AT393691B - Verfahren zur herstellung des neuen antitumorantibiotikum-komplexes bbm-1675 - Google Patents
Verfahren zur herstellung des neuen antitumorantibiotikum-komplexes bbm-1675 Download PDFInfo
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Description
AT 393 691B
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikum-Kom-plexes BBM-1675 (Aj.Aj, A3, A4,Bj, B2). Das eifindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) oder dessen Mutante A1327Y (ATCC 39638) in einem wässerigen, assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter aeroben Submersbedingungen gezüchtet wird, bis eine deutliche Menge von BBM-1675 in dem Kulturmedium produziert wurde, worauf der Komplex aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls durch an sich bekannte Trennverfahren, wie insbesondere durch Chromatographie, in seine Komponenten Aj, Kj, A3, A4, Bj bzw. B2 aufgetrennt wird.
Die erfindungsgemäß hergestellten antibiotisch wirkenden Antitumorverbindungen wurden in ihrer Struktur bisher noch nicht identifiziert. Im Hinblick auf ihre einzigartigen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften stellen sie jedoch neue Substanzen dar.
In der EP-Al 95154 ist die Fermentation von Actinomadura pulveraceus sp. nov. Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung der als WS 6049-A und WS 6049-B bezeichneten Antitumor-Antibiotika beschrieben. Die Strukturen der Antibiotika WS 6049 wurden bis jetzt noch nicht klargestellt, jedoch deuten die für die Antibiotika angegebenen charakteristischen Eigenschaften daraufhin, daß WS 6049-A und 6049-B in ihrer Struktur mit den erfindungsgemäß hergestellten Antibiotika BBM-1675 verwandt sind. Die Spektralwerte zeigen jedoch, daß weder das WS 6049-A noch das WS 6049-B mit irgend einem Bestandteil der erfindungsgemäß hergestellten BBM-1675-Verbindungen ident ist. Außerdem kann der in der EP-Al 95154 beschriebene Produktionsorganismus deutlich von dem erfindungsgemäß verwendeten Actinomadura verrucosospora in der Farbe seines Luftmycels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4 durch seine positive Milchpeptonisierung und seinen positiven Verbrauch von D-Fructose, D-Mannitol, Trehalose und Cellulose unterschieden werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird somit ein neuer antibiotischer Antitumor-Komplex bereitgestellt, der als BBM-1675bezeichnet wird. Der Komplex enthält zwei bioaktive Hauptkomponenten, die als BBM-1675Aj und A2 bezeichnet werden, und vier geringfügiger bioaktiv wirkende Komponenten, die mit BBM-I675A3, A4, B ^ und B2 bezeichnet sind. Die Verbindungen können durch übliche Chromatographieverfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Der BBM-1675-Komplex und seine bioaktiven Komponenten zeigen sowohl antimikrobielleEigenschaften als auch eine Antitumorwirkung.
In den angeschlossenen Zeichnungen zeigen Fig. 1 das Infirarotabsorptionsspektrum des teilweise gereinigten BBM-1675 Aj (KBr-Preßling), Fig. 2 das Infirarotabsorptionsspektrum des teilweise gereinigten BBM-1675 A2 (KBr-Preßling), Fig. 3 das Infrarotabsorptionsspektrum von BBM-1675 A3 (KBr-Preßling), Fig. 4 das Infiarotabsortionsspektrum von BBM-1675 A4 (KBr-Preßling), Fig. 5 das Protonenmagnetresonanzspektrum des teilweise gereinigtenBBM-1675 Aj in CDCI3 (60 MHz),Fig. 6 das Protonenmagnetresonanzspektrum des teilweise gereinigten BBM-1675 A2 in CDCI3 (60 MHz), Fig. 7 das Protonenmagnetresonanzspektrum von BBM-1675 A3 in CDCI3 (60 MHz), Fig. 8 das Protonenmagnetresonanzspektrum von BBM-1675 A4 in CDCI3 (60 MHz), Fig. 9 das Ihffarotabsoiptionsspektrum des gereinigten BBM-1675 Aj (KBr-Preßling), Fig. 10 das Protonenmagnetresonanzspektrum des gereinigten BBM-1675 Αγ in CDCI3 (360 MHz), Fig. 11 das ^C-Ma-gnetresonanzspektrum des gereinigten BBM-1675A ^ in CDCI3 (903MHz), Fig. 12 das Infrarotabsorptionsspektrum des gereinigten BBM-1675 A2 (KBr-Preßling), Fig. 13 das Protonenmagnetresonanzspektrum des gereinigten BBM-1675 A2 in CDCI3 (360MHz) und Fig. 14 das ^C-Magnetresonanzspektrum des gereinigten BBM-1675 A2 in CDC13(90,3 MHz).
Der erfindungsgemäß verwendete Eltemstamm Actinomadura verrucosospora H964-92 wurde aus einer in Pto Esperanza, Misiones, Argentienien, gesammelten Bodenprobe isoliert. Eine biologisch reine Kultur dieses Organismus wurde bei der American Type Culture Collection, Washington D. C. hinterlegt und der dortigen permanenten Sammlung von Mikroorganismen als ATCC 39334 hinzugefügL In der Folge wurde der Mutantenstamm A1327Y durch übliche Nitrosoguanidinbehandlung (NTG) des Stamms H964-92 gewonnen und bei der American Type Culture Collection als ATCC 39638 hinterlegt
Wieesbei vielen Antibiotika produzierendenKulturenderFall ist, ergibtauchdie Fermentation von Actinomadura verrucosospora Stamm H964-92 oder Stamm A1327Y eine Mischung oder einen Komplex von Bestandteilen.
Zwei stärker bioaktive Komponenten, BBM-1675 Aj und A2 und vier weniger bioaktive Komponenten BBM-1675 A3, A4, B 2 und B2 wurden aus dem BBM-1675 Komplex, der während des Fermentationsprozesses gebildet wurde, abgetrennt. BBM-1675 und seine Bestandteile BBM-1675 Aj, A2, A3, A4, Bj und B2 zeigen eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen einschließlich speziell grampositiver Bakterien. Der BBM-1675 Komplex und die daraus abgetrennten bioaktiven Komponenten zeigen auch phageninduzierende Eigenschaften in lysogenen Bakterien. Zwei der Bestandteile, BBM-1675 Aj und A2 wurden einer in vivo Prüfung gegen verschiedene Maustumorsysteme unterworfen und zeigen eine Inhibitionswirkung gegen L-1210-Leukämie, P-388-Leukämie, B 16-Melanom und Lewis Lungenkarzinom. BBM-1675 A3 und A4 zeigten eine Wirkung gegen P-388-Leukämie bei Mäusen. Der Komplex und seine bioaktiven Komponenten können daher als antimikrobielle -2-
AT 393 691B
Mittel oder als Antitumormittel zur Inhibierung von Säugetieitumoren verwendet werden.
Der Mikroorganismus:
Der Actinomyceten-S tamm H964-92 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und zur Charakterisierung durch 5 übliche Verfahren als biologisch reine Kultur entwickelt. Der Stamm H964-92 bildet kurze Sporenketten im Luftmycel, die gerade, gebogen oder gekrümmte Formen zeigen. Die Sporen sind kugelig oder oval geformt und haben eine warzige Oberfläche. Das Luftmycel ist auf den meisten Medien schlecht ausgebildet. Die Farbe der Luftmasse ist weiß, das sich später in rosa verfärbt und auf manchen Argarmedien weiter eine bläuliche Farbe annimmt. Das Substratmycel ist farblos oder schwach rosa. Die Wachstumstemperatur liegt im Bereich von IS bis 10 43 °C. Die Zusammensetzung der Zellwandaminosäuren und der Zuckerbestandteile aus dem ganzen Zellhydrolysat zeigt, daß der Stamm H964-92 zu der Zellwandtype ÜIB gehört Das Menachinon wurde als MK-9(Hg).MK-9(Hg) identifiziert
Basierend auf den hauptsächlichen morphologischen, kulturellen und physiologischen Eigenschaften gemeinsam mit den chemischen Zellwandzusammensetzungsmerkmalen kann der Stamm H964-92 als ein solcher, der zur 15 Gattung Actinomadura gehört, klassifiziert werden.
Obwohl der ursprüngliche Stamm H964-92 nur mäßiges Wachstum und spärliches Luftmycel zeigte, konnte durch Behandlung mit NTG (Nitrosoguanidin) von H964-92 eine Variante gewonnen werden, die ein gutes Wachstum und eine verbesserte LuftmyceMdung zeigte. DieseVariante, die als Stamm A1327Y bezeichnetwurde, erleichterte die weitere klassifizierende Untersuchung und wurde schließlich als Actinomadura verrucosospora 20 identifiziert.
Verfahren:
Die zur Prüfung der Kultureigenschaften und der Kohlehydrataufnahme verwendeten Medien und Verfahren waren jene, die von International Streptomyces Project (Intl. J. Syst. Bacteriol, 16, 313-340,1966) empfohlen 25 werden. Zusätzliche Medien, die von S. A. Waksman (The Actinomycetes, Vol. 2) und G. M. Lvedemann (Intl. J.
Syst. Bacteriol. 21, 240-247,1971) beschrieben sind, wurden ebenfalls verwendet. Die Zusammensetzung der Zellwandaminosäuren und die Zuckeikomponenten des gesamten Zellhydrolysats wurden gemäß den von Becker et al. in Appl. Microbiol. 13,236-243,1965 bzw. von Lechevalier und Lechevalier in The Actinomycetes, Ed. H. Prauser, Jena, Gustav Fischer Verlag. S. 393-405,1970beschriebenen Verfahren analysiert. Das Menachinon wurde 30 durch Massenspektralanalyse gemäß den Verfahren von Collins et al. in J. Gen. Microbiol. 100,221-230,1977 identifiziert und die Menachinon-Zusammensetzung wurde, basierend auf dem von Yamada et al. in J. Gen. Appl. Microbiol. 23,331-335,1977 beschriebenen System dargestellt
Morphologie: 35 Der Stamm H964-92 bildet sowohl ein Substrat- als auch ein Luftmycel. Das Substratmycel ist lang, verzweigt und nicht in kurze Abschnitte zerteilL Im Luftmycel bilden sich kurze Sporenketten monopodisch oder an der Hyphenspitze. Wirtelartige Verzweigungen der Sporenkette werden ebenfalls nahe der Hyphenspitze beobachtet. Diese Sporenketten enthalten 2 bis 10 Sporen in einer Kette und sind gerade, gekrümmt oder hakenförmig. Die Sporen haben eine warzige Oberfläche und sind kugelig bis elliptisch (0,5-0,6 x 0,6-1,4 pm) mit abgerundeten oder 40 spitzen Ecken. Nach der Reifung wird jede Spore oft mit einer leeren Scheide abgetrennt. Freibewegliche Sporen,
Sporangien oder sclerotische Körner wurden in keinem der untersuchten Medien gefunden.
Physiologische und Kultureigenschaften:
Das Wachstum des Stamms H964-92 ist sowohl im chemisch definierten als auch im natürlichen organischen 45 Medium schwach bis mäßig. Die Bildung des Luftmycels ist im allgemeinen schwach bis mäßig in Haferschrotagar (ISP-Medium Nr. 3), anorganischem Salz-Stärke-Agar (ISP-Medium Nr. 4) und Bennett-Agar. Spontane Varianten ohne Luftmycel treten häufig auf. Die Farbe des Luftmycels ist weiß, das später in Haferschrotagar, anorganischem Salzstärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar (ISP-Medium Nr. 5) schwach rosa wird. Die Farbe der Luftmasse ändert sich nach langer Inkubation (5 Monate) in Haferschrotagar, Glycerin-Asparagin-Agar und Tyrosin-Agar zu 50 einer bläulichen Farbe. Das Substratmycel ist faiblos bis gelblich in Czapeks Agar, Tyrosinagar, Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-Medium Nr. 2) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP-Medium Nr. 6) und Bennett-Agar und hat eine rosa Farbe in Glucose-Asparagin-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar. Melanoide und andere diffundierbare Pigmente werden nicht produziert. Eine Variante Nr. A1327Y, die aus dem ursprünglichen Stamm erhalten wurde, bildet hauptsächlich ein schwach blaues Luftmycel und trägt eine reichliche Luftsporenmasse. 55 Der Stamm H964-92 wächst bei lS^C, 28 °C, 37 °C und 43 °C, jedoch nicht bei 10 °C oder bei 47 °C. Er ist auf
NaO bei 7 % empfindlich und ist resistent gegen Lysozym bei 0,01 %.
Die physiologischen und die Kulturbedingungen des produzierenden Stammes sind in den Tabellen 1 bzw. 2 -3-
AT 393 691B gezeigt Die Aufnahme von Kohlenstoffquellen ist in Tabelle 3 gezeigt.
