DE3418023A1 - Antitumor-antibiotika, diese enthaltende pharmazeutische mittel, und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

POSTFACH 7·Ο. D-eooo MÜNCHEN 43 ZUGELASSENE VERTRETER BEIM

EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

TELEFON: (Ο·β) 2 71 SS 83 CABLES: PATMONDIAL MÜNCHEN TELEX: OB2IS2OS ISAR D TELEKOP: (OBB) 271 6O «3 (QR. Il + III) BAUSRSTRASSE 22, D-βΟΟΟ MÜNCHEN

München, 15. Mai 1984

UNSER^AKTE:

BETREFF! RE

BRISTOL-MYERS COMPANY

345 Park Avenue, New York 10154 U.S.A.

Antitumor-Antibiotika, diese enthaltende pharmazeutische Mittel,

und Verfahren zu deren Herstellung

M/25 082 *

Die Erfindung betrifft neue Antitumor-Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Antitumor-Antibiotika konnte noch nicht geklärt werden. Diese mit BBM-1675 bezeichneten Antibiotika sind neue Verbindungen mit bestimmten physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften.

Die europäische Patentanmeldung 95154A1 beschreibt die Fermentation von Actinomadura pulveraceus sp.nov.Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika, die mit WS 6049-A und VS 6049-B bezeichnet werden. Die Strukturen dieser WS 6049-Antibiotika konnte noch nicht geklärt werden, die charakterisierenden Eigenschaften dieser mit WS 6049-A und WS 6049-B bezeichneten Antibiotika deuten Jedoch darauf hin, daß ihre Struktur derjenigen der erfindungsgemäßen BBM-1675 Antibiotika ähnelt. Aufgrund von Spektraldaten steht jedoch fest, daß weder WS 6049A noch WS 6049B mit irgendeiner der erfindungsgemäßen BBM-1675-Verbindungen identisch ist. Außerdem unterscheidet sich der in der europäischen Patentanmeldung 95154A1 beschriebene, produzierende Organismus deutlich von dem erfindungsgemäß eingesetzten Stamm Actinomadura verrucosospora hinsichtlich der Farbe und des Luftmyzels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4, hinsichtlich seiner positiven Peptonisierung von Milch und der positiven Verwertung von D-Fructose, D-Mannit, Trehalose und Cellulose.

Erfindungsgemäß wird ein neuer Antitumor-Antibiotikum· Komplex bereitgestellt, der mit BBM-1675 bezeichnet wird. Diesen Komplex kann man erhalten, indem man einen BBM-1675 produzierenden Stamm von Actinomadura verrucosospora, am meisten bevorzugt Actinomadura verrucoaospora

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Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638), oder einen Mutanten davon in einem wäßrigen, assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine beträchtliche Menge dieses BBM-1675-Komplexes durch den genannten Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert worden ist. GewUnschtenfalls kann man den Komplex aus dem Kulturmedium gewinnen.

Erfindungsgemäß werden auch die beiden bioaktiven Hauptbestandteile des BBM-1675-Komplexes, die mit BBM-1675 A₁ und A₂ bezeichnet werden, und vier bioaktive Nebenbestandteile dieses Komplexes bereitgestellt, welche mit BBM-1675 A,, A^, B₁ und Bg bezeichnet werden. Die Bestandteile bzw. Komponenten können nach üblichen chromatographischen Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Der BBM-1675-Komplex und seine bioaktiven Bestandteile besitzen sowohl antimikrobielle als auch Antitumor-

20 Aktivität.

Von den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das IR-AbsorptionsSpektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₁ (KBr-Pille); Fig. 2 das IR-AbsorptionsSpektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₂ (KBr-Pille);

Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₃ (KBr-Pille);

Fig. 4 das IR-Absorptionsspektrum von BBM-1675 A₄ (KBr-Pille);

Fig. 5 das ''H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 6 das H-NMR-Spektrum von teilweise gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 7 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₃ in CDCl₃ (60 MHz);

M/25 082 ^

Fig. 8 das ¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A^ in CDCl₃ (60 MHz);

Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem BBM-1675 A. (KBr-Pille);

¹ Λ

Fig.10 das H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (360 MHz);

Fig. 11 das ¹ ^⁵C-NMR-Spek trum von gereinigtem BBM-1675 A₁ in CDCl₃ (90,3 MHz);

Fig.12 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem BBM-1675 A₀ (KBr-Pille);

Flg.13 das H-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (360 MHz); und

Fig.14 das ¹³C-NMR-Spektrum von gereinigtem BBM-1675 A₂ in CDCl₃ (90,3 MHz).
15

Die Erfindung betrifft einen neuen Antitumor-Antibiotikum-Komplex, der im folgenden als BBM-1675 bezeichnet wird, sowie dessen Herstellung durch Fermentation bestimmter Actinomadure. verrucosospora-Stämme, insbesondere durch Fermentation des Actinomadura verrucosospora Stamms H964-92 und eines Mutanten davon, der als Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y bezeichnet wird. Der obengenannte Urstamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die am Pto Esperanza, Misiones, Argentinien gesammelt worden war. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus ist bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, hinterlegt worden und wird dort unter der Bezeichnung ATCC 39334 aufbewahrt. Anschließend wurde der Mutantenstamm A1327Y aus dem Stamm H964-92 erhalten, indem letzterer einer üblichen Behandlung mit Nitrosoguanidin (NTG) unterworfen wurde. Der Mutantenstamm A1327Y wurde bei der American Type Culture Collection mit der Bezeichnung ATCC 39638 hinterlegt.

Wie bei vielen, Antibiotika produzierenden Kulturen, führt

Μ/25 082 H

die Fermentation des Actinomadura verrucosospora-Stamms H964-92 oder des Stamms A1327Y zur Produktion einer Mischung oder eines Komplexes von Bestandteilen. Zwei bioaktive Hauptbestandteile, BBM-1675 A₁ und Ag, und vier bioaktive Nebenbestandteile, BBM-1675 A,, A^, B₁ und B₂, wurden aus dem durch das Fermentationsverfahren hergestellten BBM-1675-Komplex isoliert.

BBM-1675 und seine Bestandteile BBM-1675 A₁, A₂, A,, A^, B₁ und B₂ besitzen gegenüber einem breiten Spektrum von Mikroorganismen, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien, antimikrobielle Aktivität. Der BBM-1675-Komplex und die davon abgetrennten, bioaktiven Bestandteile führen bei lysogenen Bakterien zur Bildung von Phagen. Zwei dieser Bestandteile, nämlich BBM-1675 A₁ und A₂, wurden in in vivo-Screening-Tests unter Verwendung verschiedener Mäusetumorsysteme untersucht. Sie besitzen inhibierende Wirkung gegenüber L-1210 Leukämie, P-388 Leukämie, Bi6-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom. Es wurde ferner festgestellt, daß BBM-1675 A, und A^ gegen P-388 Leukämie bei Mäusen wirksam sind. Der Komplex und seine bioaktiven Bestandteile können daher als antimikrobielle Agentien oder als Antitumor-Agentien zur Inhibierung von Tumoren bei Säugetieren

25 inklusive des Menschen eingesetzt werden.

Beschreibung des Mikroorganismus

Der Actinomycetes-Stamm Nr.H964-92 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und zur Charakterisierung nach Üblichen Verfahren als biologisch reine Kultur bereitgestellt. Der Stamm H964-92 bildet auf dem Luftmyzel kurze Sporenketten, die eine gerade, sich schlängelnde oder hakenförmige Form besitzen. Die Sporen sind sphärisch oder oval geformt und besitzen eine warzenähnliche Oberfläche.

Auf den meisten Medien bildet sich nur ein geringes Luft-

M/25 082 % .

ι myzel. Die Farbe der Masse an der Luft 1st weiß und bekommt später einen rosa Schatten. Auf einigen Agarmedien tritt eine weitere Farbänderung zum Bläulichen hin statt. Das Substratmyzel ist farblos oder blaßrosa. Die Wachsturnstemperatüren liegen zwischen 15 und 43⁰C. Die Zusammensetzung der Zellwand-Aminosäuren und die Zuckerbestandteile des gesamten Zellhydrolysats zeigen, daß der Stamm H964-92 zu dem Zellwand-Typ ΙΙΙ_β gehört. Das Menachinon wurde als MK-9(Hg)·ΜΚ-9(Η₈) identifiziert. 10

Aufgrund der wesentlichen morphologischen und physiologischen Eigenschaften sowie der Eigenschaften der Kultur und der chemischen Zusammensetzung der Zellwand kann der Stamm H964-92 als zum Genus Actinomadura gehörend klassifiziert werden.

Obwohl der ursprüngliche Stamm H964-92 nur sehr mäßig wuchs und ein kärgliches, löchriges Luftmyzel bildete, wurde durch Behandlung dieses H964-92-Stamms mit Nitrosoguanidin (NTG) eine Variante erhalten, die gute Wachstumseigenschaften besitzt und ein verbessertes Luftmyzel bildet. Diese Variante, die mit Stamm A1327Y bezeichnet wird, erleichterte die weitere taxonomische Untersuchung und wurde anschließend als Actinomadura

25 verrucosospora identifiziert.

Verfahren

Es wurden solche Medien und Kohlenhydrate verwendet sowie solche Verfahren zur Untersuchung der Eigenschaften der Kultur eingesetzt, die von dem International Streptomyces Project (Intl.J.Syst.Bacteriol., 1,6, 313-340, 1966) empfohlen wurden. Es wurden auch zusätzliche Medien eingesetzt, die von S.A.Waksman (The Actlnomycetes, Band 2) und G.M.Luedemann (Intl.J.Syst.Bacteriol, 2I₁, 240-247»

1971) beschrieben wurden. Die Aminosäurezusammensetzung

M/25 082 %

der Zellwand und die Zuckerbestandteile des Gesamtzellhydrolysats wurden gemäß den von Becker et al. in Appl. Microbiol. J£, 236-243, 1965, und von Lechevalier und Lechevalier in The Actinomycetes, Herausg.H.Prauser, Jena, Gustav Fischer Verlag, Seiten 393-405, 1970, beschriebenen Verfahren analysiert. Das Menachinon wurde massenspektrometrisch nach den Verfahren von Collins et al. in J.Gen.Microbiol. 100, 221-230, 1977, identifiziert. Die Menachinon-Zusammensetzung wurde beschrieben auf Basis des von Yamada et al. in J.Gen.Appl.Microbiol. 331-335, 1977, beschriebenen Systems.

Morphologie

Der Stamm H964-92 bildet sowohl Substrat- als auch Luftmyzele. Das Substratmyzel ist lang, verzweigt und nicht in kurze Filamente fragmentiert. In dem Luftmyzel bilden sich kurze Sporenketten monopodial oder an der Hyphenspitze. Wirbelähnliche Verzweigungen der Sporenkette werden auch in der Nähe der Hyphenspitze beobachtet. Diese Sporenketten enthalten 2 bis 10 Sporen in einer Kette und sind gerade, gekrümmt oder hakenartig geformt. Die Sporen besitzen eine warzenähnliche Oberfläche und eine sphärische bis elliptische (0,5-0,6 χ 0,6-1,4/um) Form mit runden oder spitzen Enden. Nach dem Reifen wird jede Spore oft mit leerer Hülle abgetrennt. Motile Sporen, Sporangia oder skierotische Körnchen werden in keinem der untersuchten Medien beobachtet.

Kulturelle und physiologische Charakterlstika Der Stamm H964-92 wächst sowohl in chemisch definierten Medien als auch in natürlichen, organischen Medien nur schlecht bis mäßig. Im allgemeinen bildet sich nur ein schwaches Luftmyzel. In einem Hafermehl-Agar (ISP Nr. 3 Medium), anorganischen Salzen-Stärke-Agar (ISP Nr. 4 Medium) und Bennett's-Agar bildet sich jedoch ein mäßiges

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Luftmyzel. Spontane Varianten ohne Luftmyzel bilden sich bei einer hohen Frequenz. Die Farbe des Luftmyzels ist weiß. Sie wird später in Hafermehl-Agar, anorganischen Salzen-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr.5 Medium) blaßrosa. Die Farbe der Luftmasse verändert sich weiterhin nach langer Inkubation (5 Monate) in Hafermehl-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar und Tyrosin-Agar zum Bläulichen hin. Das Substratmyzel ist in Czapek¹s Agar, Tyrosin-Agar, Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Nr. 2 Medium), Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6 Medium) Bennett's Agar farblos oder gelblich gefärbt. In Glucose-Asparagin-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar ist die Farbe rosa. Melanoide und andere diffusionsfähige Pigmente werden nicht gebildet. Die aus dem ursprünglichen Stamm erhaltene Variante Nr. A1327Y bildet vorwiegend ein blaßblaues Luftmyzel und trägt eine üppige Luftsporenmasse .

Der Stamm H964-92 wächst bei 15⁰C, 28⁰C, 37⁰C und 43°C, nicht jedoch bei 10⁰C oder bei 47⁰C. Er ist empfindlich gegenüber NaCl (790, jedoch gegenüber Lysozym in einer Konzentration von 0,0196 resistent.

Die kulturellen und physiologischen Charakteristik des produzierenden Stamms sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Die Verwertung der Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.

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# AS Tabelle

Charakteristik^ der Kultur des Stamms H964-92 (ursprünglicher Stamm ATCC 39334 und Variante A1327Y)

Stamm Nr. H964-92

ursprüngl. Stamm(ATCC 59334)

Variante Nr.A1327Y Actinomadura verrucosospora KCC A-0147

Trypton- G: üppig,flockig, mäßig,flok-Hefe-Extrakt sedimentiert kig,sedi-Agar und nicht

(ISP Nr. l) pigmentiert

mentiert u. pigment,

Saccharose-G: mäßig Nitrat-Agar R:farblos (Czapek¹S A:kärglich; Agar;

schlecht farblos

«.cu. c-i-a.oü, kein oder

hellgraut264) kärglich;

bis blaßrosa

(7) Dtkein g; rosa-weiß (9)
kein

mäßig,flockig, sedimentiert u.nicht pigmentiert

schlecht farblos

kein oder kärglich: fahlblau (185)

kein

Glueose-

Asparagin-

Agar

G:mäßig schwach schwach R:weiß(263)bis farblos farblos

tiefgelblich-

rosa(27)
A:kein oder sehr kein oder kein oder sehr

kärglich;blaß- sehr kärgl.;kärgl.; weiß

rosa(7) weiß
D:kein kein kein

Glycerin-Asparagin-
Agar(lSP
Nr.5)

G:schwach bis mäßig

R:farblos bis hellgelblichrosa(28)

A: schwach;hellgelblich-rosa (28),nach Monaten hellbläulich-grau (190)

D:kein

anorganische Güppig Salze-Stärke-R: gelblich-

Agar(ISP Nr. 4)

weiß (92)

A:üppigihellrosa(4)bis rosa-grau (10) *

D:kein mäßig

hellgelblich-rosa (28)

mäßig;weiß bis hellrosa(4)

kein

mäßig
hellgelblich-rosa (28)

mäßig; hellbläulichgrau (190) kein

mäßig

hellgelblichrosa(28)bis tiefgelblich-rosa(27) mäßig;weiß bis stark rosa(2)

kein

mäßig

hellgelblich-

rosa(28)

üppig; fahlblau (185)

kein

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Tabelle 1 (Forts.)

Tyrosin- G:mäßig
Agar(ISP R:gelblich-Nr.7) weiß(92)

A:schwach;hell-

gelblich-

^b rosa(28),sehr

viel später (5 Monate) teilweise hellbläulichgrau(i90)

D:kein

Nähragar G:schwach bis

mäßig
R:blaßgelb(89)

A:kein
D:kein

Hefeextrakt- G: üppi g
Malzextrakt- R:blaßgelb(89) Agar(ISP
Nr. 2)

A:schwach; weiß(263)

Hafermehl-Agar
(ISP
Nr.3)

Bennett·s
Agar

D:kein

G:mäßig

R:farblos bis

blaßrosa(7) A:schwach;rosa-

weiß(9) bis

hellbläulich-

grau(i90) D:kein

G:üppig
R:gräulichgelb (90)

A;mäßig;weiß (263) bis gelblich weiß (92)

D:kein

mäßig mäßig

stark gelb- stark gelblich

lich-rosa(26) rosa(26) mäßig;weiß mäßig; weiß bis

bis hell- hellrosa (4)

rosa(4)

kein
schwach

kein schwach

farblos bis farblos bis blaßrosa(7) blaßrosa(7) kein kein kein kein

üppig stark gelb· lich-rosa (26)

schwach; weiß bis blaßrosa (7)

kein

schwach blaßgelbl.

rosa(31) sehr kärgl.

intensiv fahlblau (184)

kein

üppig

stark gelblich-

roaa(26)

schwach;weiß bis blaßrosa(7)

kein

schwach blaßgelblichroea(31) ;sehr kärglich; intensiv fahlblau(i84)

kein

üppig stark gelb lich-rosa (26)

mäßig;blaß- kein gelbl.-rosa (31 )und bläulichweiß (189) kein kein

üppig

stark gelblich·

rosa(2b)

	(Forts.)	mäßig farblos kein kein	<k · A *	* <» M * * Ή * t, ^ « * * α	• -A " ™ * ·» ·
M/25 082 Tabelle 1	G: R: At D:		U	- * 3418023
Pepton- Hefeex- trakt-Ei- sen-Agar (ISP Nr.6)	üppig farblos kein kein	üppig farblos kein kein

+ Beobachtet nach 3wöchlger Inkubation bei 37°C.

