DE69020645T2 - Antitumor- und Antibiotikum-Substanz, ihre Herstellung und Verwendungen. - Google Patents
Antitumor- und Antibiotikum-Substanz, ihre Herstellung und Verwendungen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine neue antibiotische Antikrebsverbindung oder -substanz und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieser neuen antibiotischen Antikrebssubstanz.
- Insbesondere betrifft die Erfindung eine neue antibiotische Antikrebssubstanz, die nunmehr mit MI43-37F11 bezeichnet wird. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieser neuen antibiotischen Antikrebs-MI43-37F11- Substanz. Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die MI43-37F11-Substanz als aktiven Bestandteil enthält, und zwar in Kombination mit einem Träger für den aktiven Bestandteil.
- Die Erfindung betrifft auch die pharmazeutische Verwendung der neuen Verbindung oder der neuen Substanz als ein antibiotisches oder Antikrebs- oder krebsbekämpfendes Mittel, oder als ein Mittel zum Steigern der Interleukin-1-Produktion in vivo, oder als ein Mittel zum Aktivieren von Makrophagen in vivo in einem Säugetier, oder als Antitumormittel. Ferner betrifft die Erfindung diese neue Substanz zum Herstellen eines Arzneimittels zum Heilen von Krebs oder zum Behandeln von Tumoren.
- Man weiß, daß zahlreiche der bekannten antibiotischen Substanzen, die durch die Kultivierung von unterschiedlichen Arten an Mikroorganismen erzeugt werden, eine Antikrebs- oder eine Antitumoraktivität zeigen. Gegenwärtig werden einige der bekannten antibiotischen Antikrebs- oder der antibiotischen Antitumorsubstanzen verbreitet als chemotherapeutische Antikrebs- oder Antitumormittel eingesetzt und schaffen beachtenswerte Mittel zur therapeutischen Behandlung von Krebs oder Tumoren in der klinischen Praxis. Zahlreiche der bekannten antibiotischen Antikrebssubstanzen, die in der klinischen Praxis eingesetzt worden sind, können jedoch im Hinblick auf den menschlichen Körper eine beachtliche Toxizität zeigen, so daß der praktische Einsatz dieser Substanzen stark eingeschränkt ist. In diesem Sinne sind alle Antikrebsantibiotika, die in der klinischen Praxis eingesetzt worden sind, nicht notwendigerweise vollständig zufriedenstellende Antikrebs- oder Antitumormittel. Demzufolge bleibt das offene Bedürfnis bestehen, solche neuen Substanzen auf zudecken und bereitzustellen, die gegenüber dem Menschen eine geringe Toxizität aufweisen, jedoch eine hohe Antikrebsoder Antitumoraktivität zeigen, und die effektiv und sicher zur therapeutischen Behandlung von Krebs oder Tumoren bei menschlichen Patienten eingesetzt werden können. Ein Ziel der Erfindung ist es, eine neue antibiotische Verbindung oder Substanz zu schaffen, die auch als Antikrebs- oder Antitumormittel nützlich ist, und die die zuvor erwähnten gewünschten Eigenschaften aufweist. Weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein neues Antikrebsantibiotikum zu schaffen, nunmehr als MI43-37F11-Substanz bezeichnet, das als Antikrebs- oder krebsbekämpfendes Mittel oder als Antitumormittel einsetzbar ist, das die zuvor gewünschten Eigenschaften in der klinischen Praxis aufweist. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der neuen antibiotischen Antikrebs- MI43-37F11-Substanz zu schaffen. Andere Ziele der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
- Daher haben wir, die vorliegenden Erfinder, extensive Nachforschungen durchgeführt, mit dem Ziel, eine neue antibiotische Antikrebssubstanz herauszufinden und bereitzustellen, und wir sind nun dahingehend erfolgreich gewesen, daß ein neues Antikrebsantibiotikum aus der Kultur eines besonderen neuen mikrobiellen Stammes gefunden wurde, nunmehr als MI43-37F11-Substanz bezeichnet, die die folgende Formel [I] aufweist:
- und es wurde herausgefunden, daß diese MI43-37F11-Substanz eine höchst brauchbare Antikrebsaktivität aufweist, die keine beobachtbare Toxizität gegenüber Säugetieren aufweist. Wir haben demzufolge nunmehr diese Erfindung zustandegebracht.
- Als einen ersten Aspekt der Erfindung wurde demzufolge eine neue antibiotische Verbindung oder Substanz geschaffen, die auch eine Antikrebsaktivität zeigt, und die eine Verbindung der folgenden Formel darstellt [I]:
- Die neue antibiotische Verbindung oder antibiotische Substanz entsprechend der Erfindung ist bemerkenswert dadurch gekennzeichnet, daß sie eine hohe Aktivität gegenüber Ehrlich- Karzinomen zeigt.
- Physikochemische und biologische Eigenschaften der antibiotischen Verbindung oder der antibiotischen Substanz entsprechend der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend beschrieben:
- (1) Erscheinungsbild: Farblose Nadeln
- (2) Molekulargewicht (gemessen durch FD-Massenspektrometrie) m/z: 222.
- (3) Elementaranalyse (gefunden: C: 59,40 %, H: 4,54 %, O: 35,79 %).
- (4) Empirische Formel: C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub0;O&sub5;.
- (5) Spezifische optische Drehung: [α]D 0º (c 0,2, Acetonitril).
- (6) Schmelzpunkt 148,5 - 149,5 ºC.
- (7) UV-Absorptionsspektrum (wie in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnungen dargestellt): Methanol max
- (Die in Klammern gegebenen Werte sind die entsprechenden log-ε-Werte).
- (8) IR-Absorptionsspektrum (wie es in Fig. 2 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt ist): Charakteristische Peaks bei 3480, 1680, 1630, 1570, 1510, 1230, 1190, 1170, 1100, 1090, 980, 860, 840, 710, 690 (cm&supmin;¹).
- (9) Löslichkeit: Leicht löslich in Acetonitril, löslich in Methanol und Chloroform, jedoch schwerlöslich in Wasser und Hexan.
- (10) Protonenkernresonanzspektrum: Das ¹H-NMR-Spektrum, gemessen in Deuteroacetonitril, ist in Fig. 3 der beiliegenden Zeichnungen dargestellt (Abszisse: ppm). Tetramethylsilan diente als innerer Standard.
- Das ¹³C-NMR der MI43-37F11-Substanz, gemessen in Deuteroacetonitril, ist außerdem in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
- In Tabelle 1 bedeutet folgendes
- s: Singlett
- d: Doublett
- t: Triplett
- g: Quartett
- Tetramethylsilan diente als innerer Standard.
- In den beiliegenden Zeichnungen ist folgendes dargestellt:
- Fig. 1 ist ein UV-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen MI43-37F11-Substanz,
- Fig. 2 ist ein IR-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen MI43-37F11-Substanz, und
- Fig. 3 ist ein ¹H-NMR-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen MI43-37F11-Substanz.