jabsllgJL
Kulturmerkmale des Stamms H964-92 fursprünglicher Stamm ATCC 39334 und Variante Α1327ΥΊ
Stamm Nr. H964-92
Originalstamm (ATCC 39334) Variante Nr. A1327Y Actinomadura verrucosospora KCCA-0147 Trypton- W: reichlich, mäßig, flockig mäßig, flockig Hefeextrakt- flockig, sedimentiert sedimentiert und sedimentiert und Agar (ISP Nr. 1) und nicht pigmentiert nicht pigmentiert nicht pigmentiert Saccharose- W: mäßig schwach schwach Nitrat-Agar U: farblos farblos farblos (Czapek-Agar) L: spärlich keines oder keines od. spärlich; hellgrau (264) bis schwach rosa (7) spärlich, rosaweiß (9) blaßblau (185) Glucose- D: keines keines keines Asparagin-Agar W: mäßig schwach schwach U: weiß (263) bis dunkel-gelbrosa (27) farblos farblos L: keines oder keines oder keines oder sehr sehr spärlich sehr spärlich spärlich, blaßrosa(7) weiß weiß D: keines keines keines Glycerin- Asparagin-Agar W: schwach bis mäßig mäßig mäßig (ISP Nr. 5) U: farblos bis hellgelb- hell gelbrosa (28) heli gelbrosa (28) rosa (28) bis dunkel gelbrosa (27) Lr schwach; hell mäßig, weiß mäßig, weiß bis gelbrosa (28), nach 5 Monaten hdlblaugran(190) bis hellrosa (4) stark rosa (2) D: keines keines keines Anorganisches W: reichlich mäßig mäßig Salz-Stärke- U: gelblichweiß (92) hell gelbrosa (28) hell gelbrosa (28) Agar (ISP Nr. 4) L: reichlich, hell- mäßig, hellblau- reichlich, blaß rosa (4) Ins rosagrau (10) grau (190) blau (185) D: keines keines keines Tryptosin- W: mäßig mäßig mäßig Agar (ISP Nr. 7) U; gelblichweiß (92) stark gelbrosa (26) stark gelblichrosa (26) L: schwach, hell- mäßig, weiß bis mäßig, weiß bis gelblich rosa (28), viel später (5 Monate) teilweise hellblaugrau (190) hellrosa (4) hellrosa (4) Dikeines keines keines 4-
AT 393 691B
Fortsetzung Nähragar W: schwach bis mäßig U: blaßgelb (89) L: keines D: keines Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar(ISPNr. 2) W: reichlich U: hellgelb (89) L: schwach weiß (263) D: keines Haferschrot-Agar (ISP Nr. 3) W: mäßig U: farblos bis blaßrosa (7) L: schwach, rosa-weiß (9) bis hellblaugrau (190) D: keines Bennett- Agar W: reichlich U: graugelb (90) L: mäßig; weiß (263) bis gelblichweiß (92) D: keines Pepton-Hefe-extrakt-Eisen-Agar (ISP Nr. 6) W: mäßig U: farblos L: keines D: keines schwach schwach farblos bis farblos bis schw. schw. rosa (7) rosa (7) rosa (7) keines keines keines keines reichlich üppig stark gelb- stark gelb- rosa (26) rosa (26) schwach; weiß bis schwach, weiß bis blaßrosa (7) blaßrosa (7) keines keines schwach schwach blaß gelblich- blaß gelblich- rosa (31) rosa (31) sehr spärlich; sehr spärlich, lebhaft blaß lebhaft blaßblau blau (184) (184) keines keines reichlich reichlich stark gelb- stark gelb- rosa (26) rosa (26) mäßig; schwach keines gelblich rosa (31) und bläulich weiß (189) keines keines reichlich reichlich farblos farblos keines keines keines keines
x Beobachtet nach einer Inkubation von 3 Wochen bei 37 °C xx Abkürzungen: W: Wachstum, U: Umkehrfarbe, L: Luftmycel, D: Diffundierbares Pigment xxx Farbe und Nummer in der Klammer folgen dem Farbstandard in "Kelly, K. L. & D. B. Judd; ISCC-NBS Farbnamenkarte, mit Centroid-Farben illustriert. US-Dept of Comm. cir. 553, Washington D. C. Nov. 1975". -5-
AT 393 691B
Tabelle 2
Phvsioligische Merkmale des Stammes H964-92
Test Temperaturbereich für das Wachstum
Methode und Medium Bennett-Agar
Ergebnis
Maximales Wachstum bei 28 °C bis 37 °C. Mäßig bei 20 °C und 43 °C. Kein Wachstum bei 10 °C und47°C
Gelatine-Verflüssi gung Stärkehydrolyse Reaktionen in Magermilch Bildung von Mela-noid-Pigment verflüssigt hydrolysiert nicht koaguliert und vollständig peptonisiert nicht gebildet
Nitratreduktion nicht reduziert
Widerstandsfähigkeit Wachstum bei 5 % oder gegen NaCl weniger, kein Wachstum bei7%
Glucose-Pepton-Ge- latine-Medium Stärke-Agar-Platte Difco-Magermilch Tyrosin-Agar, Pepton-Hefe-Eisen-Agar und Trypton-Hefeextrakt-Brühe Czapek-Clucose-Nitrat-Brühe und Glucose-Hefeextrakt-Nitrat-Brühe Trypton-Hefeextrakt- Agar
Lysozym resistent, Wachstum bei 0,01 % oder weniger kein Wachstum bei 0,1 % pH Wachstum bei 5,0 bis 9,5. Kein Wachstum bei 4,5 und10,0
Trypton-Hefeextrakt- Agar
Trypton-Hefeextrakt- Agar
Bbsite1 Aufnahme von Kohlenstoffauellen Stamm Nr. H964-92
Original Variante Stamm Nr. A1327Y
Actinomadura verrucosospora KCCA-0147
Glycerin + + D(-)-Arabinosa - - L(+)-Arabinose + + D-Xylose + + D-Ribose + - L-Rhamnose + + + + + + 6- AT 393 691B Tabelle 3 (Fortsetzung)
Stamm Nr. H964-92 Actinomadura Original Variante vemicosospora Stamm Nr. A1327Y KCCA-0147 + + + + + + + + + + + + + + + -t- + + 4- + + + - . + + + D-Glucose D-Galactose D-Fructose D-Mannose L(-)-Sorbose
Saccharose
Lactose
Cellobiose
Melibiose
Trehalose
Raffmose D(+)-Melezitose Lösliche Stärke
Cellulose
Dulcit
Inosit D-Mannit D-Sorbit
Salicin
Beobachtet nach einer Inkubation von 3 Wochen bei 28 °C Basismedium: Pridham-Gottliebs anorganisches Medium
Zellwandzusammensetzung und Zuckeihestandteile der gesamten Zelle
Gereinigte Zellwand des Stammes H964-92enthältMesodiaminopimelinsäure, jedoch kein Glycin. Das gesamte Zellhydrolysat zeigt die Anwesenheit von Madurose (3-0-Methyl-D-galactose), Glucose und Ribose. Die Zellwandaminosäure und die Gesamtzellenzuckerbestandteile deuten darauf hin, daß der Stamm H964-92 zum Zellwandtyp lüg gehört. Die Hauptkomponenten des Menachinon wurden als MK-9(Hg) und MK-9(Hg) identifiziert.
Taxonomische Stellung des Stammes H964-92
Der Stamm H964-92 hat folgende Hauptmerkmale: (1) Luftsporenketten: kurz, gerade, gebogen oder hakenförmig. (2) Sporen: warzige Oberfläche. (3) Luftmycel: rosa oder bläuliche Farbe (4) Substratmycel: rosafarben in manchen Medien. (5) Diffundierbares Pigement: keines. (6) Mesophil. (7) Zellwandtyp lüg. (8) Menachinon-System: MK-9(Hg) und MK-9(Hg).
Diese Hauptmerkmale deuten darauf hin, daß der Stamm H964-92 zu der Gattung Actinomadura gehört Frühe Formen der Gattung Actinomadura wurden aus Säugetieren isoliert. Manche Stämme wurden auch aus Pflanzenmaterial gewonnen. Jedoch viele der in letzterZeit voigeschlagenen neuen Arten wurden aus dem Boden isoliert Gemäß der numerischen Taxonomie und dem Überblick über die Actinomadura und verwandten Actinomyceten von Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. 1124)5-111 (1979) werden die meisten Actinomadura-Arien aus dem Boden in Gruppen Nr. 7 unter den 14 beschriebenen Gruppen eingeteilt Der Stamm Nr. H964-92 ist den Arten von Gruppe 7 am meisten verwandt. Nonomura und Ohara in J-Ferment. Technol. 49,904-912 (1971) berichteten von fünf saprophytischen Arten der Gattung Actinomadura und Nonomura (J. Ferment TechnoL 52,71-77 (1974) und Preobrazhenskaya et al. (Actinomycetes and Related Organisms 12,30-38, (1977) veröffentlichten die Schlüssel zur Identifizierung und Klassifizierung der Gattung Actinomadura. Als ein Resultat des Vergleichs mit der Beschreibung von 30 Arten einschließlich der in den Patenten beschriebenen Organismen erscheint der Stamm H964-92 als sehr ähnlich mit Actinomadura coerula,der in der obengenannten Preobrazhenskaya et al.-Literaturstelle beschrieben ist, -7-
AT 393 691B und mit Actinomadura verrucosospora, dar in den oben genannten Nonomura-Literaturstellen beschrieben ist
Der Stamm Nr. H964-92 wurde direkt mit A.verrucosospora Stamm KCC A-0147 verglichen und es wurde gefunden, daß er mit A.verrucosospora in den morphologischen Züchtungs- und physiologischen Bedingungen nahe verwandt ist. Somit wird der Stamm H964-92 als ein neuer Stamm von Actinomadura verrucosospora klassifiziert. 5 Es versteht sich, daß für die Herstellung von BBM-167S die vorliegende Erfindung, obwohl sie im Detail im
Zusammenhang mit dem besonderen Stamm Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) und dem Mutantenstamm desselben mit der Bezeichnung A1327Y (ATCC 39638) beschrieben ist, nicht auf diese Mikroorganismen oder Mikroorganismen beschränkt ist, die durch die hier geoffenbarten Züchtungsmerkmale voll beschrieben sind. Es ist die spezielle Absicht, daß die Erfindung den Stamm H964-92 und alle natürlichen und 10 künstlichen BBM-1675 produzierenden Varianten und Mutanten desselben umfassen soll.
Herstellung des Antibiotikums
Die Antibiotika BBM-1675 der vorliegenden Erfindung können durch Züchtung eines BBM-1675 produzierenden Stamms von Actinomadura verrucosospora, der die Idendifikaüonsmerkmale von ATCC 39334 oder 15 ATCC 39638 hat, in einem üblichen wässerigen Nährmedium hergestellt werden. Der Organismus wird in einem die für Actinomyceten bekannten Nährstoffquellen enthaltenden Nährmedium gezüchtet, d. h. mit assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie gegebenenfalls anorganischen Salzen oder anderen bekannten Wachstumsfaktoren. Es wird unter aeroben Submersbedingungen gearbeitet, obwohl für die Herstellung begrenzter Mengen auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden können. Die allgemeinen für die Züchtung von 20 anderen Actinomyceten verwendeten Verfahrensweisen sind für die vorliegende Erfindung anwendbar.
Das Nährmedium sollte eine geeignete assimilierbare Kohlenstoffquelle wie Glycerin, L(+)-Atabinose, D-Xylose, D-Ribose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Fructose, Saccharose, Cellobiose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Inosit »ithalten. Als Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, etc. entweder allein oder in Kombination mit organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleisch-25 extrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl etc. verwendet werden. Es können dazu erforderlichenfalls auch anorganische Nährsalze zugesetzt werden, um Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Carbonat, Zink, Magnesium, Mangan, Cobalt, Eisen u. dgl. zu liefern.
Die Herstellung der BBM-1675-Antibiotika kann bei jeder zu einem zufriedenstellenden Wachstum des Produktionsstammes führenden Temperatur z. B. bei 15-45 °C vorgenommen werden und wird üblicherweise bei 30 einer Temperatur von etwa 27-32 °C durchgeführt. Normalerweise wird eine optimale Produktion erreicht nach Inkubationszeiten von etwa 68-180 Stunden, Je nachdem ob eine Schüttelflaschenfermentation, eine Fermentation im RührgefÜß odereine Tankfermentation vorgenommen wird. Wenn im Tank fermentiert werden soll, ist es günstig, ein vegetatives Inoculum in einer Nährbrühe durch Inoculieren der Brühenkultur mit einer Schräg- oder Bodenkultur oder ein»- lyophilisierten Kultur des Produktionsorganismus herzustellen. Nachdem auf diese Weise ein aktives 35 Inoculum gewonnen wurde, wird es aseptisch in das Fermentationstankmedium eingebracht. Die Antibiotikum-Produktion kann durch die Papierscheiben-Agardiffiisionsmethode unter Vewendung von Staphylococcus aureus 209P als Testorganismus überwacht werden.
Isolierung und Reinigung 40 Nach Abschluß der Fermentation kann der BBM-1675-Komplex durch übliche Isolierverfahren aus der Brühe gewonnen werden, z. B. duichLösungsmittelextraktion. So kann z. B. die gesamteBrühedurch Filtration oder durch Zentrifugieren in den Mycelkuchen und die überstehende Brühe getrennt werden. Aus dem Mycelkuchen kann das Antibiotikum durch Suspension des Kuchens in Methanol, Filtration des unlöslichen Materials und Einengung des methanolischen Extraktes gewonnen werden. Aus der überstehenden Brühe können die Wirkstoffe durch Extraktion 45 mit n-Butanol gewonnen werden. Die oben genannten n-Butanol- und Methanolextrakte können dann vereinigt und azeotrop abgedampft werden, wobei eine wässerige Lösung erhalten wird, in der sich die Hauptmenge an Aktivstoff als öliger Feststoff absetzt. Der Feststoff kann dann in Methanol gelöst und die Lösung abfiltriert werden. Das Filtrat wird eingeengt und mit ein» Mischung aus Äthylacetat und Wasser versetzt Der entstehende organische Extrakt enthält den rohen BBM-1675-Komplex, der durch Zusatz eines Antilösungsmittels, wie n-Hexan, ausgefällt werden 50 kann.
Der rohe BBM-1675-Komplex besteht aus einer Mischung verschiedener Bestandteile und umfaßt zwei bioaktive Hauptkomponenten BBM-1675 Aj und A2 sowie vier weniger bioaktive Komponenten, BBM-1675 A3, A4, Bj und B2. Diese bioaktiven Komponenten können durch übliche chromatographische Verfahren aufgetrennt und gereinigt werden. Bei einer Verfahrensweise wird der rohe BBM-1675-Komplex zuerst in Methanol gelöst und 55 durch Chromatographie über einer Sephadex LH-20-Säule unter Verwendung von Methanol als Eluierlösungsmittel gereinigt Dieser teilweise gereinigte Komplex kann auf einer Silicagelsäule Chromatographien und stufenweise eluiert werden, wobei Chloroform mit ein» anteigenden Konzentration von Methanol verwendet und BBM-1675 -8-
AT 393 691B
Aj, eine Mischung von BBM-1675 Aj, A3 und A4 und eine Mischung von BBM-1675 Bj und B2 erhalten wird. Die Aj-Komponente kann weiter durch Chromatographie auf einer Sephadex LH-20-Säule unter Verwendung von Methanol als Eluierlösungsmittel gereinigt werden. Die Mischung von A2, A3 und A4 kann durch Chromatographie auf ein«’ Bondapak Cjg-Säule (Waters Associates, Inc.) unter Verwendung ansteigender Konzentrationen von wässerigem Acetonitril als Eluiermittel getrennt werden. Die Mischung derB^- und B2~Koinponenten kann durch Silicagel-Säulenchromatographie getrennt werden, wobei eine Mischung aus Chloroform und Methanol als Eluierlösungsmittel verwendet wird. Weitere Details der bevorzugten chromatographischen Trennverfahren sind in den folgenden Beispielen angegeben.
Physikochemischen Eigenschaften der BBM-1675-Komponenten
Die sechs bioaktiven Komponenten des BBM-1675-Komplexes sind voneinander durch zwei Dünnschicht-chromatographie-(DSC)-systeme unterscheidbar, wie in der folgenden Tabelle angegeben ist.
Tabelle 4 DSC der BBM-1675-Komnonenten Rf-Werte SiOj * Silanisiert
Komponente CHCI3-CH3OH (5:1 v/v) CH3CN-H20(75:25 v/v) BBM-1675 Aj BBM-1675 A2 0,74 0,18 0,71 0,21 BBM-1675 A3 0,72 0,28 BBM-1675 A4 0,71 0,78 BBM-1675 Bj 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16 * Cjg Umkehrphasensilicagel
Die Trennung von BBM-1675A2, A3 u«l A4 warbeNbnnalphasen-DSC-Systemen schwierig, konnte jedoch durch eine Umkehrphasen-DSC erreicht werden.
Die einzelnen BBM-1675-Komponenten zeigen zueinander ähnliche Löslichkeits- und Farbreaktionen. Beispielsweise sind in Chloroform, Äthylacetat-Aceton, Äthanol und Methanol löslich, schwach löslich in Benzol und Wasser und unlöslich in n-Hexan und Tetrachlorkohlenstoff. Sie geben positive Reaktionen mit Ferrichlorid, Ehrlich's und Tollen's Reagens, jedoch negative Ergebnisse bei den Sakaguchi-, Ninhydrin- und Anthron-Tests.
Charakteristische physikochemische Eigenschaften der BBM-1675-Komponenten sind in der folgenden Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Physikochemische Eigenschaften der BBM-1675-Komponenten BBM-1675 Aj Ä2 A3 a4 Bl B2 Schmelzp. (Zers): 156-158 °C 147-149 °C 125-127 °C 123-126 °C 159-161 °C 156-159 °C [o]D27(cOACHa3): -191° -179,4° -161° -176° -171° -122° Anal. gef. (%) C: 51.52 53.81 55.00 53.67 H: 5.81 6.31 6.52 6.35 N: 4.02 3.82 3.57 3.45 (aus d. Differenz) O: 38.65 36.06 34.91 36.53 9- AT 393 691B Tabelle 5 (Fortsetzung!