++ Abkürzungen; G = Wachstum (Growth); R = ümkehrfarbe (Reverse color); A = Luftmyzel (Aerial mycelium); D m diffusionsfähiges Pigment (Diffusible pigment).

+++ Die Farbe und die Zahl in Klammern folgen dem Farbstandard "Kelly, K.K.& D.B.Judd; ISCC-NBS color-name Charts illustrated with Centroid Colors. U.S.Dept. of Comm.Cir. 553, Washington, D.C, November 1975.

Tabelle 2 Physiologische Charakter!stika des Stamms H964-92

Test

Ansprechen Verfahren und Medium

Temperaturbereich des Wachstums

maximales Wachstum bei 28-37⁰C ,»mäßiges b.20 und 43⁰C und kein Wachstum bei 10 und 47⁰C

Gelatineverflüs- verflüssigt sigung

Stärkehydrolyse

Reaktionen in
Magermilch

Bildung von

melanoiden

Pigmenten

hydrolysiert

nicht-koaguliert und völlig pep to· nisiert

nicht-produziert

Nitratreduktion nicht-reduziert

Resistenz gegenüber NaCl

Wachstum bei5% od.weniger,keines bei 7%

Bennett's Agar

Glucose-Pepton-Gelatine-Medium

Stärke-Agarplatte Difco Magermilch

Tyrosin-Agar, Pepton-Hefe-Eisen-Agar und Trypton-Hefeextrakt-Brühe

Czapek's Glucose-Nitrat-Brühe und Glucose-Hefeextrakt-Nitrat-Brühe

Trypton-Hefeextrakt-Agar

M/25 082 V[ Ό.1

Tabelle 2 (Forts.)

Lysozym resistent;Wachstum bei Trypton-Hefeextrakt-0,019ο oder weniger, Agar keines bei 0,1%

pH Wachstum bei 5,0 bis Trypton-Hefeextrakt-5 9,5, keines bei 4,5 Agar

und 10,0

Tabelle 5 Verwertung von Kohlenstoffquellen

Stamm Nr.H964-92 Actlnomadura

, _n ursprüngl. Variante Nr. verrucosospora ¹⁰ Stamm A1327Y KCC A-0147

Glycerin + + +

D(-)-Arabinose - -

L(+)-Arabinose + + +

D-XyIose + + +

D-Ribose +

L-Rhamnose + + +

D-Glucose + + +

D-Galactose -

D-Pructose + + +

D-Mannose - - -

L(-)-Sorbose -

Saccharose + + +

Lactose -

Cellobiose + + +

Melibiose - -

Trehalose + + +

Raffinose -

D(+)-Melezitose -

lösl.Stärke + + +

Cellulose + + +

Dulcit - -

Inosit +

D-Mannit + + +

D-Sorbit Salicin

Beobachtet nach 3wöchiger Inkubation bei 28°C Basalmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium

M/25 082 V2. 23

l Zellwandzusammensetzung und Zuckerbestandteile der Gesamtzelle

Gereinigte Zellwand des Stammes H964-92 enthält Mesodiaminopimelinsäure, jedoch kein Glycin. Das Hydrolysat der gesamten Zelle zeigt die Gegenwart von Madurose (3-0-Methyl-D-galactose), Glucose und Ribose.Aufgrund der Aminosäure in der Zellwand und der Zuckerbestandteile der gesamten Zelle gehört der Stamm H964-92 zu dem Zellwand-Typ IHq· Zwei Hauptbestandteile von Menachinon wurden als MK-9(H₆) und MK-9(H₈) identifiziert.

Taxonomische Stellung des Stamms H964-92

Der Stamm H964-92 besitzt die folgenden Hauptcharakteristika: (1) Luftsporenketten: kurze, gerade, gekrümmte oder hakenartige Form. (2) Sporen: warzenartige Oberfläche. (3) Luftmyzel: rosa oder bläulich gefärbt. (4) Substratmyzel: in einigen Medien rosa. (5) Diffusionsfähiges Pigment: keines. (6) Mesophil. (7) Zellwand-Typ IHg. (8) Menachinon-System: MK-9(H_g) und MK-9(H_Q).

Diese Hauptcharakteristika zeigen an, daß der Stamm H964-92 zu dem Genus Actinomadura gehört. Frühe Species des Genus Actinomadura wurden von Säugetieren isoliert. Einige Stämme wurden auch aus Pflanzenmaterialien erhalten. Jedodi wurden viele der kürzlich vorgeschlagenen, neuen Species aus Bodenproben isoliert. Gemäß der zahlenmäßig bewerteten Taxonomie und nach dem Übersichtsartikel von Goodfellow et al. in J.Gen.Microbiol.112. 95-111 (1979), über Actinomadura und ähnliche Actinomycetes gehören die meisten der aus Bodenproben stammenden Actinomadura-Species zu dem Cluster Nr. 7 von den beschriebenen vierzehn Clustern. Der Stamm H964-92 ähnelt am meisten den Species des Clusters 7. Nonomura und Ohara berichten in J.Ferment.Technol. 4£, 904-912 (1971), über fünf saprophytische Species des Genus Actinomadura,und

M/25 082 15 ^

Nonomura [J.Ferment.Technol. £2, 71-77 (1974)] und Preobrazhenskaya et al. [Actinomycetes and Related Organisms 1£, 30-38 (1977)] veröffentlichten die Schlüssel zur Identifizierung und Klassifizierung der Actinomadura-Species. Nach Vergleich mit den Beschreibungen von 30 Species, wozu auch solche Organismen gehören« die in Patenten offenbart sind, scheint der Stamm H964-92 dem in der obigen Literaturstelle von Preobrazhenskaya et al. beschriebenen Actinomadura coerulea und dem in den obigen Druckschriften von Nonomura beschriebenen Actinomadura verrucosospora sehr ähnlich zu sein.

Der Stamm Nr.H964-92 wurde direkt mit dem A.verrucosospora-Stamm KCC A-0147 verglichen. Es wurde gefunden, daß er hinsichtlich der morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristik mit A. verrucosospora eng verwandt 1st. Der Stamm H964-92 wird somit als neuer Stamm von Actinomadura verrucosospora klassifiziert.

Obwohl die Herstellung des erfindungsgemäßen BBM-1675-Komplexes ausführlich unter Bezug auf den bestimmten Stamm Actinomadura verrucosospora-Stamm H964-92 (ATCC 39334) und den mit Stamm A1327Y (ATCC 39638) bezeichneten Mutantenstamm davon beschrieben ist, ist die Herstellung von BBM-1675 nicht auf diese Mikroorganismen oder die Mikroorganismen beschränkt, deren kulturelle Charakteristika in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind. Erfindungsgemäß wird sowohl der Stamm H964-92 als auch alle natürlichen oder künstlichen,BBM-1675 produ-

30 zierenden Varianten und Mutanten davon umfaßt.

Antibiotika-Produktion

Die erfindungsgemäßen BBM-1675-Antibiotika können hergestellt werden, indem man einen BBM-1675 produzierenden Stamm von Actinomadura verrucosospora, vorzugsweise einen

M/25 082 ΛΜ 25

ι Stamm von Actinomadura verrucosospora mit den identifizierenden Charakteristika von ATCC 39334 oder ATCC 39638, oder eines Mutanten davon in einem üblichen, wäßrigen Nährmedium kultiviert. Der Organismus wächst in einem Nährmedium, das bekannte Nährquellen, d.h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls anorganische Salze und andere bekannte Wachstumsfaktoren, für Actinomycetes enthält. Vorzugsweise arbeitet man bei submersen, aeroben Bedingungen, um große Mengen des Antibiotikums herzustellen. Für die Herstellung von kleineren Mengen können auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Die für andere Actinomycetes eingesetzten, allgemeinen Verfahren können auch erfindungsgemäß angewendet werden.

Das Nährmedium sollte eine geeignete, assimilierbare Kohlenstoff quelle enthalten, z.B. Glycerin, L(+)-Arabinose, D-Xylose, D-Ribose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Cellobiose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Inosit, Als Stickstoffquellen kann man Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und dergl. entweder allein oder zusammen mit organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl und dergl.,einsetzen. Gewünsentenfalls kann man auch anorganische Nährsalze zugeben, um Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergl. bereitzustellen.

Die Herstellung der BBM-1675 Antibiotika kann man bei jeder Temperatur durchführen, bei der der produzierende Organismus ein befriedigendes Wachstum zeigt, z. B. bei 15 bis 45⁰C. Gewöhnlich arbeitet man bei einer Temperatür von etwa 27 bis 32⁰C. Im allgemeinen erhält man eine

M/25 082 ^- 9b

optimale Produktion nach einer Inkubation von etwa 68 bis 180 Stunden, in Abhängigkeit davon, ob die Fermentation mit Schüttelflaschen, Rührgefäßen oder mit Tanks durchgeführt wird. Bei der Tankfermentation ist es wUnschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Kulturbrühe mit einer Schrägkultur oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur des produzierendes Organismus animpft. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum erhalten hat, überführt man es aseptisch in das Medium des Fermentationstanks. Die Antibiotikaproduktion kann mit Hilfe des Papierscheibtn-Agar-Diffusionsassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Testorganismus überwacht werden.

15 Isolierung und Reinigung

Nachdem die Fermentation vollständig ist, kann man den BBM-1675-Komplex aus der Brühe nach üblichen Isolationsverfahren, z.B. Lösungsmittel-Extraktion, erhalten. So kann man z. B. die gesamte Brühe durch Filtrieren oder Zentrifugieren in den Myzelkuchen und die überstehende Brühe auftrennen. Die Antibiotika in dem Myzelkuchen kann man gewinnen, indem man den Kuchen in Methanol suspendiert, unlösliche Materialien abfiltriert und den methanolischen Extrakt konzentriert. Aktive Bestandteile in der überstehenden Brühe kann man durch Extraktion mit n-Butanol gewinnen. Die obigen n-Butanol- und Methanol-Extrakte vereinigt man dann und verdampft azeotrop bis zu einer wäßrigen Lösung, worauf sich die meisten der Antibiotika als öliger Feststoff absetzen. Diesen Feststoff kann man dann in Methanol lösen und die Lösung filtrieren. Das Filtrat konzentriert man und gibt es zu einer Ethylacetat-Wasser-Mlschung. Der erhaltene, organische Extrakt enthält den rohen BBM-1675-Komplex, den man aus der Lösung durch Zugabe eines "Anti-Lösungsmit-

35 tels", wie η-Hexan, ausfällt.

Der rohe BBM-1675-Komplex ist eine Mischung verschiedener Bestandteile. Dazu zählen zwei bioaktive Hauptkomponenten, wie BBM-1675 A₁ und A₂, und vier bioaktive Nebenbestandteile, BBM-1675 A^, A^, B₁ und B₂. Diese bioaktiven Bestandteile können nach üblichen chromatographischen Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Bei einem dieser Verfahren löst man den rohen BBM-1675-Komplex zuerst in Methanol und reinigt dann unter Verwendung einer Sephadex LH-20-Chromatographiesäule, wobei man Methanol als Eluierungsmittel verwendet. Diesen teilweise gereinigten Komplex kann man dann über eine Silikagelsäule ehromatographieren und stufenweise unter Verwendung von Chloroform und einer zunehmenden Konzentration an Methanol eluieren, wobei man BBM-1675 A₁, eine Mischung von BBM-1675 A₂, A* und A^ und eine Mischung von BBM-1675 B₁ und B₂ erhält. Den Bestandteil A₁ kann man weiter chromatographisch unter Verwendung einer Sephadex IH-20-Säule reinigen, wobei man Methanol als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung von A₂, k-x und A^ kann man chroma to graphisch auf einer Bondapak C₁₈-Säule (Waters Associates, Inc.) auftrennen, wobei man zunehmende Konzentrationen von wäßrigem Acetonitril als Eluierungsmittel einsetzt. Die Mischung der Bestandteile B₁ und B₂ kann man auf einer Silikagelsäule chromatographisch trennen, wobei man eine Mischung von Chloroform und Methanol als Eluierungsmittel einsetzt. Weitere Einzelheiten der bevorzugten, chromatographischen Trennverfahren sind in den folgenden Beispielen beschrieben.

Phvslko-chemische Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile Die sechs bioaktiven Bestandteile des BBM-1675-Komplexes können voneinander mit Hilfe zweier Dünnschichtchromatographie -Sy sterne unterschieden werden, wie dies in der folgenden Tabelle gezeigt ist.

	1	«· W · « WU * ·	Rf-Werte	»» "· to I^ <· «
	^"	SiO2	" "" : 3418023
M/25 082		CHC1,-CH,OH(5:1,V/V)
Tabelle 4
Düimschichtchromatographie (TLC) der	0,74	BBM-1675-Bestandteile
	0,71
	0,72
5 Bestandteil	0,71	mit Silan behan-
	0,63	CH3CN-Hd81f75:25,V/V)
BBM-1675 A1	0,60	0,18
BBM-1675 A2	0,21
BBM-1675 A3	0,28
3 BBM-1675 A4	0,78
BBM-1675 B1	0,23
BBM-1675 B2	0,16

C₁Q-Umkehrphasensilikagel

Die Trennung von BBM-1675 A₂, A^ und A^ unter Verwendung von TLC-Systemen mit einer gewöhnlichen Phase ist schwierig, konnte jedoch mit einer Umkehrphasen-TLC erzielt werden.

Die einzelnen BBM-1675-Bestandteile zeigen eine ähnliche Löslichkeit und ähnliche Farbreaktionen. So sind sie z.B. in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich. Sie ergeben mit Eisen(III)-chlorid, Ehrlich- und Tollen¹ s-Reagens eine positive Reaktion, im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test jedoch eine negative Reaktion.

Die charakteristischen, physiko-chemischen Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile sind in der nachfolgenden Tabelle 5 aufgeführt.

Tabelle 5 Phvsiko-chemische Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile

Fp.(Zers.)i°C
7

CHCl₃), °
Anal.gef.00

(durch Diff.)

H
N
0

in CH,OH
⁰

in 0,01N HCl-CH-OH
⁵

in 0,01N NaOH-CH,OH

Molekulargewicht
(ungefähre Werte)
(GeI-HPLC,Finepak
GEL-101)

BBM-1675 A

156-158

-191

51,52 5,81 4,02

38,65

253(325 282(195 320(143

253(323 282(192 320(144

252(325 283(172 318(136

1300

147-149 125-127 123-126 159-161

-179,4 -161

53,31

6,31

3,82

36,06

253(281
282(172
320(128

253(276
282(167
320(128

252(289
283(171
318(122

55,00
6,52
3,57

34,91

253(286
282(158
320(122

253(287
282(160
320(126)

252(280
283(162
318(120

1100

-176

53,67 6,35 3,45

36,53

253(257 282(153 320(117

253(258 282(155 320(118

252(266 283(160 318(118

1400

-171

253(225 282(14O 320(104

253(225 282(140 320(105

252(236 282(141 318(105

156-159 -122

248(212 2791141 318(103

248(210]

279(140

318(103*

248(233]

278(150

318(110]

ο 8

CX) CD NJ CO

M/25 082

Die UV-Absorptionsmaxima der BBM-1675 Bestandteile wurden bei 253, 282 und 320 nm beobachtet. Eine Verschiebung nach Zugabe einer sauren oder alkalischen Lösung konnte nicht beobachtet werden. Die IR- und PNMR-Spektren von BBM-1675 A₁, A₂, A, und A^ sind in den Fig. 1 bis 4 bzw. Fig. 5 bis 8 gezeigt. Das 360 MHz-¹H-NMR-Spektrum von BBM-1675 A₁ zeigt eine Acetylgruppe (J":2,11 ppm), eine N-CH^-Gruppe (2,52 ppm), vier OCH^-Gruppen (3,42, 3,80, 3,88 und 3,98 ppm) und eine Exomethylengruppe (4,57 und 5,48 ppm) neben zwei aromatischen Protonen (7,50 und 8,59 ppm) und einem NH-Proton (11,79 ppm). Das CNMR-Spektrum von BBM-1675 A₁ zeigt 55 Kohlenstoffsignale. Dazu zählt auch ein Signal dreifacher Intensität (S : 56,0 ppm, OCEj). Basierend auf den Protonen-und ¹^C-NMR-Spektren, der Mikroanalyse und der Bestimmung des Molekulargewichts durch HPLC und SIMS (secondary ion mass spectrometry) wurde die Molekülformel von BBM-1675

A₁ mit C₅₇H₇₂N₄O₃₂ abgeleitet. 20 Strukturuntersuchungen mit BBM-1675 A₁

Nach Behandlung mit 0,5N HCl-CHUOH bei Raumtemperatur verliert BBM-1675 A₁ seine Bioaktivität und ergibt neben verschiedenen, nichtidentifizierten Fragmenten eine lipophile, chromophore Substanz (Verbindung I). Das UV-Absorptionsspektrum der Verbindung I ähnelt demjenigen der Stammverbindung. Dies deutet darauf hin, daß die Verbindung I die chroraophore Struktur von BBM-1675 A₁ behält. Zwei weitere, chromophore Fragmente, die der Verbindung I ähneln, erhält man durch alkalische Hydrolyse von BBM-1675 A₁: Hydrolyse mit 0,05N KOH-CH₃OH bei 55⁰C während 1 h ergibt die Verbindung II mit UV-Absorptionsmaxima bei 252, 284, 297 (Schulter) und 322 nm, während die Umsetzung in 1N KOH-CH3OH zu einer sauren, chromophoren Substanz führt, die als Verbindung III bezeichnet ist.