- Basierend auf den zahlreichen physikochemischen Eigenschaften der MI43-37F11-Substanz, wie sie zuvor beschrieben worden sind, wurde die Bestimmung der chemischen Struktur der MI43-37F11- Substanz wie folgt durchgeführt: Die Substanz zeigt einen Molekül-Ion-Peak bei 222 (m/z) im FD-Massenspektrum. Das Ergebnis der Elementaranalyse stützt eine empirische Formel von C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub0;O&sub5; für diese Substanz. Das UV-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, und das IR-Spektrum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, zeigt, daß die MI43-37F11-Substanz ein Isocumaringerüst aufweist. Das in Fig. 3 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum zeigt die Existenz der Gruppe -CH&sub2;OH und der Gruppe -OCH&sub3;, sowie die Signale von drei aromatischen Wasserstoffatomen und die Existenz von einer Hydroxylgruppe, die eine Wasserstoffbindung bildet. Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigt elf Signale, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind. Die Stellungen der CH&sub2;OH-, OCH&sub3;- und OH-Substitienten am Isocumaringerüst wurden dadurch entschieden, daß diese mit den Spektren der Heteronuklearen Mehrfachbindigkeit (A. Bax et al, Journal of American Society, 108, 8056-8063 (1986)) verglichen wird.
- Durch das Prüfen der zuvor erwähnten verschiedenen Spektren der MI43-37F11-Substanz wurde entschieden, daß die MI43-37F11- Substanz die zuvor dargestellte chemische Struktur der Formel [I] aufweist. Die antibiotische M43-37F11-Substanz wurde auch als ein neues Antibiotikum bestätigt, da bisher noch keine bekannte Substanz beschrieben wurde, die mit der zuvor gezeigten Struktur der Formel [I] übereinstimmt.
- Die erfindungsgemäße antibiotische M43-37F11-Substanz ist eine solche Verbindung, bei der erstmals herausgefunden wurde, daß sie, unter den bekannten Isocumarinen eine Antikrebsaktivität aufweist. Aufgrund ihrer geringen Toxizität gegenüber Säugetieren ist die antibiotische MI43-37F11-Substanz als ein Antikrebsantibiotikum zu erwarten, das zur chemotherapeutischen Behandlung von Krebspatienten hilfreich ist.
- Wir haben übrigens davon Kenntnis erlangt, daß die veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" Nr. 71076/78 (veröffentlicht am 24. Juni 1978) 3-Hydroxymethyl-6,7-dimethoxy-8- hydroxyisocumarin der Formel
- und 3-Hydroxymethyl-6,8-dihydroxy-7-methoxyisocumarin beschreibt, die eine hemmende Wirkung auf zyklische Adenosinmonophosphat(CAMP)phosphodiesterase ausübt. In dieser japanischen Patentanmeldungsveröffentlichung ist erwähnt, daß es bei den darin beschriebenen Isocumarinderivaten erwartet werden kann, daß diese eine Antikrebsaktivität, eine hypotensive Aktivität, eine entzündungshemmende Aktivität und eine antiallergische Aktivität u. dgl. aufweisen können, es sind jedoch überhaupt keine experimentellen Daten gegeben, daß die dort beschriebenen Isocumarinderivate tatsächlich eine Antikrebsaktivität zeigen.
- (1) Antitumoraktivität der MI43-37F11-Substanz bezüglich der Verhinderung der Wucherung von unterschiedlichen Arten an experimentellen Tumorzellen und menschlichen Krebszellen.
- Es wird jeweils eine Zellsuspension hergestellt, die Zellen an Mäuseleukämie L1210, Mäuseleukämie P388, Mäuseleukämie EL4, Mäuse-IMC-Karz inom oder menschliche Lungenkrebs-LX-1- Zellen in einem Kulturmedium enthalten, das 10 % Kalbsserum mit einer Dichte von 1x10&sup5;-Zellen/ml enthält; 200 ul-Portionen der so hergestellten Zellsuspension werden auf eine Mikroplatte gebracht und anschließend wird eine Lösung der MI43-37F11-Substanz mit unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt (gelöst in einer 95:5-Mischung von Wasser und Dimethylsulfoxid). Die Zellsuspension, die die hinzugefügte Testverbindung enthält, wird anschließend für zwei Tage bei 37 ºC inkubiert (jedoch fünf Tage bei den LX-1- Zellen).
- Nach der Inkubation wird mittels eines Coulter-Zählers die Anzahl der L1210-Zellen, P388-Zellen, der EL4-Zellen und der IMC-Karzinomzellen in den behandelten Gruppen gezählt. Die Vergleichsgruppe (unbehandelt) der Zellsuspension, zu der die Testverbindung nicht hinzugefügt wurde, wurde auf die gleiche Art und Weise wie zuvor beschrieben inkubiert und anschließend wurde die Anzahl der Zellen entsprechend gezählt.
- Der Anteil (in Prozent) der Hemmung der Zellwucherung der behandelten Gruppen gegenüber dem der Vergleichsgruppe (unbehandelt) wurde bestimmt.
- Bei den menschlichen Lungenkrebs-LX-1-Zellen wurde jedoch der inkubierten Zellsuspension an LX-1-Zellen 10 ul einer Lösung hinzugefügt, die 5 mg/ml an MTT enthält (nämlich 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), gefolgt von einer weiteren Inkubation für vier Stunden bei 37 ºC. Nach der beendeten Inkubation wird die überstehende Flüssigkeit (100 ul) von der inkubierten Zellsuspension entfernt, und der sich ergebenden rückständigen Suspension, die die LX-1-Zellen enthält, wurden 150 ul einer Mischung aus Isopropanol und 1N-HCl (25:1) hinzugegeben. Von der resultierenden Mischung wurde die Absorption von Lichtstrahlen bei 540 nm bestimmt. Der Anteil (in Prozent) der Hemmung der Wucherung der LX-1-Zellen in der behandelten Gruppe gegenüber der Vergleichsgruppe (unbehandelt) wurde in Werten der bei 540 nm erhaltenen Meßwerte der Absorption der Lichtstrahlung bestimmt.
- Aus den Werten des Anteiles (in Prozent) der Hemmung, wie sie zuvor bestimmt worden sind, wurden die IC&sub5;&sub0;-Werte (ug/ml) der erfindungsgemäßen MI43-37F11-Substanz ermittelt, wobei dies die Konzentration der MI43-37F11-Substanz ist, die 50 % Hemmung der Wucherung der unterschiedlichen untersuchten Krebszellen ergibt. Die Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 summarisch zusammengestellt. Tabelle 2 Untersuchte Zellen IC&sub5;&sub0;-Wert (ug/ml) Mäuseleukämie L1210 Mäuseleukämie P388 Mäuseleukämie EL4 Mäuse-IMC-Karzinom Menschlicher Lungenkrebs LX-1
- (2) Die Antitumorwirkung der antibiotischen MI43-37F11-Substanz auf Ehrlich-Karzinom wurde durch die folgenden Verfahren bestimmt:
- (a) Experimente zur therapeutischen Behandlung von Ehrlich- Karzinom tragenden Mäusen wurden durch intraperitoneale Injektion der antibiotischen MI43-37F11-Substanz durchgeführt. Eine Zellsuspension an asziten Ehrlich-Karzinom- Zellen wird in den abdominalen Bereich einer ICR-Maus (weiblich, sechs Wochen alt, vier Mäuse in jeder behandelten Gruppe) subcutan inokuliert, und zwar derart, daß die Zahl der subcutan transplantierten Karzinomzellen 2x10&sup6; Zellen pro Maus beträgt. Nach der Transplantation der Karzinomzellen wurde die antibiotische M43-37F11-Substanz durch intraperitoneale Injektion denjenigen Mäusen verabreicht, denen Zellen transplantiert wurden und die fest gewachsene Karzinome hatten, und zwar nach folgendem Verabreichungszeitplan. Die MI43-37F11-Substanz wurde nur einmal am siebten Tag nach der Transplantation der Zellen verabreicht, und zwar mit Dosierungen von 10 mg/kg, 2,5 mg/kg oder 0,625 mg/kg, oder alternativ dazu, wurde die MI43-37F11- Substanz insgesamt fünfmal jeden zweiten Tag vom siebten bis zum vierzehnten Tag nach der Transplantation der Karzinomzellen mit Dosierungen von 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg oder 0,625 mg/kg verabreicht. Bei den Mäusen der Vergleichsgruppe (unbehandelt, acht Mäuse in jeder Vergleichsgruppe) wurde keine MI43-37F11-Substanz verabreicht, es wurde jedoch physiologische Salzlösung intraperitoneal injiziert.
