LU85362A1 - Nouveau complexe antibiotique antitumoral dit bbm-1675 - Google Patents

Description

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Arrière plan technologique i 1. Domaine de l’invention

La présente invention concerne de nouveaux antibiotiques antitumoraux, de même que leur production et leur isolement.

CD.MJ - 1 - SY-1742A

2. Etat connu de la technique

La structure des antibiotiques antitumoraux fai-sant l'objet de l'invention n'a pas encore été identifiée. En raison de leurs propriétés physiques, chimiques et biologiques particulières, la Demanderesse est néanmoins portée a croire que les antibiotiques BBM-1675 sont nou- * veaux.

La publication de brevet européen n° 95154A1 * décrit la fermentation d'Actinomadura pulveraceus sp. nov. N° 6049 (ATCC 39100) pour la production d'antibiotiques antitumoraux appelés WS 6049-A et WS 6049-B.

La structure des antibiotiques WS 6049 n'a pas encore été élucidée, mais les propriétés caractéristiques énoncées pour les antibiotiques montrent que le WS 6049A et le WS 6049B peuvent avoir une parenté de structure avec les antibiotiques BBM-1675 faisant l'objet de la présente invention. Les résultats spectroscopiques montrent toutefois que ni le WS 6049-A, ni le WS 6049-B n'est identique à aucun des antibiotiques BBM-1675 de l'invention. En outre, l'organisme producteur décrit dans le document ηβ 95154A1 peut être nettement différencié d'Actinomadura verrucosospora utilisé suivant l'invention par la couleur de son mycélium aérien sur les milieux ISP N° 2, 3 et 4, par sa réaction positive de peptonisation du lait et par sa capacité d'utiliser le D-fructose, le D-mannitol, le tréhalose et la cellulose. Sommaire Ä La présente invention a pour objet un nouveau j. complexe antibiotique antitumoral, dit ci-après BBM-1675, qui est obtenu par culture d’une souche productrice de * BBM-1675 d'Actinomadura verrucosospora de préférence la souche Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATGC 39334) ou la souche Actinomadura verrucosospora A1327Y ( ATCC 39638), ou un de leurs mutants, dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et rn m.t _ 9 _ d'azote dans des conditions d'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de ce com-xi» plexe BBM-1675 par cet organisme dans ce milieu de cul ture, et éventuellement par isolément du complexe hors * du milieu de culture. L'invention a aussi pour objet les deux composants bioactifs majeurs du complexe * BBM-1675 ditsBBM-1675A^ et A2 et les quatre composants ^ bioactifs mineurs de ce complexe dits BBM-1675A3, A^, B^ et B^. Ces composants peuvent être séparés et purifiés suivant les techniques classiques de la chromatographie. Le complexe BBM-1675 et ses composants bioactifs est antimicrobien et antitumoral.

Dans les dessins :

Fig. 1 est le spectre d'absorption infrarouge * du BBM-1675 A. partiellement purifié (pastille de KBr).

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Fig. 2 est le spectre d'absorption infrarouge j' du BBM-1675 A£ partiellement purifié (pastille de KBr).

Fig. 3 est le spectre d'absorption infrarouge du BBM-1675 A3 (pastille de KBr).

Fig. 4 est le spectre d'absorption infrarouge du BBM-1675 A^ (pastille de KBr).

Fig. 5 est le spectre de résonance magnétique des protons du BBM-1675 A^ partiellement purifié dans le CDC13 (60 MHz).

Fig. 6 est le spectre de résonance magnétique des protons du BBM-1675 A^ partiellement purifié dans le ÇDCl, (60 MHz).

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Fig. 7 est le spectre de résonance magnétique des protons du BBM-1675 A3 dans le CDC13 (60 MHz).

Fig. 8 est le spectre de résonance magnétique des protons du BBM-1675 A4 dans le CDC13 (60 MHz).

Fig. 9 est le spectre d'absorption infrarouge du BBM-1675 A^ purifié (pastille de KBr).

Fig. 10 est le spectre de résonance magnétique des protons du BBM-1675 A^ purifié dans le CDCl^ (360 MHz).

Fig. 11 est le spectre de résonance magnéti-13 que de C du BBM-1675 A^ purifié dans le CDCl^ ^ (90,3 MHz).

Fig. 12 est le spectre d'absorption infrarou- > ge du BBM-1675 A^ purifié (pastille de KBr).

Fig. 13 est le spectre de résonance magné- v tique des protons du BBM-1675 A2 purifié dans le CDCl^ (360 MHz).

Fig. 14 est le spectre de résonance magnétique de du BBM-1635 A^ purifié dans le CDC13 (90,3 MHz).

Description détaillée L'invention concerne un nouveau complexe antibiotique antitumoral dit BBM-1675 et sa prépara-A tion par fermentation de certaines souches d'Actino- ~ . madura verrucosospora et plus particulièrement de la souche Actinomadura verrucosospora H964-92 et d'un mutant de celle-ci dit Actinomadura verrucosospora A1327Y. La souche initiale précitée a été isolée d'un échantillon de terre recueilli à Pto Esperanza, Misiones, Argentine. Une culture biologiquement pure de l'organisme a été déposée à 1'American Type Culture Collection, Washington, D.C. sous le n“ ATCC 39334 de sa collection permanente de micro-organismes. Ultérieurement, la souche mutante A1327Y a été obtenue par traitement classique de la souche H964-92 au moyen de nitrosoguanidine (NTG) et a été déposée à 1'American Type Culture Collection sous le N” ATCC 39638.

? f Comme pour beaucoup de cultures produisant des antibiotiques, la fermentation de la souche * H964-92 ou A1327Y d'Actinomadura verrucosospora con duit à la formation d'un mélange ou complexe de substances. Deux composants bioactifs majeurs, à savoir BBM-1675 A^ et A^, et quatre composants bioactifs mineurs, à savoir BBM-1675 A^, A^, B^ et B2, ont été séparés au départ du complèxe BBM-1675 produit au cours de la fermentation.

Le BBM-1675 et ses composants BBM-1675 Αη, i*. , h^, , A^, B^ et B2 manifestent de l'activité anti microbienne contre une grande variété de micro-orga-nismes et spécialement les bactéries Gram-positives.

, Le complexe BBM-1675 et ses composants bioactifs sé parés manifestent aussi des propriétés d’induction du i phage chez certaines bactéries lysogenes. Deux des composants, à savoir BBM-1675 A1 et A2, soumis in vivo à des épreuves de sélection contre différents systèmes tumoraux de la souris,ont manifesté une activité inhibitrice contre la leucémie L-1210, la leucémie P-388, le mélanome B16 et le carcinome pulmonaire de Lewis. Les BBM-1675 A^ et A^ ont manifesté aussi ** de l'activité contre la leucémie P-388 de la souris.

Le complexe et ses composants bioactifs peuvent donc être utilisés comme agents antimicrobiens ou agents antitumoraux pour inhiber des tumeurs chez les mammifères .

Le micro-organisme

La souche d'atinomycète N° H964-92 a été isolée d'un échantillon de terre et préparée suivant les techniques habituelles à l'état de culture biologiquement pure en vue de la caractérisation.

La souche H964-92 forme sur le mycélium aérien de courtes chaînes de spores qui prennent des formes ^ droites, flexueuses ou anguleuses. Les spores sont 2 ^ sphériques ou ovales et ont une surface verruqueuse.

“ " Le mycélium aérien est peu abondant sur la plupart • des milieux. Le mycélium aérien est blanc et prend ultérieurement une nuance rosée ou vire davantage au bleuâtre dans certains milieux à la gélose. Le mycélium en substrat est incolore.ou rose pâle. La température de croissance s'échelonne de 15°C à 43°C.

CD.MJ - 5 -

La composition en aminoacides de la paroi cellulaire et la composition en sucres de l'hydrolySat cellulaire ** complet montrent que la souche H964-92 appartient au type IIIB de paroi cellulaire. La ménaquinone a été ' identifiée comme étant MK-9 ( H,. ) * MK-9 ( HQ ) .

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Sur la base des principales caractéristiques « de morphologie, de culture et de physiologie, conjoin-^ tement avec les caractéristiques de composition chimi que de la paroi cellulaire, la souche H964-92 peut être considérée comme appartenant au genre Actinomadura.

Bien que. la souche H964-92 d'origine ne donne lieu qu’à une croissance modérée et à un mycélium aérien rare, un variant donnant lieu à une bonne croissance et à une meilleure formation du mycélium aérien a été ^ obtenu par traitement de la souche H964-92 au moyen de nitrosoguanidine (NTG). Ce variant, dit souche A1327Y, a facilité la poursuite de l'examen taxonomique et a été identifié ultérieurement sous la dénomination Actinomadura verrucosospora.

Procédés

Les milieux et procédés appliqués à la détermination des caractéristiques de culture et de l'utilisation des hydrates de carbone sont ceux recommandés par l'International Streptomyces Project (Intl. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340 , 1966). Des milieux supplémentaires décrits par S.A. Waksman ^ (The Actinomycètes, volume 2) et G. M. Lvedemann ^ (Intl. J. Syst. Bacteriol. 21: 240-247, 1971) ont r été utilisés aussi. La composition en aminoacides . de la paroi cellulaire et la composition en sucres de l'hydrolysat cellulaire complet ont été déterminées suivant les techniques décrites par Becker et al. dans Appl. Microbiol. 13: 236-243, 1965 et par Lechevalier et Lechevalier dans The Actinomycètes .

Ed. H. Prauser, Jena, Gustav Fischer Verlag, pages 393-405, 1970, respectivement. La ménaquinone a été identifiée par analyse du spectre de masse comme indi-qué par Collins et al. dans J. Gen. Microbiol. 100 : 221-230, 1977 et la composition de la ménaquinone ' a été représentée sur base du système décrit par

Yamada et al. dans J. Gen, Appl. Microbiol. 23 : • 331-335, 1977.

Morphologie ' La souche H964-92 forme du mycélium en sub strat et du mycélium aérien. Le mycélium en substrat est long,'ramifié et non fragmenté en filaments courts. Dans le mycélium aérien, de courtes chaînes de spores sont formées en monopode ou à l'extrémité de l'hyphe. Des ramifications verticillées de chaînes de spores ^ sont observées aussi près de l'extrémité des hyphes.

Ces chaînes de spores contiennent 2 à 10 spores en chaîne et sont droites, flexueuses ou anguleuses.

Les spores ont une surface verruqueuse et sont de forme sphérique à elliptique (0,5-0,6 X 0,6-1,4 ^um) avec des extrémités arrondies ou pointues. Après ma* turation, chaque spore est souvent séparée par une gaine vide. Des spores mobiles, des sporanges ou des granules sclérotiques ne sont observés sur aucun des milieux examinés.