M/25 082

20

5418023

Die physiko-chemischen Eigenschaften der Verbindungen I, II und III sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6 Eigenschaften der Verbindungen I. II und III

Fp., ⁰C

CHCl₃), °

10 Molekularformel

Verbindung I 82-83

-100

Verbindung II Verbindung III

133

C₁₄H₁₇NO₆

nm( t )

15 MS m/z

252(26 600 283(11 200

244(21 850)

276(9 400)

318(6 300) 297(Sch 8 800

322(11 700

457 (M⁺) 425 341 281

264

TLC(XyIoI-MEK⁺- CH,0H=5:1:1,

⁵ V/V), Rf 0,58

⁺MEK = Methylethylketon

295(M⁺) 280 263 251 248

0,66

253-255

248(16 900; 295(14 400 310(13 500]

281 (M⁺)

263

236

222

218

0,13

Strukturinformationen hinsichtlich der Verbindungen II und III konnten aus den nachfolgenden Spektraldaten und den chemischen Transformationen gewonnen werden. Das

^C- und H-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von vier OCH₃-Gruppen, einer =CH₂-Gruppe, sieben -C= -Gruppen, zwei ^C=O-Gruppen und einer J^NH-Gruppe in der Verbindung II. Das NMR-Spektrum der Verbindung III ähnelt dem-Jenigen der Verbindung II, unterscheidet sich jedoch nur dadurch, daß eine der vier bei der Verbindung II beobachteten OCH₃-Gruppen nicht vorhanden ist. Aufgrund dieses Unterschiedes und der sauren Natur der Verbindung III wird angenommen, daß die Verbindung II ein Methylester der Verbindung III ist. Kocht man die Verbindung

M/25 082 2T

II mit 1N methanolischer KOH am Rückfluß, dann wird sie quantitativ in die Verbindung III überführt, während die Verbindung III durch Behandlung mit Diazomethan in die Verbindung II überführt wird. Die Behandlung der Verbindung II mit NaBH^ in C₂H₅OH ergibt ein Reduktionsprodukt (Verbindung IV, M⁺: m/z 267), bei dem im NMR-Spektrum anstelle der -COOCH,-Gruppe der Verbindung II eine -CHgOH-Gruppe vorhanden war. Nach Hydrierung mit Palladium-auf-Kohle ergibt die Verbindung II ein Dihydroderivat (Verbindung V, M⁺: m/z 297). Das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung V zeigt ein neues Methylsignal (Dublett). Das Signal für die in der Verbindung II vorhandene Exomethylengruppe fehlt Jedoch. Außerdem erscheint bei der Verbindung V eines der Signale für die OCHj-Gruppen bei höherem Feld (J: 3,50 ppm). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß eine -CsCH₂-GrUPPe in

OCH₃

der Verbindung II vorliegt, die durch Hydrierung zu einer -CH-CH,-Gruppe in Verbindung V reduziert wird. Die Ver-

20 OCH₃

bindung II wurde mit 1,5N methanolischem Chlorwasserstoff 3 h bei 80⁰C erwärmt. Das Hydrolysat wurde über eine Silikagelsäule chromatographiert. Man erhält eine schwachbasische Verbindung (Verbindung VI, M⁺: m/z 211).

Das IR-Spektrum und die physiko-chemischen Eigenschaften zeigen, daß in der Verbindung VI eine NH₂-Gruppe vorhanden ist. Die Verbindung VI wurde durch Vergleich der IR- und NMR-Untersuchungen mit einer authentischen Probe als Methyl-4,5-dimethoxy-anthranilat identifiziert. Polglich

30 besitzen die Verbindungen II bis VI die nachstehend angegebenen Strukturen.

M/25 082

Strukturen der Verbindungen II. III. IV« V und VI Verbindung II Verbindung jfcll

CH.

CH.

H-CO-C

COOCH.

CH

^s0CH.

H-CO-C

0OH

CH

"OCH.

Verbindung IV

CH.

OCH.

H⁺/Me0H

Verbindung,, VI₁

NH

OOCH

Nach Behandlung mit 0,05N KOH-CH₃OH bei 55⁰C wurde die Verbindung I in ein neues, chromophores Fragment (Verbindung VII, C₁CrH₂₁NO₇, M⁺: m/z 327) und einen Zucker (Verbindung VIII) gespalten. Das NMR-Spektrum von VII zeigt ein C-CH,-Singulett und zwei OCH,-Gruppen bei hohem Feld sowie drei OCH,-Gruppen bei niedrigem Feld und zwei aromatische Protonen, die gewöhnlich bei den Verbindungen II, V und VI beobachtet werden. Die weitere Hydrolyse von VII mit 1,5N methanolischem Chlorwasser-

.₅4·^:··"" "»'-· "--· 54 1 8023

Μ/25 082 25

stoff ergibt die Verbindung VI, die mit der zuvor aus II erhaltenen identisch ist. Nach Entfernen von VI wurde das Hydrolysat mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin behandelt, wobei ein gelber Feststoff ausfiel, der als 2,4-Dinitrophenylhydrazon von Brenztraubensäure identifiziert wurde. Bei der Verbindung VII handelt es sich somit um Methyl-4,5-dimethoxy-N-(2·,2^f-dimethoxypropionyl)-anthranilat. Mit der Verbindung VIII konnte kein MoIekülionenpeak erhalten werden. Der M-OCH,-Peak im Massenspektrum erschien bei m/z 131. Dies ist in Übereinstimmung mit der Molekülformel C^H₁^O^. Das NMR-Spektrum zeigt eine 2,6-Didesoxyhexopyranose-Struktur für die Verbindung VIII. Diese Zuordnung wird durch das ¹^C-NMR-Spektrum der Verbindung I unterstützt, die zu einem C-CH,-Signal, einem -CH₂-SIgDaI, drei O-CH<^ -Signalen und einem anomeren Kohlenstoffatom sowie 15 Kohlenstoff-Signalen führt, wobei letztere der Verbindung VII zugeordnet werden können. Das Proton an C, beim Zucker erschien bei niedrigem Feld (S : 5,39 ppm, Oktett). Die C^-OH-Gruppe des Zuckers war somit mit der Carboxylgruppe von VII verestert. Die obigen Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden:

Strukturen der Verbindungen I. VII und VIII

²⁵ Verbindung I

OCH.

M/25 082

Verbindung VII

CH.

OCH₃ -CO-C-CH

f<

OCH,

CH

OCH,

3^W ^s/ w«ww«₃

Verbindung VIII

0H

CH.

Verbindung VI

CH,O

COOCH.

ι—CH₃-CO-COOH

Das Molekulargewicht der Verbindung I (457) macht in etwa ein Drittel des gesamten Moleküls von BBM-1675 A₁ aus (vorgeschlagene Formel ^C57^H72^N4°32* "berechnetes Molekulargewicht J= 1324). Es wird angenommen, daß BBM-1675 A_n folgende Teilstruktur besitzt:

CH₃O

Anhand von späteren Studien wurde festgestellt, daß die oben beschriebenen und nach dem folgenden Beispiel 2 erhaltenen Bestandteile BBM-1675 A₁ und A₂ nicht völlig rein waren und daß bestimmte der charakterisierenden Eigenschaften, die zur Definition dieser Komponenten verwendet worden waren, inkorrekt waren. Nach weiteren chromatographischen Reinigungen, die unten in den Beispielen 3 und 6 beschrieben sind, wurden die Bestandteile BBM-

W*

M/25 082

1675 A₁ und A₂ in reinerer Form isoliert. Ebenso wurden die Daten für die Elementaranalyse der Bestandteile A* und A^ revidiert, denn diese Verbindungen enthalten Schwefel. Außerdem wurden die HPLC-Retentionszeiten für diese

5 beiden Bestandteile berechnet. Nachstehend sind die

richtiggestellten, physiko-chemischen Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile zusammengefaßt.

BBM-1675 A₁

10 —— Aussehen: weiße bis blaßgelbe Kristalle;

Fp.156 bis 158° (Zers.) Elementaranalyse:

Analyse 1 (%)	51;	,60	Analyse 2	52,74	Varian	UV, Cary	(?v	Durchschnitt (90
C	6,	,31	C	5,99	nol; Konzentration: 0,		C 52,17
H		,31	H	3,94	\ax(nm)		H 6,15
N	8;	,47	N	9,71			N 4,63
S	28,	,31	S	27,62			S 9,09
O	0	=s jeweils	0	durch Differenz			0 27,96
	UV-Absorptionsspektrum:
	320
	280	219;	Lösungsmittel: Metha-
	253	01356	g/l
	210	Absorptionsvermögen
		12,
Gerät:
Sch (Schulter)
25,
25,
,1
,5

Nach Zugabe einer Base oder einer Säure trat keine signi-

30 fikante Änderung ein.

Die optische Drehung mit CHCl^ als Lösungsmittel betrug [a]?^ = -207° (c-0,0351). Bei einer zweiten Analyse wurde die folgende optische Drehung gemessen: [a]_D' « 191 (c=0,5, CHCl₃).

M/25 082 26

IR-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 9 Die Hauptabsorptionsbanden (KBr) liegen bei:

985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608,

1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440, cm"¹

Massenspektrum: Gerät: VG-ZAB-2F; FAB-MS-Thioglycerin; Massenzahl (m/z): 1249, 1357, 1463; Nach Zugabe von NaCl

(m/z)ι 1271, 1379, 1485, 1597. FAB-MS-MB (MB:Matrix, Mol. 10 Gew.154)j Massenzahl (m/z): 1249, 1283, 1403, 1555; nach Zugabe von NaCl (m/z): 1249, 1271, 1303, 1425, 1483,1577.

FAB-MS-Glycerin-DMSO: Massenzahl (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325, 1353} nach Zugabe von NaCl (m/z): 1215, 1237,

1247, 1269, 1325, 1347, 1375.
15 Gerät: Kratos MS-50; FAB-MS-Thioglycerin; Massenzahl

(m/2): 1357, 1463.

Molekulargewicht (MG), scheinbares MG = 1248 berechnet anhand der obigen
massenspektroskopischen Daten

20 NMR-Spektren; Gerät: WM36O Brucker; Lösungsmittel:CDCl^;

¹NMR: 360 MHz~6(ppm): 11.75 (IH, s); 8.55 (IH, s); 7.45 (IH, s); 6.61 (IH, m); 6.23 (IH, brs); 6.17 (IH, brs); 5.93 (IH, d, J-9.3); 5.82 (IH, d, J-9.3); 5.7 (IH, brs); 5.49 (IH, m); 5.45 (IH, d, J=2.3); 5.38 (IH, brs); 4.95 (IH, d, J=IO.2); 4.64 (2H, m); 4.54 (IH, d, J=2.3); 4.2 (IH, s); 4.15-3.35 (26-28H) [4.10 (IH, m); 4.02 (IH, brs); 3.95 (3H, s); 3.85 (3H, s), 3.79 (3H, s); 3.46 (IH, m); 3.40 (3H, s)]; 2.82-2.70 (3H, brm); 2.50 (3H, S), 2.47 (IH, m); 2.38-2.22 (5H); 2.12 (IH, m); 2.11 (3H, s); 1.60-1.05 (22H) [1.39 (3H, d, J=6.3); 6.31 (3H, d, J»6.3); 1.29 (3H, d, J=6.3), 1.08 (6H)]

siehe Fig. 10

_g .„· ·..·...· -..- :₃ 4 -j ₈ ο2

Μ/25 082 1 ¹³C-NMR: 90,3 MHz; siehe Fig. 11.

In einem getrennten Test wurde das ^C-NMR-Spektrum einer gereinigten BBM-1675 A₁-Probe bestimmt, die in gelöst war (80 MHz). Die Hauptpeaks sind nachstehend angegeben.

CMR von BEM-1675 A₁ (BO MHz in CDCl₅)

Chemische	16.6	(q)	Verschiebungen	(q)	19.8	in	OT3m(Multii)lizität+)	(q)	22.6	(q)
K-1675 A1	29.0	(t)		(t)	35.1			(t)	47.2	(d)
13.7(q)	55.6	(U)	17.5	(q)	57.1	(q)	22.2	(t)	64.5	(d)
23.4(q)	68.2	(d)	34.0	(t)	69.2	(t)	39.5	(t)	70.2	(d)
52.5(q)	76.0	(d)	56.0	(d)	77.1	(d)	62.4	(d)	83.4	(S)
67.7{d)	88.4	(S)	68.8	(t)	97.2	(d)	69.6	(S)	99.0	(d)
71.9(d)		76.6		(U)	77.3
86.6(d)	90.5	(d)	98.3

99.6(d) 103.8(d) 107.6(s) 112.5(d) 123.l(d) 124.9(d) 130.Kd) 131.5(s) 134.9(s) 136. 7(s) 144. 0(s) 147.2(s) 153.8(s) 154.4(s) 155.0(s) 160.7(s) 166.4(s) 191.8(s) 20

⁺Multiplizität: q = Quartett; d = Dublett; u « unbekannt;

t = Triplett; s = Singulett.

BBM-1675 A₂

25 —— Aussehen: weiße Kristalle, Fp. 147 bis 149⁰C Elementaranalyse:

C 52,71%; H 5,94%; N 3,94%; B 9,39%; O (durch Differenz): 28,01%.

Das UV-Absorptionsspektrum (Gerät: Varian UV, Cary 219) mit Methanol als Lösungsmittel und einer Konzentration von 0,02052 g/l ergibt folgende Werte:

Μ/25	1	082	\nax (nm)
	32 0
	282
5	252
	214

Absorptionsvermögen

12.2 16.3 26.2 25.8

Nach Zugabe einer Säure oder einer Base zeigten sich keine signifikanten Änderungen.
Optische Drehung: [a]^⁷ = -179,4° (c*0,5, CHCl₃) IR-Spektrum: siehe Fig. 12, aufgenommen mit Beckman IR

Modell 4240.

Hauptabsorptionsbanden (KBr): 950, 1015,

1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, 2940, 2980, 3440, cm¹.

Massenspektrum: Gerät: VG-ZAB-2F; FAB-MS-Thioglycerin: Massenzahl (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569; nach Zugabe von NaCl /m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593* FAB-MS-MB (MB: Matrix; MG 154); Massenzahl (m/z): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; nach Zugabe von NaCl (m/z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577; FAB-MS-GIycerin-DMSOj Massenzahl (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, 1293, 1309, 1325, 1326, 1341, 1353, 1369.

Molekulargewicht (berechnet anhand scheinbares MG == der obigen massenspektrosk.Daten) 1248

NMR-Spektren: siehe Fig. 13
Gerät: WM 360 Brucker; Lösungsmittel:

M/25 082 $

¹H NMR 360 MHz 6(ppm): 11.91 (IH, s); 8.62 (IH, s); 7.58 (IH, s); 6.56 (IH, m); 6.22 (IH, s); 6.15 (IH, brs); 5.91 (IH, d, J»9.6); 5.83 (IH, d, J=9.6); 5.70 (IH, m); 5.45 (IH, d, J=2.2); 5.44 (IH, s), 5.34 (IH, brs); 4.95 (IH, d, J=IO.2); 4.75 (IH, m); 4.65 (IH, d, J=6.8); 4.54 (IH, d, J=2.2); 4.47 (IH, m); 4.18 (IH, s); 4.10 (IH, brs), 4.05-3.50 (20-24H); [3.96 (3H, s); 3.87 (3H, s); 3.77 (3H, s)]; 3.46 (IH, m); 3.39 (3H, s); 2.79 (IH, m); 2.73 (2H, m); 2.50 (3H, s); 2.50 (IH, m); 2.38-2.22 (3H); 2.14 (IH, m); 2.10 (3H, s); 1.98 (2H, m); 1.65-1.45 (6-8H); 1.38 (3H, d, J=6.0); 1.34 (3H, d, J=6.0); 1.22 (3H, d, J=6.8); 1.10 (6H).

¹³C NMR 90.3 MHZ

siehe Fig. 14

20 In einem getrennten Test wurde das -T-NMR-Spektrum einer gereinigten BM-1675 A₂-Probe gemessen, die in CDCl, gelöst war (80 MHz). Die Hauptpeaks sind nachstehend angegeben.