- Am fünfzehnten Tag nach der Transplantation der Karzinomzelle wurde die Tumormasse (Karzinom) von jeder Maus operativ entfernt und gewogen. Der Anteil der Reduzierung des Gewichts des Tumors (Karzinom), wie er aus der mit der MI43-37F11-Substanz behandelten Gruppe an Mäusen erhalten wurde, wurde in dem Anteil (in Prozent) der Hemmung bestimmt, und zwar unter der Annahme, daß das Gewicht der Tumore, wie sie von der Vergleichsgruppe der Mäuse erhalten wurden, 100 beträgt. In anderen Worten ausgedrückt, wurde die Hemmungsrate (in Prozent) des Wachstums der Ehrlich- Karzinome nach folgender Gleichung berechnet:
- Hemmungsrate (%) =
- wobei C das Gewicht der Tumore bei der Vergleichsgruppe an Mäusen (unbehandelt) und T das Gewicht der Tumore der behandelten Gruppe an Mäusen bedeutet.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Hemmungsrate ( %) Verabreichungszeitplan Dosierung der MI43-37F11-Substanz (mg/kg/Tag) 7. Tag (einmalig) 7. Tag bis 14. Tag (jeden 2. Tag, insgesamt 5 mal)
- (b) Weitere Experimente zur therapeutischen Behandlung von Ehrlich-Karzinom tragenden Mäusen wurden durch orale Verabreichung der MI43-37F11-Substanz durchgeführt. Dazu wurde die Zellsuspension an asziten Ehrlich-Karzinom-Zellen dem abdominalen Bereich von ICR-Mäusen (weiblich, sechs Wochen alt, fünf Mäuse pro behandelte Gruppe) subcutan inokuliert, und zwar derart, daß die Zahl der subcutan implantierten Krebszellen 2x10&sup6; Zellen pro Maus betragen hat. Die MI43-37F11-Substanz wurde den Mäusen der behandelten Gruppe vom ersten bis zum neunten Tag nach der Implantation der Krebszellen einmal pro Tag mit Dosierungen von 6,3 mg/kg, 12,5 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg oder 100 mg/kg oral verabreicht. Am vierzehnten Tag nach der Implantation der Krebszellen wurde die Tumormasse (Karzinom) operativ von jeder Maus entfernt und gewogen. Das Gewicht der Tumore, die von der behandelten Gruppe an Mäusen erhalten wurden, wurde mit dem Gewicht der Tumore verglichen, die von der Vergleichsgruppe an Mäusen (unbehandelt) erhalten wurden, indem die Hemmungsrate (in Prozent) entsprechend derselben Gleichung wie zuvor gegeben bestimmt wurde.
- Die erhaltenen Untersuchungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Dosierung der MI43-37F11-Substanz (mg/kg/Tag) Gewicht des Tumors (mg ± S.D.) Hemmungsrate (%) *** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05
- (3) Untersuchungen zur Bestimmung der Aktivität der MI43-37F11- Substanz zur Aktivierung peritonealer Makrophagen wurden entsprechend dem folgenden Verfahren durchgeführt. Ein Tag bevor die peritonealen Makrophagen gesammelt wurden, wurde die antibiotische M43-37F11-Substanz an CDF&sub1;-Mäusen (acht Wochen alt, weiblich, drei Mäuse pro Gruppe) intraperitoneal verabreicht, und zwar mit Dosierungen von 50 mg/kg, 12,5 mg/kg oder 3,125 mg/kg. Ein Tag nach der Verabreichung wurden die Makrophagen aus der Bauchhöhle der behandelten Mäuse gesammelt und in ein Kulturmedium gegeben, das in einer Plastikschale vorhanden ist (Falcone, Nr. 3002, 60x15 cm, ein Erzeugnis der Decton Dikinson & Company), und zwar mit einer Zellkonzentration von 1x10&sup6; Zellen/ml, gefolgt von einer Inkubation der Makrophagen.
- Dem die Makrophagen enthaltenden inkubierten Medium wurden anschließend 100 ng/ml Phorbolmyristatacetat hinzugegeben, um bei den Makrophagen deren Produktion von O&sub2;&supmin; hervorzurufen. Der Betrag an O&sub2;&supmin; wurde durch die reduktive Reaktion mit Cytochrom C bestimmt. Die Vergleichsgruppe an Mäusen (unbehandelt) hat nur eine intraperitoneale Injektion an physiologischer Salzlösung erhalten anstelle der Verabreichung der MI43-37F11-Substanz, bevor die peritonealen Makrophagen gesammelt wurden. Unter der Annahme, daß die Menge an O&sub2;&supmin;, die von den peritonealen Makrophagen erzeugt und freigesetzt wurde, und die von den Mäusen der Vergleichsgruppe gesammelt wurden, 100 beträgt, wurde die Anstiegsrate der Menge an O&sub2;&supmin;, wie dies von den peritonealen Makrophagen der Mäuse der behandelten Gruppe erzeugt wird, bestimmt. In anderen Worten ausgedrückt, wurde die Zuwachsrate (in Prozent) der O&sub2;&supmin;-Produktion der peritonealen Makrophagen der Mäuse der behandelten Gruppe nach folgender Gleichung berechnet:
- Anstiegsrate (in Prozent) der O&sub2;&supmin;-Produktion =
- wobei T die Menge an O&sub2;&supmin; bedeutet, die durch die peritonealen Makrophagen der Mäuse der behandelten Gruppe erzeugt wurde und C diejenige Menge an O&sub2;&supmin; bedeutet, die durch die peritonealen Makrophagen der Vergleichsgruppe (unbehandelt) erhalten wurde.