Physikochemische Eigenschaften da- BBM-1675-Komoonenten BBM-1675 Aj A2 UVVa^iE1*!^) in CH3OH: 253(325) 253 (325) 253 (281) 282(195) 282(172) 320(143) 320(128) in 0,01N HCl-CHßOH: 253 (323) 253 (276) 282(192) 282(167) 320(144) 320(128) inO,01NNaOH-CH3OH: 252(325) 252(289) 283 (172) 283 (171) 318 (136) 318(122) Molgew. (ungefähr«· Wert) uoo 1,100 (Gel HPLC, Finepak GEL-101) A3 A4 B1 b2 253 (286) 282(158) 320(122) 253 (257) 282(153) 320(117) 253(225) 282(140) 320(104) 248 (212) 279 (141) 318(103) 253 (287) 282(160) 320(126) 253 (258) 282(155) 320(118) 253 (225) 282(140) 320(105) 248(210) 279 (140) 318 (103) 252(280) 283 (162) 318 (120) 252(266) 283 (160) 318(118) 252(236) 282(141) 318 (105) 248 (233) 278(150) 318 (110) 1,100 1,400
Die UV - Absorptionsmaxima der BBM-1675-Komponenten wurden bei 253,282 und 320 nm beobachtet und verschoben sich nicht in sauerer oder alkalischer Lösung. Die IR- und PMR-Spektren von BBM-1675 Aj, k^, A3 und A4 sind in den Fig. 1-4 bzw. 5-8 gezeigt Die 360 MHz PMR des BBM-1675 Aj deutet auf eine Acetyl-(δ: 2,11 ppm), eine N-CH3-(2,52 ppm), vier OCHj-ß,·42,3,80,3,88 und3,98 ppm) und eine Exomethylengruppe(n) (4,57 und 5,48 ppm) gemeinsam mit zwei aromatischen (7,50 und 8,59 ppm) und einem NH-Proton (11,79 ppm). Das CMR-Spektrum des BBM-1675 Aj zeigte 55 Kohlenstoffsignale einschließlich eines Signals mit der dreifachen Intensität (δ: 56,0 ppm OCH3). Basierend auf den Protonen- und ^C-NMR-Spektren, der Mikroanalyse und Molekulargewichtsbestimmung durch HPLC und SIMS (Sekundärionenmassenspektrometrie) wurde eine Molekularformel für BBM-1675 Aj mit C57H72N4O32 abgeleitet
Strukturuntersuchung des BBM-1675 A^
Durch Behandlung mit 0,5N HCI-CH3OH bei Raumtemperatur verliert das BBM-1675 Aj seineBioaküvitätund liefert eine lipophile Chromophore Substanz (Verbindung I) gemeinsam mit einigen unidentifizierten Fragmenten. Verbindung I zeigt eine ähnliche UV-Absorption wie das ursprüngliche Antibiotikum, was nahelegt, daß die Verbindung I die Chromophore Struktur des BBM-1675 Aj beibehält Zwei andere mit der Verbindung I verwandte Chromophore Fragmente werden durch alkalische Hydrolyse von BBM-1675 Aj erhalten: Hydrolyse mit 0.05N KOH-CH3OH bei 55 °C während einer Stunde ergibt Verbindung Π mit UV-Absorptionsmaxima bei 252,284,297 (Schulter) und 322 nm, während die Reaktion in IN KOH-CH3OH eine saure Chromophore Substanz ergibt, die als Verbindung m bezeichnet wurde. Die physikochemischen Eigenschaften der Verbindungen I, Π und m sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengefaßt:
Tabelle 6
Eigenschaften der Verbindungen I. Π und ΙΠ Verbindung I Verbindung Π Verbindung ΠΙ Schmp.: 82-83 °C 133° 253-255 °C [a]29D(c 0,2 CHCI3): -100 °C 0 0 Molekularformel: C21H31NO10 Cl4H17N06 Cl3H15N06 10- AT 393 691B Tabelle 6 (Fortsetzung)
Eigenschaften der Verbindungen I. Π und m V»bindungl Verbindung Π Verbindung m UVA^CH30Hnm('* 244(21,850) 252(26,600) 248(26,900) 276 (9,400) 283(11,200) 295(14,400) 318 (6,300) 297 (sh 8,800) 322(11,700) 310(13,500) MS m/z: 457 (M+) 295 (M+) 281 (M+) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 (Xylol-*MEX-CH3OH = 264 248 218 = 5:5:1 v/v): Rf0,58 0,66 0,13 * MEK = Methyläthylketon
Strukturinformationen über die Verbindungen Π und m wurden aus den folgenden Spektraldaten und chemischen Umwandlungen erhalten. Die ^CundProtonen-NMRdeutetaufdieAnwesenheitvonvierOCHß-.einer^CH^-, sieben -C= zwei ^C=0- und einer ^NH-Gruppe in Verbindung Π hin. Die NMR-Spektren von Verbindung m waren ähnlich jenen von Verbindung Π und unterschieden sich nur in der Abwesenheit von einer der vier OCH3-Gruppen, die bei Verbindung Π gefunden worden waren. Dies» Unterschied, zusammen mit der sauren Natur der Verbindung ΙΠ, legt nahe, daß die Verbindung II ein Methylester der Verbindung m ist Beim Erhitzen unter Rückfluß mit IN methanolischer KOH wurde die Verbindung Π quantitativ in die Verbindung m umgewandelt, während die Verbindung m durch Behandlung mit Diazomethan in Verbindung Π umgewandelt wurde. Behandlung der Verbindung Π mitNaBH^ in C^HgOH ergab ein Reduktionsprodukt (Verbindung IV, M+:m/z267), das im NMR eine -CH^OH-Gruppe anstelle der -COOCHj-Gruppe der Verbindung Π zeigte. Nach derHydrierung über Palladium auf Aktivkohle lieferte die Verbindung Π ein Dihydroderivat (Verbindung V, M+: m/z 297). Das Protonen-NMR-Spektrum der Verbindung V zeigte ein neues Doublett-Methylsignal und das Fehlen der in Verbindung Π vorhanden gewesenen Exomethylen-Gruppe. Weiters erschien eine der OCHg-Gruppen bei höherem Feld (δ: 3,50 ppm) in Verbindung V. Diese Resultate deuten auf das Vorhandensein ein» -c=ch2 I -Gruppe OCH3 in V»bindung Π, die durch Hydrierung in eine -c=ch3 I -Gruppe OCH3 in Verbindung V umgewandelt wurde. Verbindung Π wurde mit 1,5N methanolischer HCl bei 80 °C 3 Stunden erhitzt und das Hydrolysat über eine Silicagelsäule chromatographiert, um eine schwach basische Verbindung (Verbindung VI, M+: m/z 211) zu »halten. Das IR-Spektrum und die physikochemischen Eigenschaften deuten darauf hin, daß die V»bindung VI eine hffl^-Gruppe enthält. V»bindung VI wurde durch vergleichende IR- und NMR-Studien mit einer authentischen Probe als Methyl-4,5-dimethoxyanthranilat identifiziert. Demzufolge wurden die Strukturen der Verbindungen Π-VI wie folgt bestimmt: -11-
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Strukturen der Verbindungen Π. ΠΙ. IV, V und VI
Verbindung Π Veibindangm
Durch die Behandlung mit 0,05N KOH-CH3OH bei 55 °C spaltete sich Verbindung I in ein neues chromqphores Fragment (Verbindung VH, C15¾ jNOy, M+: m/z 327) und einen Zucker (Verbindung Vm). Das NMR-Spektrum von VH zeigte ein Singulett C-CH3 und zwei Hochfeld-OC^-Gruppen zusätzlich zu drei Niederfeld-OC^-Gruppen und zwei aromatischen Protonen, die üblicherweise für die Verbindungen Π, V und VI beobachtet werden. Weitere Hydrolyse von VH mit 1,5N methanolischem Chlorwasserstoff ergab die Verbindung VI, die ident war mit jener Verbindung, die oben aus Π »halten worden war. Nach der Abtrennung von VI wurde das Hydrolysat mit2,4-Dinitrophenylhydrazin behandelt, um einen gelben Feststoff auszufällen, der als das 2,4-Dinitrophenylhydrazon der Brenztraubensäure identifiziert wurde. Somit besteht die Verbindung VH aus MethyM^-dimethoxy-N^'^-dimethoxypropionyl)-anthranilaL Die Verbindung Vm zeigte nicht den molekularen Ionenpeak, sondern zeigte den M-OC^-Peakbeim/z 131 im Massenspektrum in Übereinstimmung mit der Molekularformel C7H14Ο4. Das NMR-Spektrum wies darauf hin, daß die Verbindung Vm die 2,6-Dideoxyhexopyianose-Struktur hat Die Zuordnung wurde durch das1 ^C-NMR von Verbindung I unterstützt, die ein C-CH3, ein -CHj, drei 0-CH< und ein anomerisches Kohlenstoff zusätzlich zu 15 der Verbindung VII zuzuordnenden Kohlenstoffsignalen zeigte. Das C3-Proton des Zuckers erschien im Niederfeld (δ: 5,39 ppm, Oktett) und zeigte, daß das C3-OH desZuckers durch die Carboxylgruppe von VH verestert ist Die obigen Resultate sind im folgenden zusammengefaßt -12-
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Verbindung I Verbindung VII
Verbindung VI
L-at3-co-coa8
Das Molekulargewicht der Verbindung I (457) macht etwa ein Drittel des gesamten Moleküls des BBM-1675 A j aus (vorgeschlagene Formel ¢57^72^4^325 berechnetes Molgewicht = 1324). Die Partialstruktur des BBM-1675 Aj wird wie folgt angenommen:
Im Laufe der Arbeiten hat sich herausgestellt, daß die oben beschriebenen und gemäß dem folgenden Beispiel 2 hergestellten Komponenten BBM-1675 Aj und A2 tatsächlich nicht vollständig rein waren und daß bestimmte der zur Bestimmung solcher Substanzen verwendeten kennzeichnenden Merkmale ungenau waren. Durch zusätzliche chromatographische Reinigungsverfahren, wie sie genauer in den Beispielen 3 und 6 beschrieben werden, wurden BBM-1675 Aj und A2 in gereinigterer Form isoliert und wie folgt gekennzeichnet Auch die Elementaranalysenwerte für die Verbindungen A3 und A4 wurden überarbeitet und zeigten die Anwesenheit von Schwefel in diesen Verbindungen und die HPLC-Retentionszeiten wurden für diese beiden Bestandteile berechnet. Im folgenden zusammengefaßt sind die physikochemischen Eigenschaften der BBM-1675-Bestandteile: BBM-1675 At
Beschreibung: weiße bis blaßgelbe Kristalle Schmp. 156-158 °C (Zers.) -13-
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Elementaranalyse: Analyse 1 Analvse2 Mittelwert C: 51,60 % C: 52,74 % C: 52,17 % H: 631% H: 5,99% H: 6,15% N: 531% N: 3,94% N: 4,63% S: 8,47% S: 9,71% S: 9,09% O (als Differenz): 28,31 % O (als Differenz): 27,62 % O (als Differenz): 27,96 %
Ultraviolettabsorptionsspektrum: Instrument Varian UV, Cary 219
Lösungsmittel: Methanol Konzentration: 0,01356 g/I w(nm) Absorptionen 320 12,4 280 Sch(Schulter) 253 25,1 210 25,5 keine deutliche Änderung mit Säure oder Base
Optische Drehung: Lösungsmittel - CHCl^ [a]D2^ = -207° (C = 0,0351)
Eine zweite Analyse zeigte die folgende optische Drehung: [<x]d27° = -191° (C = 0,5, CHCI3) IR-Absorptionsspektrum: vgl. Fig. 9
Hauptabsorptionsbanden (KBr): 985,1015,1070,1110,1150,1210,1250, 1308,1380,1405,1446,1520,1592,1608, 1668,1715,2920,2960,3360,3440, cm’1
Massenspektrum: Instrument: VG-ZAB-2F FAB-MS-Thioglycerin
Molekulare Massenbereichsionen (m/z): 1249,1357,1463; mitNaCl-Zusatz (m/z): 1271, 1379,1485,1597; FAB-MS-MB (MB:Matrix, M.G. 154); Molekulare
Massenbereichkonen (m/z): 1249,1283,1403,1555; mitNaCl-Zusatz (m/z): 1249, 1271, 1303,1425,1483,1577. FAB-MS-Glycerin-DMSO: Molekulare Massenbereichsionen (m/z): 1215,1247,1279, 1293,1325, 1353; mitNaCl-Zusatz (m/z): 1215,1237,1247,1269,1325,1347,1375. Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-Thioglycerin; Molekulare Massenbereichsionen (m/z): 1357,1463. Molekulargewicht (auf der Basis der oben angegebenen Massenspektralwerte) scheinbares MG = 1248 NMR-Spektrum: Instrument: WM 360 Bracker -14-
AT 393 691B Lösungsmittel: CDCI3 1NMR: 360 MHz 6(ppm): 11,75 (1H, s); 8,55 (1H, s); 7,45 (1H, s); 6,61 (1H, m); 6,23 (1H, brs);6,I7(IH,brs); 5,93 (lH,d,J=9,3); 5,82 (1H, d, J=93); 5,7 (1H, brs); 5,49 (lH,m); 5,45 (lH,d, J = 2,3); 5,38 (1H,1ks); 4^5 (1H, d, J = 10,2); 4,64 (2H, m); 4,54 (1H, d, J = 23); 4,2 (1H, s); 4,15-3,35 (26-28H) [4,10 (1H, m); 4,02 (1H, bis); 3,95 (3H, s); 3,85 (3H, s), 3,79 (3H, s); 3,46 (1H, m); 3,40 (3H, s)]; 2,82-2,70 (3H, brm); 2,50 (3H, s), 2,47 (1H, m); 238-232 (5H); 2,12 (1H, m); 2,11 (3H, s); 1,60-1,05 (22H) [139 (3H, d, J=6,3); 6,31 (3H, d, J = 6,3); 139 (3H, d, J = 63), 1,08 (6H)] vgl. Fig. 10
Cl3 NMR: 903 MHz,vgl. Fig. 11
In einer getrennten Untersuchung wurde das 1 -fc-NMRSpektrum des gereinigten BBM-1675 Aj an einer in CDCI3 gelösten Probe bestimmt (80 MHz). Die Haupt-Peaks sind im folgenden angegeben. CMR vom BBM-1675 A][ (80 MHz in CDCM Chemische Verschiebung in ppm (Multiolicität*') BBM-1675A! 13,7(q) 16,6(q) 173(q) 19,8(q) 223(q) 22,6(q) 23,4(q) 29,0(t) 34,0(t) 35,1(0 39,5(t) 473(d) 52,5(q) 55,6(u) 56,0(q) 57,l(d) 62,4(t) 64,5(d) 67,7(d) 683(d) 68,8(0 693(d) 69,6(t) 703(d) 71,9(d) 76,0(d) 76,6(d) 77,l(u) 773(d) 83,4(s) 86,6(d) 88,4(s) 903(0 973(d) 98,3(s) 99,0(d) 99,6(d) 103,8(d) 107,6(s) 112,5(d) 123,l(d) 124,9(d) 130,l(d) 1313(s) 134,9(s) 136,7(s) 144,0(s) 1473(s) 153,8(s) 154,4(s) 155,0(s) 160,7(s) 166,4(s) 191,8(s) * Multiplicität - q=Quartett; d= Doublctt; u = unbestimmt t=Triplett; s=Singlett BBM-1675 An
Beschreibung: weiße Kristalle, Schmp. 147-149 °C
Elementaranalyse: C: 52,71 % H: 5,94% N: 3,94% S: 9,39% O (als Differenz): 28,01 % UV-Absorptionsspektrum: Instrument: Varian UV, Caiy 219 Lösungsmittel: Methanol Konzentration: 0,02052 g/1
Absorptionen 320 123 282 16,3 252 263 214 25,8
Keine wesentliche Änderung mit Säure oder Base -15
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Optische Drehung; [a]j^ = -179,4° (c 0,5, CHClg) IR-Spektrum: vgl. Fig. 12
Instrument: Beckinan IR Modell 4240
Hauptabsorptionsbanden (KBr): 950,1015,1070,1100,1155,1213.1250,1313,1375, 1405,1450,1520,1595,1610,1685,1735,2940,2980,3440, cm'1.