BBM-1675 25	A.	1	16.9	17.5	19.	8	2.2.3	22.	7	23.4	33.1
13.	7	35.1	39.3	47.	6	52.6	55.	7	56.0	56.1
34.	1	62.4	64.5	64.	9	65.9	68.	3	69.2	69.7
57.	6	73.6	75.8	76.	1	77.1	77.	7	78.1	78.3
71.	9	86.2	88.4	90.	4	97.2	98.	3	99.1	99.5
30 83.	3	103.8	107.1	112.	4	123.2	124.	8	129.9	137.3
99.	6

144.1 154.2 154.5 160.9 167.9 192.2

M/25 082 JO

l Tabelle 7

Physiko-chemische Eigenschaften von BBM-1675 A,,A^,B₁,B₂

^A3 ta h ^B2

ρ- Fp.(Zers.)»

^ö oc 125-127 123-126 159-161 156-159

-171 -122

0,5,CHCl3	),	-161	-176
Analyse
gef.(90	C	54,55	54,65
	H	6,46	6,29
	N	3,73	8,07
	S	7,49	8,07

._ MeOH 253(286) 253(257) 253(225) 248(212]

282(158) 282(153) 282(140) 279(141

320(122) 320(117) 320(104) 318(103!

0,01N 253(287) 253(258) 253(225) 248(210]

HCl-MeOH 282(160) 282(155) 282(140) 279(140

320(126) 320(118) 320(105) 318(103!

0,01N 252(280) 252(266) 252(236) 248(233]

NaOH-MeOH 283(162) 283(160) 283(141) 278(150

318(120) 318(118) 318(105) 318(110]

Dünnschichtchromatographie(TLC)-und High Performance

Liquid Chromatographie (HPLC)-Daten für die BBM-1675· Bestandteile

25 A. Untersuchung Nr. 1 - Zusammenfassung

M/25 082 t\

Tabelle ,8 TLC und HPLC der BBM-1675-Bestandteile

TLC (Rf)	mit Silan beh.	HPLC (Retentionszeit in min)
SiO2	CH3CN-H2O	Lichrosorb RP-18
CHCl3-MeOH	(75:25.V/V)	CH3CN-MeOH-Of1M CH3-
(5:1.V/V)		(5:2:3. V/V)
BBM-1675	0,18
A1 0,74	0,21	13,3
A2 0,71	0,28	17,3
A3 0,72	0,78	8,0
A4 0,71	0,23	5,1
B1 0,63	0,16	-
B2 0,60	-

⁺ C₁Q-Umkehrphasen-Silikagel

B. Untersuchung Nr. 2 - TLC und HPLC für gereinigte A₁-

und A₂-Bestandteile

20 TLC-Chromatographie

Analtech GHLF Silica Gel Uniplates wurden für alle chromatographischen Untersuchungen mit Normalphase verwendet. Es wurden Platten mit 2,5 cm χ 10 cm für eine eindimensionale TLC eingesetzt. Diese wurden in Glaszylindern mit einer Größe von 6,4 cm (Außendurchmesser) χ 12 cm entwickelt. Die Glaszylinder enthielten 10 ml Elulerungsmittel. Platten mit 7,5 cm χ 10 cm wurden für die zweidimensionale TLC verwendet. Die Probe wurde auf die untere linke Ecke in einer Entfernung von 1 cm von der Kante gegeben. Die Platte wurde zuerst in einem Behälter (12,7 cm breit, 8,6 cm tief und 13 cm hoch) entwickelt, der 50 ml des ersten Eluierungsmittels enthielt. Die Platte wurde dann an der Luft getrocknet, um 90° gegen den Uhrzeigersinn gedreht und in einem zweiten, 50 ml

35 des zweiten Eluierungsmittels enthaltenden Tank entwickelt.

M/25 082 fyZ \

Für die Umkehrphasen-ChromatograpMe wurden analytische, vorbehandelte C-18 Sllikagelplattpn von Whatman (Whatman analytical precoated C-18 silica gel plates) verwendet. Die Platten mit 2,5 cm χ 7,6 cm wurden in Glaszylindern

5 mit 10 ml Eluierungsmittel entwickelt.

Die Platten für die Normalphase wurden zuerst mit UV-Licht von 254 nm betrachtet. Die Platten wurden dann in einen Glaszylinder [6,4 cm (Außendurchmesser) χ 12 cm], der J₂-Kristalle enthielt, gegeben. Anschließend wurden die Platten etwa 2 min wiederum untersucht. Die Umkehrphasenplatten wurden nur mit UV-Licht von 254 nm untersucht. Die Zonen wurden bestimmt bzw. sichtbar gemacht, indem auf das Quenchen der Fluoreszenz eines imprägnier-

15 ten Farbstoffs geachtet wurde.

Analytische HPLC

Die folgenden Bestandteile wurden verwendet, um ein analytisches HPLC-System zu konstruieren: Waters Associates Model 6000A Solvent Delivery System pump; Varian Varichrom Model VUV-10 uv/vis Detector set mit 254 nm 0,1 OD; Fisher Recordal Series 5000 Recorder; Waters Associates Model 660 Solvent Programmer; Waters Associates Model U6K injector; Alltech,/U-Bondapak G₁₈ (10 /u) Säule (4,6 mm Innendurchmesser χ 25 cm) mit einer Whatman Co.Pell ODS (0,03-0,038 mm) Schutzsäule (4_t6 mm Innendurchmesser x 5 cm). Die Teile wurden mit einer 316 Säule aus rostfreiem Stahl (316 stainless steel tubing; 1,6 mm Außendurchmesser - 0,23 mm Innendurchmesser) verbunden. Das Eluierungsmittel wurde bei allen Analysen mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min gepumpt.

Präparative HPLC

Die folgenden Bestandteile wurden verwendet, um ein Flüssig-Chromatographie-System für mittleren Druck zusammen-

M/25 082 53

zustellen: Fluid Metering, Inc. Model RP-SY 2CSC PMI Lab Pumpe; Fluid Metering, Inc. Model PD-60LP FMI Pulse Dampener; eine schleifenförmige Polypropylen-Rohrleitung (3f0 mm Außendurchmesser χ 1,5 mm Innendurchmesser) für eine 15 ml Probe, die um ein Papprohr (8,65 cm AD) gewickelt ist; Glenco Series 3500 Universal LC Säulen; Instrument Specialties Co. Model UA-5 Absorptions/ Fluoreszenz-Monitor mit einer optischen Einheit vom Typ 6; Instrumentation Specialties Co. Model 590 Flußunterbrecherventil; und Instrumentation Specialties Co,Model 328 Fraktionssammler. Die Bestandteile wurden mit Polypropylen- und Teflonröhrchen (3_f0 mm AD χ 1,5 mm ID) und Glenco multifit Verbindungsstücken und Ventilen in der angegebenen Reihenfolge verbunden.

Die Glenco Serie 3500 Universal LC-Säulen wurden nach üblichen Verfahren als Aufschlämmung mit einem definierten Absorbens in dem gewählten Lösungsmittel gepackt. Das Leervolumen zwischen dem gesetzten Bett und dem oberen Ende des Röhrchens wurde mit Standard-Ottawasand gefüllt. Das Eluierungsmittel wurde mit einer solchen maximalen Geschwindigkeit (in etwa 20 ml/min) gepumpt, daß der Rückdruck 60 psi (4,1 bar) nicht überstieg .

25 Gradientenelution

Eine Glenco-Gradientenelutionsvorrichtung wurde für alle Gradientenelutionen verwendet. Diese Vorrichtung bestand aus zwei Kammern mit gleichen Durchmessern, gleicher Höhe und gleichem Volumen, die tandemartig mit einem Teflonventil verbunden waren. Eine Kammer diente als Mischkammer und die andere als statisches Reservoir. Am Anfang befand sich in der Mischkammer das weniger polare Lösungs mittel, während der polarere Lösungsmittel in der statischen Kammer war. Mit Teflon beschichtete Magnetrührstäbe (1,0 χ 3,7 cm) wurden in beide Kammern gegeben und

M/25 082 54

mit Thomas Model 15 Magne-matic-Rührern gedreht. Das Eluierungsmittel wurde aus der Mischkammer über eine Polypropylen-Rohrleitung (1,5 mm ID χ 3,0 mm AD) zu dem HPLC-System für mittleren Druck gepumpt. Sobald sich kein Eluierungsmittel mehr in der Mischkammer befand, konnte das Lösungsmittel in dem statischen Reservoir dieses ersetzen. Dadurch wurde ein Eluierungsmittel mit einem linearen Gradienten geschaffen.

TLC-Analysen von BBM-1675 A₁ und A₂

In der folgenden Tabelle 9 sind die für BBM-1675 A₁ und A₂ auf Platten mit normaler Phase erhaltenen Rf-Werte zusammengefaßt. Der Rf-Wert wurde berechnet, indem die Entfernung, die zwischen dem Zentrum einer Zone und dem Auftragungspunkt der Probe gemessen wurde, durch die Entfernung geteilt wurde, die zwischen der Lösungsmittelfront und dem Auftragungspunkt der Probe gemessen wurde.

20 Tabelle 9

System/V erbindung 4% Methanol in Chloroform 5% Methanol in Diethylether

50% Aceton in Skellysolve B 25

In der folgenden Tabelle 10 sind die für BBM-1675 A₁ und A₂ beobachteten Rf-Werte zusammengefaßt, die mit Platten für normale Phase erhalten wurden. Diese Platten wurden in zwei Dimensionen entwickelt. Die Positionen der Flekken ist in kartesianischen Koordinaten ausgedrückt. Auf der X-Achse sind die Rf-Werte des an zweiter Stelle aufgeführten Lösungsmittelsystems aufgetragen. Auf der Y-Achse sind die Rf-Werte des an erster Stelle aufgeführten Lösungsmittelsystems aufgetragen.

BBM-I	b75 A.	. BBM-1	675 A2	31
o,	33	o,	30
o,	39		>
o,	38	o,

M/25 082

System/Verbindung

16

Tabelle

BBM-1675 a* BBM-1675

Methanol in Chloroform gegen
5% Methanol in Diethylether (0,34,0,33) (0,28, 0,23)

4% Methanol in Chloroform gegen

50% Aceton in Skellysolve B (0,33, 0,29)

In der folgenden Tabelle 11 sind die für BBM-1675 A₁ und Ap erhaltenen Rf-Werte zusammengefaßt. Diese Werte wurden auf C-18-Umkehrphasen-TLC-Platten erhalten, welche in
binären Eluierungsmitteln entwickelt wurden.

Tabelle

Rf

System/Verbindung

BBM-1675 A₁ BBM-1675

15 2596 0,5M NaCl in Acetonitril 0,18 0,21
2596 Wasser in Acetonitril 0,00 0,00
In der folgenden Tabelle 12 sind die für BBM-1675 A₁ und A₂ erhaltenen Rf-Werte aufgeführt, welche auf C-18-ümkehrphasen-TLC-Platten erhalten wurden, die mit ternären

Eluierungsmitteln entwickelt wurden.

Tabelle 12 Rf
System/Verbindung BBM-1675A, BBM-1675A.,

Acetonitril!Methanol:0,5 M NaCl 60%
60%
40%
30%
50%
40%
50%
60%

10% 10% 30% 50% 30% 40% 20% 20%

10% 30% 30% 20% 20% 20% 20% 20%

1.00	1.00
0.57	0.50
0.32	0.22
0.44	0.33
0.62	0.54
0.60	0.49
0.42	0.34
0.74	0.69

Acetonitril:Methanol!Wasser 40% : 30% : 30%

0.00

0.00

Acetonitril!Methanol!O,1M NH^OAc 40% : 30% : 30%

0.32

0.22

Μ/25 082 ?6

¹ Tabelle 12 (Forts.)

Acetonitril:Methanol:0,1M NaH₂PO₄ 40% : 30% : 30% 0,00 0,00

HPLC-Analyse von BBM-1675 A₁ und k_?

BBM-1675 A₁ und A₂ wurden untersucht, wobei einheitliche, binäre und ternäre Eluierungsmittel für C-18-Umkehrphasen-Silikagelsäulen verwendet wurden. In den folgenden Tabellen 13, 14 und 15 sind die für diese Verbindungen beobachteten K'-Werte zusammengefaßt. Die K'-Werte wurden nach der folgenden Formel berechnet:

_K, _ TR-To

wobei TR die Retentionszeit bedeutet, gemessen vom Injektionszeitpunkt bis zur Peakspitzej To ist die Zeit für das Leervolumen.

Tabelle 13

System/Verbindung BBM-1675 A₁ BBM-1675

Acetonitril a a

Tetrahydrofuran a a

Methanol 0,00 0,00

a a die Verbindung konnte nicht aus der Säule elulert werden.

Tabelle 14 _K,

System/Verbindung BBM-1675 A₁ BBM-1675

25% Wasser in Acetonitril a a 25% Methanol in Wasser 1,25 1,25

a = die Verbindiong konnte nicht aus der Säule eluiert werden.

M/25 082

Tabelle 15
Ternäre Eluierungsmittel

K'

System/ Verbindung

BBM-1675A,

BBM-1675A.

Acetonitrile : Methanol : Wasser 40% : 30% : 30%

Acetonitrile	: Methanol	1.7	3.0
40%	: 30%	3.8	6.5
50% :	20% :	6.1	b
43.3%	: 23.3% :	7.8	b
42.5% :	22.5% :	9.7	b
41.5%	: 21.5% :
: 0.1M NH4OAc
30%
30%
33.3%
35.0%
37.0%

a = konnte nicht eluiert werden b = nicht bestimmt

Biologische Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile Die antimikrobielle Aktivität der BBM-1675-Bestandteile wurde für eine Vielzahl von Bakterien (grampositive, gramnegative und säurebeständige) und Pilze nach der zweifachen Serien-AgarverdUnnungsmethode bestimmt. Nähragarmedium wurde für grampositive und gramnegative Bakterien verwendet. Für säurebeständige Organismen wurde Medium Nr.1001 (3% Glycerin, 0,3% Natrium-L-glutamat, 0,2% Pepton, 0,31% Na₂HPO^, 0,1% KH₂PO^, 0,005% Ammoniumeitrat, 0,001% MgSO^ und 1,5% Agar) verwendet. Für Pilze wurde Sabouraud-Agarmedium eingesetzt. Wie in Tabelle 16 gezeigt, zeigt jeder der sechs BBM-1675-Bestandteile (A₁, A₂, k-zy A^, B₁, B₂) ein breites antimikrobielles Aktivitätsspektrum. Insbesondere BBM-1675 A₁ bis A^ waren gegen grampositive Bakterien sehr wirksam.

M/25 082

ι Tabelle 16

Antimikrobielle	3BM-1675	Aktivität	A1 A2	der BBM-1	675-Bestandteile	Bl	B2
	<0.0008	MIC	0.0063	in mcg/ral		0.012	0.0063
Stamm	<C. OtIOB	0.0031	A3	A4	0.012	0.012
S. aur«u« 209P	<0.0008	0.05	0.0063	0.0125	0.05	0.05
S. auraus Smith	0.0016	0.0063	0.0063	0.0125	0.1	0.1
Bj- «ubtlli» PCI 219	<C.000B	0.0016	0.0125	0.0125	0.025	0.025
M^ luteua 1001	0.0!	0.1	0.0125	0.0125	0.05	0.025
M. flavus	0.1	0.8	0.0063	0.0125	0.8	3.1
Mycobactariura 607	0.4	0.8	NT	NT	0.8	0.8
E. coll NIHJ	0.8	1.6	1.6	3.1-	3.1	3.1
K. pneumonia· DIl	0.4	0.4	1.6	3.1	3.1	1.6
P. atruginosa D15	1.6	3.1	1.6	3.1	6.3	12.5
C. alblcan» IAH 4888	1.6	6.3
C. neoforaans	1.6	6.3

15

20 30

Mit den gereinigten Verbindungen A^ und A₂ (hergestellt gemäß dem folgenden Beispiel 3) wurde noch ein zweiter antimikrobieller Test durchgeführt. Das gleiche gilt für die Komponenten A, und A^. Die erhaltenen Daten sind nachstehend zusammengefaßt.