- Die erhaltenen Untersuchungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 5 Dosierung an MI43-37F11-Substanz (mg/kg) Ausstiegsrate (%) der O&sub2;&supmin;-Produktion
- (4) Untersuchungen zur Bestimmung der Wirkung der antibiotischen MI43-37F11-Substanz auf die Phagozytose der peritonealen Makrophagen wurden entsprechend dem folgenden Verfahren durchgeführt. Drei Tage und ein Tag vor Sammeln der peritonealen Makrophagen wurde die MI43-37F11-Substanz an CDF&sub1;-Mäusen (weiblich, acht Wochen alt, drei Mäuse) intraperitoneal mit Dosierungen von 50 mg/kg, 5 mg/kg oder 0,5 mg/kg verabreicht. Ein Tag nach der Verabreichung der MI43-37F11-Substanz wurden die peritonealen Makrophagen der Mäuse der behandelten Gruppe an Mäusen aus der Bauchhöhle gesammelt und in ein in einer Plastikschale (Falcone) vorhandenes Kulturmedium inokuliert, und zwar mit einer Zelldichte von 5x10&sup5;-Zellen/ml, gefolgt von einer Inkubation der Makrophagen. Dem inkubieften Medium, das die Makrophagen enthält, wurden anschließend wärmebehandelte Hefezellen mit 7,5x10&sup6;-Zellen/ml hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren Inkubation für eine gewisse Zeitdauer. Die Makrophagen werden anschließend durch Hinzufügen von Methanol und Färben nach der Giemsa-Färbemethode gefärbt. Die Anzahl der Hefezellen, die die Phagozytose durch 400 Makrophagen erhalten haben, wurden gezählt. Die Vergleichsgruppe an Mäusen (unbehandelt) haben lediglich eine intraperitoneale Injektion an physiologischer Salzlösung anstelle der Verabreichung der MI43-37F11-Substanz erhalten, bevor die Sammlung der peritonealen Makrophagen durchgeführt wurde. Angenommen, daß die Zahl der Hefezellen, die die Phagozytose durch 400 Makrophagen, die von der Maus der Vergleichsgruppe gesammelt wurden, einen Betrag von 100 einnimmt, wurde die Zuwachsrate der phagozytischen Wirkung der peritonealen Makrophagen, die von der behandelten Gruppe an Mäusen gesammelt wurde, bestimmt. In anderen Worten ausgedrückt, wurde die Zuwachsrate (in Prozent) der phagozytischen Wirkung der peritonealen Makrophagen der Mäuse der behandelten Gruppe entsprechend der folgenden Gleichung berechnet:
- Zuwachsrate (%) der phagozytischen Wirkung =
- wobei T die Zahl der Hefezellen bedeutet, die die Phagozytose durch 400 Makrophagen empfangen haben, welche aus der behandelten Gruppe der Mäuse gesammelt wurden, und C die Zahl der Hefezellen bedeutet, die die Phagozytose durch 400 Makrophagen empfangen haben, welche aus der Vergleichsgruppe an Mäusen (unbehandelt) erhalten wurde.
- Die Untersuchungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Dosierung der MI43-37F11-Substanz (mg/kg) Zuwachsrate (%) an phagozytischer Wirkung der peritonealen Makrophagen
- (5) Untersuchungen zur Bestimmung der Aktivität der antibiotischen MI43-37F11-Substanz zur Erhöhung der in vivo Interleukin-1-Produktion wurden entsprechend dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die MI43-37F11-Substanz wurde CDF&sub1;- Mäusen (weiblich, sechs Wochen alt) mit einer Dosierung von 25 mg/kg oral verabreicht. Einen Tag, drei Tage, fünf Tage und sieben Tage nach der Verabreichung werden peritoneale Exsudatzellen (PEC) und Milzzellen von den Mäusen der behandelten Gruppe gesammelt. Die gesammelten peritonealen Exsudatzellen und die Milzzellen werden unabhängig voneinander in zwei Klassen aufgeteilt, nämlich in die Klasse der anhaftenden Zellen, die bezüglich ihrer Natur an der Wand der Plastikschale haften und in die Klasse der nichtanhaftenden Zellen. Die Gesamtheit der peritonealen Exsudatzellen (PEC), die der anhaftenden Zellen der PEC und die anhaftenden Zellen der Milzzellen werden getrennt in aliquoten Teilen eines Kulturmediums suspendiert unter Bildung von Zellkonzentrationen von 1x10&sup6; Zellen/Mulde, 2x10&sup6; Zellen/Mulde und 2,5x10&sup6; Zellen/Mulde. Nach Inkubation für 24 Stunden wurden die Flüssigkeitsüberstände durch Filtrieren des inkubierten Kulturmediums gesammelt und anschließend bezüglich deren Aktivität von Interleukin-1 (IL-1) entsprechend der Methode von Jonathan K. et al (siehe "Lymphokineresearch" 3 (4), 175-182, (1984)) untersucht. Concanavalin A (mit einer Endkonzentration von 2,5 ug/ml) und 100 ul des zuvor erhaltenen Flüssigkeitsüberstandes werden zu 100 ul einer Zellsuspension hinzugefügt, die 1x10&sup5; Zellen/ml an D10.G4.1. Zellen enthält, die in der Gegenwart von Concanavalin A plus Interleukin-1 proliferieren, falls letztere Verbindungen hinzugegeben wurden. Die resultierende Mischung wird anschließend für 48 Stunden inkubiert, und anschließend wird ³H-Thymidin (³H-dT) hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 16 Stunden. Danach wird der Anteil an der Aufnahme von ³H-dT durch die D10.G4.1. Zellen in Einheiten der Radioaktivitätseinheit c.p.m. bestimmt. Der Anteil der Aufnahme von ³H-dT bei der Vergleichsgruppe der (unbehandelten) Mäuse wurde auf dieselbe Art und Weise wie zuvor bestimmt.
- Die erhaltenen Untersuchungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 7 zusammengestellt. Tabelle 7 Aufnahme von ³H-dT (c.p.m.) Gesamtheit der peritonealen Exsudatzellen (PEC) Anhaftende Zellen der PEC Anhaftende Zellen der Milzzellen Tage nach oraler Verabreichung der MI43-37F11-Substanz (25 mg/kg) Vergleichsgruppe Tag TageAls ein zweiter Aspekt der Erfindung ist das Schaffen eines Verfahrens zur fermentativen Herstellung der antibiotischen Antikrebsverbindung oder -substanz, die, wie zuvor beschreiben, die Formel [1] aufweist, bei dem ein substanzproduzierender Stamm der Gattung Streptoverticillium in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält, solange kultiviert wird, bis eine beträchtliche Menge der Substanz erzeugt und in der Kultur angesammelt ist, und anschließend die Substanz, die die zuvor erwähnte Formel [1] aufweist, aus der Kultur gewonnen wird. Ein typisches Beispiel für einen substanzproduzierenden Stamm, der in dem Verfahren des zweiten Aspektes dieser Erfindung zur Verfügung steht, ist ein neuer Stamm, der als Stamm MI43-37F11 bezeichnet wird, der der Gattung Streptoverticillium zugehörig ist, und der von uns aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in Midori-ku, Yokohama City, Kanagawa Prefecture, Japan, gesammelt wurde. Dieser MI43-37F11-Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
- Eine mikroskopische Untersuchung zeigt, daß der MI43-37F11- Stamm verzweigte Substratmyzelien aufweist, von denen sich Lufthyphen unter Bildung von Wellen entwickeln. Es wurde beobachtet, daß sich an der Spitze der Lufthyphen eine Kette von mehr als zehn Sporen gebildet hat. Die Größe der Sporen wird mit etwa 0,7 - 0,8 bis 1,1 - 1,3 um gemessen und sie weisen eine glatte oberfläche auf.
- Der Standard, der in eckigen Klammern [ ] zur Beschreibung der Farbe gegeben ist, entspricht dem "color Harmony Manual" der Container Corporation of America.
- Auf der farblosen Kolonie haben sich in dünner Schicht weiße Lufthyphen ausgebildet. Es werden keine löslichen Pigmente beobachtet.