Massenspektrum; Instrument: VG-ZAB-2F FAB-MS-Thioglycerin
Molekulare Massenbereichsionen (m/z): 968,1249,1355,1357,1463,1569; mitNaCl-Zusatz
NaCl (m/z): 990,1271,1379,1485,1593 FAB-MS-MB (MB: matrix, M. G. 154); Molekulare
Massaibereichsionen (m/z): 1249,1403,1419,1555,1571,1587; mitNaCl-Zusatz (m/z): 1249,1271,1425,1441,1457,1483,1577. FAB-MS-Glycerin-DMSO; Molekulare Massaibereichsionen (m/z): 1215,1231,1247,1263,1279,1293,1309,1325,1326,1341,1353,1369.
Molekulargewicht scheinbares Molekulaigew. = 1248 (auf der Basis der oben angegebenen Massenspektralweite) NMR-Spektrum: Vgl. Fig. 13 Resonanzspektren:
Instrument: WM 360 Brücker Lösungsmittel: CDCI3 ^NMR 360 MHz δ (ppm): 11,91 (1H, s); 8,62 (1H, s); 7,58 (1H, s); 6,56 (1H, m); 6,22 (1H, s); 6,15 (1H, brs); 5,91 (1H, d, J = 9,6); 5,83 (1H, d, J = 9,6); 5,70 (1H, m); 5,45 (1H, d,J=2,2); 5,44 (1H, s), 5,34 (1H, brs); 4,95 (1H, d,J= 10,2); 4,75 (1H, m); 4,65 (1H, d, J = 6,8); 4,54 (1H, d, J = 2,2); 4,47 (1H, m); 4,18 (1H, s); 4,10 (1H, brs), 4,05-3,50 (20-24H); [3,96 (3H, s); 3,87 (3H, s); 3,77 (3H, s)]; 3,46 (1H, m); 3,39 (3H, s); 2,79 (1H, m); 2,73 (2H, m); 2,50 (3H, s); 2,50 (1H, m); 2,38-2,22 (3H); 2,14 (1H, m); 2,10 (3H, s); 1,98 (2H,m); 1,65-1,45 (6-8H); 1,38 (3H,d,J=6,0); 134(3H,d,J=6,0); 1,22 (3H, d, J = 6,8); 1,10 (6H). 13C NMR 90,3 MHz vgL Fig. 14
Bei einer anderen Untersuchung wurde das NMR-Spektrum des gereinigten BBM-1675^ an einer in CDCl^ gelösten Probe bestimmt (80 MHz). Die Hauptpeaks sind im folgoiden angegeben: 13,7 16,9 173 19,8 223 22,7 23,4 33,1 34,1 35,1 393 47,6 52,6 55,7 56,0 56,1 57,6 62,4 643 64,9 653 683 693 69,7 71,9 73,6 75,8 76,1 77,1 77,7 78,1 783 833 863 88,4 90,4 973 983 99,1 993 99,6 103,8 107,1 112,4 123,2 124,8 129,9 1373 144,1 154,2 1543 160,9 167,9 1923 -16-
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TbWIc-Z
Physikochemische Eigenschaften von BBM-1675
Aj, A4, Bj, B2 a4 B1 B2 123-126 °C 159-161 °C 156-159 °C -176 °C -171 °C -122 °C 54,65 639 331 8,07 253 (257) 253 (225) 248(212) 282(153) 282(140) 279(141) 320(117) 320(104) 318(103) 253 (258) 253(225) 248(210) 282(155) 282(140) 279(140) 320(118) 320(105) 318(103) 252(266) 252(236) 248(233) 283(160) 283(141) 278(150) 318(118) 318(105) 318(110) A3 Schmp. (Zers.): 125-127 0 [a]D27 (c 03 CHC13): -161 °C Anal. gef. (%): C: 5435 H: 6,46 N: 3,73 S: 7,49 «VW“”»11«): 253(286) inMeOH 282(158) 320(122) in 0.01N HCl-MeOH: 253(287) 282(160) 320(126) in 0.01N NaOH-MeOH: 252(280) 283 (162) 318(120) Dünnschichtchromatographie (DSC) and Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chiomatography, HPLC) der BBM-1675-Komponenten. A. Studie Nr. 1 - Zusammenfassung
Tabelle 8 DSC und HPLC der BBM-1675-Komponenten DSC (Rf) HPLC (Retentionszeit in Minuten)
Si02 1 Silanisiert Lichrosorb RP-18 CHClo-MeOH CH3CN-H20 CH3CN-MeOH-0,lMCH3COONH4 (5:1 v/v) (75:25 v/v) (5:2:3 v/v) BBM-1675AJ BBM-1675A2 BBM-1674A3 BBM-1675A4 BBM-1675B! BBM-1675B2 0,74 0,71 0,72 0,71 0,63 0,60 0,180,21 0,28 0,78 0,23 0,16 133 1738,0 5,1 -17- 1 ^18 Umkehrphasensilicagel
AT 393 691B B. Studie Nr. 2 - DSC und HPLC der gereinigten Komponenten Aj und A2 DSC-Chromatographie
Analtech GHLF Silicagel Uniplates wurden für alle Normalphasenchromatographien eingesetzt. Die Platten hatten das Ausmaß 2,5 x 10 cm und wurden für eine eindimensionale DSC verwendet. Sie wurden in Glaszylindern von 6,4 cm (ä. D.) x 12 cm, die 10 ml Eluiermittel enthielten, entwickelt Platten mit dem Ausmaß 7,5 cm x 10 cm wurden für die zweidimensionale DSC verwendet Die Probe wurde links unten 1 cm von der Ecke aufgebracht Die Platte wurde zuerst in einem Tank (12,7 cm lang, 8,6 cm breit und 13 cm hoch) mit 50 ml des ersten Eluiermittels entwickelt Dann wurde die Platte luftgetrocknet, um 90° gegen den Uhrzeigersinn gedreht und in einem zweiten Tank mit 50 ml des zweiten Eluiermittels entwickelt
Whatmans analytische, vorbeschichtete C18-Silicagelplatten wurden für die Umkehrphasenchromatographie verwendet Die Platten hatten die Dimension 2,5 cm x 7,6 cm und wurden in Glaszylindern mit 10 ml Eluiermittel entwickelt
DieNormalphasenplatten wurden zuerstunter UV-Lichtmit254 nm betrachtet Dann wurden die Platten meinen Glaszylinder (6,4 cm ä. D. x 12 cm), der ^-Kristalle enthielt eingebracht Die Platten wurden dann nach etwa 2 min wieder geprüft Die Umkehrphasenplatten wurden nur unter UV-Licht mit 254 nm betrachtet Die Zonen wurden an der Auslöschung der Fluoreszenz einer imprägnierten Farbe festgestellt
Analytische HPLC
Die folgenden Bestandteile wurden zum Aufbau eines analytischen HPLC-Systems verwendet: Lösungsmittelpumpsystem von Waters Associates, Modell 6000A; Varian Varichrom Modell VUV-10 uv/vis Detektorsatz für 254 nm 0,1 OD; Recorder von Fisher Recordal, Serie 5000; Lösungsmittelprogrammierer von Waters Associates, Modell 660; Injektor von Waters Associates, Modell U6K; Alltech, μ-Bondapak Cjg (10p)-Säule (4,6 mm i. D. x 25 cm) mit einer Whatman Co. Pell ODS (0,03-0,038 mm) Beobachtungssäule (4,6 mm i. D. x 5 cm). DieBestandteile wurden mit rostfreien Stahlrohren 316 (1,6 mm ä. D. - 0,23 mm i. D.) verbunden. Bei allen Analysen wurde das Eluiermittel mit 2 ml/min gepumpt.
Präparative HPLC
Zur Errichtung eines Mitteldruck-Flüssigchromatographiesystems wurden folgende Bestandteile verwendet Laborpumpe, Fluid Metering, Inc. Modell RP-S Y 2CSC FMI; Impulsdämpfer, Fluid Metering, Inc. Modell PD-60LF FMI; eine aus Propylenrohr hergestellte 15 ml Probeschlinge (3,0 mm ä. D. x 1,5 i. D.) um ein Kartonrohr geschlungen (8,65 cm ä. D.) Glenco Series 3500 Universal LC Säulen; Absorption/Fluoreszenz-Monitor mit optischer Einheit Typ 6, Instrumentation Specialities Co, Modell UA-5; Strömungsbrecherventil, Instrumentation Specialities Co., Modell 590; Fraktionskollektor, Instrumentation Specialities Co., Modell 328. Die Bestandteile wurden mit Polypropylen- und Teflonrohren (3,0 mm ä. D. x 1,5 mm i. D.) und Glenco Multifit-Konnektoren und Ventilen in der angegebenen Reihenfolge verbunden.
Die Glenco Serie 3500 Universal LC Säule waren in bekannter Weise mit dem angegebenen Adsorptionsmittel in dem bezeichneten Lösungsmittel schlammgepackt Der Freiraum zwischen dem abgesetzten Bett und dem oberen Rohrende wurde mit Ottawa Standard-Sand gefüllt Das Eluiermittel wurde mit maximaler Geschwindigkeit gepumpt was 41,4 N/cm^ Rückdruck (etwa 20 ml/min) nicht überstieg.
Gradienteneluierung Für alle Gradienteneluierungen wurde eine Glenco Gradienteneluierungseinrichtung verwendet die aus zwei Kammern mit gleichem Durchmesser, gleicher Höhe und gleichem Volumen bestand, die tandemartig mit einem Teflonventil verbunden waren. EineKammer diente als Mischkammer und einealsstehendesReservoir.Das weniger polare Lösungsmittel wurde zuerst in der Mischkammer gehalten. Das polarere Lösungsmittel wurde in der ruhenden Kammer gehalten. Teflonbeschichtete Magnetrührstäbe (1,0 x 3,7cm) wurden in beide Kammern eingebracht und durch Magnetrührer von Thomas, Modell 15 Magnematic angetrieben. Das Eluiermittel wurde aus der Mischkammer durch Polypropylenrohre (1,5 mm i. D. x 3,0 mm ä. D) zu der Mitteldruck-HPLC-Anlage gepumpt. Wenn das Eluiermittel aus der Mischkammer abgezogen war, wurde das Lösungsmittel in dem ruhenden Reservoir frei zu dessen Ersatz einlaufen gelassen, wodurch sich ein linearer Gradient des Eluiermittels ergibt. DSC-Analvse von BBM-1675 Aj und_A2
In der folgenden Tabelle 9 sind die beobachteten Rf-Werte für BBM-1675 Aj und A2 an Normalphasenplatten zusammengefaßt. Der Rf-Wert wird durch Dividieren der gemessenen Distanz des Zentrums einer Zone vom Punkt der Probeaufgabe durch die gemessene Distanz der Lösungsmittelffont von dem Punkt der Probeaufgabe berechnet. -18-
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Tabelle 9 Bf System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675 A2 4 % Methanol in Chloroform 033 0,30 5 % Methanol in Diäthyläther 039 - 50 % Aceton in Skellylsolve B 0,38 0,31
In der folgenden Tabelle 10 sind die beobachteten Rf-Weite von BBM-1675A j und A2 auf in zwei Dimensionen entwickelten Normalphasenplatten zusammengefaßt. Die Positionen der Spots ist in Cartesischen Koordinaten angegeben. Die X-Koordinate trägt die Rf-Werte des an zweiter Stelle genannten Lösungsmittelssystems.
Taten«? 10 Bf System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675 A: 4 % Methanol in Chloroform vs 5 % Methanol in Diäthyläther (034,0,33) (038,033) 4 % Methanol in Chloroform vs 50 % Aceton in Skellylsolve B (0,33,0,29)
In der folgenden Tabelle 11 sind die für BBM-1675 Aj und A2 auf C-18 Umkehrphasen-DSC-Platten, die in binären Eluiermitteln entwickelt wurden, beobachteten Rf-Werte zusammengefaßt.
latellgJJL
Bf
System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675 A2 25 % 0,5 M NaQ in Acetonitril 0,18 031 25 % Wasser in Acetonitril 0,00 0,00
In der folgenden Tabelle 12 sind die für BBM-1675 A j und A2 auf C-18 Umkehrphasen-DSC-Platten, die mit ternären Eluiermitteln entwickelt wurden, beobachteten Rf-Werte zusammengefaßt.
Tabelle 12 E£
System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675
Acetonitril 80% Methanol 10% 03M NaCl 10% 1,00 1,00 60% 10% 30% 0,57 0,50 40% 30% 30% 032 032 30% 50% 20% 0,44 033 50% 30% 20% 0,62 034 40% 40% 20% 0,60 0,49 -19-
AT 393 691B
Tabelle 12 (Fortsetzung)
System/Verbindung Bf BBM-1675 Aj BBM-1675 Aj Acetonitril : Methanol : O^MNaCl 50% : 20 % : 20% 0,42 034 60% : 20% : 20% 0,74 0,69 Acetonitril : Methanol : Wasser 40% : 30 % : 30% 0,00 0,00 Acetonitril Methanol : 0,1MNH4OAc 40% : 30% : 30% 0,32 0,22 Acetonitril : Methanol : 0,lMNaH,PO4 40% : 30 % : 30% 0,00 0,00 HLPC-Analvse von BB-1675 und A2 BBM-1675 A j und A2 wurden unter Verwendung eines einfachen binären und ternären Eluiermittels auf C-18-Umkehrphasen-Silicagelsäulen untersucht. In den Tabellen 13, 14 und 15 sind die für diese Verbindungen beobachteten K'-Werte zusammengefaßL Das K' wurde unta· Verwendung der folgenden Formel berechnet: TR-To K'=-
To in welcher TR die von der Injektionszeit bis zur Feakspitze gemessene Retensionszeit und To die Leervolumenzeit ist. TMgJ2 K’
System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675 Aj Acetonitril a a Tetrahydrofuran a a Methanol 0,00 0,00 a: Verbindung ließ sich nicht von der Säule eluieren.
Tabetfc 13 £
System/Verbindung 25 % Wasser in Acetonitril 25 % Methanol in Wasser
BBM-1675 A 1 a 1,25 BBM-1675 A2 a 1,25 a: Verbindung ließ sich nicht von der Säule eluieren -20-
AT 393 691B laMlaii
Ternäre Eluiermittel
Kl
System/Verbindung BBM-1675 Aj BBM-1675 A2
Acetonitril 40% Methanol 30% Wasser 30% a a Acetonitril 40% Methanol 30% 0,1MNH4OAc 30% 1,7 3,0 50% 20% 30% 3,8 63 433% 233% 33,3% 6,1 b 423% 223% 35,0% 7,8 b 413% 213% 37,0 % 9,7 b a: ließ sich nicht eluieren b: wurde nicht bestimmt
Biologische Eigenschaften der BBM-1675-Komnonenten
Die antimikrobielle Wirksamkeit der BBM-1675-Komponenten wurde an einer Vielzahl von Bakterien (grampositive, gram-negative und säurefeste) und an Fungi durch die fortgesetzte zweifache Agarverdünnungsmethode bestimmt Für die gram-positiven und gram-negativen Bakterien wurde Nähragarmedium und für die säurefesten Organismen wurde Medium Nr. 1001 (3 % Glycerin, 0,3 % Natrium-L-ghitamat, 0,2 % Pepton, 031 % NajHPO^, 0,1 % KH2PO4,0,005 % Ammoniumcitrat, 0,001 % MgSO^ und 1,5 % Agar) verwendet. Für die Fungi wurde Sabouraud's Agarmedium verwendet Wie aus Tabelle 16 hervorgeht zeigte jede der sechs BBM-1675-Komponen-ten (Aj, A2, A3, Αφ Β^, B2) ein breites Spektrum antimikrobieller Wirksamkeit BBM-1675 Aj, A2, A3 und A4 waren besonders wirksam gegen gram-positive Bakterien.