Caractéristiques de culture et de physiologie

La croissance de la souche H964-92 est faible à modérée dans les milieux chimiquement définis et aussi dans les milieux organiques naturels. La ^ » formation du mycélium aérien est généralement faible, mais est modérée dans la gélose à la farine d'avoine s (milieu ISP Ne3), la gélose à l'amidon et aux sels inorganiques (milieu ISP N° 4) et la gélose de Bennett. Des variants spontanés sans mycélium aérien apparaissent très fréquemment. Le mycélium aérien est blanc, mais vire ensuite au rose pâle dans la gélose à la farine d'avoine, la gélose à l'amidon et aux sels inorganiques et la gélose à l'asparagine et au glycérol (milieu ISE Ne 5) . La couleur de la masse aérienne passe ensuite au bleuâtre après une longue incubation (5 mois) dans la gélose à la farine d'avoine, la gélose à l'asparagine et au glycérol et la gélose à la * tyrosine. Le mycélium en substrat est incolore à jaunâtre dans la gélose de Czapek, la gélose à la tyro- * sine, la gélose à l'extrait de malt et à l'extrait de levure (milieu ISP N° 2), la gélose au fer, à l'extrait de levure et à la peptone (milieu ISP N° 6) et la gélose de Bennett et est de nuance rosée dans la gélose à l'asparagine et au glucose et la gélose à l'asparagine et au glycérol. Des pigments mélanoïdes et d'autres pigments diffusibles ne sont pas formés. Le ** variant ηβ A1327Y issu de la souche d'origine forme * un mycélium aérien principalement bleu pâle et porte une abondante masse de spores aériennes.

La souche H964-92 croît à 15°C, 28°C, 37°C et 43°C, mais non à 10°C ni à 47°C. Elle est sensible au NaCl à 1% et résistante au lysozyme à 0,01/é.

Les caractéristiques de culture et de physiologie de la souche productrice sont données aux tableaux 1 et 2 respectivement. L'utilisation des sources de carbone est explicitée au tableau 3.

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Caractéristiques physiologiques de la souche H964-92

Epreuve Réponse Procédé et milieu r Intervalle de tempé- croissance maximale Gélose de Bennett rature de croissance de 28°C à 37°C, modérée à 20eC et 43°C.

Nulle à 10°C et 47°C

« Liquéfaction de la liquéfiée gélatine à la peptone gélatine et au glucose

Hydrolyse de l'ami- hydrolysé gélose à l'amidon, don boîte Réactions dans le non coagulé et corn- lait écrémé Difco lait écrémé plètement peptonisé

Formation de pigment non produit gélose à la tyrosine, ^ mélanoide gélose au fer»à la levure et à la peptone et bouillon à 5 l'extrait de levure et à la tryptone Réduction du nitrate non réduit Bouillon au nitrate et au glucose de Czapek et bouillon au nitrate,à l'extrait de levure et au glucose Résistance au NaCl croissance à 5% Gélose a l'extrait et moins. Pas de de levure et à la croissance à T% tryptone

Lysozyme résistance, crois- Gélose à l'extrait de ^ sance à 0,01/6 et levure et à la tryp- moins. Pas de tone croissance à 0,1% -nj·* pH croissance de 5,0 à Gélose à l'extrait de . 9,5; pas de crois- levure et à la tryp- sance à 4,5 et 10,0 tone CD.MJ - 12 - TABLEAU 3

Utilisation des sources de carbone Souche H964-92

Actinomadura

Souche Variant verrucosospora d'origine A1327Y KCC A-0147

Glycérol + + + D(-)-Arabinose - - L(+)-Arabinose + + + î D-Xylose + + + D-Ribose + - - L-Rhamnose + + + D-Glucose + + + D-Galactose - - - D-Fructose + + + M-Mannose - ** L(-)-Sorbose -

Sucrose + + +

Lactose - - - " Cellobiose + + + Mélibiose - - -

Tréhalose + + +

Raffinose - D(+)-Mélézitose - - -

Amidon soluble + - + +

Cellulose + + +

Dulcitol -

Inositol + λ D-Mânnitol + + + D-Sorbitol - ï Salicme -

; Observation après 3 semaines d'incubation à 28°C

Milieu de base: milieu inorganique de Pridham-Gottlieb

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Composition de la paroi cellulaire et sucres constitutifs de la cellule complète.

La paroi cellulaire purifiée de la souche H964-92 contient de l'acide mésodiaminopimélique, mais * pas de glycine. L'hydrolysat cellulaire complet con tient du madurose (3-0-méthyl-D-galactose) , du glu-. cose et du ribose. Les aminoacides de la paroi cel lulaire et les sucres de la cellule complète indiquent ' que la souche H964-92 appartient au type III_ pour la paroi cellulaire. Les composants majeurs de la ména-quinone sont MK-9(HC) et MK-9(H_).

O O

Position taxonomique de la souche H964-92

La souche H964-92 présente les caractéristiques majeures suivantes: (1) chaînes aériennes de spores: courtes, droites, flexueuses ou anguleuses.

** (2) Spores: surface verruqueuse (3) Mycélium aérien: . rosé ou bleuâtre. (4) mycélium en substrat: rosé dans certains milieux. (5) Pigment diffusible: néant.

(6) Mésophile. (7) Paroi cellulaire de type III_.

B

(8) Système de la ménaquinone: MK-9(H^) et MK-9(H0).

O O

Ces caractéristiques majeures indiquent que la souche H964-92 appartient au genre Actinomadura.

Des espèces déjà connues du genre Actinomadura ont été isolées chez des mammifères. Certaines souches aussi ont été isolées sur des substances végétales. Néanmoins, beaucoup des nouvelles espèces proposées récemment ont été isolées sur des échantillons ^ de terre. Suivant la taxonomie numérique et la revue des Actinomadura et actinomycètes apparentés faites - par Goodfellow et al. dans J. Gen. Microbiol. 112 : i 95-111 (1979), la plupart des espèces d1Actinomadura provenant de la terre sont classées dans le groupe ne 7 parmi les 14 groupes décrits. La souche H964-92 est très apparentée aux espèces du groupe 7. Nonomura et Ohara dans J. Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971) CD.MJ - 14 - i mentionnent cinq espèces saprophytes du genre Actinoma-dura et Nonomura [J. Ferment. Technol. 52 : 71-77 (1974)] et Preobrazhenskaya et al. ΓActinomycètes and Related Oraanisms 12: 30-38 (1977)] donnent les clés d'iden-~ tification et de classification des espèces d1 Actino- madura. A la suite de la comparaison avec les descrip-, tions de 30 espèces comprenant des organismes cités dans des brevets, la souche H964-92 apparaît très semblable à Actinomadura coerulea décrite dans l'article de Preobrazhenskaya et al. ci-dessus et à Actinomadura verrucosospora décrite dans les articles précités de Nonomura.

La souche H964-92 comparée directement à A. verrucosospora KCC A-0147 apparaît étroitement apparentée à J\. verrucosospora par les caractéristiques * de morphologie, de culture et de physiologie. Dès , lors la souche H964-92 est considérée comme étant une nouvelle souche d1Actinomadura verrucosospora.

Il eonvient d'observer que pour la production du BBM-1675, la présente invention, bien que décrite en détail avec référence a la souche Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATGC 39334) particulière et son mutant A1327Y (ATCC 39638-)., n'est pas limitée à ces micro-organismes ni aux micro-organismes décrits en détail par les caractéristiques de culture mentionnées ici. Il est spécifiquement prévu que l'invention s'applique à la souche H964-92 et à tous ses variants et * mutants naturels et artificiels produisant du BBM-16 75.

h Production des antibiotiques - Les antibiotiques BBM-1675 faisant l'objet de l'invention peuvent être obtenus par culture d'tlne souche productrice de BBM-1675 d'Actinomadura verrucosospora . de préférence d'une souche d'Actinomadura verrucosospora ayant les caractéristiques d'identification des N° ATCC 39334 ou 39638, ou d'un mutant de CD.MJ - 15 - celle-ci, dans un milieu nutritif aqueux classique. L'organisme est cultivé dans un milieu nutritif contenant des sources nutritives connues pour les actinomycètes , à savoir des sources assimilables de carbone „ et d'azote avec éventuellement des sels inorganiques et d'autres facteurs de croissance connus. Des conditions d'aérobiose en submersion sont de préférence entretenues pour la production de grandes quantités de l'antibiotique, bien que pour la production de quantités limitées, les cultures en surface et en flacon conviennent aussi. Les techniques générales appliquées à la culture des autres actinomycètes conviennent aux fins de l'invention.

.Le milieu nutritif doit contenir une source de carbone assimilable appropriée telle que du glycé-rol, du L( + )-arabinose, du D-xylose, du D-ribose, du L-rhamnose, du D-glucose, du D-fructose, du saccharose, du cellobiose, de l'amidon soluble, du D-mannitol ou de l'inositol. Le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium,'le nitrate de sodium, etc. peuvent être utilisés comme sources d'azote soit isolément, soit conjointement avec des sources ' d'azote organique comme la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la liqueur de macération de maïs, la farine de soya, la farine de graines de coton, etc.

Si nécessaire, le milieu peut être additionné aussi de sels inorganiques nutritifs constituant des sources de sodium, de potassium, de calcium, d'ammonium, de phosphate, de sulfate, de chlorure, de bromure, de car- ^ * * bonate, de zinc, de magnésium, de manganèse, de cobalt, , de fer, etc.

La production des antibiotiques BBM-1675 peut être effectuée à toute température assurant une croissance satisfaisante de l'organisme producteur, par exemple de 15 à 45°C, et est effectuée avec avantage au voi- CD.MJ ' - 16 - sinage de 27 à 32°C. D'ordinaire, la production est optimale après des durées d'incubation d'environ 68 * a 180 heures, suivant que la fermentation est réalisée -b en flacons secoués; bocal à agitateur ou fermenteurs.

" Pour le travail en fermenteurs, il est souhaitable de produire un 'inoculum végétatif dans un bouillon nutri-* tif en inoculant le bouillon de culture à l'aide d'une culture sur gélose inclinée ou terre ou à l'aide d'une culture lyophilisée de l'organisme producteur. Un inoculum actif obtenu de la sorte est ensuite transféré aseptiquement dans le milieu du fermenteur. La production de l'antibiotique peut être surveillée par épreuve de diffusion sur gélose avec disques de papier en présence de Staphvlococcus aureus 209P comme organisme ^ d1 épreuve.

Isolement et purification

Au terme de la fermentation, le complexe BBM-1675 peut être isolé du bouillon suivant les techniques habituelles, par exemple l'extraction en solvant. Par exemple, le bouillon complet peut être séparé par filtration ou centrifugation en un gâteau mycélien et en un liquide surnageant. L'antibiotique du gâteau mycélien peut être isolé par mise en suspension des solides dans du méthanol, séparation des insolubles par filtration et concentration de 1'extrait méthanolique. La fraction active du bouillon surna-' géant peut être recueillie par extraction dans du n-butanol. L'extrait n-butanolique et l'extrait mé-thanolique précités peuvent être combinés et évaporés avec azéotropie en une solution aqueuse qui dépose la majeure partie de l'activité antibiotique sous la forme d'un solide huileux. Celui-ci peut être dissous dans du méthanol et la solution peut être filtrée.

Le filtrat est concentré et ajouté à un mélange d'acétate d'éthyle et d'eau. Le complexe BBM-1675 brut contenu dans l'extrait organique résultant peut être précipité de la solution par addition d'un antisolvant tel que le n-hexane.