MIC by ADT (mcg/ml)

25 7"

Stamm	BBM-1675 A1	A2	A3	A4
S. aursus 209P	<0.0008	0.0063	0.0063	0.012
S. auraus Smith	<0.0008	0.0031	0.0063	0.012
B. iubtilis PCI 219	<0.0008	0.05	0.012	0.025
H. luteus 1001	0.0016	0.0063	0.012	0.05
M1. flavu«	<0.0008	0.0016	0.0063	0.012
Mycobactarium 607	0.05	0.1	0.16	0.16
E^ ooli NIHJ	0.1	0.8	1.6	3.1
K. gnaumonia« DIl	0.4	0.8	1.6	3.1
P. aawginosa D15	0.8	1.6	3.1	3.1
Si fraqili« A20928	0.2	1.6	0.2	0.4
C. difficile A21675	0.4	0.8	0.05	0.4
C. perfrincfens A9635	0.05	0.8	0.4	0.4
C. albicans IAM 4838	0.4	0.4	1.6	6.3
C. neofornans	1.6	3.1	1.6	6.3

35

Die Aktivität der BBM-1675-Bestandteile zur Induktion von Prophagen bei dem lysogenen Bakterien E.coli ¥1709 (Λ) wurde nach dem Verfahren von Lein et al. durchgeführt, das in Nature 1^6, 783-784 (1962) beschrieben ist. Es wurde die Anzahl an Plaquen auf Agarplatten mit Test-

M/25 082

ι material (T) und auf Kontrollplatten (C) bestimmt. Ein T/C-Verhältnis bei der Piaquenzahl von größer als 3,0 wurde als signifikant betrachtet. Die Aktivität der lysogenen Induktion (ILB-Aktivität) wurde als minimale induzierende Konzentration der Testverbindung ausgedrückt. Wie in Tabelle 17 gezeigt, besitzen die BBM-1675-Bestandteile bei lvsogenen Bakterien starke ILB-Aktivität. Dies deutet darauf hin, daß diese Bestandteile Antitumoraktivität besitzen.
Tabelle 17 Aktivität der lvsogenen Induktion der BBM-1675-Bestandt. Antibiotika MIC*(mcg/ml)

BBM-1675 A₁ 0.0063

BBM-16 75 A₂ 0.0125

15 BBM-1675 A₃ 0.05

BBM-16 75 A₄ .0.10

BBM-16 75 B₁ 0.1p

BBM-16 75 B₂ 0.20

20 minimale induzierende Konzentration

Die Antitumorwirksamkeit von BBM-1675 A^ und A₂ wurde anhand verschiedener Mäusetumor-Systeme bestimmt. Lymphozytäre Leukämie P-388, lymphoide Leukämie L-1210, melanotisches Melanom B16 und Lewis-Lungenkarzinom wurde männlichen BDF₁-MaUSOn intraperitoneal implantiert. Die Inokulumgröße betrug 10⁶, 10⁵, 5 x 10⁵ bzw. 1O⁶ Zellen/Maue. Abgestufte Dosen der Testverbindungen wurden den Mäuetn intraperitoneal 24 h nach der Tumor-Inokulation verabreicht. Die Behandlungen erfolgten einmal nur am ersten Tag, am Tag 1, 4 und 7 (q3d χ 3), einmal täglich während eines Zeitraums von 9 Tagen (qd 1. -» 9) oder von 11 Tagen (qd 1 * 11). Die Bestandteile A, und A^ wurden, da nur wenig Material zur Verfügung stand, nur gegen P-388 Leuk-

35 ämie nach einem q3d χ 3-Plan getestet.

M/25 082

BBM-1675 A₁, A₂, A₃ und A^ wurden in 0,9% Kochsalzlösung gelöst, die 1096 Dimethylsulfoxid enthielt. Chromomycin A, (Toyomycin, Takeda) wurde als Bezugsverbindung in 0,9%iger Kochsalzlösung gelöst. Es wurde täglich festgestellt, welehe der behandelten und der unbehandelten Mäuse gestorben waren bzw. noch lebten. Die mittlere Überlebenszeit (median survival time, MST) wurde für jede der Testgruppen (T) und der Kontrollgruppen (C) berechnet. Ein T/C-Wert gleich oder größer als 12596 zeigt an, daß eine signifikante Antitumorwirkung erzielt wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 13 bis 23 zusammengefaßt. BBM-1675 A₁ und A₂ zeigten extrem wirksame Antitumor-Aktivität gegenüber P-388 Leukämie mit einem maximalen T/C-Wert von 160%. Sie sind etwa 100 bis 3000 Mal wirksamer als Chromomycin A-*, ausgedruckt als minimale effektive Dosis. BBM-1675 A, und A^ jedoch waren weniger wirksam gegenüber P-388 Leukämie (Tabelle 19)als die Bestandteile A₁ oder Ag. BBM-1675 A₁ und A₂ waren auch gegenüber L-1210 Leukämie (Tabelle 21), B 16 Melanom (Tabelle 22) und Lewis-Lungenkarzinom (Tabelle 23) wirksam. Die Toxizität von BBM-1675 A₁ und A₂ wurde anhand männlicher ddY-Mäuse durch intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung bestimmt. BBM-1675 A₁ war etwa 10 Mal toxischer als BBM-1675 A₂ (Tabelle 24). Die therapeutischen Indices von BBM-1675 A₁ und A₂ in dem P-388 Leukämie-System (Tabelle 25) waren 4 bis 8 bzw. 8 bis 20 Mal besser als die von Chromomycin A-*. Weitere Experimente wurden durchgeführt, indem BBM-1675-Bestandteile gegen P-388 und L-1210 Leukämie intravenös verabreicht wurden. Dabei wurden P-388 und L-1210 Leukämie in einer Menge von 5 x 1Cr bzw. 10 Zellen/Maus intravenös inokuliert. Bei diesen Versuchen wurde Adriamycin als Bezugsagens eingesetzt, das in einer 0,9%igen Kochsalzlösung gelöst war und an den Tagen 1, und 7 verabreicht wurde. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 26 und 27 gezeigt. Beide Bestandteile A₁ und A₂ waren wirksamer als Adriamycin,ausgedrückt als maximaler

M/25 082 #Ί

l T/C-Wert, minimale wirksame Dosis und Wirksamkeitsbereich.

Tabelle 18 Wirkung der BBM-1675-Bestandteile auf P-388 Leukämie

5 (Behandlung am Tag 1)

Dosis,ip MST T/C durchschn. Überlebende (mg/kg/Tag⁺) (Tage) (%) Gewichts- am Tag

and. am 5 45 Tag 5(g)

BBM-1675

BBM-1675 A-

Chromomycin a.

0.03

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

0.3

0.1

0.03

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.3

0.1

0.03

0.01

Träger

19.0 19.0 18.0 20.0 16.0 15.0 14.0

20.0 18.0 17.0 17.0 16.0 15.0 14.0

19.0 17.0 16.0 14.0 14.0

(1S2)

(IfO)

(J2p

120

112

-2.6 -1.0 -1.0 -1.4 0.0 -0.2 -0.2

-3.8

-1.8

-1.4

-0.6

-0.4

0.0

0.0

0.0

-0.2 +0.6 +0.8 0.0 -0.2

+0.1

5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

3/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5

4/5 5/5 5/5 5/5 5/5

10/10

0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

0/10

Tag 1, i.p.

30 Der Kreis zeigt eine signifikante Antitumor-Wirksamkelt an. (Dieser Hinweis gilt auch für die folgenden Tabellen 19 bis 23 und 26 und 27.)

M/25 082

Tabelle 19

Wirkun«	O	der BBM-1675-Bestandteile auf	MST	Tagen 1	P-388	56	.And.am	Leukämie	5	Tag
	BBM-1675 A1	(Behandlung an den	(Tage)	, 4 und	.JIP	5(fi)	7)	5/5	45
	X	Dosis,ip		T/C durchschn.	CSD?	-2.8		5/5	0/5
		(mg/kg/Tag+)	7.0	(90 Gew		-1.0	überlebende	5/5	0/5
		19.0	Tag		-0.6	am	5/5	0/5
	0.03	19.0		-0.6	5/5	0/5
	0.01	16.0	112	-0.4	5/5	0/5
	0.003	17.0	—	-0.2	5/5	0/5
BBM-1675 A2	0.001	16.0	88	+0.4	2/5	0/5
	0.0003	14.0		_	5/5	0/5
	0.0001	tox.	(ÖP	-1.0	5/5	0/5
	0.00003	11.0		-1.2	5/5	0/5
	0.3	18.0	(13p	-0.4	5/5	0/5
	0.1	18.0	(UP	-0.4	5/5"	0/5
	0.03	18.0	(LTp	-0.4	5/5	0/5
	0.01	17.0	120	-0.4	5/5	0/5
	0.003	16.0	(up	-0.2	5/5	0/5
BBM-1675 A3	o.obi	16.0	120	-0.4	4/4	0/5
	0.0003	15.0	108	+0.2	4/4	0/4
	0.0001	17.5	<®	+0.6	4/4	0/4
BBM-1675 A4	0.00003	15.0	112	+0.6	4/4	0/4
	0.01	13.5	100	+0.2	4/4	0/4
	0.001	16.5		+0.4	4/4	0/4
Chromomycin A^	0.0001	14.0	QiP	+0.6	5/5	0/4
	0.01	12.5	(Oip	+0.6	5/5	1/5
	0.001	18.0	112	+0.6	5/5	0/5
	0.0001	18.0	-0.2	5/5	0/5
0.3	17.0	0.0	0/5
0.1	14.0
0.03
0.01

Träger

12.5

+0.4

10/10

0/10

Tage 1, 4 und 7, ip

35

M/25 082

a 41 8 02

Tabelle

Wirkung der BBM-1675-Bestandteile auf P-388 Leukämie (Behandlung qd 1 4 9)

T/C durchschn. Überlebende

(%) Gew.und.am am Tag

Tag 5 (g) 5

Dosis,ip, MST (mg/kg/Tag ) (Tage)

BBM-1675

BBM-1675 A_n

Chromomycin A₃

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

0.00001

0.1

0.03

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

0.00001

0.3

0.1

0.03

0.01

0.003

Träger

7.0 13.0 19.0 19.0 18.0 16.0 16.0

6.0 13.0 18.0 18.0 18.0 17.0 16.0 15.0 15.0

9.0 18.0 18.0 15.0 13.0

12.5

-1.8 -1.0 -1.2 -0.8 0.0 +0.2 -0.2

-2.2 -1.4 -1.0 -0.6 -0.8 -0.4 -0.4 -0.6 +0.4

-2.0 +0.4 0.0 -0.2 -0.2

+0.4

5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
4/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5
5/5	0/5

10/10

0/10

* qd l-»9, i.p.

	1	Wirkun«	der	55	21	MST	14.5	T/C	auf L-1210	34	1802	5	Tag
M/25 082				BBM-1675-Bestandteile	(mg/kg/Tag ) (Tage)	12.0	00	durchschn.			6/6	45
		Tabelle	Dosis, ,		12.0		Gew.And-am			6/6	0/6
				11.0		Ta« 5 (na)	Leukämie	6/6	1/6
5 BBM-1675 A1			10.5		-1.7	Überlebende	6/6	0/6
		13.5	CUSP	-0.5	am	6/6	0/6
		13.0	116	+0.3	6/6	0/6
		11.0	111	+1.0	6/6	0/6
BBM-1675 A2		10.5	(Ϊ42)	-1.5	6/6	0/6
		8.5	(UP	-1.2	6/6	0/6
		11.5	116	-0.2	6/6	0/6
		11.0	111	+1.3	6/6	0/6
		11.0	89	+1.0	6/6	0/6
Chromomycin A.		10.0	121	-1.2	6/6	0/6
		116	+1.2	6/6	0/6
		116	+1.2	0/6
		105	+1.3
			+1.5
	0.003
	0.001
	0.0003
0.0001
0.03
0.01
0.003
0.001
0.0003
0.3
0.1
0.03
0.01
0.003

Träger

9.5

+1.4

12/12

0/12

* qd 1+9, i.p.

35

M/25 082

Tabelle 22 Wirkung der BBM-1675-Bestandteile auf Bi6-Melanom

Dosis ₊ MST T/C durchschn. Überlebende (mg/kg/Tag ) (Tage) {%) Gew.And.am am Tag Tag 5 (g) 5 "

BBM-1675

BBM-1675 A-

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

0.00001

0.03

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

10.0 31.5 40.5 27.0 22.0 18.0

11.0 26.5 29.5 26.0 22.0 18.0 17.0

-0.7 0.0 +0.3 +0.8 +1.8 +2.2

-0.8 +0.3 +0.2 +0.8 +0.2 +0.2 +1.7

6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

Chromomycin A₃

0.1 0.03 0.01 0.003

Träger

25.5 23.0 21.0 18.0

16.5

109

+2.3 +2.2 +2.3 +2.2

+2.1

6/6 6/6 6/6 6/6

12/12

0/6 0/6 0/6 0/6

0/12

* qd 1+9, i.p.

M/25 082

Tabelle

Wirkung der BBM-1675~Bestandteile auf Lewis-Lungenkarzinom Dosis j. MST T/0 durchschn. Überlebende

(mg/kg/Tag⁺) (Tage) (Ji) Gew.und.am Tag 5 (g)

am Tag 5

BBM-1675

BBH-1675 A.

Chroraoraycin A.

Träger

0.003

0.001

0.0003

0.0001

C.00003

0.00001

0.03

0.01

0.003

0.001

0.0003

0.0001

0.00003

0.1
0.03
0.01
0.003

10.0 31.5 21.5 21.0 13.0 11.5

10.0 25.5 28.5 17.0 15.0 10.5 11.0

21.5 17.0 17.0 11.5

11.0 qd 1+11, i.p.

-1.7 -0.7 -0.7 +1.0 +1.0 +1.0

-1.8 -1.7 0.0 -0.3 +1.2 +0.5 +0.8

+1.2 +1.7 +1.5 +1.7

+0.8

5/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6

6/6 5/5 6/6 6/6

12/12

0/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6

0/6 0/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6

1/6 0/5 0/6 0/6

1/12

M/25

Tabelle 24 Toxlzltät der BBM~1675-Bestandteile

	ω?0	iv	(mg/kg/Tag)
	Einzeldosis	Mehrfachdosis(ad 1*9)
	ip
BBM-1675 A1 A2 Chromomycin A,	0,019 0,18 0,81	0,010 0,00046 0,10 0,0072 0,41 0,23

10 15

BBM-1675 ^A1

20 Chromomycin A,

Tabelle 25
Therapeutische Indices

	LD50ZMED+	T-55	B16	LL
P-388	L-1210
Einzeln qd

63	>46	2	15	VJl
180	72	2	24	24
8	8	inaktiv	23	23

minimale wirksame Dosis

30

M/25 082 48

l Tabelle 26

Wirkung der BBM-1675-Bestandteile auf intravenös implan-

tierte P-388 Leukämie

Dosis . MST T/C durchschn. Überlebende ρ· (mg/kg/Tag ) (Tage) (%) Gew.Änd.am am Tag Tag 5 (g) 5 45

BBH-1675 A1	0.01	9.5	106	-1.7	6/6	0/6
	0.003	14.0		-0.3	6/6	0/6
	0.001	11.5	(ÜjP	+0.3	6/6	0/6
	0.0003	9.0	100	+0.3	6/6	0/6
BBM-1675 A2	0.1	7.0	78	-3.7	6/6	0/6
	0.03	15.0		-1.0	6/6	0/6
	0.01	12.0	(Hf)	-0.5	6/6	0/6
	0.003	9.0	100	+1.0	6/6	0/6
Adriamycin	30	tox.	—	_	0/6	0/6
	10	9.0	100	-1.5	6/6	0/6
	3	12.0	flip	+0.7	6/6	0/6
	1	9.0	100	+1.7	6/6	0/6

Träger - 9.0 - +1.7 12/12 0/12

⁺ Tage 1, 4 und 7, iv 25

M/25 082

Tabelle 27

Wirkung der BBM-1675-Bestandteile auf intravenös implantierte L-1210 Leukämie

Dosis , MST T/C (mg/kg/Tag^) (Tage) (%)

durchschn. Überlebende Gew.And.am am Tag
Tag 5 (g) 5 45

BBM-1675 A1	0.008	9.5	119	-2.0	4/6	0/6
	0.004	14.0	(175}	-0.2	6/6	0/6
	0.002	13.0	(jJZl)	+0.2	6/6	0/6
	0.001	9.5 -	119	+0.8	6/6	0/6
	0.0005	9.0	113	+0.8	6/6	0/6
BBM-1675 A2	0.063	11.0		-1.8	6/6	0/6
	0.032	14.0		+0.2	6/6	0/6
	0.016	10.5	(up	+0.8	6/6	0/6
	0.008	8.0	100	+1.2	6/6	0/6
	0.004	8.0	100	+0.8	6/6	0/6
Adriamycin	16	tox.	_	_	2/6	0/6
	8	12.0		+0.2	6/6	0/6
	4	9.0	113	+1.5	6/6	0/6
	2	8.0	100	+1.7	6/6	0/6

Träger

8.0

+1.4

12/12

0/12

25 ⁺ Tage 1, 4 und 7, Iv

Die AntitumoWirksamkeit der Bestandteile BBM-1675 A₁
und A₂ wurde auch in einem zweiten Test gegenüber P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie und BI6 Melanom bei Mäusen ge« testet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in den folgenden Tabellen 28,.29 und 30 aufgeführt. Einzelheiten der in diesen Tests eingesetzten Verfahren sind in Cancer
Chemother.Rep.3, 1-87 (Teil 3), 1972, beschrieben.