Tabelle 16
Antimikrobielle Wirksamkeit von BBM-1675-Komponenten
Minimale induzierbare Konzentration (MIO in mce/ml
Stamm BBM-1675 Aj *2 A3 a4 B1 b2 S. aureus 209P <0,0008 0,0063 0,0063 0,0125 0,012 0,0063 S. aureus Smith <0,0008 0,0031 0,0063 0,0125 0,012 0,012 B. subtilis PCI 219 <0,0008 0,05 0,0125 0,0125 0,05 0,05 M. luteus 1001 0,0016 0,0063 0,0125 0,0125 0,1 0,1 M.flayas, <0,0008 0,0016 0,0063 0,0125 0,025 0,025 Mycobacterium 607 0,05 0,1 NT NT 0,05 0,025 E. coli NIHJ 0,1 0,8 1,6 3,1 0,8 3,1 K. pneumoniae Dil 0,4 0,8 1,6 3,1 03 0,8 P. aeruginosa D15 0,8 1,6 1,6 3,1 3,1 3,1 Q. albicans IAM 4888 0,4 0,4 1,6 63 3,1 1,6 C. neoformans 1,6 3,1 1,6 63 63 12,5
Ein zweiter antimikrobieller Test wurde an gereinigtem Aj und A2 (hergestellt nach dem folgenden Beispiel 3) und an den Komponenten A3 und A4 vorgenommen. Die Werte sind im folgenden zusammengefaßt; -21 -
AT 393 691B MIC durch ADT (mcg/ml)
Stamm BBM-1675 Aj A2 A3 a4 S. aureus 209P <0,0008 0,0063 0,0063 0,012 S. aureus Smith <0,0008 0,0031 0,0063 0,012 B. subtilisPCI 219 <0,0008 0,05 0,012 0,025 MJuisu&iooi 0,0016 0,0063 0,012 0,05 M.flayus <0,0008 0,0016 0,0063 0,012 Mycobacterium 607 0,05 0,1 0,16 0,16 E. coli NIHJ 0,1 0,8 1,6 3,1 K. pneumoniae Dil 0,4 0,8 1,6 3,1 P. aeruginosa D15 0,8 1,6 3,1 3,1 B. fragüis A20928 0,2 1,6 0,2 0,4 C. difficile A21675 0,4 0,8 0,05 0,4 C. oerfringens A9635 0,05 0,8 0,4 0,4 ς, alt»i?ang IAM 4888 0,4 0,4 1,6 6,3 C. neoformans 1,6 3,1 1,6 63
Die Aktivität der Prophageninduktion in lysogenem Bacterium E. coli W1709 (λ) wurde nach der Methode von Lein et al. in Nature 196,783-784 (1962) für die BBM-1675-Komponenten bestimmt Die Plaque-Zählung erfolgte auf Agarplatten, die das Testmaterial (Γ) enthielten, und aufKontrollplatten (C). Ein T/C-Verhältnis bei der Plaque-Zählung von mehr als 3,0 wurde als signifikant »achtet und die lysogene Induktionswirkung (ILB-Wirkung) wurde als minimale induzierbare Konzentration der Testverbindung ausgedrückt. Wie in Tabelle 17 gezeigt, hatten die BBM-1675-Komponenten eine starke ILB-Wirkung in den lysogenen Bakterien, was darauf hindeutet, daß sie eine Antitumorwirkung haben können.
Taten? n
Lvsogene Induktionswirkung der BBM-1675-Komponenten
Antibiotikum MIC* (mcg/ml) BBM-1675Aj 0,0063 BBM-1675 A2 0,0125 BBM-1675 A3 0,05 BBM-1675 A4 0,10 BBM-1675 Bj^ 0,10 BBM-1675 B2 0,20 * minimale induzierbare Konzentration
Die Antitumorwirkung der BBM-1675 A^ und A2 wurde an verschiedenen Mäusetumorsystemen bestimmt. Lymphocytische Leukämie P-388, lymphoide Leukämie L-1210, melanotisches Melanom B16 und Lewis Lungencarcinom wurden intraperitonal in männliche BDF j-Mäuse mit einer Inoculum-Größe von 10^,10^,5x10^ und 106 Zellen pro Maus implantiert Abgestufte Dosen der Testveibindungen wurden den Mäusen intraperitoneal 24 Stunden nach der Tumorinokulierung verabreicht Die Behandlung erfolgte einmal nur am ersten Tag, an den Tagen 1, 4 und 7 (q3d x 3), einmal pro Tag während 9 Tagen (qd 1—>9) oder 11 Tagen (qd 1—>11). Die Komponenten A3 und A4 wurden nur gegen P-388 Leukämie nach dem Schema q3dx3 untersucht da nur wenig Material zur Verfügung stand. BBM-1675 Aj, A2, A3 und A4 wurden in 0,9 %iger Salzlösung mit einem Gehalt von 10 % Dimethylsulfoxid gelöst und Chromomycin A3 (Toyomycin, Takeda), das als Bezugsverbindung verwendet wurde, wurde in 0,9 %iger Salzlösung gelöst Tod oder Überleben der behandelten und unbehandelten Mäuse wurde täglich festgehalten und -22-
AT 393 691B die mittlere Überlebenszeit (median survival time, MST) für jeden der Test (Ί> und Kontroll-(C)-Gruppen berechnet. Ein T/C-Wert von oder größer als 125 % deutet darauf hin, daß ein signifikanter Antitumoreffekt erreicht wurde. Die Resultate sind in den Tabellen 18-23 gezeigt. BBM-1675Aj und A2 zeigten eine außerordentlich starke Antitumorwirkung gegen P-388 Leukämie mit einem maximalen T/C-Wert von 160 %. Die Substanzen sind etwa 100 bis 3000 mal so wirksam wie Chromomycin A3, ausgedrückt in der minimalen Wirkungsdosis. BBM-1675 A3 und A4 waren jedoch weniger wirksam als die Komponenten Aj und A2 gegen die P-388-Leukämie (Tabelle 19). BBM-1675 Aj und A2 waren auch gegen L-1210-Leukämie (Tabelle 21), B16 Melanom (Tabelle 22) und Lewis Lungencarcinom (Tabelle 23) wirksam. Die Toxizität von BBM-1675 Aj und A2 wurde an männliche ddY-Mäusen durch intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung bestimmt; BBM-1675 A^ war etwa 10 mal toxischer als BBM-1675 A2 (Tabelle 24). Die therapeutischen Indices von BBM-1675 Aj und A2 waren 4- bis 8- bis 20 mal besser als die von Chromomycin A3 im P-388-Leukämiesystem (Tabelle 25). Eine zweite Versuchsserie wurde durch intravenöse Verabreichung von BBM-1675-Komponenten gegen P-388 Leukämie und L-1210-Leukämie vorgenommen, die intravenös mit 5 x 10^ und 10^ Zellen pro Maus inoculiert worden waren. Bei diesen Versuchen wurde Adriamycin als Bezugsverbindung verwendet, das in 0,9 %iger Salzlösung gelöst und an den Tagen 1,4 und 7 verabreicht wurde. Die Resultate sind in den Tabellen 26 und 27 gezeigt. Beide Komponenten Aj und A2 waren dem Adriamycin überlegen, ausgedrückt im maximalen T/C-Wert, der minimalen Wirkungsdosis und dem Wirkungsbereich.
Tabelle 18
Wirkung der BBM-1675-Komponente gegen P-388-Leukämie (Behandlung 1 Tag)
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am
Dosis, ip MÜZ T/C änderungam (mg/kg/Tag*) (Tage) (%) Tag 5 (g) Tag 5 Tag 45 BBM-1675 Aj 0,03 19,0 d§> -2,6 5/5 0/5 0,01 19,0 dB) -1,0 5/5 0/5 0,003 18,0 -1,0 5/5 0/5 0,001 20,0 dÜD -1,4 5/5 0/5 0,0003 16,0 dü> 0,0 5/5 0/5 0,0001 15,0 120 -0,2 5/5 0/5 0,00003 14,0 112 -0,2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0,3 6,0 48 -3,8 3/5 0/5 0,1 20,0 <W -1,8 5/5 0/5 0,03 18,0 @> -1,4 5/5 0/5 0,01 17,0 di> -0,6 5/5 0/5 0,003 17,0 -0,4 5/5 0/5 0,001 16,0 d§> 0,0 5/5 0/5 0,0003 15,0 120 0,0 5/5 0/5 0,0001 14,0 112 0,0 5/5 0/5 Chromomycin A3 1 19,0 © -0,2 4/5 0/5 03 17,0 +0,6 5/5 0/5 0,1 16,0 <3D +0,8 5/5 0/5 0,03 14,0 112 0,0 5/5 0/5 0,01 14,0 112 -0,2 5/5 0/5 Träg» _ 12,5 - +0,1 10/10 0/10 -23-
AT 393 691B * Tag 1, i. p. ** MÜZ: Mittlere Überlebenszeit
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
Tabelle 19
Wirkung der BBM-1675-Komponente gegen P-388-Leukämie (Behandlung 1.4 und 71
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am
Dosis, ip (mg/kg/Tag*) MÜZ (Tage) T/C (%) änderung am Tag5(g) Tag 5 Tag 45 BBM-1675 Aj 0,03 7,0 56 -2,8 5/5 0/5 0,01 19,0 CH2> -1,0 5/5 0/5 0,003 19,0 -0,6 5/5 0/5 0,001 16,0 © -0,6 5/5 0/5 0,0003 17,0 c® -0,4 5/5 0/5 0,0001 16,0 <® -03 5/5 0/5 0,00003 14,0 112 +0,4 5/5 0/5 BBM-1675 A2 03 tox. - - 2/5 0/5 0,1 11,0 88 -1,0 5/5 0/5 0,03 18,0 © -13 5/5 0/5 0,01 18,0 <33> -0,4 5/5 0/5 0,003 18,0 -0,4 5/5 0/5 0,001 17,0 © -0,4 5/5 0/5 0,0003 16,0 c® -0,4 5/5 0/5 0,0001 16,0 (Ώ$) -03 5/5 0/5 0,00003 15,0 120 -0,4 5/5 0/5 BBM-1675 A3 0,01 173 <®> +0,2 4/4 0/4 0,001 15,0 120 +0,6 4/4 0/4 0,0001 133 108 +0,6 4/4 0/4 BBM-1675 A4 0,01 163 © +0,2 4/4 0/4 0,001 14,0 112 +0,4 4/4 0/4 0,0001 123 100 +0,6 4/4 0/4 Chromomycin A3 03 18,0 © +0,6 5/5 1/5 0,1 18,0 © +0,6 5/5 0/5 0,03 17,0 © -03 5/5 0/5 0,01 14,0 112 0,0 5/5 0/5 Träger . 123 . +0,4 10/10 0/10 -24-
AT 393 691B *Tagel,4und7i.p.
Eingekreiste Weite deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung TABELLE 20
Wirkung derBBM-1675-Komponente gegen P-388-Leuk2mie (Behandlung od 1—>91
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am
Dosis, ip MÜZ T/C änderungam (mg/kg/Tag1) (Tage) (%) Tag5(g) Tag 5 Tag 45 BBM-1675 Aj 0,01 7,0 56 -1,8 5/5 0/5 0,003 13,0 104 -1,0 5/5 0/5 0,001 19,0 @> -U 5/5 0/5 0,0003 19,0 @> -0,8 5/5 0/5 0,0001 18,0 © 0,0 5/5 0/5 0,00003 16,0 @> +0,2 5/5 0/5 0,00001 16,0 @> -0,2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0,1 6,0 48 -2,2 4/5 0/5 0,03 13,0 104 -1,4 5/5 0/5 0,01 18,0 © -1,0 5/5 0/5 0,003 18,0 @ -0,6 5/5 0/5 0,001 18,0 (¾ -0,8 5/5 0/5 0,0003 17,0 © -0,4 5/5 0/5 0,0001 16,0 © -0,4 5/5 0/5 0,00003 15,0 120 -0,6 5/5 0/5 0,00001 15,0 120 +0,4 5/5 0/5 Chiomomycin A3 0,3 9,0 72 -2,0 5/5 0/5 0,1 18,0 © +0,4 5/5 0/5 0,03 18,0 @ 0,0 5/5 0/5 0,01 15,0 120 -0,2 5/5 0/5 0,003 13,0 104 oa 5/5 0/5 Träger 12,5 +0,4 10/10 0/10 -25- 1 qd 1—>9 i. p.
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
AT 393 691B TABELLE 21
Wirkung der BBM-1675 Komponenten auf L-1210 Leukämie
Dosis, ip (mg/kg/Tag*) MÜZ (Tage) T/C (%) Durchschnittliche Gewichtsänderung am Tag 5 (g) Überlebende am Tag 5 Tag 45 BBM-1675 Aj 0,003 143 QB> -1,7 6/6 0/6 0,001 12,0 (1¾) -03 6/6 1/6 0,0003 12,0 Qg> +0,3 6/6 0/6 0,0001 11,0 116 +1,0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0,03 103 111 -13 6/6 0/6 0,01 133 -13 6/6 0/6 0,003 13,0 -03 6/6 0/6 0,001 11,0 116 +1,3 6/6 0/6 0,0003 103 111 +1,0 6/6 0/6 Chromomycin Ag 03 8,5 89 -U 6/6 0/6 0,1 113 121 +1,2 6/6 0/6 0,03 11,0 116 +13 6/6 0/6 0,01 11,0 116 +1,3 6/6 0/6 0,003 10,0 105 +1,5 6/6 0/6 Träger 93 . +1,4 12/12 0/12 *qd 1—>9, i. p.
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
Tabelle 22
Wirkung der BBM-1675 Komponenten auf B16 Melanom
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am
Dosis, ip (mg/kg/Tag*) MÜZ (Tage) T/C (%) änderung am Tage 5 (g) Tag 5 Tag 45 0,003 10,0 61 -0,7 6/6 0/6 0,001 313 @> 0,0 6/6 0/6 0,0003 403 @> +0,3 6/6 0/6 0,0001 27,0 <® +0,8 6/6 0/6 0,00003 22,0 +1,8 6/6 0/6 0,00001 18,0 109 +2,2 6/6 0/6 -26-
AT 393 691B
Tabelle 22 (Fortsetzung)
Wirkung der BBM-1675 Komponenten auf B16 Melanom
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am
Dosis, ip MÜZ T/C änderung am (mg/kg/Tag*) (Tage) <%) Tage 5 (g) Tag 5 Tag 45 BBM-1675 A2 0,03 11,0 67 -0,8 6/6 0/6 0,01 26,5 CUP +0,3 6/6 0/6 0,003 29,5 <w> +0,2 6/6 0/6 0,001 26,0 +0,8 6/6 0/6 0,0003 22,0 @> +0,2 6/6 0/6 0,0001 18,0 109 +0,2 6/6 0/6 0,00003 17,0 103 +1,7 6/6 0/6 Chromomycin Aß 0,1 25,5 <3§> +2,3 6/6 0/6 0,03 23,0 o +2,2 6/6 0/6 0,01 21,0 @) +2,3 6/6 0/6 0,003 18,0 109 +2,2 6/6 0/6 Träger 16,5 +2,1 12/12 0/12 *qdl—>9»i.p.