Le complexe BBM-1675 brut est un mélange de différents composants comprenant deux composants bioactifs majeurs, à savoir BBM-1675 A^ et Ä2,et quatre composants bioactifs mineurs, à savoir BBM-1675, A^, A^, B^ et Έ>2· Ces composants bioactifs peuvent être séparés et purifiés suivant les techniques habituelles de la chromatographie. Suivant un procédé, le complexe BBM-1675 brut est d'abord dissous dans du méthanol et purifié par chromatographie sur une colonne de Sephadex LH-20 dont il est élue au moyen de méthanol. Ce complexe partiellement purifié peut être chromatographié ensuite sur une colonne de gel de silice et élué par fractions à l'aide de chloroforme additionné de métha-"V nol en concentration croissante pour donner du BBM-1675 A^, un mélange de BBM-1675 A2, A^ et A^ et un mélange ? des BBM-1675 B^ et B2. Le composant peut être puri fié davantage par chromatographie sur une colonne de Sephadex LH-20 dont il est élué au moyen de méthanol.

Le mélange de A2 avec A^ et A^ peut être fractionné par chromatographie sur une colonne de Bondapak C^g (Waters Associates, Inc.) qui est éluée avec des concentrations croissantes d'acétonitrile aqueux. Le mélange de B^ et de B2 peut être fractionné par chromatographie sur une colonne de gel de silice éluée ^ avec un mélange de chloroforme et de méthanol. D'au tres détails relatifs aux séparations chromatographi- * =' ques préférées sont donnés dans les exemples ci-après.

; Propriétés phvsicochimiques des composants du BBM-1675

Les six composants bioactifs du complexe BBM-1675 sont discernables les uns des autres à l'aide de deux systèmes CCM comme illustré au tableau suivant CD.MJ - 18 - TABLEAU 4 CCM des composants du BBM-1675 r Valeurs de Rf • Si02 * Silané

Composant CHCl 3-CH3OH(5:1 v/v) CH3CN-H20(75:25 v/v) BBM-1675 h1 0,74 0,18 BBM-1675 A2 0,71 0,21 BBM-1675 A3 0,72 0,28 BBM-1675 A4 0,71 0,78 BBM-1675 Βχ 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16 * Gel de silice à inversion de phase C,0

J-O

La séparation des BBM-1675 A2, A3 et A^ est difficile par CCM à phase ordinaire, mais est réalisa- •ä-, ble par CCM à inversion de phase.

Les différents composants du BBM-1675 ont des propriétés de solubilité et réactions colorées proches les unes des autres. Par exemple, ils sont solubles dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faiblement solubles dans le benzène et l'eau et insolubles dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone. Ils donnent des réactions positives avec le chlorure ferrique, les réactifs d'Ehrlich et de Tollens et des réponses négatives dans les épreuves de Sakaguchi, à la ninhydrine et à 1'anthrone.

Les propriétés physicochimiques caractéris-t tiques des composants du BBM-1675 sont données au ta bleau 5 ci-après.

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Les maxima' d'absorption UV des composants du BBM-1675 sont observés à 253, 282 et 320 nm et ne sont pas déplacés en solution acide ou alcaline. Les spectres IR et RME des BBM-1675 A2 , A^ et A^ ~ font l'objet des Fig. 1 à 4 et 5 à 8 respectivement.

Le spectre RMP à 360 MHz de BBM-1675 A^ révèle un radical acétyle (Æ :2,11 ppm), un radical N-CH^ (2,52ppm), quatre radicaux 0CH3 (3,42, 3,80, 3,88 et 3,98 ppm) et ^ un radical exométhylène (4,57 et 5,48 ppm), outre deux protons aromatiques (7,50 et 8,59 ppm) et un proton de NH (11,79 ppm). Le spectre RMN 13C du BBM-1675 Αχ comprend 55 signaux du carbone comprenant un signal d'intensité triple (6 :56,0 ppm, OCH^). La formule' brute attribuée au BBM-1675 An est Cc_H_oN.0^» sur 1 57 72 4 32 base des spectres de résonance magnétique nucléaire 13

des protons et du C, de la micro-analyse et de la " détermination des poids moléculaires par HPLC et SMIS

(chromatographie liquide à haute performance et spectrométrie de masse d'ion secondaire ).

Etude de la structure du BBM-1675 A^

Par addition de HCl 0,5 N-CH3OH à la température ambiante, le BBM-1675 A^ perd sa bioactivité et donne naissance à une substance Chromophore lipo-phile (composé I) et à différents fragments non identifiés. Le .composé I a une absorption UV semblable à celle de 1'antibiotique dont il provient, ce qui sug-gère que le composé I conserve la structure chromopho-~ re du BBM-1675 A^. Deux autres fragments chromopho- res apparentés au composé I sont obtenus par hydroly-- se alcaline du BBM-1675 A^ : l'hydrolyse par KOH 0,O5N- CH3OH à 55°C pendant 1 heure conduit au composé II ayant des maxima d'absorption UV à 252, 284, 297 (épaulement) et 322 nm, tandis que la réaction dans KOH 1N-CH30H donne une substance Chromophore acide dite composé III. Les propriétés physicochimiques des composés I, II et CD.MJ - 21 - III sont résumées au tableau 6 ci-après.

.TABLEAU 6

Propriétés des composés I. II et III

Composé I Composé II Composé III ' P.F. : 82 - 83°C 133°c 253-255°C

[o<]^9(c 0,2 CHC13 ) : -100° 0 0

Formule brute : C^NO^ C^H^NOg C^H^NOg UV^S0H nm (€) : 244 (21.850) 252 (26.600) 248 (26.900) 276 ( 9400) 283 (11.200) 295 (14.400) 318 ( 6300) 297 (ép.8800) 310 (13.500) . 322 (11.700) SM m/z : 457 (M+) 295 (M+) 281 (M+) 425 280 263 341 263 236 * 281 251 222 264 248 218

CCM

« (Xylène-*MEK-CH_0H= 5:5 v/v) : Rf 0,58 0,66 0,13 * MEK = méthyléthylcétone

Les données spectroscopiques et la transformation chimique ci-après procurent des informations relatives à la structure des composés II et III. Les 13 spectres RMN de C et de H montrent la présence de quatre radicaux OCH-, d’un radical CH_, de deux radi-| <5 6 eaux -C=, de deux radicaux >C=0 et d’un radical yNH ^ dans le composé II. Le spectre RMN du composé III est semblable à celui du composé II et n'en diffère que par l'absence de l'un des quatre radicaux OCH^ observables dans le composé II. Cette différence, jointe au caractère acide du composé III, suggère que le composé II est un ester méthylique du composé III. Chauffé au reflux dans le KOH méthanolique IN, le composé II est converti quantitativement en le composé III, tandis que le composé III est converti en le composé II par réaction avec le diazométhane. La réaction du composé II avec le NaBH^ dans l'éthanol donne un produit de réduction (composé IV, M+:m/z 267) dont le spectre RMN révèle l'existence d'un radical -Ci^OH à la place ™^ du radical -COOCH^ du composé II. Par hydrogénation sur le charbon palladié, le composé II donne un di-hydrodérivé (composé V, M+:m/z 297). Le spectre RMN des protons du composé V se distingue par un nouveau i doublet de radical méthyle et par l'absence des si gnaux du radical exométhylène existant dans le composé II. En outre, l'un des radicaux OCH^ apparaît a champ plus élevé (6: 3,5Chppm) dans le composé V.

Ces résultats indiquent la présence d'un radical -C=CH_ ,

1 L

0CH3 dans le composé II qui est réduit par hydrogénation —en un radical " -CH-CH, I 6 och3 dans le composé V. Le composé II chauffé dans le HCl méthanolique 1,5N à 80°C pendant 3 heures donne un produit d'hydrolyse dont la chromatographie sur une colonne de gel de silice révèle l'existence d'un composé faiblement basique (composé VI, M+: m/z 211). Le spectre IR et les propriétés physicochimiques montrent que le composé VI contient un radical ΝΗ3. La comparaison des spectres IR et RMN du composé VI et d'un échantillon i authentique révèle qu'il s'agit du 4,5-diméthoxy- anthranilate de méthyle. Les structures des composés ; Il a VI apparaissent donc être celles indiquées ci- après.

Structures des composés II. III, IV, V et VI

.CH

- NH-CO-C ' T il Nqch3

—JJv. composé II

CH30 COOCH3

^CH

CH^O NH-CO-C/^ OH' 3 J ^OCH,

-> I JJ composé III

COOH

/CH2

CH^O NH-CO-C"^ Z

NaBH4 TT

- -> I | compose IV

„ CH30^S^^/V CH20h . . CHo

H CH3° NH-CO-CH

2 >> I il 0CHo composé V

pd/c JL U J

CH3CrXX^ COOCH3 H+ CH30v^V NH2

H / |T compose VI

MeOH ^ |[ COOCH3 . Par réaction avec du KOH 0,05N-CH30H à 55°C, v le composé I donne naissance à un nouveau fragment chro- • mophore (composé VII, ci5H2iN07' M+: m/z 323^ et à un sucre (composé VIII). Le spectre RMN du composé VII comprend un singulet de C-CH3 et des signaux à champ élevé de deux radicaux OCH3 en plus des signaux à champ faible de trois radicaux OCH3 et des signaux des deux ΓΤ1 M T _ 0 Λ _ protons aromatiques normalement observés pour les composés II, V et VI. L'hydrolyse du composé VII avec du HCl méthanolique 1,5N conduit au composé VI identique à celui déjà obtenu à partir du composé II.-Après séparation du composé VI, l'hydrolysat additionné de 2,4-dinitrophénylhydrazine fait précipiter un solide jaune identifié comme étant la 2,4-dinitrophénylhydra-zone de 11 acide pyruvique. Le composé VII est dès lors * le 4,5-diméthoxy-N-(2‘,2'-diméthoxypropionyl)anthrani- late de méthyle. Le composé VIII ne comprend pas de pic de l'ion moléculaire mais comprend le pic dû à M-OCH^ à m/z 131 dans le spectre de masse, en concordance avec la formule brute C7H1404· Le spectre RMN indique une structure 2,6-didésoxyhexopyranose pour le composé VIII. Cette proposition est confirmée par le - 13 spectre RMN de C du compose I qux comprend les si-~T gnaux d'un radical C-CH^, d'un radical -CH2 , de trois radicaux O-CH< et d'un atome de carbone anomère en plus de 15 signaux du carbone attribuables au composé VII. Le proton en Cg du sucre apparaît à champ faible (6 :5,39 ppm, octet) ce qui indique que le C^-OH du sucre est estérifié par le radical carboxyle du composé Vil. Ces résultats sont résumés ci-après.

s *

Structures des composés I. VII et VIII Composé i composé VIII

^3 OH’ ch3o^£\. nh-co-c-ch3 ch3ohï’ __^ oh J. 1 CH3°\ Voh CHOx/^ co No_/ y_« cp'3 Çh l och3

Composé VII

— 0CH3 -0?,mPose VI ch3o,^vn^nh-co-c-ch3 -3°. ^ «U H+ T X AcH3

Tlf CH3O^^X^XCOOCH3

COOCH3 L

, CH3-CO-COOH

Le poids moléculaire du composé I (457) est à peu près le tiers de celui de la molécule complète de BBM-1675 (formule proposée C57H72N4°32 '· PM calcu_ lé = 1324). La structure partielle du BBM-1675 A^ est considérée comme étant la suivante: ί CH30 NH-CO-C=CH2 I Î>CH3 H.