- Lufthyphen mit gelb getönter weißer Farbe [1½ db, Parchmeat] haben sich in dünner Schicht auf der Kolonie mit farbloser bis leicht gelber [2ea, Lt Wheat] oder bis leicht gelbbrauner Farbe [2 gc, Bamboo] gebildet. Weiße baumwollartige Lufthyphen werden ebenfalls teilweise gebildet. Es werden keine löslichen Pigmente festgestellt.
- Auf der farblosen bis leicht gelbbraunen Kolonie [2 ie, Lt Mustard Tan] haben sich farblose Lufthyphen ausgebildet. Das lösliche Pigment ist braun getönt.
- Auf der farblosen bis blaß gelbbraunen [2 le, Mustard - 2 ne, Mustard Gold] Kolonie haben sich gelblichweiß [1½ ca, Cream] bis hell olivgrau [1½ ge, Lt Olive Gray] gefärbte Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
- Auf der leicht gelblichbraun [2 ie, Lt Mustard Tan] bis hellgraubraun [2 lg, Mustard Tan] gefärbten Kolonie haben sich weiße bis bräunlich weiße [3 ba, Pearl - 2 cb, Ivory Tint] Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
- Auf der farblosen bis blaßgelblichbraun [2 ie, Lt Mustard Tan] gefärbten Kolonie haben sich in dünner Schicht weiße Lufthyphen ausgebildet. Es wird etwas schwarz getöntes lösliches Pigment gebildet.
- Auf der farblosen bis blaßgelblichbraun [2 ic, Honey Gold - 3 ic, Lt Amber] gefärbten gekräuselten Kolonie haben sich weiße bis bräunlich weiße [3 ba, Pearl] gefärbte Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
- Auf der farblosen bis blaßgelb [2 ea, Lt Wheat - 2 ca, Lt Ivory] gefärbten Kolonie hat sich eine dünne Schicht an weißen bis gelblich weißen Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
- Auf der farblosen bis blaßgelb [2 ca, Lt Ivory] gefärbten Kolonie hat sich eine dünne Schicht an weißen bis gelblich weißen [1½ db, Parchment] Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird beobachtet.
- Auf der farblosen bis blaßgelb [2 ea, Lt Wheat] oder blaßgelblich braun [1½ ic, Lt Antique Gold] gefärbten Kolonie haben sich weiße bis gelblich weiße [2 ca, Lt Ivory] Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird festgestellt.
- Weiße Lufthyphen werden schwach auf der farblosen und sehr gering vorhandenen Kolonie ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird festgestellt.
- Die Kultur ist farblos und es haben sich darauf keine Lufthyphen ausgebildet. Kein lösliches Pigment wird festgestellt.
- In einem 15%igen einfachen Gelatine-Kulturmediuin (kultiviert bei 20ºC) ist die Kolonie farblos, es haben sich jedoch keine Lufthyphen ausgebildet, und es wird ein leicht gelblich braunes lösliches Pigment beobachtet. Im Glucose- Pepton-Gelatine-Kulturmedium (kultiviert bei 27ºC) ist die Kultur farblos, es haben sich jedoch keine Lufthyphen ausgebildet, und es wird ein lösliches Figment mit leicht bräunlicher Farbe beobachtet.
- Die Kultur ist farblos bis blaßbraun und es haben sich keine Lufthyphen ausgebildet. Es wird ein lösliches Pigment mit leicht gelblicher bis bräunlicher Farbe beobachtet.
- Bei den Untersuchungen, die unter Verwendung eines Stärkeanorganisches Salz-Agar-Mediums (ISP-Medium 4, BACTO- INORGANIC-SALTS STARCH AGAR) durchgeführt wurden und bei denen der MI43-37F11-Stamm bei unterschiedlichen Temperaturen, nämlich 20ºC, 24ºC, 27ºC, 30ºC, 37ºC und 50ºC inkubiert wurde, ist der MI43-37F11-Stamm bei allen untersuchten Temperaturen gewachsen, nur nicht bei 50ºC. Optimale Temperaturen für ein gutes Wachstum scheinen in der Nähe von 27ºC zu liegen.
- Die Verflüssigung setzte etwa am dritten Tag der Inkubation ein, und zwar sowohl in dem 15%igen einfachen Gelatine- Medium als auch im Glucose-Pepton-Gelatine-Medium. Das Ausmaß der Verflüssigung ist mittel bis ziemlich stark.
- Die Hydrolyse setzte am dritten Tag der Inkubation ein, und zwar sowohl beim Stärke-anorganisches Salz-Agar-Medium als auch beim Stärke-Agar-Medium, bei dem das Ausmaß der Hydrolyse ziemlich stark ist.
- Eine Koagulation zeigt sich etwa am zweiten Tag der Inkubation und wird am dritten Tag der Inkubation vervollständigt, anschließend beginnt unmittelbar die Peptonisation. Die Peptonisation schreitet langsam voran und war sogar nach drei Wochen der Inkubation noch nicht vervollständigt.
- Die Melanoidausbildung war im Pepton-Hefe-Eisen-Medium positiv und ersichtlich positiv in der Trypton-Hefebrühe, jedoch negativ im Tyrosin-Agar-Medium.
- Glucose, Fructose und Inositol sind für die Kolonie einsetzbar. Jedoch sind L-Arabinose, D-Xylose, Sucrose, Rhamnose, Raffinose, D-Mannitol und Lactose nicht einsetzbar.
- Eine Verflüssigung des Calciummalates in dem Calciummalat- Agar war negativ.
- Die Reduktion war ziemlich schwach positiv.
- Die Zersetzung der Zellulose war negativ.
- Unter Zusammenfassung der zuvor beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der MI43-37F11-Stamm dahingehend morphologisch charakterisiert, daß die Lufthyphen Wellen aufweisen, und die Ausbildung von Spiralen nicht beobachtet wird. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Es werden weiße bis bräunlich weiße oder gelblich weiße, oder manchmal hell olivgrau gefärbte Lufthyphen auf der Kolonie ausgebildet, die in unterschiedlichen Kulturmedien farblos bis blaßgelblichbraun ist. Lösliche Pigmente werden nicht erzeugt, manchmal wird ein lösliches Pigment mit bräunlich getönter Farbe beobachtet. Die Ausbildung von Melanoidpigment ist im Tyrosin-Agar-Medium negativ, ist jedoch in der Trypton-Hefebrühe und in dem Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium positiv. Das Ausmaß der Proteinzersetzungsaktivität ist mittel bis ziemlich stark und das Maß der stärkehydrolisierenden Aktivität ist ebenfalls ziemlich stark. 2,6-Diaminopimelinsäure, die in den Zellwänden vorhanden ist, ist vom LL-Typ.
- Im Hinblick auf die zuvor beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften haben wir entschieden, daß der MI43-37F11-Stamm der Gattung Streptoverticillium zugehörig ist.
- Bei der Suche nach analogen bekannten Spezies mit Hinweis auf die Eigenschaften des MI43-37F11-Stammes, scheinen Streptoverticillium eurocidicum [Literatur 1: "International Journal of Systematic Bacteriology", Vol. 22, Seite 293 (1972); Literatur 2: ditto, Vol. 30, Seite 408 (1980); Literatur 3: "The Journal of Antibiotics, Serie A.", Vol. 7, Seite 98 (1954)] und Streptoverticillium albireticuli [Literatur 1: "International Journal of Systematic Bacteriology", Vol. 18, Seite 80 (1968); Literatur 2: ditto, Vol. 30, Seite 407 (1980)] dem MI43-37F11-Stamm zu ähneln.