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
Tabelle 23
Wirkung der BBM-1675 Komponenten auf Lewis Lungencaroinoro
Dosis, ip (mg/kg/Tag*) MÜZ (Tage) T/C (%) Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am änderung am Tag5(g) Tag 5 Tag 45 1675 Aj 0,003 10,0 91 -1,7 5/6 0/6 0,001 31,5 <ü§> -0,7 6/6 1/6 0,0003 21,5 -0,7 6/6 0/6 0,0001 21,0 Q9^ +1,0 6/6 0/6 0,00003 13,0 118 +1,0 6/6 0/6 0,00001 11,5 105 +1,0 6/6 0/6 1675 A2 0,03 10,0 91 -1,8 6/6 0/6 0,01 25,5 @) -1,7 6/6 0/6 0,003 28,5 @> 0,0 6/6 1/6 -27-
AT 393 691B
Tabelle 23 (Fortsetzung!
Wirkung der BBM-1675 Komponenten auf Lewis Lungencarcinom
Dosis, ip MÜZ (mg/kg/Tag*) (Tage) BBM-1675 A2 0,001 17,0 0,0003 15,0 0,0001 10,5 0,00003 11,0
Chromomycin A3 0,1 21,5 0,03 17,0 0,01 17,0 0,003 11,5
Träger - 11,0
Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am T/C (%) änderung am Tag5(g) Tag 5 Tag 45 -03 6/6 0/6 @) +1,2 6/6 0/6 95 +0,5 6/6 0/6 100 +0,8 6/6 0/6 ® +1,2 6/6 1/6 @) +1,7 5/5 0/5 (IIS) +1,5 6/6 0/6 105 +1,7 6/6 0/6 _ +0,8 12/12 1/12 *qd 1—>11, i. p.
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
Tabelle 24
Toxizität der BBM-1675-Komponenten LD50 (mg/kg/Tag)
Einmalige Dosis mehrmalige Dosis (qd 1—>9) i.p. i. v. Lp. BBM-1675 Aj BBM-1675 A2 0,019 0,010 0,00046 0,18 0,10 0,0072 Chromomycin A3 0,81 0,41 0,23 -28-
AT 393 691B
Tabelle 25
Therapeutische Indices d50/mwd1 P-388 einmalig qd 1—>9 L1210 B16 LL 63 >46 2 15 5 180 72 2 24 24 8 8 unwirksam 23 23 BBM-1675 Aj BBM-1675 A2 Chromomycin A3 ♦minimale Wirkungsdosis
Tabelle 26
Wirkung der BBM-1675-Komponenten auf intravenös implantierte P-388-Leukämie
Dosis, ip (mg/kg/Tag1) MÜZ (Tage) T/C (%) Durchschnitt- Überlebende liehe Gewichts- am änderung am Tag 5 (g) Tag 5 Tag.45 BBM-1675 Aj 0,01 9,5 106 -1,7 6/6 0/6 0,003 14,0 -0,3 6/6 0/6 0,001 114 (HD +0,3 6/6 0/6 0,0003 9,0 100 +0,3 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0,1 7,0 78 -3,7 6/6 0/6 0,03 15,0 (¾ -1,0 m 0/6 OJOI 12,0 © -04 6/6 0/6 0,003 9,0 100 +1,0 6/6 0/6 Adriamycin 30 tox. - - 0/6 0/6 10 9,0 100 -14 6/6 0/6 3 12,0 <@> +0,7 6/6 0/6 1 9,0 100 +1,7 6/6 0/6 Träger _ 9,0 • +1,7 12/12 0/12 -29- 1
Tage 1,4 und 7, i. v.
Eingekreiste Werte deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
AT 393 691B
TahsHg ZI
Wirkung der BBM-1675-Konroonenten auf intravenös implantierte L-1210-Leukämie
Dosis, ip (mg/kg/Tag*) MÜZ (Tage) T/C (%) Durchschnittliche Gewichtsänderung am Tag 5 (g) Überlebende am Tag 5 Tag 45 BBM-1675 Aj 0,008 9,5 119 -2,0 4/6 0/6 0,004 14,0 (475) -0,2 6/6 0/6 0,002 13,0 <46j) +0,2 6/6 0/6 0,001 9,5 119 +0,8 6/6 0/6 0,0005 9,0 113 +0,8 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0,063 11,0 -1,8 6/6 0/6 0,032 14,0 Qzf> +0,2 6/6 0/6 0,016 10,5 dE> +0,8 6/6 0/6 0,008 8,0 100 +1,2 6/6 0/6 0,004 8,0 100 +0,8 6/6 0/6 Adriamycin 16 tox. . . 2/6 0/6 8 12,0 +0,2 6/6 0/6 4 9,0 113 +1,5 6/6 0/6 2 8,0 100 +1,7 6/6 0/6 Träger _ 8,0 _ +1,4 12/12 0/12 * Tage 1,4 und 7, i. v.
Eingekreiste Weite deuten auf eine signifikante Antitumorwirkung
Die Antitumorwirkung der Komponenten BBM-1675 Aj und A2 wurde auch durch einen zweiten Test gegen P-338-Leukämie, L-1210-Leukämie und B16-Melanom an Mäusen getestet Die Resultate dieser Untersuchungen sind in den folgenden Tabellen 28,29 und 30 gezeigt Die Details dieser bei den Tests angewendeten Methoden wurden in Cancer Chemother. Rep. 3:1-87, Teil 3,1972 beschrieben.
Tabelle 28
Wiikung von BBM-1675 A tund A2 auf P-338-Leukämie Substanz Behandlung- Dosis Lp. MÜZ Wiikung MGÄ Überlebende Schema pg/kg/Tag Tage MÜZ d.5 d.5 (30) %T/C *NSC 38270 qdl—>9 400 13,0 163 -0,6 6/6 200 11,0 138 -0,9 6/6 -30-
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Tabelle 28 (Fortsetzung)
Wirkung von BBM-1675 At und A2 auf P-338-Leukämie 5
Substanz Behandlungsschema Dosis i. p. pg/kg/Tag MÜZ Tage Wirkung MÜZ %T/C MGÄ d. 5 Überlebende d. 5 (30) 10 BBM-1675 Aj d.l 513 20,0 250 -2,1 4/6 DMSO-Salzlösung 25,6 18,0 225 -1,8 6/6 12,8 16,5 206 -1,1 6/6 6,4 13,0 163 +0,1 6/6 15 33 12,0 150 -03 6/6 1,6 11,0 138 -03 6/6 0,8 10,5 131 0 6/6 0,4 10,0 125 +0,4 6/6 0,2 10,0 125 +0,3 6/6 20 0,1 10,0 125 0 6/6 d.l, 5 & 9 25,6 8,0 100 -1,8 6/6 12,8 13,5 169 -14 6/6 6,4 164 206 -0,8 6/6 25 3,2 16,0 200 -0,8 6/6 1,6 154 194 +0,3 6/6 0,8 124 156 +0,3 6/6 0,4 12,0 150 -0,1 6/6 02 114 144 +0,2 6/6 30 0,1 12,0 150 +0,8 6/6 0,05 10,0 125 +0,8 6/6 qdl—>9 12,8 TOX TOX TOX 1/6 6,4 6,0 75 -14 4/6 35 32 13,0 163 -13 6/6 1,6 144 181 -1,6 6/6 0,8 16,5 206 -2,3 6/6 0,4 16,0 200 -0,9 6/6 02 15,0 188 -0,8 5/5 40 0,1 13,0 163 -0,4 6/6 0,05 12,0 150 +0,1 6/6 0,025 12,0 150 -0,7 6/6 BBM-1675 A2 d.l 256 TOX TOX TOX 0/6 45 DMSO-Salzlösung 128 124 156 -34 4/6 64 27,0 338 -1,9 6/6 32 26,0 325 -2,0 6/6 16 16,0 200 -1,8 6/6 8 154 194 -1,9 6/6 50 4 15,0 188 -0,7 6/6 2 12,0 150 -04 6/6 1 12,0 150 0 6/6 0,5 10,0 125 +0,2 6/6 31- 55
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Tabelle 28 (Fortsetzung!
Wirkung von BBM-1675 und An auf P-338-Leukämie
Substanz Behandlungs- Dosis i. p. MÜZ Wirkung MGÄ Überlebende
Schema pg/kg/Tag Tage MÜZ d. 5 d. 5 (30)
__ % T/C BBM-1675 A2 d.l,5&9 128 TOX TOX TOX 0/6 DMSO-Salzlösung 64 TOX TOX TOX 0/6 32 TOX TOX -1,3 2/6 16 24,5 306 -1,3 5/5 8 17,5 219 -U 6/6 4 15,0 188 0 6/6 2 15,0 188 +0,1 6/6 1 12,5 156 -0,4 6/6 0,5 12,0 150 -0,4 6/6 BBM-1675 A, DMSO-Salzlösung 0,25 11,0 138 -0,4 6/6 qdl—>9 64 TOX TOX TOX 1/6 32 6,0 75 -2,9 4/6 16 8,0 100 -1,9 6/6 8 15,5 194 -u 6/6 4 17,0 213 -1,8 6/6 2 15,0 188 -1,1 6/6 1 14,0 175 -0,5 6/6 0,5 14,0 175 -0,6 6/6 0,25 12,0 150 -0,1 6/6 0,125 12J0 150 +0,1 6/6 Kontrolle Salzlösung 8,0 - +0,5 10/10
Tumorinoculum: 10^ Asciteszellen, i. p. implantiert
Wirt: Männliche CDF^-Mäuse
Tox: < 4/6 Mäuse lebend am 5. Tag
Bewertung: MÜZ = mittlere Überlebenszeit
Wirkung: % T/C = (MÜZ behandelt/MÜZ Kontrolle) x 100
Kriterien: % T/C > 125 wird als signifikante Antitumorwirkung erachtet.
x NSC 38270 = Olivomycin A -32-
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Tabelle 29
Wirkung von BBM-1675 und A* auf L-l 210 Leukämie
Substanz
BehandlungS' Schema
Dosis, IP MÜZ μΐ^τ/ίη] Tage BBM-1675 Aj d.l 512 12,0 25,6 7,0 12,8 9,0 6,4 94 32 6,0 1,6 7,0 0,8 8,0 0,4 7,0 02 7,0 0,1 7,0
Wirkung MÜZ %T/C M.G.Ä. g d. 5 171 -U 100 -23 129 -U 136 -0,5 86 -1,7 100 -0,8 114 -0,4 100 +0,3 100 -04 100 +0,8 d.l, 5 & 9 qd 1—>9 BBM-1675 A2 d.l 25,6 TOX 12,8 9,0 6,4 9,0 32 8,0 1,6 84 0,8 8,0 0,4 74 02 8,0 0,1 8,0 0,05 7,0 12,8 TOX 6,4 8,0 32 8,0 1,6 9,0 0,8 84 0,4 8,0 02 8,0 0,1 7,0 0,05 7,0 0,025 6,0 256 TOX 128 7,0 64 74 32 8,0 16 7,0 8 94 4 84 2 8,0 1 8,0 0,5 8,0 TOX TOX 129 -1,8 129 -0,8 114 -1,9 121 0 114 -0,4 107 -1,3 114 0 114 +0,4 100 +0,3 TOX -2,4 114 -1,6 114 -1,7 129 -2,1 121 -1,6 114 -1,0 114 -04 100 +0,3 100 +0,3 86 -0,6 TOX TOX 100 -1,8 107 -13 114 -22 100 -23 136 -1,4 121 -1,1 114 -0,8 114 0 114 -0,1 33-
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Tabelle 30
Wirkung von BBM-1675 und A2 auf B 16 Melanom
Substanz Dosis i. p. MÜZ Wirkung MGÄ Überlebende pg (m) oder mg/kg/inj. Tage MÜZ g am d. 10 (61) %T/C d. 5 BBM-1675 Aj 3,2M TOX TOX -1,8 2/10 1,6 16,0 64 -1,8 10/10 0,8 34,5 168 -1,8 10/10 0,4 56,5 226 -0,9 10/10(2)b 0,2 47,0 188 -0,7 10/10 0,1 37,0 148 -0,4 10/10 BBM-1675 Aj 16M 13,0 52 -2,1 10/10 8 294 118 -2.0 10/10 4 434 174 -1,1 10/10 2 504 202 -2,1 10/10(3)b 1 04 140 -1,0 10/10 0,5 38,0 152 -1,1 10/10 Kontrolle Salzlösung 25,0 - -0,1 10/10 a nur eine ohne Tumor, MÜZ d. m. 0. = 55,0 (220 %) k zwei ohne Tumon MÜZ d. m. 0. = 46,0 (184 %)
Tumorinoculum: 0,5 ml eines 10 % BREI, ip.
Wirt: männliche BDFj Mäuse
Behandlung: qd 1—>9
Tox: < 7/10 Mäuse lebend am Tag 10
Bewertung: MÜZ=mittlere Überlebenszeit
Wirkung % T/C = (MÜZ behandelt/MÜZ Kontrolle) x 100
Kriterien: % T/C > 125 wird als signifikante Antitumorwirkung erachtet
Nach der weiteren Reinigung von BBM-1675 Aj gemäß Beispiel 6 wurden Proben der gereinigten Verbindung gegen L-1210-Leukämie, P-388-Leukämie und B 16-Melanom an Mäusen getestet Die Resultate dieser Untersuchungen sind im folgenden zusammengefaßt
Tabelle 31
Wirkung des gereinigten BBM-1675 Al auf P-388-Leukämie (Behandlung 1 Tag)
Verbindung Dosis Verabreichungsart MÜZ T/C MGÄ am Überlebende (mg/kg/Tag) Schema Tage (%) d.5 am d.5 BBM-1675 Aj 0,1024 i.p.,qdxl TOX TOX 0/6 0,0512 17,5 159 -14 4/6 0,0256 16,5 150 -2,6 6/6 0,0128 174 159 -1,4 6/6 0,0064 154 141 -2,2 6/6 0,0032 154 141 -24 6/6 -34-
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Tabelle 31 (Fortsetzung!
Wirkung des gereinigten BBM-1675 A1 auf P-388-Leukämie ("Behandlung 1 Tag)
Verbindung Dosis (mg/kg//Tag) Verabreichungsart Schema BBM-1675 Aj 0,0016 0,0008 0,0004 0,0256 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 0,0002 0,0001 0,00005 i.p.,q4dx3; 0,0128 0,0064 0,0032 0,0016 0,0003 0,0004 0,0002 0,0001 0,00005 0,000025 i. p., qd x 5 Kontrolle (Träger) lxlO6 i. p., q4d x 3; MÜZ T/C MGÄam Überlebende Tage (%) d.5 am d.5 163 150 -1,0 6/6 15,0 136 -13 6/6 15,0 136 -2,0 6/6 TOX TOX -13 1/6 10,0 91 -23 5/6 173 159 -1,9 6/6 17,0 155 -0,8 6/6 17,0 155 -2,0 6/6 15,0 136 -1,7 6/6 15,0 136 -0,4 6/6 13,0 118 -0,8 6/6 13,0 118 -13 6/6 133 123 -1,0 6/6 TOX TOX 0/6 TOX TOX -3,6 3/6 173 155 -23 5/6 143 132 -2,0 6/6 153 141 -23 6/6 16,0 145 -2,8 6/6 17,0 155 -1,3 6/6 14,0 127 -1,6 5/6 15,0 136 -1,6 6/6 15,0 136 -1,0 6/6 11,0 100 -0,7 9/9
Wirt CDFj Mäuse, weiblich Implantierungsmenge und -art: 1 x 10^ Zellen, i. p.
Tabelle 32
Wirkung des gereinigten BBM-1675 A1 auf L-1210-Leukämie (Behandlung 1 Tag!