\_O

0

Après la date de dépôt de la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 495.231, il a été découvert que les BBM-1675 A^ et A3 décrits ci-dessus et obtenus conformément à l'exemple 2 ne sont en fait pas parfaitement purs et que certaines des propriétés caractérisantes exploitées pour définir ces composants manquent de précision. Après de nouvelles purifications chromatogra-phiques décrites plus en détail dans les exemples 3 et 6 ci-après, les BBM-1675 A^ et ont été isolés sous une forme plus pure et complètement caractérisés comme décrit ci-après. En outre, l'analyse élémentaire des composants A^ et A^ a été revue pour tenir compte de la présence du soufre dans ces composés et les temps de rétention en HPLC ont été calculés pour ces deux composants . Les propriétés physicochimiques corrigées des composants du BBM-1675 sont résumées ci-après.

BBM-1675

Description: cristaux blancs à jaune pâle; . PF. 156-158° (décomposition).

Analyse élémentaire:

Analyse 1 Analyse 2 Moyenne C: 51,60% C: 52,74% C: 52,17% H: 6,31% H: 5,99% H: 6,15% N: 5,31% N: 3,94% N: 4,63% S: 8,47% S: 9,71% S: 9,09% 2 ί Ο: 28,31?έ Ο: 27,62% Ο: 21,96% (par différence) (par différence) (par différence) „ Spectre d'absorption UV : Instrument-Varian UV, Cary 219

Solvant - méthanol 2 Concentration - 0,01356 g/1 ^ (nm) Absorptivités max 320 12,4 280 ép (épaulement) 253 25,1 210 25 ,5

Pas de modification notable par les acides ou les bases. Rotation optique: solvant -CHC1- [<*]£ = -207° (C=0 ,0351)

Rotation optique à une seconde analyse: [ot]D7°= “191° (C = °,5, chc13)

Spectre d'absorption infrarouge: voir Fig. 9 / Bandes d'absorption majeures (KBr): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440 cm-1.

Spectre de masse:

Instrument - VG-ZAB-2F FAB-MS-thioglycérol

Ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 1249, 1357, 1463 ; avec addition de NaCl (m/z): 1271, 1379, 1485, 1597. t FAB-MS-MB (MB:matrice, P.M. 154); ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 1249, 1283, 1403, 1555; avec - addition de NaCl (m/z): 1249, 1271, 1303 , 1425, 1483, 1577.

FAB-MS-glycérol-DMSO: ions de la gamme de masse moléculai-• re (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293 , 1325 , 1353; avec addition de NaCl (m/z): 1215, 1237, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375.

Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-thioglycérol;

Ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 1357, 1463.

Poids moléculaire (sur base des spectres de masse ci-dessus) : P.M. = 1248.

Spectres de résonance magnétique nucléaire:

Instrument - WM360 Brucker Solvant: CDC1-.

1RMN: 360 MHzô(ppm): 11,75 (1H, s); 8,55 (1H, s); 7,45 (1H, s); 6,61 (1H, m); 6,23 (1H, si); 6,17 (1H, si); 5,93 (1H, d, J=9,3); 5,82 (1H, d, J=9,3); 5,7 (1H, si); 5,49 (1H, m); 5,45 (1H, d, J=2,3); 5,38 (1H, si); 4,95 (1H, d, J=10,2); 4,64 (2H, m); 4,54 (1H, d, J=2,3); 4,2 (1H, s); 4,15-3,35 (26-28H) [4,10 (1H, m); 4,02 (1H, si); 3,95 (3H, s); 3,85 (3H, s), 3,79 (3H, s); 3,46 (1H, m); 3,40 (3H, s)]; 2,82-2,70 (3H, ml); 2,50 (3H, s), 2,47 (1H, m); 2,38-2,22 (5H) ; 2,12 (1H, m); 2,11 (3H, s); 1,60-1,05 (22H) [1,39 (3H, d, J=6,3); 1,31 (3H, d, J=6,3); 1,29 (3H, d, J=6,3), 1,08 (6H)D.

Voir Fig. 10 RMN de 13c à 90,3 MHz

Voir Fig. 11

Au cours d'une expérience distincte, le spectre 13 : RMN de C du BBM-1675 A^ purifié, relevé sur échantillon dissous dans le CDCl^ (à 80 MHz) , donne les pics principaux indiqués ci-après.

RMN de 13C du BBM-1675 A (80 MHz dans CDC1 ) X J’" Déplacements chimiques en ppm (multiplicité*) BBM-1675 A1 13,7(q) 16,6(q) 17,5(q) 19,3(q) 22,2(q) 22,6(q) 23,4(q) 29,0(t) 34,0(t) 35,l(t) 39,5(t) 47,2(d) 52,5(q) 55,6(i) 56,0(q) 57,l(d) 62,4(t) 64,5(d) 67,7(d) 68,2(d) 68,8(t) 69,2(d) 69,6(t) 70,2(d) * 71,9(d) 76,0(d) 76,6(d) 77,l(i) 77,3(d) 83,4(s) 86,6(d) 88,4(s) 90,5(t) 97,2(d) 98,3(s) 99,0(d) 99,6(d) 103,8(d) 107,6(s) 112,5(d) 123,l(d) 124,9(d) s 130,l(d) 131,5(s) 134,9(s) 136,7(s) 144,0(s) 147,2(s) 153,8(s) 154,4(s) 155,0(s) 160,7(s) 166,4is) 191,8(s) ♦Multiplicité - q = quadruplet; d = doublet; i = incertain; t = triplet; S = singulet.

rn. m.t _ ? q _ BBM-1675 Ä2

Description: cristaux blancs; P.F. 147-149eC Analyse élémentaire: C: 52,71% H: 5,94% N: 3,94% S: 9,39% 0(par différence): 28,01% s

Spectre d'absorption UV: . Instrument - Varian ÜV, Cary 219

Solvant : méthanol Concentration: 0,02052 g/litre \nax Absorptivité 320 12,2 282 16,3 252 26,2 214 25,8

Pas de modification sensible par les acides ou les bases. ‘ Rotation optique: [ot]^ = -179,4e (c=0,5, CHCl^)

Spectre infrarouge: voir Fig. 12 Instrument Beckman IR modèle 4240

Bandes d'absorption majeures (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, 2940, 2980, 3440 cm“1.

Spectre de masse: Instrument: VG-ZAB-2F FAB-MS-thioglycérol

Ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569; avec addition de NaCl (m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593 FAB-MS-MB (MB: matrice, p.m. 154); ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; avec addition de NaCl (m/z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577.

FAB-MS-glycérol-DMSO; ions de la gamme de masse moléculaire (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, 1293, 1309, 1325, 1326, 1341, 1353, 1369.

CD.MJ - 30 - ί .

f ι ι ί

Poids moléculaire (sur base des spectres de masse ci-dessus) : P.M. apparent «= 1248 * Spectre de résonance magnétique nucléaire: voir Fig.13

Instrument: WM 360 Brucker Solvant: CDCl^' 1H RMN 360 MHz <5(ppm): 11,91 (1H, s); 8,62 (1H, s); 7,58 (1H, s); 6,56 (1H, m); 6,22 (1H, s); 6,15 (1H, si); 5,91 (1H, d, J=9,6); 5,83 (1H, d, J=9,6); 5,70 (1H, m); 5,45 (1H, d, J=2,2); 5,44 (1H, s), 5,34 (1H, si); 4,95 (1H, d, J=10,2); 4,75 (1H, m); 4,65 (1H, d, J=6,8) ; 4,54 (1H, d, J=2,2); 4,47 (1H, m); 4,18 (1H, s); 4,10 (1H, si), 4,05-3,50 (20-24H); [3,96 (3H, s); 3,87 (3H, s); 3,77 (3H, s)]; 3,46 (1H, m); 3,39 (3H, s); 2,79 (1H, m); 2,73 (2H, m); 2,50 (3H, s); 2,50 (lH,m); 2,38-2,22 (3H) ; 2,14 (1H, m); 2,10 (3H, s); 1,98 (2H, m); 1,65-1,45 (6-8H); 1,38 (3H, d, J=6,0); 1,34 (3H, d, J=6,0); 1,22 (3H, d, J=6,8); 1,10 (6H).

RMN de 13C à 90,3 MHz Voir Fig. 14

Au cours d'une expérience distincte, le spectre 13 RMN de C du BBM-1675 purifié, relevé sur échantillon dissous dans le CDCl^ (80 MHz), donne les pics principaux indiqués ci-après.

BBM-1675 A2 13,7 16,9 17,5 19,8 22,3 22,7 23,4 33,1 34,1 35,1 39,3 47,6 52,6 55,7 56,0 56,1 57,6 62,4 64,5 64,9 65,9 68,3 69,2 69,7 71,9 73,6 75,8 36,1 77,1 77,7 78,1 78,3 83,3 86,2 88,4 90,4 97,2 98,3 99,1 99,5 4 99,6 103,8 107,1 112,4 123,2 124,8 129,9 137,3 144,1 154,2 154,5 160,9 167,9 192,2 CD.MJ - 31 - t i υ ο

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Chromatographie en couche mince (CCM) et chromatogra phie liquide à haute performance (HPLC) des composants du BBM-1675 A. Etude n° 1 - Résume TABLEAU 8 CCM et HPLC des composants du BBM-1675 CCM (Rf) HPLC (temps de rétention _ en minutes)_

SiCL *Silané Lichrosorb RP-18 CHCU-MeOH OLCN-Η,Ο CH_CN-MeOH-0,lM CH-COONH.

(5:1 v/v) (75:25 v/v) 0 (5:2:3 v/v)_ BBM-1675 Αχ 0,74 0,18 13,3 BBM-1675 A2 0,71 0,21 17,3 BBM-1675 Â3 0,72 0,28 8,0 BBM-1675 A4 0,71 0,78 5,1 J- BBM-1675 Βλ 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16

* Gel de silice à inversion de phase C1Q

B. Etude n° 2 - CCM et HPLC pour les composants A^ et A2 purifiés_

CCM

On utilise pour toutes les chromatographies en phase normale des plaques Analtech GHLF Silica Gel Uniplates. Pour la CCM unidimensionnelle on prend des plaques de 2,5 cm x'10 cm. On les développe dans des verres cylindriques de 6,4 cm (diamètre extérieur) sur 12 cm contenant 10 ml d'éluant. Pour la CCM bidimensionnelle, on utilise des plaques de 7,5 cm x 10 cm. On dépose l'échantillon dans le coin inférieur gauche à 1 cm au-dessus du bord. On développe la plaque d'abord dans une cuve (12,7 cm de largeur, 8,6 cm de profondeur et 13 cm de hauteur) contenant 50 ml du premier éluant.

On sèche la plaque ensuite à l'air, on la tourne de 90° dans le sens opposé à celui des aiguilles de la montre et on la développe dans une seconde cuve contenant 50 ml en.MJ - 33 - du second éluant.

Pour toutes les chromatographies à inversion de phase, on utilise des plaques de gel de silice analytiques pré-enduites C-18 de Whatman. On développe les plaques de 2,5 cm x 7,6 cm dans des verres cylindriques contenant 10 ml d'éluant.