M/25 082

Wirkung von BBM-1675

{βλ

Tabelle 28
A₄ und .

auf P-388 Leukämie

Material Behandlungs- Dosis,ip MST Wirkung AWC überleb.

plan /ug/kg/Tag Tage MST gm d.5(3O) ' 9LT/C d.5

* NSC 31270

TSA₁

Kochsalzlösung

qdl-9

d.l

d.l, 5(9

qdl-9

400	13.»	163	-0.6	6/6
200	11.0	138	-0.9	6/6
Sl.2	20.0	250	-2.1	4/6
25.6	18.0	225	-1.8	6/6
12.8	16.5	206	-1.1	6/6
6.4	13.0	163	+0.1	6/6
3.2	12.0	150	-0.3	6/6
1.6	11.0	138	-0.3	6/6
0.8	10.5	131	0	6/6
0.4	10.0	125	+0.4	6/6
0.2	10.0	125	+0.3	6/6
0.1	10.0	125	0	6/6
25.6	8.0	100	-1.8	6/6
12.8	13.5	169	-1.5	6/6
6.4	16.5	206	-0.8	6/6
3.2	16.0	200	-0.8	6/6
1.6	IS.5	194	+0.3	6/6
O.B	12.5	156	+0.3	6/6
0.4	12.0	150	-0.1	6/6
0.2	11.5	144	+0.2	6/6
0.1	12 ,,0	150	+0.8	6/6
0.05	10.0	125	+0.8	6/6
12. S	TOX	TOX	TOX	1/6
6.4	6.0	75	-1.5	4/6
3.2	13.0	163	-1.2	6/6
1.6	14.5	181	-1.6	6/6
o.a	16.5	206	-2.3	6/6
0.4	16.0	200	-0.9	6/6
0.2	15.0	188	-0.8	5/5
0.1	13.0	163	-0.4	6/6
0.05	12.0	150	+0.1	6/6
0.025	12.0	150	-0.7	6/6

	d.l, 5 t 9	BBM-1675 A2	Λ	)	256	V w	TOX	TOX	34180;
		DMSO Kochsalz		128		156	-3.5
M/25 082		lösung qdlH.9	64		338	-1.9
l Tabelle 28 (Forts.			32		325	-2.0	0/6
BBM-1675A2 d.l			16	TOX	200	-1.8	4/6
DMSO Kochsalz			8	12.5	194	-1.9	6/6
lösung			4	27.0	188	-0.7	6/6
			2	26.0	150	-0.5	6/6
			1	16.0	150	0	6/6
		0.5	15.5	125	+0.2	6/6
		128	15.0	TOX	TOX	6/6
		64	12.0	TOX	TOX	6/6
	Kontrolle	32	12.0	TOX	-1.3	6/6
	16	10.0	306	-1.3	0/6
8	TOX	219	-1.1	0/6
4	TOX	18«	0	2/6
2	TOX	188	+0.1	5/5
1	24.5	156	-0.4	6/6
0.5	17.5	150	-0.4	6/6
	15.0			6/6
0.25	15.0	138	-0.4	6/6
64	12.5	TOX	TOX	6/6
32	12.0	75	-2.9
16		100	-4.. 9	6/6
8	. 11.0	194	-1.3	1/6
4	TOX	213	-1.8	4/6
2	6.0	188	-1.1	6/6
1	8.0	175	-0.5	6/6
0.5	15.5	175	-0.6	6/6
0.25	17.0	150	-0.1	6/6
0.125	15.0	150	+0.1	6/6
Kochsalzlös.	14.0	-	+0.5	6/6
14.0			6/6
12.0		6/6
12.0		10/10
8.0

Tumorinokulum: 10 Asciteszellen, implantiert i.p. Wirt: CDF₁ weibliche Mäuse Toxizität: <4/6 Mäuse lebten am Tag 5 30 Bewertung: MST = mittlere Überlebenszeit

Wirkung: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) χ 100 Kriterien: % T/C = 125 wurde als signifikante Antitumor wirksamkeit betrachtet

⁺ NSC 38270 = Olivomycin A 35 AWC: durchschnittliche Gewichtsänderung in g

M/25

1 Tabelle 29

Wirkung von BBM-1675 A₁ und A₂ auf L-1210 Leukämie

Material Behandlungs- Dosis,ip MST Wirkung AWC Überleb, plan /ug/kg/lnj Tage MÖI g am Tag 5

₅ ' % T/C (30)

BBM-1675 A₁

d.l

d.l, 5 t

qd X-9

25

BBH-1675

d.l

30

51.2	12.0	171	-1.1	5/6
25.6	7.0	100	-2.3	6/6
12.8	9.0	129	-1.1	5/6
6.4	3.5	136	-0.5	6/6
3.2	6.0	86	-1.7	6/6
1.6	7.0	100	-0.8	6/6
0.8	8.0	114	-0.4	6/6
0.4	7.0	100 .	+0.3	6/6
0.2	7.0	100	-0.5	5/6
0,1	7.0	lOO	+0.8	5/6
25.6	TOX	TOX	TOX	1/6
12.8	9.0 ■	129	-1.8	6/6
6.4	9.0	129	-0.8	6/6
3.2	8.0	114	-1.9	6/6
1.6	8.5	121	0	6/6
0.8	S.O	114	-0.4	6/6
0.4	7.5	107	-1.3	6/6
0.2	8.0	114	0	6/6
0.1	8.0	114	+0.4	5/6
0.05	7.0	100	+0.3	6/6
12.8	TOX	TOX	-2.4	3/6
6.4	8.0	114	-1.6	6/6
3.2	8.0	114	-1.7	6/6
1.6	9.0	129	-2.1	6/6
0.8	8.5	121	-1.6	6/6
0.4	8.0	114	-1.0	6/6
0.2	8.0	114	-0.5	5/6
0.1	7.0	100	+0.3	6/6
0.05	7.0	100	+0.3	6/6
0.025	6.0	86	-0.6	6/6
256	TOX	TOX	TOX	0/6
128	7.0	100	-1.8	5/6
64	7.5	107	-1.3	4/6
32	8.0	114	-2.2	S/6
16	7.0	100	-2.3	6/6
8	9.5	136	-1.4	6/6
4	8.5	121	-1.1	6/6
2	8.0	114	-o.a	6/6
1	8.0	114	0	6/6
0.5	8.0	114	-0.1	6/6

35

M/25 082

Tabelle 50
Wirkiong von BBM-1675 A₁ und A₂ auf Bi6-Melanom

Material Dosis,ip MST

/ug(m)od.mg/ Tage ' kg/Iitf.

BBM-1675
A-,

3.2M

1.6

0.8

0.4

0.2

0.1

16M 8 4 2 1 0.5

Kontr. Kochsalzlös,

Wirkung

MST
% T/C

AWC Überleb, g am Tag 10 Tag 5 (61)

TOX	TOX
16.0	64
34.5	168
56.5	226
47.0	188
37.0	148
13.0	52
29.5	118
43.5	174
50.5	202
0.5	140
38.0	152

25.0

-1.8 -1.8 -1.8 -0.9 -0.7 -0.4

-2.1 -2.0 -1.1 -2.1 -1.0 -1.1

-0.1

2/10 10/10 10/10 . 10/10(2)b 10/10 10/10

10/10

10/10

10/10

10/10(3)b

10/10

10/10

10/10

a) nur ein Tier ohne Tumor; MST d.m.o. »

55,0 (22090)
b) zwei Tiere ohne Tumor; MST d.m.o.=46,0(18496)

Tumorinokulum: 0,5 ml eines 1Obigen Breis, ip

Wirt: weibliche BDF₁-MaUSe 25 Behandlung: qd 1 ·* 9

Toxizität: £ 7/10 Mäuse lebten am Tag 10 Bewertung: MST = mittlere Überlebenszeit Wirkung: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) χ 100 Kriterien: % T/C ^ 125 wurde als signifikante Antitumor-Wirksamkeit betrachtet

AWC: durchschnittliche Gewichtsänderung in g

Nach einer weiteren Reinigung von BBM-1675 A₁ gemäß Beispiel 6 wurden Proben der gereinigten Verbindung gegenüber L-1210 Leukämie, P-388 Leukämie und B16 Melanom bei Mäusen getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

M/25 082

Tabelle 31

Wirkung von	gereinigtem BBM-1675 A1 auf P-388 Leukämie	T/C	durchschn.	überleb.
	(Behandlung am Tag 1)	<*)	Gew.Änd.am	am Tag 5
Verbind. Dosis	Behandlungs- MST		Ta« 5
(mg/kg/	plan u. Tage	TOX		0/6
Dosis)	Verabr.Weg	159	-1.8	4/6
BBM-IeTSA1 0.1024	i.p., qd χ 1 TOX	150	-2.6	6/6
0.0512	17.5	159	-1.4	6/6
0.0256	16.5	141	-2.2	6/6
0.0128	17.5	141	-2.5	6/6
0.0064	15.5	150	-1.0	6/6
0.0032	15.5	136	-1.2	6/6
0.0016	16.5	136	-2.0	6/6
0.0008	15.0	TOX	-1.5	1/6
0.0004	15.0	91	-2.5	5/6
0.0256	i.p., q4d χ 3; TOX	159	-1.9	6/6
0.0128	10.0	155	-0.8	6/6
0.U064	17.5	155	-2.0	6/6
0.0032	17.0	136	-1.7	6/6
0.0016	17.0	136	-0.4	6/6
0.0008	15.0	118	-0.8	6/6
0.0004	15.0	118	-1.3	6/6
0.0002	13.0	123	-1.0	6/6
0.0001	13.0	TOX		0/6
0.00005	13.5	TOX	-3.6	3/6
0.0128	i.p., qd χ 5; TOX	155	-2.2	5/6
0.0064	TOX	132	-2.0	6/6
0.0032	17.5	141	-2.2	6/6
0.0016	14.5	145	-2.8	6/6
0.0008	15.5	155	-1.3	6/6
0.0004	16.0	127	-1.6	5/6
0.0002	17.0	136	-1.6	6/6
0.0001	14.0	136	-1.0	6/6
0.00005	15.0
0.000025	15.0

1 X 10^s

i.p., q4d X 3;

11.0

100

-0.7

K = Kontrolle (Träger) Wirt: weibliche CDP1 Mäuse

er

Implantatlevel und -stelle: 1 χ 10 Zellen, i.p,

9/9

(ob"

M/25 082

Tabelle Wirkung von gereinigtem BBM-1675

auf L-1210 Leukämie

(Behandlung am Tag 1)

Verbind. Dosis Verabr.Weg u. MST T/C durchschn. Überleb.

(mg/kg/ Behandlungs- Tage {%) Gew.And.am am Tag 5

Dosis) ρ lan Tag 5

BBM-1675A.

0.1024 0.0512 0.0256 0.0128 0.0064 0.0032 0.0016

o.oooa

0.0256 0.0128 0.0064 0.0032 0.0016 0.0008 0.0004 0.0002

0.0128 0.0064 0.0032 0.0016 0.0008 0.0004 0.0002 0.0001

i.p., qd X

i.p., q4d χ

i.p., qd χ

TOX	TOX	-2.0	1/6
TOX	TOX	-2.9	Ü/6
8.0	114	-2.0	4/«
11.0	157	-1.9	6/«
11.0	157	-2.0	6/6
10.0	143	-2.6	' 6/6
10.0	143	-0.4	5/6
8.0	114	-2.3	6/6
TOX	TOX	-1.7	2/6
10.5	150	-1.8	6/6
11.0	157	-1.4	6/6
11.0	157	-1.9	6/6
10.5	150	-0.6	6/6
9.0	129	-0.7	6/6
8.5	121	-0.5	6/6
8.0	114	-2.8	6/6
TOX	TOX	-1.8	2/6
7.0	100	-1.0	5/6
11.5	164	-1.5	6/6
11.0	157	-1.6	6/6
10.0	143	-0.4	5/6
8.5	121	0.1	6/6
8.5	121	0.0	6/6
8.5	121	6/6

1 X 10°

i.p., qd χ S

7.0 100

0.1

10/10

3OK= Kontrolle (Träger) Wirt: weibliche CDF1-Mäuse

Implantatlevel und -stelle: 1 χ 10 Zellen, i.p,

Μ/25 082

1 Tabelle 35

Wirkung von gereinigtem BBM-1675 A₁ auf Bi6-Melanom

(Behandlung am Tag 1)

Verbind. Dosis Verabr.Weg u. MST T/C durchschn. Überleb, (mg/kg/ Behandlungs- Tage {%) Gew.And.am am Tag 5 Dosis) plan Tag 5

•BBM-1675AJ	0.	0064	0004	i.	p., q4d j	( 3	16.5	110	-3.8	8/10
	0.	0032	0016				22.5	150	-3.0	10/10
	0.	0016	0008				25.0	167	-1.8	10/10
	0.0008	0004				22.0	147	-2.3	10/10
	0.	.0002				24.0	160	-1.8	9/10
	0.	0001	i.	p., qd χ	9	27.0	180	-3.7	10/10
	0.					27.0	180	-2.9	10/10
	0.	.5 HL				26.0	173	-2.3	10/10
	0.	.0064				24.5	163	-2.4	10/10
	0.	.0032				25.5	170	-2.3	10/10
Kontrolle		.0016
(Träger)	0.	.0008	i.	.p.. qd X	9	15.0	100	-0.3	10/10
"BBH-1675A1	0	.0004	i.v	., q4d X	3	15.0	86	-4.7	10/10
	0	.0064				32.5	186	-2.1	10/10
	0	.0032				26.0	149	-1.4	10/10
	0	.0016				24.0	137	-0.4	10/10
	0	.0008				24.5	140	-0.0	10/10
	0	.0004	i.p	., q4d X	3	18.0	103	-2.7	10/10
	0					23.0	131	-1.4	10/10
	0	.2 HL				24.0	137	-0.7	10/10
	0				25.5	.146	-0.8	10/10
	0				21.5	123	-1.4	10/10
Kontrolle
(Träger)	0	i.v	., q4d χ	3	17.S	100	-0.4	10/10

Wirt: weibliche BDF1-Mäuse

Implantatlevel und -stelle: ⁺ 0,5 ml 10%iger Brei, i.p, ⁺⁺ Fragment, s.c.

M/25 082 5?

Die oben aufgeführten Screeningdaten zeigen, daß die gereinigte BEM-1675 A₁-Komponente im wesentlichen dieselbe Antitumoreigenschaften besitzt wie die zuvor gescreente Probe geringerer Reinheit. Diese Verbindung besitzt eine außerordentlich hohe Wirksamkeit; denn es konnte gezeigt werden, daß sie, wenn sie fünfmal täglich in einer Dosis von 25 ng/kg verabreicht wird, gegenüber P-388 Leukämie bei Mäusen wirksam ist. Bei Tests mit P-388 und L-1210 Leukämie ist BBM-1675 A₁ wirksam, wenn als einzelne Injektion verabreicht oder am Tag 1, in drei Injektionen an jedem 4. Tag oder fünfmal täglich verabreicht. Diese Verbindung war gegenüber Bi6-Melanom wirksam, unabhängig davon, ob sie Tieren mit subkutanen Tumoren intravenös oder Tieren intraperitoneal verabreicht wurde, welche ipimplantierte Tumore besaßen. Diese Eigenschaft, daß ein Arzneimittel auf pharmakologische Weise erfolgreich zu einem Tumor transportiert wird, der sich an einer entfernten Stelle befindet, ist für Antltumor-Antibiotika ungewöhnlich.

Wie oben gezeigt, besitzen die BBM-1675-Bestandteile eine sehr große antimikrobielle Wirksamkeit und sind somit für die therapeutische Behandlung von Säugetieren einschließlich des Menschen und anderer Tiere nützlich, die an Infektionskrankheiten leiden, welche durch derartige Mikroorganismen hervorgerufen werden. Die Bestandteile können weiterhin für andere, übliche Anwendungen antimikrobieller Agentien, z.B. als desinfizierende Mittel für medizinische und zahnmedizinische Ausrüstungen, ein-

30 gesetzt werden.

Die Prophagen™Induktion bei lysogenen Bakterien und die gezeigte Wirksamkeit gegen Mäusetumor-Systeme deuten darauf hin, daß die BBM-1675-Bestandteile auch therapeutisch nützlich sind bei der Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säugetieren.

M/25 082

Gegenstand der Erfindung ist somit u.a. die Verwendung der BBM-1675 A₁, A₂, A^, A^, B₁ oder B₂-Bestandteile zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen oder maligner Tumore. Dabei wird eine wirksame, antimikrobielle oder tumorinhibierende Dosis dieser BBM-1675 A₁, A₂, A^, A^, B₁ oder Bg-Bestandteile oder ein pharmazeutisches Mittel davon an den Wirt verabreicht.

Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische Mittel, die eine wirksame, antimikrobielle oder tumorinhibierende Menge an BBM-1675 A₁, A₂, A,, A^, B₁ oder B₂ zusammen mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese Mittel können in jeder zur parenteralen Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Form vorliegen. Zur parenteralen Verabreichung geeignete, erfindungsgemäße Präparate sind beispielsweise sterile, wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Derartige Präparate können auch in fester Form vorliegen, so daß sie kurz vor der Verwendung in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder irgendeinem anderen sterilen, injizierbaren Medium gelöst werden können.