Verbindung Dosis Verabreichungs- (mg/kg/Tag) art, Schema BBM-1675 Aj 0,1024 i. p., qd x 1 0,0512 0,0256 0,0128 0,0064 MÜZ T/C MGAam Überlebende am
Tage (%) d.5 d.5 TOX TOX 1/6 TOX TOX -2,0 0/6 8,0 114 -2,9 4/6 11,0 157 -2,0 6/6 Π3 157 -1,9 6/6 -35-
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Tabelle 32 (Fortsetzung)
Wirkung des gereinigten BBM-1675 auf L-1210-Leukämie (Behandlung 1 Tag)
Verbindung Dosis (mg/kg/Tag) Verabreichungsart, Schema MÜZ Tage T/C (%) MGÄam Überlebende d. 5 d. 5 BBM-1675 Aj 0,0032 10,0 143 -2,0 6/6 0,0016 10,0 143 -2,6 5/6 0,0008 8,0 114 -0,4 6/6 0,0256 i.p.,q4dx3 TOX TOX -23 2/6 0,0128 10,5 150 -1,7 6/6 0,0064 11,0 157 -1,8 6/6 0,0032 11,0 157 -1,4 6/6 0,0016 10,5 150 -1,9 6/6 0,0008 9,0 129 -0,6 6/6 0,0004 8,5 121 -0,7 6/6 0,0002 8,0 114 -0,5 6/6 0,0128 i. p., qd x 5 TOX TOX -2,8 2/6 0,0064 7,0 100 -1,8 5/6 0,0032 113 164 -1,0 6/6 0,0016 11,0 157 -13 6/6 0,0008 10,0 143 -1,6 5/6 0,0004 83 121 -0,4 6/6 0,0002 83 121 0,1 6/6 0,0001 8,5 121 0,0 6/6 Kontrolle lxlO6 i. p., qd x 5 7,0 100 0,1 10/10 (Träger)
Wirt: CDFj Mäuse, weiblich Implantierungsmenge und -art: 1 x 10^ Zellen i. p.
TaWlg,33
Wirkung des gereinigten BBM-1675 auf B16 Melanom (Behandlung 1 Tag)
Verbindung Dosis (mg/kg/Tag) Verabreichungs-art, Schema ♦BBM-1675 Al 0,0064 0,0032 0,0016 0,0008 0,0004 Lp.,q4dx3 0,0016 0,0008 i.p.,qdx9 MÜZ T/C MGÄam 1 1 Tage (.%) d. 5 amd.5 163 110 -3,8 8/10 223 150 -3,0 10/10 25,0 167 -1,8 10/10 22,0 147 -23 10/10 24,0 160 -1,8 9/10 27,0 180 -3,7 10/10 27,0 180 -2,9 10/10 -36-
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Tabelle 33 (Fortsetzung)
Wirkung des gereinigten BBM-1675 auf B16 Melanom (Behandlung 1 Tag)
Verbindung Dosis Verabreichungs- MÜZ T/C MGÄam Überlebende (mg/kg/Tag) art, Schema Tage (%) d.5 am d.5 ♦BBM-1675 Aj 0,0004 i. p., qd x 9 26,0 173 -23 10/10 0,0002 24,5 163 -2,4 10/10 0,0001 25,5 170 -23 10/10 Kontrolle (Ttüget) 0,5 ML i.p.,qdx9 15,0 100 -03 10/10 ♦♦BBM-1675 Αχ 0,0064 i. v., q4d x 3 15,0 86 -4,7 10/10 0,0032 323 186 -2,1 10/10 0,0016 26,0 149 -1,4 10/10 0,0008 24,0 137 -0,4 10/10 0,0004 243 140 0,0 10/10 0,0064 i.p.,q4dx3 18,0 103 -2,7 10/10 0,0032 23,0 131 -1,4 10/10 0,0016 24,0 137 -0,7 10/10 0,0008 253 146 -0,8 10/10 0,0004 213 123 -1,4 10/10 Kontrolle 03 ML i.v., q4dx 3 173 100 -0,4 10/10 (Träger)
Wirt BDFj Mäuse, weiblich x Implantierungsmenge und -art: 0,5 ml 10 % BREI, L p. xx Implantierungsmenge und -art: Fragment, s, c.
Die obigen Prüfungsergebnisse deuten daraufhin, daß die gereinigte BBM-1675 Aj-Komponente im wesentlichen die gleichen Antitumor-Eigenschaften aufweist, wie die vorher geprüfte, wenig»’ gereinigte Probe. Die Verbindung hat eine außerordentlich hohe Wirkung, da sich der Effekt bei ein» Dosis von 25 Nanogramm/kg bei einem V»abreichungsschema von täglich 5 mal gegen P-338-Leukämie an Mäusen gezeigt hat. Bei untersuchungen gegen P-388- und L-1210-Leukämie ist BBM-1675 Aj wirksam, unabhängig davon, ob es als einzige Injektion am Tag 1, an jedem vierten Tag mit 3 Injektionen oder täglich 5 mal verabreicht wird. Gegen B16 Melanom war die Verbindung gleichermaßen wirksam, wenn sie intravenös an Tieren verabreicht wird, die subcutane Tumore haben, oder wenn sie intraperitoneal an Tieren verabreicht werden, die i. p. Tumorimplantate tragen. Diese Eigenschaft der erfolgreichen pharmakologischen Anlieferung einer Droge an einen Tum» an entfernter Stelle ist unter den Antitumor-Antibiotika unüblich.
Wie oben gezeigt, besitzen die BBM-1675-Komponenten eine starke antimikrobielle Wirksamkeit und sind daher bei der therapeutischen Behandlung von Säugetieren und anderen Tieren gegen infektiöse Krankheiten, die von solchen Mikroorganismen hervorgerufen sind, brauchbar. Zusätzlich dazu können die Komponenten für andere übliche Anwendungen antimikrobieller Mittel, wie als Desinfektionsmittel und in der Dentalausrüstung eingesetzt werden.
Die Phageninduktion in lysogene Bakterien und die gezeigte Wirksamkeit gegen Mäusetumorsysteme deuten darauf hin, daß die BBM-1675-Komponenten auch therapeutisch zur Inhibierung des Wachstums von Säugetiertumoren wirksam sind. -37-
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Die vorliegende Erfindung sieht daher ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen Wirts vor, der von einer mikrobiellen Infektion oder einem malignen Tumor befallen ist, welches daraus besteht, dem genannten Wirt eine antimikrobiell oder tumorinhibierende wirksame Dosis von BBM-167S Aj, A2, A3, A4, B ^ oder B2 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung derselben zu verabreichen, 5 DieZubereitungen für dieparenterale Verabreichung umfassen sterile wässerige oder nicht-wässerigeLösungen, S uspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in Form steriler fester Zusammensetzungen hergestellt werden, die in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder anderen sterilen Injektionsmedien unmittelbar vor der Anwendung gelöst werden.
Es ist festzuhalten, daß die tatsächlich bevorzugten Mengen an eingesetzten BBM-1675-Antibiotika entspre-10 chend da* jeweiligen Verbindung, der speziellen Zubereitung, der Anwendungsweise und der speziellen Lage, dem jeweiligen Wirt und der zu behandelnden Krankheit variieren werden. Viele Faktoren, die die Wirkung der Droge verändern, müssen vom Fachmann berücksichtigt werden, wie beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Anwendungszeit, Anwendungsweise, Ausscheidungsrate, Zustand des Wirts, Drogenkombination, Reaktionsempfindlichkeiten und Stärke der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch 15 innerhalb der maximal tolerierten Dosis erfolgen. Die optimalen Anwendungsraten für gegebene Bedingungen können vom Fachmann durch den Einsatz üblicher Dosierungsbestimmungstests im Hinblick auf die obigen Richtlinien festgelegt werden.
Die folgenden Beispiele sind allein zu Erläuterungszwecken angegeben und sollen in keiner Weise die Erfindung einschränken. 20
Beispiel 1:
Fermentation von BBM-1675
Actinomadura Stamm Nr. H964-92 wurde gezüchtet und in einer Agarschrägkultur mit einem Gehalt von 1 % Malzextrakt, 0,4 % Glucose, 0,4 % Hefeextrakt, 0,05 % CaCO^ und 1,6 % Agar aufbewahrt. Eine gutgewachsene 25 Agar Schrägkultur wurde zur Inokulierung eines vegetativen Mediums mit einem Gehalt an 3 % löslicher Stärke, 3 % Trockenhefe, 03 % K2HP04, 0,1 % ΚΗ2Ρ04,0,05 % MgS04.7H20,0,2 % NaCl und0,1 % CaC03 verwendet, wobei der pH-Wert vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt wurde. Die vegetative Kultur wurde 72 Stunden bei 32° C in einem Rotationsschüttelapparat (250 Upm) inkubiert und 5 ml der gewachsenen Masse wurde in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Fermentationsmedium, bestehend aus 3 % Rohrzuckermelasse, 1 % Maisstärke, 1 % 30 Fischmehl, 0,1 % CaCOg und0,005 % CuS04.5H20 übertragen (pH 7,0 vor der Sterilisierung). Die Fermentation wurde während 6 Tagen bei 28 °C im Rotationsschüttler vorgenommen. Die antibiotische Wirksamkeit in der Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P als Testorganismus durch Papier-scheiben-Agardiffusion bestimmt Die antibiotische Kraft erreichtenachfürdTagenFermentationemMaximurnvon etwa 1 mcg/ml. 35 Auch in Rührbehältern wurde die Fermentation von BBM-1675 vorgenommen. 500 ml der oben vorbereiteten
Inokulierungsmasse wurden in 201-Gefäße mit 101 Fermentationsmedium der gleichen Bestandteile wie bei der Schüttelflaschenfermentation übertragen. Die Fermentation wurde bei 32 °C mit einer Belüftungsrate von 121/min und Rühren mit 250 UpM vorgenommen. Unter diesen Bedingungen erreichte die antibiotische Produktion nach 68-76 Stunden Fermentation ein Maximum von etwa 0,9 mcg/ml. 40 Auch in Fermentationstanks wurden Fermentalionsstudien vorgenommen. Eine Samenkultur wurde vier Tage lang bei 30 °C in Erlenmeyerkolben geschüttelt, die in vegetatives Medium mit einem Gehalt von 3 % löslicher Stärke, 3 % Trockenhefe, 03 % K2HP04,0,1 % KH2P04,0,05 % MgS04.7H20,03 % NaCl und 0,1 % CaC03 enthielten. Die Samenkultur wurde in einen 200-1 Tank mit 130 1 Samenmedium mit der oben genannten Zusammensetzung eingebracht und der Tank mit240Upm 31 Stunden bei 30 °C gerührt. Die zweite Samenkultur 45 wurde zur Inokulierung von 3000 1 Fermentationsmedium mit einem Gehalt von 1 % Maisstärke, 3 % Rohrzuckermelasse, 1 % Fischmehl, 0,005 % CuS04.5H20 und 0,1 % CaCO^ verwendet. Der Produktionstank wurde bei 28 °C und 164 Upm sowie einer Belüftungsrate von 20001/min betrieben. Dar pH-Wert der Brühe stieg langsam mit Zunahme der Fermentation an und erreichte 7,7 - 7,8 nach 170 bis 180 Stunden, als eine Spiize der antibiotischen Wirksamkeit von 1,7 mcg/ml erreicht war.
Beispiel 2:
Isolierung und Reinigung von BBM-1675-Komponenten
Die geerntete Fermentationsbrühe (30001, pH 7,8) wurde mit Hilfe einer Sharpless-Zentrifuge in Mycelkuchen und überstehende Flüssigkeit getrennt Der Mycelkuchen wurde in 16001 Methanol suspendiert und die Mischung eine Stunde gerührt Die unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert und der methanolische Extrakt im Vakuum auf 431 eingeengt. Der in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Wirkstoff wurde aus derselben durch Extraktion mit zwei mal 10001n-Butanol gewonnen. Die Endbutanolextrakte und der eingeengte Methanolextrakt wurden vereinigt und -38-
AT 393 691B azeotropisch abgedampft durch gelegentlichen Zusatz von Wasser zu emo- wässerigen Lösung (201), wobei sich die Hauptmenge des antibiotischen Wirkstoffs als öliger Feststoff absefzte. Der Feststoff wurde in 301 Methanol digeriert und die unlöslichen Anteile durch Filtration abgetrennt. Der methanolische Extrakt wurde dann im Vakuum auf 101 Lösung eingeengt, worauf 401 Äthylacetat und 301 Wasser zugesetzt wurden. Nach 30 Minuten Rührzeit wurde die organische Schicht abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf 41 eingeengt Das Konzentrat wurde zu 201 n-Hexan zugesetzt und ergab einen schwach gelben Feststoff von rohem BBM-1675-Komplex (90,14 g, Wirkkraft: 55 mcg/mg). In der DSC zeigte sich, daß der Komplex eine Mischung aus zwei Hauptkomponenten, BBM-1675 Al und A2, und einigen Nebenkomponenten war. Diese wurde getrennt und durch wiederholte Chromatographie gereinigt, die in einem gekühlten Raum vorgenommen wurde, um Schädigungen zu vermeiden.
Der BBM-1675 Komplex (20 g) wurde in 20 ml Methanol gelöst und auf eine Sephadex-Säule LH-20 (0 5,5 x 85 cm) aufgegeben. Die Säule wurde mit Methanol entwickelt und die Eluierung durch Bioversuche unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P überwacht. Die aktiven Eluate wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert, um einen halbreinen Feststoff von BBM-1675-Komplex (4,19 g) zu ergeben. Der Feststoff wurde dann über einer Silicagelsäule (0 5,0 x 50 cm) unter Verwendung von Chloroform mit einem ansteigenden Gehalt (1 —> 5 % v/v) von Methanol als Eluiermittel Chromatographien.
Die Eluate wurden auf der Basis dm antimikrobiellen Wirksamkeit (S. aureus ) zusammengelegt, durch DSC (SiC^; CHG3-CH3OH=5:1 v/v) chromatographiertund im Vakuum eingeengt. Ein nahezu homogenes BBM-1675 Aj (Ausbeute nach dem Abdampfen 351 mg) wurde zuerst mit2 %igem Methanol in Chloroform eluiert, worauf eine Mischung von BBM-1675 A2, A3 und A4 (507 mg) sowie anschließend eine BBM-1675 B-Mischung (210 mg) mit 3%igem Methanol in Chloroform erhalten wurde. Der BBM-1675-A^-Feststoff wurde auf eine Sephadex-LH-20-Säule (0 2,0 x 80 cm) aufgebracht, die mit Methanol entwickelt wurde. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockene eingedampft und der verbleibende Feststoff aus Methanol kristallisiert, um farblose Plättchen von reinem BBM-1675Aj(124 mg) zu ergeben (diese Substanz ist das Ausgangsmaterial für Beispiel 3 A). Der Komplex BBM-1675 A2, A3 und A4 wurde durch Chromatographie auf einer Bondapak C18-Säule (Waters, 0 3,0 x 50 cm) aufgetrennt. Die Elution erfolgte mit wässerigem Acetonitril und die bioaktiven Eluate wurden durch DSC (Merck, *silanisiert: CH3CN-H2O = 75 : 25 v/v) geprüft. Die Nebenbestandteile A4 (33 mg) und A3 (18 mg) wurden nacheinander in dieser Reihenfolge mit20 % Acetonitril eluiert, worauf eine andere Hauptkomponente A2 (301 mg) mit 50 % Acetonitril folgte (diese Substanz ist das Ausgangsmaterial für Beispiel 3B).