On observe les plaques en phase normale d'abord à la lumière UV de 254 nm. On insère les plaques ensuite dans un cylindre en verre (6,4 cm de diamètre extérieur x 12 cm) contenant des cristaux d'iode. On examine les plaques à nouveau après environ 2 minutes. On examine les plaques à inversion de phase uniquement en lumière UV à 254 nm. On détecte les zones en recherchant l'extinction de la fluorescence d'un colorant fixé par im-_ _ prégnation.

HPLC analytique

On utilise les composants suivants pour construire un système HPLC analytique: pompe de débit de solvant Waters Associates modèle 6000A; détecteur UV/vi-sible Varian Varichrom modèle VUV-10 réglé à 254 nm 0,1 DO; enregistreur Fisher Recordai Sériés 5000; programmeur de solvant Waters Associates modèle 660; in-jecteur Waters Associates modèle U6K; Colonne ^u-Bonda-pak C18 (10^u) Alltech (diamètre intérieur de 4,6 mm x 25 cm) avec colonne de garde Whatman Co. Pell ODS (0,03-0,038 mm) (4,6 mm diamètre intérieur x 5 cm). Les composants sont raccordés avec du tube d’acier inoxydable 316 (diamètre extérieur 1,6 mm, diamètre intérieur 0,23 mm). Le débit d'éluant est de 2 ml/minute pour toutes les analyses.

* HPLC préparative

On utilise les composants suivants pour constituer un système de chromatographie liquide sous moyenne pression: pompe Fluid Metering, Inc. modèle RP-SY 2CSC FMI Lab; amortisseur d'impulsion Fluid Metering,

Inc. modèle PD-60LF FMI; boucle d'échantillon de 15 ml faite d'un tube de polypropylène (diamètre i extérieur 3,0 mm, diamètre intérieur 1,5 mm) roulé sur un tube en carton (diamètre extérieur 8,65 cm); colonnes Glenco Sériés 3500 Universal LC; détecteur d'absorption et fluorescence avec unité optique type . 6 Instrument Specialties Co. modèle UA-5 ; valve d'ar rêt Instrumentation Specialties Co. , modèle 590 et collecteur de fractions Instrumentation Specialties Co., modèle 328. Les composants sont raccordés par du tube de polypropylène et de Teflon (diamètre extérieur 3,0 mm, diamètre intérieur 1,5 mm) et des connecteurs Glenco et robinets ou valves dans l'ordre indiqué.

On garnit les colonnes Glenco sériés 3500 Universal LC au moyen d'Une dispersion de l'absorbant , défini dans le solvant indiqué en appliquant les tech niques habituelles. On remplit l'espace vide entre le lit sédimenté et le sommet du tube avec du sable d'Ottawa normalisé. On pompe l'éluant à un débit maximum sans excéder une contre-pression de 4,14 bars (environ-20 ml/minute).

Elution à gradient

On utilise pour toutes les élutions à gradient un appareil d'élution à gradient Glenco qui comprend deux chambres de même diamètre, de même hauteur et de même volume raccordées en tandem par un robinet en Teflon. Une chambre sert de chambre de mélange et . l'autre sert de réservoir statique. On conserve le ' solvant le moins polaire initialement dans la chambre i de mélange. On conserve le solvant le plus polaire dans la chambre statique. On introduit des barreaux d'agitateurs magnétiques habillés .de Teflon (1 cm x.3,7 cm) dans les deux chambres et on les entraîne à 1'aide d'a-gitateurs Thomas modèle 15 Magne-matic. On pompe 11é- CD.MJ - 35 - ί luant de la chambre de mélange jusqu'au système HPLC à moyenne pression en passant par du tube de poly-propylène (diamètre intérieur 1,5 mm, diamètre extérieur 3,0 mm). A mesure que l'éluant quitte la chambre de mélange, on laisse le solvant du réservoir statique le remplacer librement, ce qui établit un gradient linéaire d'éluant.

*

Analyse par CCM des BBM-1675 A^ et A^ . Le tableau 9 ci-après rassemble les Rf ob servés des BBM-1675 A^ et sur des plaques en phase normale. On calcule le Rf en divisant la distance mesurée depuis le centre d'une zone jusqu'au point d'application de l'échantillon par la distance mesurée depuis le front du solvant jusqu'au point d'application de l'échantillon.

TABLEAU 9

Rf

Système/composé BBM-1675 A-j BBM-1675 A^ 4% de méthanol dans du chloroforme 0,33 0,30 5% de méthanol dans de l'éther diéthylique 0,39 50% d'acétone dans du Skellysolve B 0,38 0,31

Le tableau 10 ci-après rassemble les Rf ob servés des BBM-1675 A^ et A^ sur des plaques en phase normale développées en deux dimensions. Les positions des taches sont données en coordonnées cartésiennes.

La coordonnée X est le Rf dans le second système solvant précisé. La coordonnée Y est le Rf dans le premier système solvant précisé.

* TABLEAU 10 Rf

Système/composé_ BBM-16 75 A^ BBM-1675 A^ 4% de méthanol dans du chlo-* roforme vs 5% de méthanol dans l'éther diéthylique (0,34, 0,33) (0,28, 0,23) 4% de méthanol dans du chlo-, roforme vs 50% d'acétone dans du Skellysolve B (0,33, 029)

Le tableau 11 ci-après rassemble les Rf observés des BBM-1675 A^ et ' A^ sur des plaques de CCM à inversion de phase C-18 développées dans des éluants binaires.

TABLEAU 11

RI

S£S tème/composé_ BBM-1675 A^ BBM-1675 A^ 25% NaCl 0,5 M dans l'acétonitrile 0,18 0,21 25% eau dans l'acétonitrile 0,00 0,00 ' Le tableau 12 ci-après rassemble les Rf ob servés des BBM-1675 A^ et A^ sur des plaques CCM à inversion de phase C-18 développées avec des éluants ternaires.

TABLEAU 12 --- Rf _Système/composé BBM-1675 A^ BBM-1675 A^ CH3CN : Méthanol : 0,5M NaCl 80% : 10% : 10% 1,00 1,00 60% : 10% : 30% 0,57 0,50 40% : 30% : 30% 0,32 0,22 30% : 50% : 20% 0,44 0,33 50% : 30% : 20% 0,62 0,54 î 40% : 40% : 20% 0,60 0,49 50% : 20% : 20% 0,42 0,34 60% : 20% : 20% 0,74 0,69 CH3CN : Méthanol : eau 40% : 30% : 30% 0,00 0,00 TABLEAU 12 (suite)

Rf _Système/coroposé_ BBM-1675 A1 BBM-1675 A^

CH.CN : Méthanol : 0,1 M NH.OAC

40% : 30% : 30% 0,32 0,22 v CE^CN : Méthanol : 0,1M NaE^PO^ 40% : 30% : 30% 0,00 0,00 , Analyse HPLC des BBM-1675 A^ et A^

On analyse le BBM-1675 A^ et le BBM-1675 A2 sur des colonnes de gel de silice à inversion de phase C-18 avec des éluants simples, binaires et ternaires. Les résultats rassemblés aux tableaux 13, 14 et 15 sont les K' observés ponn ces composés. La grandeur K' est donnée par la formule suivante: T - T R o K - — o J où TD est le temps de rétention mesuré depuis le mo-

R

ment de l'injection jusqu'au sommet du pic et Tq est le temps du volume vide.

TABLEAU 13

·. .K

Système/composé BBM-1675 A^ BBM-1675 A^

Acétonitrile a a Tétrahydrofuranne - a a Méthanol 0,00 0,00 a = le composé n'est pas élue de la colonne TABLEAU 14 K'

Système/composé_ BBM-1675 A^ BBM-1675 A^ 25% d'eau dans 1'acétonitrile a a 25% de méthanol dans l'eau 1,25 1,25 a = le composé n'est pas élué de la colonne TABLEAU 15 Eluants ternaires

Système/composé_ BBM-1675 BBM-1675 A^ CH^CN : Méthanol : eau 40% z 30% : 30% a a * CH-CN : Méthanol : 0,1M NH.OAc 3 ' 4 40% : 30% : 30% 1,7 3,0 50% : 20% : 30% 3,8 6,5 43,3% : 23,3% : 33,3% 6,1 b 42,5% : 22,5% : 35,0% 7,8 b 41,5% : 21,5% : 37,0% 9,7 b a = non élue b = non déterminé * Propriétés biologiques des composants du BBM-1675

On détermine l'activité biologique des com- * posants du BBM-1675 à l'égard de différentes bactéries (Gram-positives, Gram-négatives et résistantes aux acides) et de différents champignons suivant la technique de dilution du simple au double sur gélose. On utilise de la gélose nutritive pour les bactéries Gram-positives et Gram-négatives et du milieu N® 1001 (3% de glycérol, 0,3% de L-glutamate sodi-que, 0,2% de peptone, 0,31% de Na^PO^, 0,1% de Κί^ΡΟ^, 0,005% de citrate d'ammonium, 0,001% de MgSO^ et 1,5% de gélose) pour les organismes ré-„ sistants aux acides. On prend de la gélose de Sabouraud pour les champignons. Comme il ressort du tableau 16, : chacun des six composants du BBM-1675 (A^, A3» À4» B^, B£) a un large spectre antimicrobien. Les BBM-1675 A^, A2, A^ et A^ en particulier sont fort actifs contre les bactéries Gram-positives.

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On détermine l'activité d'induction de pro-phage sur la bactérie lysogene E_^ coli W1709 ( λ ) que manifestent les composants du BBM-1675 en appliquant le mode opératoire de Lein et al. dans Nature 196 : 783-784 (1962). On réalise les comptages sur de la gélose coulée en plaques contenant le composé testé (T) et des plaques de contrôle (C). Un rapport T/C entre les résultats de comptage sur les plaques supérieur à 3,0 est considéré comme significatif et l'activité d'induction lysogène (activité ILB) est exprimée par la concentration d'induction minimale du com-» posé examiné. Comme il ressort du tableau 17, les composants du BBM-1675 ont une intense activité ILB sur les bactéries lysogènes, ce qui suggère qu'ils peuvent avoir une activité antitumorale.

TABLEAU '17

Activité d'induction lysoqène des composants du BBM-1675 Antibiotique CIM (^uq/ml)* BBM-1675 Αχ 0,0063 .

BBM-1675 A2 0,0125 BBM-1675 A3 ^ 0,05 BBM-1675 A4 0,10 BBM-1675 0,10 BBM-1675 B2 0,20 * concentration d'induction minimale L'activité antitumorale des BBM-1675 A^ et A2 se manifeste sur différentes tumeurs de la souris. On implante la leucémie lymphocytaire P-388, la leucémie lymphoïde L-1210, le mélanome mélanotique B16 et le carcinome pulmonaire de Lewis par voie intrapéritonéale à des souris mâles BDF.. avec un inoculum de 10,10 , 5 x 10° et 10° cellules par souris, respectivement. On administre des doses échelonnées des composés expérimentaux aux souris par voie intrapéritonéale 24 heures après l'inoculation de la tumeur.