- Daraufhin haben wir Untersuchungen zum Vergleich der Eigenschaften von dem MI43-37F11-Stamm mit den Eigenschaften von Streptoverticillium eurocidium und Streptoverticillium albireticuli, wie sie in den zuvor genannten Literaturstellen beschrieben worden sind, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in der nachfolgenden Tabelle 8 summarisch dargestellt. Tabelle 8 Streptoverticillium eurocidium IMC S-0770 (ISP5604) Streptoverticillium albireticuli IMC S-0222 (ISP5051) Art der Lufthyphen Oberfläche der Sporen Farbe der Lufthyphen Farbe der Kultur Lösliches Pigment Ausbildung von Melanoiden Im ISP-Medium Hydrolyse von Stärke Koagulation von Magermilch Peptonisation von Magermilch Verflüssigung von Gelatine In 15%igem einfachen Gelatine-Medium In Glucose-Pepton-Medium Ausbildung von Wellen glatt weiß bis gelb getöntes weiß, bräunllich weiß oder hell olivgrau farblos bis schwach gelblich braun weiß bis gelb getöntes weiß, bräunlich weiß oder hell olivgrau Keine Beschr. langs. Reduktion von Nitrat Verwendung als Kohlenstoffquelle* D-Glucose L-Arabinose D-Xylose D-Fructose Sucrose Inositol Rhamnose Raffinose D-Mannitol Lactose
- In Tabelle 8 bedeutet das Symbol "±""möglicherweise (-)"; "?" bedeutet "zweifelhaft" und "(+)" bedeutet "möglicherweise +".
- Insbesondere bei Verwendung als Kohlenstoffquelle bedeutet das Symbol "+" "verwendbar"; "(+)" bedeutet "möglicherweise verwendbar"; "±" bedeutet "zweifelhaft, entweder "+" oder "-"; "?" bedeutet "variabel", und "-" bedeutet "nicht verwendbar".
- Literatur*1: "International Journal of Systematic Bacteriology", Vol. 22, Seite 293 (1072)
- Literatur*2: "The Journal of Antibiotics, Serie A.", Vol. 7, Seite 98 (1954)
- Literatur*3: "International Journal of Systematic Bacteriology", Vol. 18, Seite 80 (1968)
- Literatur*4: S.A. Waksman; "The Actinomycetes", Vol. 2, Seite 169 (19861)
- Wie aus der vorangegangenen Tabelle 8 entnommen werden kann, ähnelt der MI43-37F11-Stamm sowohl Streptoverticillium eurocidicum als auch Streptoverticillium albireticuli sehr. Im Hinblick auf die hell olivgraue Farbe der Lufthyphen, die möglicherweise "negative" Ausbildung von Melanoidpigment in dem ISP-Medium 7, die mögliche Verwendbarkeit von D-Fructose und andere Eigenschaften des MI43-37F11-Stammes wird entschieden, daß der MI43- 37F11-Stainm am nächsten analog zu Streptoverticillium eurocidicum ist. Demzufolge wird der MI43-37F11-Stamm nunmehr als Streptoverticillium eurocidicum MI43-37F11 identifiziert.
- Der Stamm MI43-37F11 wurde bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute" hinterlegt, der Agency of Industrial Science and Technology (Sitz in Tsukaba-City, Ibaraki Prefecture, Japan), und zwar seit dem 27. Januar 1989 unter der Hinterlegungsnummer "FERM P-10513", die nunmehr in die Hinterlegungsnummer "FERM BP-2783" in der Terminologie des Budapester Vertrages umgewandelt ist.
- Bei der Durchführung des Verfahrens zur Herstellung der antibiotischen Antikrebs-MI43-37F11-Substanz entsprechend dem zweiten Aspekt der Erfindung, wird ein MI43-37F11 substanzerzeugender Stamm, der der Gattung Streptoverticillium zugehörig ist, mit der bekannten und gebräuchlichen Methode zur Kultivierung des Mikroorganismus der Actinomyces kultiviert. Eine bestimmte Menge des MI43-37F11 substanzerzeugenden Stammes wird demzufolge in ein geeignetes Kulturmedium inokuliert, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält und wird anschließend unter aeroben Bedingungen inkubiert, vorzugsweise unter eingetauchten aeroben Bedingungen, so daß die MI43-37F11-Substanz produziert und in der Kulturbrühe angesammelt wird.
- Das zur Kultivierung eingesetzte Kulturmedium kann Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze etc. enthalten, die üblicherweise für die Kultivierung von Actinomyces eingesetzt werden. Die Stickstoffquellen beinhalten solche kommerziell zur Verfügung stehenden bekannten Materialien wie Pepton, Fleischextrakt, steifer Maisliquor, gemahlene Baumwollsamen, Erdnußpulver, Sojabohnenpulver, Hefeextrakt, NZ-Amin, Kaseinhyrolisat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Die Kohlenstoffquellen schließen kommerziell zur Verfügung stehende bekannte Materialien wie zum Beispiel Kohlenhydrate wie Glycerin, Stärke, Glucose, Galactose, Manose und Molasse ein, sowie Fette und Öle. Die anorganischen Salze können Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat und dergleichen einschließen.
- Das produktive Kulturmedium, das für die kommerzielle Erzeugung von MI43-37F11-Substanz eingesetzt werden kann, kann in geringer Menge ein oder mehrere anorganische Salze enthalten und kann auch Antischäummittel, tierische Öle, Pflanzenöle und Mineralöle enthalten. Darüber hinaus können jegliche andere organische oder anorganische Materialien, die dafür bekannt sind, daß sie nützliche Materialien zur Potenzierung von Mikroorganismen sind und für die erhöhte Produktion von MI43-37F11-Substanz einsetzbar sind, ebenfalls vorteilhaft als Zusatz in dem Kulturmedium eingesetzt werden.
- Die Kultivierung des MI43-37F11-Stammes für die kommerzielle Herstellung der MI43-37F11-Substanz kann unter eingetauchten, aeroben Bedingungen durchgeführt werden, und die Kultivierungstemperatur kann in einem Temperaturbereich liegen, in dem der MI43-37F11 substanzproduzierende Stamm wachsen und eine beträchtliche Menge an der MI43-37F11-Substanz erzeugen kann, wobei dies üblicherweise in einem Bereich zwischen 27ºC und 37ºC erfolgt. Die weiteren Bedingungen für die Kultivierung können abhängig von und entsprechend der mikrobiologischen und physiologischen Eigenschaften der MI43-37F11 substanzproduzierenden Stämme ausgewählt werden.
- Das Gewinnen der MI43-37F11-Substanz aus der Kultur des MI43- 37F11 substanzproduzierenden Stammes kann auf die folgende Art und Weise erreicht werden. Das Antibiotikum MI43-37F11 ist im wesentlichen in der flüssigen Phase der Kulturbrühe angesammelt. Demzufolge wird die erhaltene Kulturbrühe abfiltriert, und das Filtrat der Brühe wird auf einen schwach sauren ph eingestellt und wird mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat extrahiert. Zusätzlich zu der zuvor beschriebenen Extraktionsmethode können jegliche gebräuchlichen Methoden zur Isolierung von oleophilen Substanzen herangezogen werden, nämlich Absorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie, wobei auch eine Kombination dieser Methoden vorteilhafterweise zur Isolierung und Reinigung der MI43-37F11-Substanz herangezogen werden kann.
