1)

1、一种生产具有下列结构式(Ⅰ)的抗生素物质的方法，
该方法包括在含有可同化碳源和可同化氮源的培养基中培养保藏号为CCTCC No.M90026的Streptoverticillium eurocidicumMI43-37F11菌株直到在培养基中产生并积聚相当量的抗生素物质，然后由培养物回收抗生素物质。
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