On réalise les administrations une fois le premier jour uniquement, aux jours 1, 4 et 7 (q3d x 3), une fois par jour pendant 9 jours (qd 1 —> 9) ou 11 jours (qd 1 —> 11). On essaie les composants A^ et A^ contre la leucémie P-388 uniquement suivant le programme q3d x 3 vu l'insuffisance des réserves disponibles de ces composants.

i On dissout les BBM-1675 A^, » A^ et A4 dans de la solution physiologique salée à 0,9% contenant 10% de diméthylsulfoxyde et on utilise la chro-momycine A^ (Toyomycine, Takeda) comme composé de référence en solution dans de la solution physiologique salée à 0,9%. On note chaque jour le nombre d'animaux morts et survivants chez les souris traitées et non traitées et on calcule le temps de survie moyen (TSM) CD.MJ - 42 - pour chaque groupe de test (T) et groupe de contrôle (C). Un quotient T/C égal ou supérieur à 125% indique qu'un effet anti,tumoral significatif est atteint. Les résultats sont rassemblés aux tableaux 18 à 23. Les BBM-1675 A-^ et A2 manifestent une activité antitumorale très puissante contre la leucémie P-388 avec une valeur T/C maximale de 160%. Ils sont à peu près 100 à 3000 fois plus actifs que la chromomycinè A^ pour ce qui est de la dose efficace minimale. Toutefois, les BBM-1675 A^ et A^ sont moins actifs que les composants A. ou A0 contre la leucémie P-388 (tableau 19). Les • 1 2 BBM-1675 A^ et A2 sont actifs aussi contre la leucémie L-1210 (tableau 21), le mélanome B16 (tableau 22) et le carcinome pulmonaire de Lewis (tableau 23). On détermine la toxicité des BBM-1675 A1 et A2 sur des souris mâles ddY par adminsitration intrapéritonéale ou intraveineuse, le BBM-1675 A^ apparaissant à peu près 10 fois plus toxique que le BBM-1675 A2 (tableau 24). Les indices thérapeutiques des BBM-1675 A1 et A2 sont 4 à 8 fois et 8 à 20 fois plus favorables que ceux de la chromomycinè A^, respectivement,contre la leucémie P-388 (tableau 25). On exécute une seconde série d'expériences par administration intraveineuse des composants du BBM-1675 contre les leucémies P-388 et L-1210 inoculées par voie intraveineuse à raison 5 4 de 5 x 10 et 10 cellules par souris, respectivement. Pour ces dernières expériences,1'agent de référence 5 est l'adriamycine, dissoute dans de la solution phy siologique salée à 0,9% et administrée aux jours 1, » 4 et 7. Les résultats sont repris aux tableaux 26 et 27. Les composants A^ et A2 sont supérieurs à l'adriamycine par la valeur maximale de T/C, la dose efficace minimale et la plage d'activité.

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BBM-1675 A 0,019 0 ,010 0,00046 BBM-1675 A2 0,18 0,10 0,0072

Chromomycine A^ 0,81 0,41 0,23 TABLEAU 25

Indices thérapeutiques DLcn/DEM*

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BBM-16 75 A 63 >46 2 15 5 i BBM-1675 A2 180 72 2 24 24

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On détermine également l'activité antitumorale des BBM-1675 A^ et au cours d'une seconde 5 expérience contre la leucémie P-388 , la leucémie L-1210 et le mélanome B16 chez la souris. Les résultats sont repris aux tableaux 28, 29 et 30. Les détails relatifs aux modes opératoires appliqués à cette fin ont été décrits dans Cancer Chemother. Rep. 3: 1-87 (partie 3) , 1972.

TABLEAU 28

Effet des BBM-1675 A^ et A^ sur la leucémie P-388 . . Dose ip TSM Effet CMP Survi- gen rogramme jour Jours % T/C g vants _'_jour 5 j.5 (30) * NSC 38270 qd.l-» 9 400 13,0 163 -0,6 6/6 200 11,0 138 -0,9 6/6 BBM-1675 Αχ jour 1 51,2 20,0 250 -2,1 4/6 =·6 ω'° 225 -1·8 6/6 12,8 16,5 206 -1,1 6/6 : 6,4 13,0 163 +0,1 6/6 3.2 12,0 150 -0,3 6/6 1,6 11,0 138 -0,3 6/6 0,8 10,5 131 0 6/6 0,4 10,0 125 +0,4 6/6 0,2 10,0 125 +0,3 6/6 0,1 10,0 125 0 6/6 jours 1, 5 , 25,6 8,0 100 -1,8 6/6 9 12,8 13,5 169 -1,5 6/6 1 6,4 16,5 206 -0,8 6/6 3.2 16,0 200 -0,8 6/6 * 1,6 15,5 194 +0,3 6/6 4 0,8 12,5 156 +0,3 6/6 0,4 12,0 150 -0,1 6/6 0,2 11,5 144 +0,2 6/6 0,1 12,0 150 +0,8 6/6 0,05 10,0 125 +0,8 6/6 TABLEAU 28 (suite)

Effet des BBM-1675 A^ et sur la leucémie P-388 t Dose ip TSM Effet CMP Survi-

Agent Programme ,ug/kg/jour Jours % T/C g vants ___._jour 5 j,5 (30) - BBM-1675 A^ qd 1 —> 9 12,8 tox. tox. tox. 1/6 DMSO —r a en ne îc Ale . ,r 6.4 6,0 75 -1,5 4/6 ser.phys. ' ' ' 3,2 13,0 163 -1,2 6/6 1,6 14,5 181 -1,6 6/6 0,8 16,5 206 - -2,3 6/6 0,4 16,0 200 -0,9 6/6 .0,2 15,0 188 -0,8 5/5 0,1 13,0 163 -0,4 6/6 0,05 12,0 150 +0,1 6/6 0,025 12,0 150 -0,7 6/6 BBM-1675 jour 1 256 tox. tox. tox. 0/6 128 12'5 156 ~3'5 4/6 64 27,0 338 -1,9 6/6 32 26,0 325 -2,0 6/6 16 16,0 200 -1,8 6/6 8 15,5 194 -1,9 6/6 4 15,0 188 -0,7 6/6 2 12,0 150 -0,5 6/6 1 12,0 150 0 6/6 0,5 10,0 125 +0,2 6/6 jours 1, 5, 128 tox. tox. tox. 0/6 ο 64 tox. tox. tox. 0/6 32 tox. tox. -1,3 2/6 16 24,5 306 -1,3 5/5 8 17,5 219 -1,1 6/6 i 4 15,0 188 0 6/6 2 15,0 188 +0,1 6/6 1 12,5 156 -0,4 6/6 0,5 12,0 150 -0,4 6/6

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TABLEAU 28 (suite)

Effet des BBM-1675 A^ et A? sur la leucémie P-388 5 Aoent Proaramme Dose ip TSM Effet CMP Survi- ^ 09 ,ug/kg/ jour Jours % T/C g - vants _:_______jour 5 i.5 (30) * BBM-1675 A2 0,25 11,0 138 -0,4 6/6 DMSO —> qd 1 —> 9 64 tox. tox. tox. 1/6 ser.phys.

32 6,0 75 -2,9 4/6 16 8,0 100 -1,9 6/6 8 15,5 194 -1,3 6/6 4 17,0 213 -1,8 6/6 2 15,0 188 -1,1 6/6 1 14,0 175 -0,5 6/6 0,5 14,0 175 -0,6 6/6 0,25 12,0 150 -0,1 6/6 ; 0,125 12,0 150 +0,1 6/6

Contrôle sér. 8,0 - +0,5 10/10 phys.

Inoculum de tumeur: 10** cellules d'ascite en implantation irp.

Hôte : souris CDF^$

Tox. : < 4/6 souris qui survivent au jour 5

Evaluation : TSM = temps de survie moyen

Effet : % T/C = (TSM traité/TSM contrôle) x lOO

Critère : % T/C ^ 125 considéré comme activité antitumorale significative.

^ * NSC 38270 = olivomycine A

CD.MJ - 60 - TABLEAU 29

Effet des BBM-1675 A^ et h 2 sur la leucémie L-1210 . . _ Dose ip TSM Effet CMP Survi- , A9ent ’ Programme ^/kg/ln^ Jou!:s % T/c g vants __;_ ' _jour 5 j.5 (30) BBM-1675 Αχ jour 1 51,2 12,0 171 -1,1 5/6 25,6 7,0 100 -2,3 6/6 12,8 9,0 129 -1,1 5/6 6.4 9,5 136 -0,5 6/6 3.2 6,0 86 -1,7 6/6 1.6 7,0 100 -0,8 6/6 0,8 8,0 114 -0,4 6/6 0,4 7,0 100 40,3 6/6 0,2 7,0 100 -0,5 5/6 0,1 7,0 100 40,8 5/6 - jours 1, 5, 25,6 tox. tox. tox. 1/6 9 12,8 9,0 129 -1,8 6/6 6.4 9,0 129 -0,8 6/6 3.2 8,0 114 -1,9 6/6 1.6 8,5 121 0 6/6 0,8 8,0 114 -0,4 6/6 0,4 7,5 107 -1,3 6/6 0,2 8,0 114 0 6/6 0,1 8,0 114 40,4 5/6 0,05 7,0 100 40,3 6/6 qd 1—> 9 12,8 tox. tox. -2,4 3/6 6.4 8,0 114 -1,6 6/6 „ 3,2 8,0 114 -1,7 6/6 1.6 9,0 129 -2,1 6/6 0,8 8,5 121 -1,6 6/6 0,4 8,0 114 -1,0 6/6 * 0,2 8,0 114 -0,5 5/6 0,1 7,0 100 40,3 6/6 0,05 7,0 100 40,3 6/6 0,025 6,0 86 -0,6 6/6 TABLEAU 29 (suite)

Effet des BBM-1675 A^ et A2 sur la leucémie L-1210 ' Agent Programme “P5®1? ^ O® Survi- • ^ ,ug/kg/ m j Jours % T/C g vants —-----jour 5 ~j.5 (30) BBM-1675 Ä£ jour 1 256 tox. tox. tox. 0/6 128 7,0 100 -1,8 5/6 64 7,5 107 -1,3 4/6 32 8,0 114 -2,2 5/6 16 7,0 100 -2,3 6/6 8 9,5 136 -1,4 6/6 4 8,5 121 -1,1 6/6 2 8,0 114 -0,8 6/6 1 8,0 114 0 6/6 0,5 8,0 114 -0,1 6/6 TABLEAU 30 : ‘ Effet des BBM-1675 A^ et A^ sur le mélanome B16

Agent Dose ip TSM Effet CMP Survi- ,ug (M) ou jours % T/C g vants 'mg/kg/inj jour 5 j.10 (61) BBM-1675 Αχ 3,2M tox. tox. -1,8 2/10 1,6 16,0 64 -1,8 10/10 0,8 34,5 168 -1,8 10/10 0,4 56,5 226 -0,9 10/10(2)b 0,2 47,0 188 -0,7 10/10 0,1 37,0 148 -0,4 10/10 = BBM-1675 A2 16M 13,0 52 -2,1 10/10 8 29,5 118 -2,0 10/10 4 43,5 174 -1,1 10/10 2 50,5 202 -2,1 10/10(3)b * 1 0,5 140 -1,0 10/10 0 ,5 38,0 152 -1,1 10/10

Contrôle sér.phys. 25,0 - -0,1 10/10 a Un seul sans tumeur; TSM d.m.o. = 55,0 (220%),

Deux sans tumeur; TSM d.m.o. = 46,0 (184%) ïnoculum de tumeur: 0,5 ml d'un broyât à 10%, ip Hôte : souris BDF.^? * Administration : qd 1 —> 9

Tox. : < 7/10 souris qui survivent au jour 10

Evaluation : TSM = temps de survie moyen

Effet : % T/C = (TSM traité/TSM contrôle) x 100

Critère : % T/C ^ 125 considéré comme activité antitumorale significative

Après une nouvelle purification du BBM-1675 A^ de la façon indiquée à l'exemple 6, on essaie des échantillons du composé purifié contre la leucémie L-1210, la leucémie P-388 et le mélanome B16 chez la souris.