- Die Erfindung beinhaltet auch die Verwendung der MI43-37F11- Substanz in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, bspw. einem Mittel gegen Krebs oder einem krebsbekämpfenden Mittel, das als aktiven Bestandteil eine Verbindung der Formel [I] enthält.
- Auf Basis solch nützlicher biologischer Eigenschaften der MI43- 37F11-Substanz, wie diese zuvor erwähnt wurden, besteht ein dritter Aspekt dieser Erfindung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil die antibiotische MI43-37F11-Substanz mit der zuvor gegebenen Formel [I] aufweist, und zwar in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Trägern für den aktiven Bestandteil. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist als karzinostatisches oder Antitumormittel für Säugetiere, einschließlich Menschen, wirksam und nützlich.
- Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf konventionelle Art und Weise formuliert werden, und zwar in jeglicher geeigneter Form an medizinischen Präparationen für die orale, intraperitoneale oder parenterale Verabreichung, wie bspw. Injektionen, Tabletten, Kapseln, Granulas, Sirups, Suppositorien und Salben. Als pharmazeutisch verträgliche Träger können je nach Wunsch jegliche Arten von bekannten gebräuchlichen Trägern eingesetzt werden. Die Natur und die Zusammensetzung der verwendeten Träger variieren in Abhängigkeit von dem Weg und der Art und Weise der Verabreichung und schließen organische und anorganische, feste und flüssige, im allgemeinen inerte Träger und Vehikel, die zu pharmazeutischen Zwecken bekannt sind und zur Verfügung stehen, ein. Einige konkrete Beispiele derartiger Träger sind kristalline Zellulose, Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche sowie tierische Fette und Öle, Gummis und Polyalkylenglykole sowie andere. Die Konzentration der MI43-37F11-Substanz als aktiver karzinostatischer oder Antitumorbestandteil in der pharmazeutischen Zusammensetzung entsprechend der vorliegenden Erfindung kann von 0,2 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise von 1 bis 90 Gew.-% betragen, und zwar bezüglich des Gesamtgewichtes der Zusammensetzung. Falls gewünscht, kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zusätzlich zur MI43-37F11-Substanz einen oder mehrere andere pharmakologisch aktive Bestandteile enthalten, einschließlich solcher, die karzinostatische, Antitumoroder andere pharmakologische Aktivitäten zeigen.
- Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Dosierungen verabreicht werden, die die gewünschte pharmakologische Aktivität entwickeln, ohne daß sie von nennenswerten Nebenwirkungen begleitet sind. Die jeweilige Dosis ist von dem medizinischen Experten in jedem besonderen Fall auszuwählen, die Dosierung des aktiven Bestandteiles, nämlich der MI43-37F11- Substanz liegt im allgemeinen im Bereich von 10 mg bis 10 g, vorzugszweise 20 mg bis 5 g pro Tag bei einem Erwachsenen zur therapeutischen Behandlung von Karzinomen und malignen Tumoren. Bei diesen Fällen kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in üblicher Weise als eine Zusammensetzungseinheit verabreicht werden, die 1 mg bis 5 g, vorzugsweise 3 mg bis 1 g des aktiven Bestandteiles, nämlich die MI43-37F11- Substanz, enthält.
- Wie bereits kurz erwähnt, muß die Dosierung der MI43-37F11- Substanz vom medizinischen Experten in geeigneter Weise bestimmt werden, wobei typischerweise das Alter, das Körpergewicht, die Symptome des Patienten und der beabsichtigte therapeutische Zweck berücksichtigt werden muß. Die zuvor erwähnte effektive Dosis kann kontinuierlich oder periodisch verabreicht werden, solange die Gesamtdosis ein bestimmtes Maß, wie es im Hinblick auf die Ergebnisse von tierischen Tests und verschiedenen Umständen festgelegt wurde, nicht überschreitet.
- Darüber hinaus beinhaltet ein weiterer Aspekt dieser Erfindung die pharmazeutische Verwendung der antibiotischen MI43-37F11- Substanz der zuvor gegebenen Formel [I], und zwar als ein Antikrebs- oder krebsbekämpfendes Mittel oder als Antitumormittel oder bei der Herstellung solcher Mittel. Die Erfindung beinhaltet auch die pharmazeutische Verwendung der MI43-37F11-Substanz als ein Mittel zur Steigerung der in vivo Produktion von Interleukin-1 in Säugetieren, einschließlich Menschen, oder die Herstellung eines solchen Mittels. Diese Mittel können in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen, die die MI43-37F11-Substanz als aktiven Bestandteil enthalten, und zwar in Zusammenhang mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für den aktiven Bestandteil.
- Daneben ist die MI43-37F11-Substanz der vorliegenden Erfindung, wie bereits zuvor beschrieben, dahingehend wirksam, daß peritoneale Makrophagen dazu angeregt werden, deren O&sub2;&supmin;-Produktion zu erhöhen und sie ist auch dahingehend wirksam, daß sie die phagozytische Wirkung der Makrophagen sowie die in vivo Produktion von Interleukin-1 erhöht, so daß die erfindungsgemäße MI43- 37F11-Substanz tatsächlich in der Lage ist, die Makrophagen eines Säugetieres in vivo zu erhöhen. Demzufolge schließt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung der MI43-37F11-Substanz als ein Mittel zur Aktivierung von Makrophagen in vivo in einem Säugetier ein.
- Die Erfindung wird nunmehr in Zusammenhang mit den nachfolgenden Beispielen erläutert.
- Eine Menge, die einer vollständigen Schleife entspricht, des Streptoverticillium eurocidicum MI43-37F11-Stammes (identifiziert als FERM BP-2783) wird von seiner geneigten Agarkultur entnommen und in drei Erlenmeyerkolben inokuliert, die jeweils 110 ml eines sterilisierten Kulturmediums beinhaltet, welch letzteres 2,0 % Galactose, 2,0 % Dextrin, 1,0 % Sojapepton ("Bacto Soyton", ein Erzeugnis der Difco Co., Ltd.), 0,5 % steifen Maisliquor (ein Erzeugnis der Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.), 0,2 % Ammoniumsulfat, 0,2 % Calciumcarbonat und 0,003 % Entschäumungsmittel, Siliconöl "Silicon KM70" (ein Handelsname eines Produktes der Shinetsu Chemicals, Co., Ltd.) enthält und auf ph 7,0 eingestellt ist. Das inokulierte Kulturmedium wurde für zwei Tage unter Rühren bei 30ºC inkubiert, so daß eine Saatkultur hergestellt wurde.
- 2,5 ml-Portionen der so erhaltenen Saatkultur werden jeweils in 80 Sakaguchi-Kolben inokuliert, von denen jeder 125 ml eines Kulturmediums beinhaltet, das 2,0 % Glycerin, 1,5 % "Esusan Meat" (ein Handelsname eines Sojabohnengewächs-Produktes von Ajinomoto Co., Ltd.), 0,1 % Kaliumhydrogenphosphat, 0,0005 % Kobaltchlorid-6-hydrat und 0,003 % Siliconentschäumer enhält, wobei mit Dikaliumphosphat auf einen pH von 6,2 eingestellt wurde. Die Kultivierung des MI43-37F11-Stammes wurde dann für vier Tage bei 28ºC durchgeführt. Die resuliertende Kulturbrühe wurde filtriert, um die Myzelien zu entfernen, und das gewonnene Filtrat der Brühe (eingestellt auf ph 5) wurde mit einer gleichen Menge an Ethylacetat extrahiert. Der resultierende Extrakt in Ethylacetat wurde unter verringertem Druck konzentriert, wobei eine bräunlich ölige Substanz (2,0 g) erhalten wird, die die MI43-37F11-Substanz enthält.