Welche Menge an BBM-1675-Antibiotika vorzugsweise verabreicht wird, hängt von der speziellen Verbindung, der speziellen, formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsart und dem speziellen Situs, Wirt und der behandelten Krankheit ab. Viele Faktoren, die die Wirkung des Arzneimitteln beeinflussen, müssen von dem Therapeuten berücksichtigt werden. Dazu zählen beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht, die Ernährung, die Verabreichungszeit, die Verabreichungsart, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, Der Zustand des Wirts, die Arzneimittelkombinationen, die speziellen Empfindlichkeiten und die Schwere der Krankheit. Die Antibiotika

M/25 082

können kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis verabreicht werden. Bei vorgegebenen Bedingungen kann der Therapeut die optimale Verabreichung anhand üblicher Tests zur Bestimmung der Dosierung im Lichte der obengenannten Richtlinien bestimmen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Fermentation von BBM-1675

Actinomadura Stamm Nr. H964-92 wurde auf einem Schrägagar gezogen, der 1% Malzextrakt, 0,4% Glucose, 0,4% Hefeextrakt, 0,0596 CaCO₃ und 1,6% Agar enthielt. Ein gut gewachsener Schrägagar wurde verwendet, um das vegetative Medium anzuimpfen, das 3% lösliche Stärke, 3% Trockenhefe, 0,3% K₂HPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,2% NaCl und 0,1% CaCO, enthielt, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7»0 eingestellt wurde. Die vegetative KuI-tür wurde 72 h bei 32⁰C auf einem Drehschüttler (250 U/ min) inkubiert. 5 ml der Kultivierung wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, der 100 ml des Fermentationsmediums aus 3% Zuckerrohrmelassen, 1% Maisstärke, 1% Fischmehl, 0,1% CaCO₃ und 0,005% CuSO₄.5HgO enthielt (pH 7,0 vor der Sterilisierung). Die Fermentation wurde 6 Tage auf einem Drehschüttler bei 28⁰C durchgeführt. Die antibiotische Wirksamkeit in der Fermentationsbrühe wurde mit der Papierscheiben-Agardiffusion unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Test-Organismus durchgeführt. Die antibiotische Wirksamkeit erreichte nach 5tägiger Fermentation ein Maximum von etwa 1 mcg/ml.

Fermentation von BBM-1675 wurde auch in einem gerührten Fermentationsgefäß durchgeführt. 500 ml der, wie oben

18023

Μ/25 082 66

hergestellten, Inokulum-Kultivierung wurden in ein 20 1-Fermentationsgefäß überführt, das 10 1 des Fermentationsmediums enthielt, das dieselben Bestandteile aufwies wie das für die Schüttelflaschen-Fermentation verwendete Medium. Die Fermentation wurde bei 32⁰C und einer Belüftung von 12 l/min und bei Rühren mit 250 ü/min durchgeführt. Bei diesen Bedingungen erreichte die Antibiotika-Produktion nach 68- bis 76stündiger Fermentation ein Maximum von etwa 0,9 mcg/ml.

Fermentationsuntersuchungen wurden auch in Fermentationstanks durchgeführt. Eine Impfkultür wurde 4 Tage bei 30⁰C in Erlenmeyerkolben geschüttelt, die das vegetative Medium enthielten, das aus 3% löslicher Stärke, 396 Trokkenhefe, 0,396 K₂HPO₄, 0,196 KH₂PO₄, 0,0596 MgSO₄.7H₂O, 0,2% NaCl und 0,196 CaCO^ bestand. Die Impfkultür wurde in einen 200 1-Impftank inokuliert, der 130 1 Impfmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung enthielt. Der Impftank wurde 31 h bei 30⁰C und 240 U/min gerührt. Die zweite Impfkultür wurde verwendet, um einen 3000 1-Fermentationstank zu inokulieren, der 196 Maisstärke, 396 Zuckerrohrmelassen, 196 Fischmehl, 0,00596 CuSO₄.5H₂O und 0,196 CaCO, enthielt. Der Produktionstank wurde bei 28⁰C und 164 U/min betrieben, wobei die Belüftungsrate 2000 l/ min betrug. Der pH-Wert der Brühe sti^g stufenweise mit dem Fortschreiten der Fermentation und erreichte nach 170 bis 180 h einen Wert von 7,7 bis 7,8, wenn die antibiotische Spitzenaktivität 1,7 mcg/ml betrug.

30 Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der BBM-1675-Bestandteile Die erhaltene Fermentationsbrühe (3000 1, pH 7,8) wurde mit Hilfe einer Sharpiess-Zentrifuge in den Myzelkuchen und die überstehende Flüssigkeit getrennt. Der Myzelkuchen wurde in 16ΟΟ 1 Methanol suspendiert und 1 h gerührt.

M/25 082 GA

Die unlöslichen Materialien wurden abfiltriert und der methanolische Extrakt wurde im Vakuum auf 43 1 eingeengt. Die in der überstehenden Brühe enthaltene Aktivität wurde daraus durch Extraktion mit 2 χ 1000 1 n-Butanol gewon-B nen. Die n-Butanol-Extrakte und der eingeengte Methanolextrakt wurden vereinigt und azeotrop durch gelegentliche Zugaben von Wasser zu einer wäßrigen Lösung (20 1) eingeengt, wobei sich der Hauptteil der antibiotisch wirksamen Verbindungen als öliger Peststoff ablagerte.

Der Feststoff wurde in 30 1 Methanol digeriert und die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert. Der Methanol-Extrakt wurde dann im Vakuum zu einer 10 1-Lösung eingeengt, zu der 40 1 Ethylacetat und 30 1 Wasser gegeben wurden. Nach 30minütigem Rühren wurde die organische Schicht abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf 4 1 eingeengt. Nach Zugabe des Konzentrats zu 20 1 η-Hexan erhielt man einen blaßgelben Feststoff des rohen BBM-1675-Komplexes (90,14 g, Wirksamkeit: 55 mcg/mg). Die TLC dieses Komplexes zeigt, daß er aus einer Mischung von zwei Hauptbestandteilen, BBM-1675 A^ und A₂, und mehreren Nebenbestandteilen besteht. Diese wurden durch wiederholte chromatographische Behandlungen aufgetrennt und gereinigt. Diese Maßnahmen wurden in einem gekühlten Raum durchgeführt, um eine Zersetzung zu vermeiden.

Der BBM-1675-Komplex (20 g) wurde in 20 ml Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20 Säule (0 5,5 x 85 cm) gegeben. Die Säule wurde mit Methanol entwickelt. Die Elution wurde mit Hilfe eines Bioassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P überwacht. Die aktiven Eluate wurden vereinigt, im Vakuum konzentriert und zu einem semireinen Feststoff des BBM-1675-Komplexes lyophilisiert (4,19 g). Der Feststoff wurde dann über eine Silikagelsäule (0 5,0 χ 50 cm) chromatographiert. Dabei wurde Chloroform und eine zunehmende Menge Methanol (1 -> 5%_t V/V) als Eluierungsmittel eingesetzt.

M/25 082 62

Die Eluate wurden auf Basis der antibakteriellen Aktivität (gegenüber S.aureus) und TLC (SiO₂; CHCl₃-CH₃OH = 5/1, V/V) vereinigt und im Vakuum konzentriert. Ein fast homogener BBM-1675 A₁-Bestandteil (Ausbeute nach Einengen: 351 mg) wurde zuerst mit 296 Methanol in Chloroform eluiert. Dann wurde eine Mischung von BBM-1675 A₂» A-x und A^ (507 mg) und anschließend eine Mischung von BBM-1675 B (210 mg) mit 3% Methanol in Chloroform eluiert. Der BBM-1675 A₁-Feststoff wurde auf eine Sephadex LH-20 Säule (0 2,0 χ 80 cm) gegeben, die mit Methanol entwickelt wurde. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der zurückgebliebene Feststoff wurde aus Methanol kristallisiert, wobei farblose Plättchen des reinen BBM-1675 A₁ (124 mg) erhalten wurden (dieses Material ist das Ausgangsmaterial für das Beispiel 3A). Der Komplex BBM-1675 A₂, A₃ und A^ wurde chromatographisch auf einer Bondapack C₁₈-Säule (Waters, 0 3,0 χ 50 cm) aufgetrennt. Die Elution erfolgt mit wäßrigem Acetonitril. Die bioaktiven Eluate wurden mittels TLC untersucht [Merck, mit Silan behandelt (C₁₈-Umkehrphasen-Silikagel): CH₃CN-H₂O = 75:25, V/V). Die Nebenbestandteils A^ (33 mg) und A₃ (18 mg) wurden nacheinander in dieser Reihenfolge mit 1Obigem Acetonitril eluiert. Anschließend wurde ein weiterer Hauptbestandteil A₂ (301 mg) (dieses Material diente als Ausgangsmaterial für das Beispiel 3B) mit 50#igem Acetonitril eluiert.

Der BBM-1675 B₁ und B₂ enthaltende Feststoff wurde auf einer Silikagelsäule (0 3,0 χ 40 cm) mit Chloroform und Methanol als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Die mit 4% Methanol in Chloroform eluierten, aktiven Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt» wobei reines BBM-1675 B₁ (7 mg) erhalten wurde. Eine weitere aktive Fraktion wurde mit 5%igem Methanol eluiert. Nach Einengen wurde BB-1675 B₂ (8 mg) erhalten.

M/25 082 &t>

1 Beispiel 5 Weitere Reinigung von BBM-1675 A^ und A₂

A. Reinigung von BBM-1675 A₁

Eine Glencosäule (2,67 cm ID χ 75 cm) wurde mit einer Aufschlämmung von Silikagel mit einer gebundenen Octadecylphase (von Baker, C18, Teilchengröße 40 /um) in Methanol gepackt. Die Säule wurde mit einem HFLC-System für mittleren Druck verbunden und mit 1,51 Eluierungsmittel (41,6?6 Acetonitril/21,6% Methanol/36,8% 0,1M Ammoniumacetat) äquilibriert. Teilweise gereinigtes BBM-1675 A^ (100,5 mg), das gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Reinigungsverfahren erhalten worden war, wurde in 2 ml Acetonitril gelöst und in die Probenwindung gezogen. Die Probe wurde auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit dem obigen Eluierungsmittel eluiert, wobei 87 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Das Eluierungsmittel wurde bei 254 und 340 nm überwacht. Die Fraktionen 55 bis 71 wurden zusammengegeben und zweimal mit 1500 ml Aliquots Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde bis zur Trockene abgezogen, wobei 89,8 mg des Rückstands C erhalten wurden.

Eine Glencosäule (1,5 cm ID χ 20 cm) wurde in Form einer Aufschlämmung mit 12 g Silikagel von Woelm gepackt (60 bis 200 Mikron-Teilchen). Der Rückstand C wurde in Chloroformlösung auf die Säule gegeben. Die Säule wurde mit 500 ml eines Lösungsmittels mit einem linearen Gradienten von Chloroform nach 10% Methanol in Chloroform eluiert. Es wurden 20 bis 25 ml-Fraktionen gesammelt. Nach TLC-Analyse auf Silikagel wurden die Fraktionen 6 bis 9 vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 73 mg des Rückstands D erhalten wurden.

Eine Glencosäule (1,5 cm ID χ 20 cm) wurde in Form einer Aufschlämmung mit 12 g Silikagel von Woelm (Teilchen-

M/25 082 64

größe 63 bis 200 Mikron) in Skellysolve B gepackt. Der Rückstand D wurde in etwa 2 ml CHCl₃ gelöst und auf die Säule gegeben. Das Chloroform wurde mit 25 ml Skellysolve B versetzt. Die Säule wurde dann mit 500 ml eines Lösungsmittels eluiert, das einen linearen Gradienten von Skellysolve B zu 60% Aceton in Skellysolve B aufwies. Es wurden 28 bis 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 19 bis 23 wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt, wobei 65,6 mg rines BBM-1675 A₁ erhalten wurden.

Dieser Rückstand war in drei TLC-Systemen (5% Methanol in Chloroform; 5% Methanol in Ether; und 50% Aceton in Skellysolve B auf Silikagel) und in der HPLC (C-18 SiIikagel - 41,596 Acetonitril/21,5% Methanol/37,0% 0,1M Am-

15 moniumacetat) homogen.

Gelpermeationschromatographie mit gereinigtem BBM-1675 A₁

Eine Pharmacia-Säule (2,5 cm ID χ 45 cm) wurde in Form einer Aufschlämmung mit Sephadex LH-20 in Methanol gepackt und so justiert, daß das Chromatographiebett bei 33»4- cm war. Gereinigtes BBM-1675 A₁ (etwa 120 mg) wurde in 2 ml Methanol gelöst und in einen 2,5 ml Probenbehälter überführt. Die Probe wurde auf die Säule gegeben. Die Elution wurde mit 1,75 ml/min Methanol begonnen, wobei 10 ml-Fraktionen [Pharmacia Frac-100 Fraktionssammler] gesammelt wurden. Das Eluierungsmittel wurde bei 254 nm mit einem Isco UA-5 Detektor überwacht. BBM-1675 A₁ eluierte bei Ve/Vt 0,79 bis 0,91 (Ve = Elutionsvolumen; Vt = Bettvolumen).

B. Reinigung von BBM-1675 A₂

Eine Glencosäule (2,65 cm ID χ 75 cm) wurde in Form einer Aufschlämmung mit Silikagel mit gebundener Octadecylpha-

M/25 082

se von Baker (C18, Teilchengröße 40 Mikron) in Methanol gepackt. Die Säule wurde mit dem HPLC-System für mittleren Druck verbunden und mit 1,5 1 Eluierungsmittel (50% Acetonitril/20% Methanol/30% 0,1M Ammoniumacetat) äquilibriert. Teilweise gereinigtes BBM-1675 A₂ (76,9 mg), das nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten worden war, wurde in 2 ml Acetonitril gelöst und in die Probenwindung gezogen. Die Probe wurde auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit obigem Eluierungsmittel eluiert, wobei 87 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Das Eluierungsmittel wurde bei 254 und 340 nm überwacht. Die Fraktionen 31 bis 38 wurden vereinigt und zweimal mit 500 ml Aliquots Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde bis zur Trockene abgezogen, wobei 65,8 mg homoge-

15 nes BBM-1675 Ap erhalten wurden.

BBM-1675 A₂ war in zwei TLC-Systemen, einer 2-d TLC-Analyse und in der HPLC homogen.

20 Beispiel 4

Bevorzugtes Extraktionsverfahren für BBM-1675 A₁

Die nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 erhaltene Rohfermentation (6,8 1) wurde in einen PoIypropylenkübel (oberer Durchmesser 12 cm, Durchmesser am Boden 10 cm, Höhe 37 cm) überführt, welcher am Boden mit einem Hahn ausgerüstet war. Ein gleiches Volumen Chloroform wurde zugesetzt. Die Mischung wurde 2 h mit einem durch Luft angetriebenen Rührer gut gerührt. Etwa 4 1 (1,3 kg) Dicalite (Filterhilfe) wurden zugegeben und beigemischt. Die Mischung wurde über ein Dicalite-Kissen filtriert, welches in einem Büchnertrichter Nr. 12 gehalten wurde. Das Filtrat wurde in einer 19 1-Flasche gesammelt, die mit einem Anschluß für Vakuum ausgestattet war (Ace.Nr. 5396-06). Die "Matte" wurde mit 2 1 Chloro-

Μ/25 082 £6

form gewaschen, das Flltrat wurde in einen 20 1 Scheidetrichter überführt und die Phasen wurden sich absetzen gelassen. Die untere Phase (Chloroform) wurde entfernt.

Eine Glencoröhre (2,5 cm ID χ 40 cm) wurde mit einer Auf-. schlämmung von 91 g Silikagel von Woelm (Teilchengröße 63 bis 200 Mikron) gepackt. Unter Verwendung einer FMI RPY-2CSD-Pumpe wurde die obige Chloroformphase durch die Säule gepumpt« Die Säule wurde nit 600 ml frischem ChIoroform gespült. Das Chloroform-Eluierungsmittel wurde verworfen. Die Säule wurde dann mit 600 ml 10%igem Methanol in Chloroform eluiert. Das Eluierungsmittel wurde bis zur Trockene abgezogen, wobei 547 mg des Rückstands A erhalten wurden.

Der Rückstand A wurde in 50 ml Chloroform gelöst, die Chloroformlösung wurde zu 20 g Dicalite in einem 1 1 Rundkolben gegeben und eine Aufschlämmung wurde durch Zugabe von etwa 200 ml Skellysolve B erhalten. Die Lösungsmittel wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt, der Rückstand in 300 ml Skellysolve B aufgeschlämmt und die Aufschlämmung nach dem folgenden Verfahren in eine ⁿAce flask chromatography tube" (Part Nr. B5872-14)(41 mm ID χ 45,7 cm) gepackt. Ein Glaswollstopfen wurde in die Mündung des Absperrhahns zwischen dem Hahn und der röhrchenförmigen Säule eingeführt. Eine Schicht von 1 cm aus Standard-Ottawasand wurde zu der Glaswolle gegeben. Der Absperrhahn, die Glaswolle und das Sandbett wurden von Luft befreit, indem Skellysolve B mit Druck hindurchgedrückt wurde (5,7 psi). Die Aufschlämmung wurde dann zu einer Säule gegeben, so daß sich bei Fluß unter Druck ein gepacktes Bett bildete. Die Säule durfte niemals trocken werden. Nachdem eine stabile Säule erhalten worden war, wurde eine 2 cm Schicht Ottawasand oben auf das Bett gegeben. Das Bett wurde dann, mit weiteren 600 bis 700 ml

M/25 082 67

Skellysolve B eluiert. Das Bett wurde mit 500 ml Toluol eluiert. Das als Eluierungsmittel dienende Toluol wurde zur Trockene eingeengt, wobei 93 mg des Rückstands B erhalten wurden. Dieser teilweise gereinigte BBM-1675 A₁-Bestandteil kann dann weiter nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gereinigt werden.