Les résultats sont rassemblés ci-après.

TABLEAU 31

Effet du BBM-1675 A^ purifié sur la leucémie P-388 (Administration jour 1)

Change- Survi- , Dose Voie, pro- TSM T/C ment moy- vants (rog/Kg/dose) gramme jours (%) en de j.5 poids _____lour 5 _ BBM-1675 A^ 0,1024 ip, qd x 1 tox. tox. 0/6 0,0512 17,5 159 -1,8 4/6 0,0256 16,5 150 -2,6 6/6 0,0128 17,5 159 -1,4 - 6/6 0,0064 15,5 141 -2,2 6/6 0,0032 15,5 141 -2,5 6/6 0,0016 16,5 150 -1,0 6/6 0,0008 15,0 136 -1,2 6/6 0,0004 15,0 136 -2,0 6/6 » TABLEAU 31 (suite)

Effet du BBM-1675 A^ purifié sur la leucémie P-388 (Administration jour 1)

Change- , Dose Voie, pro- TSM T/C ment moy- Survi- ompose (mg/kg/dose) gramme jours {%) en de vants poids j.5 _ __ _ _ _ jour 5 _ BBM-1675 A^ 0,0256 ip, q4d x 3 tox. tox. -1,5 1/6 0,0128 10,0 91 -2,5 5/6 0,0064 17,5 159 -1,9 6/6 0,0032 17,0 155 -0,8 6/6 0,0016 17,0 155 -2,0 6/6 0,0008 15,0 136 -1,7 6/6 0,0004 15,0 136 -0,4 6/6 0,0002 13,0 118 -0,8 6/6 0,0001 13,0 118 -1,3 6/6 0,00005 13,5 123 -1,0 6/6 0,0128 ip, qd x 5 tox. tox. 0/6 0,0064 tox. tox. -3,6 3/6 0,0032 17,5 155 -2,2 5/6 0,0016 14,5 132 -2,0 6/6 0,0008 15,5 141 -2,2 6/6 0,0004 16,0 145 -2,8 6/6 0,0002 17,0 155 -1,3 6/6 0,0001 14,0 127 -1,6 5/6 0,00005 15,0 136 -1,6 6/6 0,000025 15,0 136 -1,0 6/6

Contrôle (excipient) 1 x 10 0 ip, q4d x 3 11,0 100 -0,7 9/9 Hôte: souris femelle CDF1 • g

Implantation et site: 1 x ÎO cellules, ip TABLEAU 32

Effet du BBM-16 75 A.) purifié sur la leucémie L-1210 (Administration jour 1)

Change- Survi-

Composé Dose Voie, pro- TSM T/C ment moy- vants ' (mg/kg/dose) gramme jours {%) en de j.5 poids __ _ _ _ _ jour 5 _ BBM-1675 A^ 0,1024 ip, qd x 1 tox. tox. 1/6 0,0512 tox. tox. -2,0 0/6 0,0256 8,0 114 -2,9 4/6 0,0128 11,0 157 -2,0 6/6 0,0064 11,0 157 -1,9 6/6 0,0032 10,0 143 -2,0 6/6 0,0016 10,0 143 -2,6 5/6 = 0,0008 8,0 114 -0,4 6/6 0,0256 ip, q4d x 3 tox. tox. -2,3 2/6 0,0128 10,5 150 -1,7 6/6 0,0064 11,0 157 -1,8 6/6 0,0032 11,0 157 -1,4 6/6 0,0016 10,5 150 -1,9 6/6 0,0008 9,0 129 -0,6 6/6 0,0004 8,5 121 -0,7 6/6 0,0002 8,0 114 -0,5 6/6 0,0128 ip, qd x 5 tox. tox. -2,8 2/6 0,0064 7,0 100 -1,8 5/6 0,0032 11,5 164 -1,0 6/6 - 0,0016 11,0 157 -1,5 6/6 0,0008 10,0 143 -1,6 5/6 0,0004 8,5 121 -0,4 6/6 0,0002 8,5 121 0,1 6/6 0,0001 8,5 121 0,0 6/6

Contrôle - (excipient) 1 x 10- ip, qd x 5 7,0 100 0,1 10/10 Hôte: souris fQuelle CDF1

Implantation et site: 1 x 106 cellules, ip TABLEAU 33

Effet du BBM-1675 A^ purifié sur le mélanome B16 (Administration jour 1)

Change- Survi- _ , Dose Voie, pro- TSM T/C ment moy- vants ^ (mg/kg/dose) gramme jours (%) en de j.5 ' poids _____jour 5 _ *BBM-1675 Αχ 0,0064 ip, q4d x 3 16,5 110 -3,8 8/10 0,0032 22,5 150 -3,0 10/10 0,0016 25,0 167 -1,8 10/10 0,0008 22,0 147 -2,3 10/10 0,0004 24,0 160 -1,8 9/10 0,0016 ip, qd x 9 27,0 180 -3,7 10/10 0,0008 27,0 180 -2,9 10/10 0,0004 26,0 173 -2,3 10/10 5 0,0002 24,5 163 -2,4 10/10 0,0001 25,5 170 -2,3 10/10

Contrôle (excipient) 0,5 ml· ip, qd x 9 15,0 100 -0,3 10/10 **BBM-1675 Αχ 0,0064 iv,q4dx 3 15,0 86 -4,7 10/10 0,0032 32,5 186 -2,1 10/10 0,0016 26,0 149 -1,4 10/10 0,0008 24,0 137 -0,4 10/10 0,0004 24,5 140 -0,0 10/10 0,0064 ip, q4d x 3 18,0 103 -2,7 10/10 0,0032 23,0 131 -1,4 10/10 0,0016 24,0 137 -0,7 10/10 0,0008 25,5 146 -0,8 10/10 0,0004 21,5 123 -1,4 10/10

Contrôle ’ (excipient) 0,2 ml iv, q4d x 3 17,5 100 -0,4 10/10 Hôte: souris femelle BDF1 ^Implantation et site: 0,5 ml de broyât à 10%, ip ** Implantation et site: fragment sous-cutané

Les résultats ci-dessus montrent que le BBM-1675 A^ purifié a sensiblement les mêmes propriétés antitumorales que l'échantillon moins purifié essayé antérieurement. Ce composé est exceptionnellement efficace, du fait qu'à une dose de 25 nanogram-mes/kg administrée 5 fois par jour,il s'est révélé efficace contre la leucémie P-388 chez la souris.

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Le BBM-1675 A^ est efficace contre les leucémies 0 P-388 et L-1210 lorsqu’il est administré en injec tion unique au jour 1, tous les quatre jours en 3 injections ou 5 fois par jour. Contre le mélanome B16, ce composé est également efficace en injection intraveineuse à des animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées et il est efficace aussi en injection intrapéritonéale chez des animaux portant des tumeurs implantées ip. Cette aptitude du principe actif à atteindre une tumeur éloignée est inhabituelle parmi les antibiotiques antitumoraux.

Comme indiqué ci-dessus, les composants du BBM-1675 ont une activité antimicrobienne intense et sont utiles pour le traitement curatif d'infections provoquées par de tels micro-organismes chez les mammifères ou d'autres animaux. De plus, ces composants peuvent être utilisés pour des applications classiques des agents antimicrobiens, comme la désinfection du matériel médical et dentaire.

L'induction du prophage dans les bactéries . lysogènes et l'activité manifestée contre les tumeurs chez la souris révèlent que les composants du BBM-1675 * 5 sont aussi thérapeutiquement utiles pour inhiber le dé veloppement de tumeurs chez les mammifères.

L'invention a donc aussi pour objet un procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte atteint d'une infection microbienne ou d'une tumeur maligne, suivant lequel on administre à cet animal, en CD.MJ - 67 - dose efficace contre le microbe ou la tumeur, du BBM-1675 A^, , A^, B^ ou ou une composi tion pharmaceutique de l'un de ceux-ci.

Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant en quantité efficace contre les microbes ou les tumeurs du BBM-1675 A^, , A^, A^, ou B^ en combinaison avec un excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable inerte. Ces compositions peuvent être préparées sous toute forme pharmaceutiquement acceptable propre à l'administration parentérale.

Les préparations conformes à l'invention destinées à l'administration parentérale sont notamment des solutions, suspensions ou émulsions aqueuses ou non aqueuses stériles. Elles peuvent être préparées sous la forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau, de la solution physiologique salée stérile ou un autre milieu injectable stérile immédiatement avant l'administration.

Il est évident que la quantité des antibiotiques BBM-1675 qui est préférée en pratique varie avec la nature du composant, la forme pharmaceutique, le mode et le site d’administration, l’espèce à laquelle appartient l'hôte et l'affection à traiter.

De nombreux facteurs qui modifient l'influence du principe actif peuvent être envisagés par le spécialiste comme l'âge, le poids du corps, le sexe, l'alimentation, le moment et la voie d'administration, la , * vitesse d'excrétion, l'état de l'hôte,.la combinaison avec d'autres principes actifs, les réactions de sen- a sibilité et la gravité de l'affection. L'administration peut être réalisée de manière continue ou périodique dans les limites de la dose maximale tolérée. La dose optimale pour un ensemble déterminé de condi- CD.MJ - 68 - tions peut être évaluée par le spécialiste à l'aide des épreuves classiques de détermination des doses, compte tenu des indications données ci-dessus.

Les exemples ci-après -illustrent davantage l'invention sans la limiter.

EXEMPLE 1

Fermentation du BBM-1675

On cultive la souche H964-92 d'Actinomadura s et on l'entretient sur gélose inclinée contenant 1% d'extrait de malt, 0,4% de glucose, 0,4% d'extrait de levure, 0,05% de CaCO^ et 1,6% de gélose. On utilise une culture bien formée sur gélose inclinée pour inoculer un milieu végétatif contenant 3% d'amidon - soluble, 3% de levure séchée, 0,3% de I^HPO^, 0,1% de KH2P04, 0,05% de MgS04.7H20, 0,2% de NaCl et 0,1% de CaCO^, le pH étant ajusté à 7,0 avant stérilisation. On met la culture végétative à incuber à 32°C pendant 72 heures dans un secoueur rotatif (250 tours par minute) et on introduit 5 ml de la culture dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml d'un milieu de fermentation contenant 3% de mélasse de canne, 1% d'amidon de maïs, 1% de farine de poisson, 0,1% de CaCO^ et 0,005% de CuS04.5H20 (pH ajusté à 7,0 avant stérilisation). On exécute la fermentation à 28°C pendant six jours dans le secoueur· rotatif. On détermine l'activité antibiotique du bouillon de fermentation par diffusion sur gélose à partir d'un disque de ^ papier contre Staohvlococcus aureus 209P comme organis me étalon. L'activité antibiotique atteint un maximum d'environ 1 ^ug/ml après cinq jours de fermentation .