- Das Rohprodukt der MI43-37F11-Substanz wird mit 10 g Silicagel vermischt, gefolgt von einem Trocknen unter vermindertem Druck. Die sich daraus ergebende trockene Mischung wird auf das obere Ende einer 60 ml-Säule an Silicagel gegeben, woraufhin anschließend eine Silicagelsäulenchromatographie durchgeführt wird. Die Silicagelsäule wurde zuvor mit Hilfe von n-Hexan mit dem Silicagel gepackt. Die Silicagelsäule, die am oberen Ende die genannte Mischung enhält, wird zunächst mit einer Mischung (300 ml) von n-Hexan und Ethylacetat (8 : 2 V/V) gewaschen und anschließend mit einer Lösungsmittelmischung bestehend aus n- Hexan und Ethylacetat (1 : 1, V/V) eluiert. Das resultierende Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um eine braun gefärbte ölige Substanz (0,2 g) zu erhalten, die die MI43-37F11- Substanz enthält.
- Diese ölige Substanz wird mit 2 g Silicagel vermischt, gefolgt von einer Trocknung unter verminderten Druck. Diese sich ergebende trockene Mischung wird an das obere Ende einer 20 ml- Säule an Silicagel gebracht, welches mit Hilfe von n-Hexan in die Säule gepackt wurde. Danach wird für die Säulenchromatographie die Silicagelsäule, die am oberen Ende die Mischung aufweist, zunächst mit 100 ml einer Mischung an n-Hexan/Ethylacetat (7 : 3, V/V) gewaschen und anschließend mit 100 ml einer Mischung von n-Hexan/Ethylacetat (6 : 4, V/V) eluiert. Das Eluat aus der Silicagel-Säule wird in 50 ml-Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen, die die MI43-37F11-Substanz enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, woraus sich 115 mg einer gelb gefärbten öligen Substanz ergeben.
- Dieses gelbe Ölprodukt wurde in einem geringen Volumen Acetonitril gelöst und die Lösung wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer Reversed phase-Säule (20 mm Durchmesser, 300 mm Höhe) mit Octadodecylsilanid beschichtetem Silicagel (kommerziell verfügbar unter dem Handelsnamen "Senshu Pack" ODS 3301N, ein Erzeugnis der Senshu Kagaku Co., Japan) unterworfen, die derart durchgeführt wird, daß das Eluieren mit einer Durchflußrate von 4 ml pro Minute mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 20 % Acetonitril bis 50 % Acetonitril in Wasser bewirkt wird. Das Eluat wird in 4 ml-Fraktionen gesammelt. Unter den gesammelten Fraktionen werden die aktiven Fraktionen, die die MI43-37F11-Substanz enthalten, vereinigt und im Vakuum konzentriert, wodurch 50 mg eines gelb gefärbten Pulvers erhalten werden, das die MI43-37F11-Substanz enthält.
- Diese gelbe pulverige Substanz wird erneut einer Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer Silicagelsäule (20 mm Durchmesser, 250 mm Höhe) an "YMC-Pack, A-043SIL" (ein im Handel erhältliches Produkt der Yamamura Kagaku Kenkyujo Co., Japan) unterworfen, und zwar mit einer Lösungsmittelmischung aus n- Hexan/Chloroform (1 : 9, V/V) als Eluent, und zwar derart, daß die Elution mit einer Durchflußrate von 4 ml pro Minute bewirkt wird; das Eluat wurde in 4 ml-Fraktionen gesammelt. Die aktiven Fraktionen, die die MI43-37F11-Substanz enthalten, wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei 20 mg einer leicht gelb gefärbten pulverigen Substanz erhalten werden, die die MI43-37F11-Substanz enthält. Diese pulverige Substanz wird in einem kleinen Volumen einer Mischung von Chloroform/Methanol (100 : 1, V/V) gelöst, und der sich ergebenden Lösung wird langsam n-Hexan hinzugefügt, wobei eine kristalline Substanz ausgefällt wurde. Das kristalline Produkt wurde durch Filtration gesammelt und getrocknet, wobei 10 mg eines kristallinen Produktes der MI43-37F11-Substanz erhalten wurde, die einen Schmelzpunkt von 148,5 - 149,5ºC aufweist.
- Dieses kristalline Produkt zeigt bei einer Silicageldünnschichtchromatographie auf einer Silicagelplatte (kommerziell verfügbar unter der Handelsbezeichnung "Art, 5715", ein Produkt der Merck Co., U.S.A.) nur einen einzigen Fleck, wenn es mit Chloroform- Methanol (15 : 1, V/V) entwickelt wird, wodurch sich zeigt, daß die MI43-37F11-Substanz in reiner Form erhalten worden ist.
Claims (13)
1. Verbindung mit der Formel [I]
2. Verfahren zur fermentativen Herstellung einer
Verbindung oder einer Substanz mit der Formel [I], wie in Anspruch
1 definiert, bei dem ein substanzproduzierender Stamm der Gattung
Streptoverticillium in einem Kulturmedium, das assimilierbare
Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält,
so lange kultiviert wird, bis eine beträchtliche Menge der
Substanz erzeugt und in der Kultur angesammelt ist, und
anschließend die Substanz aus der Kultur gewonnen wird.
3 Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der
substanzproduzierende Stamm der Stamm Streptoverticillium eurocidicum MI43-
37F11 ist, identifiziert als FERM BP-2783, die
Hinterlegungsnummer bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation
Research Institute".
4. Substanz mit der Formel [I], erhältlich durch das
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3.
5. Verbindung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist oder
Substanz, wie sie in Anspruch 4 definiert ist, zur Verwendung
als Antibiotikum.
6. Verbindung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist oder
Substanz, wie sie in Anspruch 4 definiert ist, zur Verwendung
als ein die in vivo Produktion von Interleukin-1 in Säugetieren
steigerndes Mittel.
7. Verbindung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist oder
Substanz, wie sie in Anspruch 4 definiert ist, zur Verwendung
als ein in vivo Aktivierungsagens für Makrophagen von
Säugetieren.
8. Verbindung oder Substanz, wie sie in Anspruch 1 oder
in Anspruch 4 definiert ist, zur Verwendung als Antikrebs- oder
krebsbekämpfendes Mittel.
9. Verbindung oder Substanz, wie sie in Anspruch 1 oder
in Anspruch 4 definiert ist, zur Verwendung als Antitumormittel.
10. Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung oder eine
Substanz nach Anspruch 1 oder Anspruch 4, zur Verwendung als
Arzneimittel.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die
Verbindung oder die Substanz, wie sie in Anspruch 1 oder in
Anspruch 4 definiert ist, als aktiven Bestandteil in Zusammenhang
mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für den aktiven
Bestandteil.
12. Mittel gegen Krebs oder krebsbekämpfendes Mittel,
enthaltend als aktiven Bestandteil eine Verbindung mit der Formel
13. Verwendung einer Verbindung oder einer Substanz nach
Anspruch 1 oder Anspruch 4 zur Herstellung eines Arzneimittels
zum Heilen von Krebs oder zum Behandeln von Tumoren.
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