Beispiel 5

Fermentation des BBM~1675-Komplexes unter Verwendung der Variante H964-92-A1327Y

Ein Variantenstamm A1327Y, der durch Behandlung von Actinomadura verrucosopora-Stamm Nr. H964-92 mit NTG erhalten worden war, wurde verwendet, um das vegetative Medium anzuimpfen, das 2% lösliche Stärke, 196 Glucose, 0,596 Hefeextrakt, 0,596 NB-Amin vom Typ A und 0,196 CaCO, enthielt, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt wurde. Die vegetative Kultur wurde 4 Tage bei 32⁰C auf einem Drehschüttler (250 U/min) Inkubiert. 5 ml der KuI-tür wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben Überführt, der 100 ml des Fermentationsmediums enthielt, das aus 3% Zuckerrohrmelassen, 196 Maisstärke, 196 Fischmehl, 0,00596 CuS0_/+.5H₂0, 0,0596 MgSO^.7H₂O und 0,196 CaCO, bestand. Der pH wurde vor der Sterilisierung auf 7,0 eingestellt.

Die Fermentation wurde 7 Tage bei 28⁰C auf einem Drehschüttler durchgeführt. Die Antibiotika-Produktion erreichte ein Maximum von ca. 1,5 mcg/ml.

30 Beispiel 6

Isolierung und Reinigung der BBM-167£-Bestandteile

Die in Beispiel 5 erhaltene Fermentationsbrühe (3000 1, pH 7,6) wurde mit Hilfe einer Sharpless-Zentrifuge in den Myzelkuchen und die überstehende Flüssigkeit aufge-

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trennt. Der Myzelkuchen wurde mit 2000 1 Methanol 1 h gerührt. Die unlöslichen Bestandteile wurden abfiltriert. Die in der überstehenden Brühe enthaltenen, aktiven Bestandteile wurden daraus mit 1800 1 n-Butanol extrahiert. Die Methanol- und n-Butanol-Extrakte wurden vereinigt und azeotrop durch gelegentliche Zugabe von Wasser zu einer wäßrigen Lösung (20 1) eingeengt, worauf sich die meisten der antibiotisch wirksamen Substanzen als öliger Feststoff absetzten. Die Mischung wurde dann dreimal mit 20 1 Ethylacetat geschüttelt, um die aktiven Bestandteile zu extrahieren. Die Extrakte wurden vereinigt, die unlöslichen Bestandteile abfiltriert und die Extrakte im Vakuum auf 4 1 eingeengt. Nach Zugabe des Konzentrats unter Rühren zu 30 1 η-Hexan wurde ein blaßgelber Feststoff des rohen BBM-1675-Komplexes (81,7 g, Wirksamkeit: 59 mcg/mg) erhalten. In der TLC und der HPLC zeigte sich, daß der Komplex aus einer Mischung von zwei Hauptbestandteilen, BBM-1675 A^ und A₂, und verschiedenen Nebenbestandteilen bestand. Diese wurden nach mehreren chromatographischen Behandlungen aufgetrennt und gereinigt. Diese Maßnahmen wurden in einem kalten Raum durchgeführt, um eine Zersetzung zu vermeiden.

Der rohe BBM-1675-Komplex (20 g) wurde in 20 ml Methanol gelöst und auf eine Sephadex LH-20 Säule (0 5,5 x 85 cm) gegeben. Die Säule wurde mit Methanol entwickelt und die Elution wurde mit Hilfe eines Bioassays unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P überwacht. Die aktiven Eluate wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und zu einem halbreinen Feststoff des BBM-1675-Komplexes (4,86 g, Wirksamkeit: 203 mcg/mg) lyophilisiert. Der Feststoff wurde dann auf einer Silikagelsäule (0 3,0 χ 70 cm) unter Verwendung von Chloroform und zunehmenden Mengen (1-5%) Methanol als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Die Eluate wurden auf Basis ihre antibakteriellen Wirk-

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samkeit gegenüber S. aureus und der TLC (SiO₂, CHCl₃-MeOH =5:1, V/V) vereinigt und im Vakuum konzentriert. BBM-1675 A₁ (nach Verdampfen 425 mg; Wirksamkeit: 960 meg/ mg) wurde zuerst mit 2% Methanol in Chloroform eluiert. Dann wurde eine Mischung von BBM-1675 A₂, A, und Ar (732 mg; Wirksamkeit: 340 meg/mg) und anschließend ein BBM-1675 B-Komplex (200 mg; Wirksamkeit: 190 meg/mg) mit 3% Methanol in Chloroform eluiert. Der obige BBM-1675 A₁-Bestandteile wurde erneut mit Silikagel (Säule: 0 2,2 χ 44 cm) mit 2% Methanol in Benzol chromatographiert. Die bioaktiven Eluate wurden mittels HPLC (Lichrosorb RP-18: CH₃CN-MeOH-O,1M CH₃COONH₄ = 5;2:3, V/V) geprüft. Die homogenes BBM-1675 A₁ enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der zurückbleibende Feststoff wurde aus Methanol (10 ml) kristallisiert. Es wurden farblose» Prismen von BBM-1675 A₁ erhalten (197 mg; Wirksamkeit? 1000 meg/rag).

Der Komplex von BBM-1675 A₂, A₃ und A₄ (537 mg) wurde

auf einer Bondapak C^-Chromatographiesäule (Waters, 0 2,0 χ 42 cm) aufgetrennt. Elution wurde mit wäßrigem Acetonitril bewirkt. Die bioaktiven Eluate wurden mittels TLC (Merck, mit Silan behandelt: CH₃CN-H₂O = 75:25, V/V) untersucht. Die Nebenbestandteile BBM-1675 A₄ (45 mg; Wirksamkeit: 410 meg/mg) und A₃ (19 mg; Wirksamkeit: 300 meg/ mg) wurden nacheinander mit 20%igem Acetonitril eluiert. Dann wurde ein Hauptbestandteil,BBM-1675 A₂, (203 mg) mit 50%igem Acetonitril eluiert. Die BBM-1675 A₂-Fraktion wurde aus Chloroform/n-Hexan kristallisiert. Dabei bildeten sich farblose Stäbe (70 mg; Wirksamkeit: 290 meg/mg). Der die BBM-1675 B-Mischung enthaltende Feststoff wurde auf einer Silikagelsäule (0 3,0 χ 40 cm) mit Chloroform und Methanol als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Die mit k% Methanol in Chloroform eluierten, aktiven Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt, wobei

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reines ΒΒΜ-1675 B₁ (7 mg; Wirksamkeit! 180 mcg/mg) erhalten wurde. Eine weitere, aktive Fraktion wurde mit einer 5%igen Methanolkonzentration eluiert, worauf nach Verdampfen BBM-1675 B₂ (8 mg; Wirksamkeit: 140 mcg/mg) erhalten wurde.

10 15 20 25 30 35

Claims (13)

1. Patentansprüche

   Antitumor»Antibiotikum BBM-1675 A₁, das in im entliehen gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt; es

   (a) bildet weiße bis fahlgelbe Kristalle,

   (b) ist in Chloroform, Ithylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;

   (e) gibt mit Iisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen¹s»Reagens eine positive Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion;

   (d) besitzt im wesentlichen das in Fig. 9 gezeigte IR»Absorptionsspektrum (KBr);

   (e) besitzt, wenn in CDCl, gelöst, im wesentlichen das in Fig. 10 gezeigte ¹H-NMR-Spektrum;

   158⁰C;

   (f) besitzt einen Schmelzpunkt von etwa 156 bis

   (g) besitzt eine optische Drehung von [a]_n *

   -191^Q (c m 0,5, CHCl₃);

   (h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargeweicht von 1248;

   (i) besitzt folgende, ungefähre Elementarzusammensetzung; 52,1796 C, 6,1596 H, 4,6396 N, 9,0996 S und 27,9696 Sauerstoff (durch Differenz);

   (5) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5:1,V/ V)zu einem Rf-Wert von 0,74 und führt bei der ümkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75:25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,18;

   M/25 082 2

   ι (k) führt, wenn in Methanol in einer Konzentration von 0,01356 g/l gelöst, zu den folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen:

   ^λ max (™) Absorptionsvermögen

   5 320 12,4

   280 Schulter

   253 25,1

   210 25,5

   (nach Zugabe einer Säure oder einer Base ergeben sich keine signifikanten Änderungen);

   (l) führt in der high performance liquid chromatography (HPLC) mit einer C₁g-Umkehrphasen-Silikageleäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-O^M CH₃COONH₄ (5:2:3, V/V) zu einer Retentionszeit von 13,3 Minuten; (m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;

   (n) induziert Prophagen bei lysogenen Bakterien;

   und

   (o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, BI6 Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen.
2. 2. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₂, das in im wesentlichen gereinigter Form folgende Eigenschaften besitzt: es

   (a) bildet weiße Kristalle;

   (b) ist in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich, in Benzol und Wasser wenig löslich und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;

   (c) führt mit Eisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen¹s-Reagens zu einer positiven Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test zu einer negativen Reaktion;

   (d) besitzt im wesentlichen das in Fig. 12 gezeig-

   35 te IR-Absorptionsspektrum (KBr);

   (e) besitzt, wenn in CDCl, gelöst, im wesentlichen das in Fig. 13 gezeigte H-NMR-Spektrum;

   (f) besitzt einen Schmelzpunkt von etwa 147 bis 149⁰Cj

   (g) führt zu einer optischen Drehung von [alrj » -179,4° (c * 0,5, CHCl₃);

   (h) besitzt ein massenspektroskopisch bestimmtes, scheinbares Molekulargewicht von 1248;

   (i) besitzt in etwa folgende Elementar zusammen·* setzungi 52,7196 C, 5,9496 H, 3,94% N, 9,3996 S und 28,0196 0 (durch Differenz);

   (j) führt bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl,-CHjOH (5:1, V/ V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75:25, VA) zu einem Rf-Wert von 0,21;

   (k) führt, wenn in einer Konzentration von 0,02052 g/l in Methanol gelöst, zu folgenden UV-Absorptionsmaxima und Absorptionsvermögen:

   Absorptionsvermögen

   320 12,2

   282 16,3

   25 ^{282 26}'²

   214 25,8

   (nach Zugabe einer Säure oder Base ergaben sich keine signifikanten Änderungen);

   (1) führt bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-O,1M CH₃COONH^ (5:2:3, V/V) zu einer Retentionszeit von 17,3 Minuten;

   (m) inhibiert das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze;
   35

   M/25 082 4

   (η) induziert Prophagen bei lysogenen Bakterien; und

   (o) inhibiert das Wachstum von P-388 Leukämie, L-1210 Leukämie, Bi6-Melanom und Lewis-Lungenkarzinom bei Mäusen.
3. 3. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A₃, das

   (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslieh ist und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;

   (b) mit Eisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen¹S-Reagens eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;

   (c) im wesentlichen das in Fig. 3 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;

   (d) im wesentlichen das in Fig. 7 gezeigte H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl, gelöst;

   (e) einen Schmelzpunkt von etwa 125 bis 127⁰C besitzt;

   (f) zu einer optischen Drehung von [oc]^'« -161° (c β 0,5, CHCl₃) führt;

   (g) folgende ungefähre Elementarzusammensetzung besitzt: 54,5596 C, 6,4696 H, 3,7396 N, 7,4996 S und Zl,77%

   25 (durch Differenz);

   (h) bei der Silikagel-Dünnsohichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5:1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,72 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-DUnnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75s25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,28 führt; (i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst,

   M/25 082 5

   nm (

   in Methanol 253 (286)

   282 (158)

   320 (122)

   in 0,01N HCl-CH₃OH 253 (287)

   282 (160) 320 (126)

   in 0,01N NaOH-CH₃OH 252 (280)

   283 (162) 318 (120);

   (3) bei der HPLC mit einer C₁₈-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COOIBL₄ (5:2:3, V/V) eine Retentionszeit von 8,0 Minuten besitzt;

   (k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;

   (l) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und

   (m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert.
4. 4. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 A^, das

   (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslieh ist und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;

   (b) mit Eisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen«s-Reagens eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;

   (c) im wesentlichen das in Fig. 4 gezeigte IR-Absorptionsspektrum (KBr) besitzt;

   (d) im wesentlichen das in Fig. 8 gezeigte H-NMR-Spektrum besitzt, wenn in CDCl₃ gelöst;

   (e) einen Schmelzpunkt von etwa 123 bis 126⁰C besitzt;

   M/25 082 6

   l (f) zu einer optischen Drehung von [a Jn » -176° (c a 0,5, CHCl₃) führt;

   (g) folgende ungefähre Elementarzusammensetzung besitzt: 54,6596 C, 6,29% H, 3,5196 N, 8,07# S und 27,48* 0 (durch Differenz);

   (h) bei der Silikagel-Dünnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5:1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,71 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-DünnschichtChromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75:25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,78 führt; (i) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst,

   nm (

   15 in Methanol 253

   282 320

   in 0,01N HC1-CH,OH 253

   ⁵ 282

   320

   _on in 0,01N NaOH-CH,OH 252

   20 5 ₂₈₃

   318

   (j) bei der HPLC mit einer C_1Q-Umkehrphasen-Silikagelsäule und dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-CH₃OH-0,1M CH₃COONH^ (5:2:3, V/V) eine Retentionszeit von 5,1 Minuten besitzt;

   (k) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert;

   (1) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und

   (m) das Wachstum von P-388 Leukämie bei Mäusen inhibiert.
5. 5. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₁, das

   (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig lös-

   M/25 082 7

   lieh ist und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;

   (b) mit Eisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen¹s-Reagens eine positive Reaktion ergibt und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;

   (c) einen Schmelzpunkt von etwa 159 bis 161°C besitzt;

   (d) zu einer optischen Drehung von [<*]q * -171° (c = 0,5, CHCl₃) führt;

   (e) bei der Silikagel-DUnnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CHjOH (5:1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,63 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-DUnnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75:25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,23 führt;

   (f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃O und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst,

   20 UV \ ^ nm (

   f236 141

   in Methanol 253 (225!

   282 (140 320 (104J

   in 0,01 N HC1-CH,OH 253 (225Ϊ

   ⁵ 282 (140

   25 320 (105;

   in 0,01N NaOH-CH,OH · 252

   ⁵ 283

   318

   (g) das Wachstum verschiedener Bakterien und Pilze inhibiert; und

   (h) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
6. 6. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675 B₂, das (a) in Chloroform, Ethylacetat, Aceton, Ethanol

   M/25 082 8

   l und Methanol löslich ist, in Benzol und Wasser wenig löslich ist und in η-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich ist;

   (b) mit Eisen(III)-Chlorid, Ehrlich- und Tollen¹S-Reagens eine positive Reaktion und im Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Test eine negative Reaktion ergibt;

   (c) einen Schmelzpunkt von etwa 156 bis 159⁰C besitzt;

   (d) zu einer optischen Drehung [a]n ^β -122° 10 (c = 0,5, CHCl₃) führt;

   (e) bei der Silikagel-DUnnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CHCl₃-CH₃OH (5:1, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,60 und bei der Umkehrphasen-Silikagel-DUnnschichtchromatographie mit dem Lösungsmittelsystem CH₃CN-H₂O (75:25, V/V) zu einem Rf-Wert von 0,16 führt;

   (f) die folgenden UV-Absorptionsmaxima besitzt, wenn in Methanol, 0,01N HCl-CH₃OH und 0,01N NaOH-CH₃OH gelöst,

   in Methanol 248

   279 318

   in 0,01N HC1-CH,OH 248

   ⁵ 279

   25 318

   in 0,01N NaOH-CH,OH 248

   ^D 278

   318 (g) das Wachstum verschiedener Bakterien und

   Pilze inhibiert; und

   (f) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert; und
7. 7. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A^, BBM-1675 B^ oder BBM-1675 B₂, dadurch gekennzeichnet,

   M/25 082 9 ) ' ..

   daß man einen BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ produzierenden Organismus des Stamms Actinomadura verrucosoapora in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen so lange kultiviert, bis eine wesentliche Menge an BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM 1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ durch den genannten Organismus in dem genannten Kulturmedium produziert worden ist, und daß man anschließend BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₉ aus dem Kulturmedium gewinnt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BB^-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ produzierende Organismus die identifizierenden Charakteristika des Actinomadura verrucosospora-Stamms H964-92 (ATCC 39334), des Actinomadura verrucosospora-Stamms A1327Y (ATCC 39638) oder eines Mutanten davon besitzt.
9. 9. Verwendung von BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen.
10. 10. Verwendung von BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂ zur Bekämpfung maligner Tumore.
11. 11. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend BBM-1675 A₁, BBM-1675 A₂, BBM-1675 A₃, BBM-1675 A₄, BBM-1675 B₁ oder BBM-1675 B₂, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel.

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12. 12. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39334), wobei diese Kultur nach Kultivieren in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stick-

    5 stoffquellen enthält, das Antibiotikum BBM-1675 in einer gewinnbaren Menge produzieren kann.
13. 13. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Actinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638), wobei diese Kultur nach Kultivieren in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff quellen enthält, das Antibiotikum BBM-1675 in einer gewinnbaren Menge produzieren kann.