Der das BBM-1675 Bj und B2 enthaltende Feststoff wurde üb» einer Silicagelsäule (0 3,0 x 40 cm) mit Chloroform und Methanol als Entwicklungsmittel chromatographiert Die mit4 % Methanol in Chloroform eluierten aktiven Fraktionen wurden vereinigt und lieferten beim Eindampfen reines BBM-1675B j (7 mg). Eine andere aktive Fraktion wurde bei einer Konzentration von 5 % Methanol eluiert und lieferte nach dem Eindampfen BBM-1675 B2 (8 mg). *C18-Umkehrphasensilicagel
Beispiel 3:
Weitere Reinigung von BBM-1675 Aj und A2 A. Reinigung von BBM-1675 A^
Eine Glenco-Säule mit 2,67 cm i. D. x 75 cm wurde schlammgepackt mit Octadecyl (C18) Silicagel (Baker, gebundene Phase) (40 pm Korngröße) in Methanol. Die Säule wurde an ein Mitteldruck-HPLC-System angeschlossen und mit 1,51 Eluiermittel (41,6 % Acetonitril - 21,6 % Methanol - 36,8 % 0,1 M Ammoniumacetat äquilibriert. Das nach dem Reinigungsverfahren von Beispiel 2 erhaltene teilweise gereinigte BBM-1675 Aj (100,5 mg) wurde in 2 ml Acetonitril gelöst und in die Probeschlinge aufgenommen. Die Probe wurde auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit dem obigen Eluiermittel eluiert und 87 ml Fraktionen aufgefangen. Das Eluiermittel wurde bei 254 nm und 340nm überwacht Die Fraktionen 55 bis 71 wurden vereinigt und zwei mal mit 1500 ml Anteilen Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde zur Trockene eingedampft und es wurden 89,8 mg Rückstand C erbalten.
Eine Glenco-Säule mit 14 cm i. D. x 20 cm wurde mit 12 g Woelm-Silicagel schlammgepackt (60-200 pm-Teilchen). Der Rückstand C wurde in Chloroform-Lösung auf die Säule aufgebracht Die Säule wurde mit Chloroform und mit bis zu 10 % Methanol in Chloroform (linearer Gradient) eluiert und 20-25 ml-Fraktionen aufgefangen. Nach der DSC-Analyse über Silicagel wurden die Fraktionen 6-9 vereinigt und zur Trockene eingedampft Es wurden 73 mg Rückstand D erhalten.
Eine Glenco-Säule mit 1,5 cm i. D. x 20 cm wurde mit 12 mg Woelm-Silicagel (63-200 pm-Teilchen) in Das Chloroform wurde mit 25 ml Skellysolve B verdrängt Die Säule wurde dann mit500 ml Skellysolve B und mit -39-
AT 393 691B bis zu 60 % Aceton in Skellysolve B (linearer Gradient) eluiert und28-25 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 19-23 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft Man erhielt 65,6 mg reines BBM-1675 Aj. Dieser Rückstand war in drei DSC-Systemen (5 % Methanol in Chloroform, 5 % Methanol in Äther und 50 % Aceton in Skellysolve B auf Silicagel) und in der HPLC (C-18 Silicagel - 41,5 % Acetonitril: 21,5 % Methanol: 5 37,0 % 0,1 M Ammoniumacetat) homogen. 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Gelnermeationschromatogranhie mit gereinigtem BBM-1675 A^ Eine Pharmacia-Säule mit 2,5 cm i. D. x 45 cm wurde mit Sephadex LH-20 in Methanol schlammgepackt und auf ein 33,4 cm Chromatographiebett eingestellt Gereinigtes BBM-1675 Aj (etwa 120 mg) wurde in 2 ml Methanol gelöst und in ein 2,5 ml Probegefäß eingebracht Die Probe wurde dann auf die Säule aufgebracht und die Eluierung mit 1,75 ml/min mit Methanol begonnen, wobei 10 ml-Fraktionen aufgefangen wurden. (Fraktionskollektor Pharmacia Frac-100). Das Eluiermittel wurde bei 254 nm mit einem Isco-UA5-Detektor überwacht Es wurde beobachtet daß das BBM-1675 Aj bei einem Verhältnis Ve/Vt von 0,79 bis 0,91 eluierte (Ve=Elutionsvolumen; Vt=Bettvolumen). B. Reinigung von BBM-1675 Ao Eine Glenco-Säule mit 2,65 cm i. D. x 75 cm wurde mit Octadecyl (C18-Silicagel (Baker, gebundene Phase) (40 pm Teilchengröße) in Methanol schlammgepackt. Die Säule wurde an eine Mitteldruck-HPLC angeschlosen und mit 141 Eluiermittel (50 % Acetonitril - 20 % Methanol - 30 % 0,1 M Ammoniumacetat) äquilibriert Das nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhaltene teilweise gereinigte BBM-1675 A2 (76,9 mg) wurde in 2 ml Acetonitril gelöst und in die Probeschlinge aufgezogen. Die Probe wurde auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit dem oben genannten Eluiermittel eluiert und 87 ml-Fraktionen aufgefangen. Das Eluiermittel wurde bei 254 nm und 340 nm überwacht Die Fraktionen 31-38 wurden vereinigt und zweimal mit 500 ml-Portionen Chloroform extrahiert Das Chloroform wurde zur Trockene eingedampft und es wurden 65,8 mg homogenes BBM-1675 A2 erhalten. BBM-1675 Aj war in zwei DSC-Systemen, einer zweiten DSC-Analyse und bei HPLC homogen. Beispiel 4: Bevorzugtes Extraktionsverfahren für BBM-1675 Aj 6,81 Rohfermentation, erhalten nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 1, wurden in ein am Boden mit Abflußzapfen ausgestattetes Polypropylengefäß (12 cm D, am oberen Rand, 10 cm D am Boden, 37 cm Höhe) eingebracht Ein gleiches Volumen Chloroform wurde zugesetzt Die Mischung wurde mit ziemlicher Geschwindig-keit mit einem luftgetriebenen CRC-Rührer 2 Stunden gerührt Etwa41 (13 kg) Dicalit (Filterhilfe) wurden zugesetzt und eingemischt Die Mischung wurde dann über ein Dicalit-Bett filtriert das sich in einem Buchnertrichter Nr. 12 befand. Das Filtrat wurde in einer mit Vakuumabzug versehenen 191 Lösungsflasche vereinigt (Ace. Nr. 53964)6). Der Kuchen wurde mit 21 Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde dann in einen 201-Scheidetrichter eingebracht und die Phasen trennen gelassen. Die untere (Chloroform-) Phase wurde entfernt Ein Glenco-Rohr mit 23 cm L D. x 40 cm wurde mit 91 g Woelm Silicagel (63-200 pm-Teilchen) schlammgepackt Unter Verwendung einer FMI RPY-2CSD-Pumpe wurde die oben genannte Chloroform-Phase durch die Säule gepumpt Die Säule wurde mit 600 ml frischem Chloroform gespült Das Chloroformeluiermittel wurde verworfen. Die Säule wurde dann mit600ml 10 % Methanol in Chloroform eluiert Dieses Eluat wurdezur Trockene eingedampft und ergab 547 mg Rückstand A. Der Rückstand A wurde in 50 ml Chloroform aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde in einem 11-Rundkolben mit 20 g Dicalit versetzt Durch Zusatz von etwa200ml Skellysolve B wurde ein Schlamm hergestellt DieLösungsmittel wurden in einemRotationsverdampfer abgedampft Der Rückstand wurde mit300ml Skellysolve B aufgeschlämmt Der Schlamm wurde in ein Ace-Flaschenchromatographierohr (Teil Nr. B5872-14) (41 mm i. D. x 45,7 cm) in folgender Weise eingebracht Ein Glaswollstopfen wurde in die Engstelle des Absperrhahns zwischen Hahn und Säulenrohr eingebracht Einei cm dickeSchichtausStandard-Ottawa-SandwurdeoberhalbderGlaswolle aufgebracht Der Absperrhahn, die Glaswolle und das Sandbett wurden durch einen Druckstrom (3,9 M/cm^) aus Skellysolve B von Luft gereinigt. Der Schlamm wurde dann in die Säule eingebracht und bildete unter der Wirkung des Druckstroms ein gepacktes Bett Die Säule durfte nie trocken laufen. Nachdem ein stabiles Säulenbett erhalten worden war, wurde eine 2 cm Schicht Ottawa-Sand von oben auf das Bett aufgebracht Das Bett wurde dann mit weiteren 600-700 ml Skellysolve B eluiert Dann folgte eine Elution mit 500 ml Toluol. Das Toluol-Eluiermittel wurde zur Trockene eingedampft und ergab 93 mg Rückstand B. Dieses teilweise gereinigte BBM-1675 A^ kann dann weiter nach dem Verfahren von Beispiel 3 gereinigt werden. -40- 55
AT 393 691B
Beispiel 5:
Fermentation des BBM-1675-Komplexes unter Verwendung der Variante H964-92-A1327Y
Die Variante Stamm A1327Y, die durch NTG-Behandlung von Actinomadura verrucosospora Nr. H964-92 erhalten worden war, wurde zur Inokulierung eines vegetativen Mediums mit 2 % löslicher Stärke, 1 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 %NB-AminTyp A und 0,1 %CaC03,dessen pH-Wertvorder Sterilisation auf7,0eingestellt wurde, verwendet Die vegetative Kultur wurde vier Tage bei 32 °C im Rotationsschüttler (250Upm) inkubiert und 5 ml der gewachsenen Masse wurden in einen500ml-Erlenmeyerkolben eingebracht, der 100 ml Fermentationsmedium aus 3 % Rohrzuckermelasse, 1 % Maisstärke, 1 % Fischmehl, 0,005 % CUSO4.5H2O,0,05 % MgSC^J^O und 0,1 % CaCC>3 mit einem vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellten pH-Wert enthielt
Die Fermentation wurde bei 28 °C 7 Tage lang im Rotationsverdampfer vorgenommen. Die antibiotische Produktion «reichte ein Maximum von etwa 14 mcg/ml.
Beispiel 6:
Isolierung und Reinigung von BBM-1675-Komponenten
Die geerntete Fermentationsbrühe aus Beispiel 5 (30001, pH 7,6) wurde mit ein«1 Sharples-Zentrifuge in Mycelkuchen und überstellende Flüssigkeit getrennt. DerMycelkuchen wurde mit20001Methanol eine Stunde lang gerührt und die unlöslichen Stoffe durch Filtration abgetrennt. Der in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Wirkstoff wurde daraus durch Extraktion mit 18001 n-Butanol extrahiert. Die Methanol- und n-Butanolextrakte wurden vereinigt und azeotropisch durch gelegentliche Zugabe von Wasser zu ein«* wässerigen Lösung (201) eingeengt, wodurch sich der Hauptbestandteil des antibiotischen Wirkstoffs als öliger Feststoff absetzte. Die Mischung wurde drei mal mit je 201 Äthylacetat zur Extraktion des Wirkstoffes geschüttelt Die Extrakte wurden vereinigt, zur Abtrennung der unlöslichen Anteile filtriert und im Vakuum auf41 eingedampft. Das Konzentrat wurde unter Rühren mit 301 n-Hexan versetzt und ergab einen schwach gelben Feststoff aus rohem BBM-1675-Komplex (81,7 g, Wirkkraft: 59 mcg/kg). Der Komplex erwies sich in der DSC und HPLC als Mischung zweier Hauptkomponenten, BBM-1675 A j und A2 mit einigen Nebenkomponenten. Diese wurden getrennt und durch eine Reihe von Chromatographieverfahren gereinigt, die in einem kalten Raum vorgenommen wurden, um Schädigungen zu vermeiden.
Der rohe BBM-1675-Komplex (20 g) wurde in Methanol (20 ml) gelöst und auf eine Sephadex-Säule LH-20 (0 5,5 x 85 cm) aufgebracht. Die Säule wurde mit Methanol entwickelt und die Elution durch Bioversuche mit-Staphylococcus aureus 209 P überwacht. Die aktiven Eluate wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert, um einen halbreinen Feststoff aus BBM-1675-Komplex (4,86 g, Wirkkraft: 203 mcg/mg) zu «geben. Der Feststoff wurde dann üb« einer Silicagelsäule (0 3,0 x 70 cm) unter V«wendung von Chloroform und einem ansteigenden Gehalt (1-5 %) Methanol als Entwicklungsmittel chromatographierL Die Eluate wurden entsprechend ihrer antibakteriellen Wirksamkeit gegen S. aureus vereinigt, wurden dünnschichtchromatographiert (SiC^, CHCI3-MeOH=5:1, v/v) und im Vakuum eingeengt. BBM-1675 Aj (425 mg nach dem Eindampf«!, Wirkkraft: 960 mcg/ mg) wurde zuerst mit 2%igem Methanol in Chloroform eluiert, dann folgte eine Mischung von BBM-1675 A2, A3 und A^ (732 mg, Wirkkraft: 340 mcg/mg) und anschließend d« BBM-1675 B-Komplex (200 mg, Wirkkraft: 190 mcg/mg) mit 3%igem Methanol in Chloroform. Das obige BBM-1675 A j wurde nochmals über Silicagel (Säule: 02,2x44cm) mit2 % Methanol in Benzol Chromatographien. Die bioaktiven Eluate wurden durchHPLC (lichrosorb RP-18 : CH3CN-MeOH-0,l MCH3COONH4 = 5:2:3, v/v) geprüft und die das homogene BBM-1675 Aj enthaltenden Fraktionen im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der zurückgebliebene Feststoff wurde aus Methanol (10 ml) umkristallisiert und ergab farblose Prismen von BBM-1675 Aj (197 mg, Wirkkraft: 1000 mcg/ mg).
Der KomplexvonBBM-1675 A2, A3 und A4 (537 mg) wurdedurch Säulenchromatographie auf einer Bondapak C18-Säule (Waters, 0 2,0 x 42 cm) getrennt. Die Elution wurde mit wässerigem Acetonitril vorg«iommen und die bioaktiven Eluate wurden durch DSC (Merck, silanisierti CH3CN-H2O = 75 : 25 v/v) geprüft. Die Nebenkomponenten BBM-1675 A4 (45 mg, Wirkkraft: 410 mcg/mg) und A3 (19 mg, Wirkkraft: 300 mcg/mg) wurd«i nacheinander mit20 % Acetonitril, gefolgt von einer Hauptkomponente, BBM-1675A2 (203 mg) mit 50 % Acetonitril eluiert. Die BBM-1675 A2-Fraktion wurde aus Chlaroform-n-Hexan kristallisiert und es setzten sich farblose Stäbchenab(70mg,Wirkkraft290mcg/mg).D«dieBBM-1675B-MischungenthaltendeFe$tstoffwurdeüberein« Silicagelsäule (0 3,0 x 40 cm) mit Chloroform und Methanol als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Die mit 4%igem Methanol in Chloroform eluierten aktiven Fraktionen wurden v«einigt und eingedampft und ergaben reines BBM-1675 Bj (7 mg, Wirkkraft: 180 mcg/mg). Eine weitere aktive Fraktion wurde mit 5 % Methanol eluiert, die nach dem Eindampfen BBM-1675 B2 lieferte (8 mg; Wirkkraft: 140 mcg/mg).
Claims (3)
- AT 393 691B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikum-Komplexes BBM-1675 (Aj, A2, A3, A4.Bj.B2), dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acünomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) oder dessen Mutante A1327Y (ATCC 39638) in einem wässerigen, assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter aeroben Submersbedingungen gezüchtet wird, bis eine deutliche Menge von BBM-1675 in dem Kulturmedium produziert wurde, worauf der Komplex aus dem Kulturmedium isoliert und gegebenenfalls durch an sich bekannte Trennverfahren, wie insbesondere durch Chromatographie, in seine Komponenten A j, A2, A3, A4, Bj bzw. B2 aufgetrennt wird.
- 2. Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen Wirts, der von einer Mikrobeninfektion befallen ist, bei welchem diesem Wirteine antimikrobiell wirksame Menge von BBM-1675 Aj,BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A4, BBM-1675 Bj oder BBM-1675 B2 verabreicht wird.
- 3. Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines tierischen Wirts, der von einem bösartigen Tumor befallen ist, bei welchem diesem Wirt eine antimikrobiell wirksame Menge von BBM-1675 A j, BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A4, BBM-1675 Bj oder BBM-1675 B2 verabreicht wird. Hiezu 14 Blatt Zeichnungen -42-
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