»

On exécute la fermentation du BBM-1675 aussi dans des fermenteurs à agitateur. On introduit 500 ml de la culture d'inoculation préparée comme ci-dessus dans des fermenteurs de 20 litres contenant 10 litres r.n. m.t _ fi q _ d'un milieu de fermentation ayant la même constitution que celui utilisé pour la fermentation en flacon secoué . On exécute la fermentation à 32eC avec un débit d'air de 12 litres par minute et une agitation de 250 tours par minute. Dans ces conditions, la production d'antibiotique atteint un maximum d'environ 0,9 ,ug/ml après 68-76 heures de fermentation.

» '

On exécute des études de fermentation aussi 5 dans des cuves de fermentation. On agite une culture d'ensemencement pendant quatre jours à 30°C dans des fioles d'Erlenmeyer contenant du milieu végétatif qui comprend 3% d'amidon soluble, 3%’ de levure séchée, 0,3% de K2HP04, 0,1% de KH2P04, 0,05% de MgS04.7H20, 0,2% de NaCl et 0,1% de CaCO^. On introduit la culture d'ensemencement dans une cuve d'ensemencement de 200 litres contenant 130 litres de milieu d'ensemencement ayant la même constitution que ci-dessus et on agite le contenu de la cuve à 240 tours par minute à 30°C pendant 31 heures. On utilise la seconde culture d'ensemencement pour inoculer 3000 litres d'un milieu de fermentation contenant 1% d'amidon de maïs, 3% de mélasse de canne, 1% de farine de poisson, 0,005% de CuS04.5H20 et’ 0,1% de CaCO^* On exécute la production en cuve à 28°C à 164 tours par minute avec une aération de 2000 litres/minute. Le pH du bouillon augmente à mesure de l'avancement de la fermentation et atteint une valeur de 7,7-7,8 après 170-180 heures, - moment auquel l'activité antibiotique maximale s'élève à 1,7 ^ug/ml.

EXEMPLE 2

Isolement et purification des composants du BBM-1675 »

On sépare le bouillon de fermentation recueilli (3000 litres, pH 7,8) en un gâteau mycélien et en un liquide surnageant au moyen d'une centrifugeuse Sharpless. On met le gâteau mycélien en sus- CD.MJ - 70 - pension dans 1600 litres de méthanol et on agite le mélange pendant 1 heure. On sépare les insolubles par filtration et on concentre l'extrait méthanoli-que sous vide, jusqu'à 43 litres,. On isole l'activité contenue dans le liquide surnageant par deux extrac- * tions au n-butanol en quantité de 1000 litres à chaque reprise. On combine les extraits dans le n-butanol et l'extrait méthanolique concentré et on les évapore par azéotropie avec apport occasionnel d'eau en une solution aqueuse (20 litres) qui dépose la majeure partie de l'antibiotique sous la forme d'un solide huileux. On met le solide à digérer dans 30 litres de méthanol et on sépare les insolubles par filtration. On concentre l'extrait méthanolique sous vide pour obtenir 10 litres d'une solution à laquelle on ajoute 40 litres d'acétate d'éthyle et 30 litres d'eau. Après 30 minutes d'agitation, on sépare la couche or- 5 ganique, on la sèche sur du sulfate de sodium et on l'évapore sous vide jusqu'à 4 litres. Par addition du concentré à 20 litres de n-hexane,on obtient un solide jaune pâle qui est le complexe BBM-1675 brut (90,14 g, titre: 55 ^ug/mg). Ce complexe se révèle à la CCM être un mélange de deux composants majeurs, les BBM-1675 A^ et A^,avec quelques composants mineurs. On les sépare et on les purifie par chromato-graphies répétées qu'on exécute en chambre froide pour éviter la détérioration.

; On-dissout le complexe BBM-1675 (20 g) dans du méthanol (20 ml) et on verse la solution sur une * colonne de Sephadex LH-20 (0 5,5 cm, hauteur 85 cm).

On développe la solution au méthanol et on surveille l'élution par dosage biologique contre Staphylococcus aureus 209P. On combine les éluats actifs, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir le complexe BBM-1675 sous forme de solide semi-pur CD.MJ - 71 - i (4,19 g). On chromatographie le solide ensuite sur une colonne de gel de silice (0 5,0 cm, hauteur 50 cm) qu'on élue avec du chloroforme contenant des quantités croissantes de méthanol (1 —> 59» v/v) .

On rassemble les éluats d'après leur acti-( vite antibactérienne (contre J3. aureus) et la CCM

(S1O2; CHClg-CH^OH = 5:1 v/v), puis on les concentre sous vide. On élue d'abord du BBM-1675 A1 presque homogène (production après évaporation: 351 mg) avec i 2% de méthanol dans du chloroforme, et ensuite un mélange des BBM-1675 A2 , Ag et A (507 mg) , puis un mélange dès BBM-1675 B (210 mg) avec 3% de méthanol dans du chloroforme. On dépose le BBM-1675 A^ sur une colonne de Sephadex LH-20 (0 2,0 cm, hauteur 80 cm) qu'on développe au méthanol. On concentre les frac-- tions actives sous vide jusqu'à siccité et on cris tallise le solide résiduel dans le méthanol pour ob-tenir des plaquettes incolores de BBM-1675 A^ pur (124 mg) (ce produit est le composé de départ pour l'exemple 3A). On sépare le complexe des BBM-1675 A2, Ag et par chromatographie sur une colonne Bondapak C^g (Waters, 0 3,0 cm, hauteur 50 cm). On exécute l'élution avec de 1'acétonitrile aqueux et on examine les éluats bioactifs par CCM (Merck, silané c'est-à-dire gel de silice à phase inversée C18: CHgCN-l^O = 75:25 v/v). On élue les composants mineurs A^ (33 mg) et Ag (18 mg) successivement dans cet ordre au moyen d'acétonitrile à 20%, puis un autre composant majeur A2 (301 mg) (celui-ci est le composé de départ pour . l'exemple 3B) avec de 1'acétonitrile à 50%.

On chromatographie le solide contenant les BBM-1675 B^ et B2 sur une colonne de gel de silice (0 3,0 cm, hauteur 40 cm) avec du chloroforme et du méthanol comme solvant de développement. On combine les fractions actives éluées avec 4% de méthanol dans CD.MJ - 72 - du chloroforme et on les évapore pour obtenir le ; BBM-1675 'B^ pur (7 mg). On élue une autre fraction ’ . active avec 5% de méthanol pour obtenir après éva poration le BBM-1675 B2 (8 mg).

EXEMPLE 3 ïj·

Purification plus poussée des BBM-1675 A^ et A2 A. Purification du BBM-1675 A^

On garnit une colonne Glenco d'un diamètre : intérieur de 2,67 cm et d'une hauteur de 75 cm au moy en d'une suspension de gel de silice à phase octadé-cyle (C18) fixée Baker (granulométrie 40 ^um) dans du méthanol. On raccorde la colonne à un système HPLC à moyenne pression et on 1'amène à 1'équilibre avec 1500 ml d'éluant (41,6% d'acétonitrile, 21,6% de méthanol, 36,8% d'acétate d'ammonium 0,1 M). On dissout dans 2 ml d'acétonitrile du BBM-1675 A^ partiellement purifié (100,5 mg) obtenu suivant la technique de purification de l'exemple 2 et on l'introduit dans la boucle d'échantillon. On pompe l'échantillon dans la colonne. On élue la colonne à l'aide de l'éluant ci-dessus en recueillant des fractions de 87 ml. On surveille les éluats à 254 nm et 340 ma. On rassemble les fractions 55 à 71 et on les extrait deux fois avec des volumes de 1500 ml de chloroforme. On évapore le chloroforme à siccité pour recueillir 89,8 mg de résidu C.

On garnit une colonne Glenco d'un diamètre ; intérieur de 1,5 cm et d'une hauteur de 20 cm au moy

en d'une dispersion de 12 g de gel de silice Woelm * ’ (granulométrie 60 à 200 ^um). On dépose le résidu C

sur la colonne dans une solution chloroformique. On élue la colonne avec 500 ml de chloroforme dans lequel on établit un gradient linéaire jusqu'à 10% de méthanol dans le chloroforme, en recueillant des fractions de 20-25 ml. Après analyse par CCM sur gel de silice, CD.M.T - 73 - on rassemble les fractions 6-9 et on les évapore à siccité pour recueillir 73 mg de résidu D.

On garnit une colonne Glenco d'un diamètre intérieur de 1,5 cm et d'une hauteur de 20 cm au moyen d'une dispersion de 12 g de gel de silice Woelm (gra-nulométrie 63-200 ^um) dans du Skellysolve B. On dissout le résidu D dans environ 2 ml de chloroforme et b on le dépose sur la colonne. On déplace le chloro-. forme par 25 ml de skellysolve B. On élue la colonne avec 500 ml de Skellysolve B dans lequel on établit un gradient linéaire jusqu'à 60% d'acétone dans le Skellysolve B ,en recueillant des fractions de 28-25 ml. On rassemble les fractions 19-23 et on les évapore à siccité pour recueillir 65,6 mg de BBM-1675 A^ pur.

Ce résidu apparaît homogène dans trois systèmes CCM (5% de méthanol dans le chloroforme; 5% de méthanol dans de l'éther et 50% d'acétone dans du Skellysolve B, sur gel de silice) et à la HPLC (gel de silice C-18: 41,5% d'acétonitrile, 21,5 % de méthanol, 3 7,0% d'acétate d'ammonium 0,1 M) .

Chromatographie de perméation de gel avec BBM-1675 A^ purifié

On garnit une colonne Pharmacia d'un diamètre intérieur de 2,5 cm et d'une hauteur de 45 cm au moyen d'une dispersion de Sephadex LH-20 dans du méthanol et on‘ajuste le lit chromatographique à 33,4 cm. On dissout du BBM-1675 A1 purifié (environ 120 mg) dans ; 2 ml de méthanol et on le dépose dans un réservoir à échantillon de 2,5 ml. On dépose l'échantillon sur ^ * la colonne et on commence l'élution avec 1,75 ml par minute de méthanol en recueillant des fractions de 10 ml [collecteur de fractions Pharmacia Frac-100].

On surveille l'éluat à 254 nm au moyen d'un détecteur Isco UA-5. On constate que le BBM-1675 A.^ s'élue pour Ve/Vt de 0,79 à 0,91 (Ve = volume d’élution; Vt = vo- CD.MJ - 74 - lume du lit).

B. Purification du BBM-1675

On garnit une colonne Glenco d'un diamètre intérieur de 2,65 cm et d'une hauteur de 75 cm au moyen d'une dispersion de gel de silice à phase oc- b- tadécyle (C18) fixée Baker (granulométrie 40 ^um) dans du méthanol. On raccorde la série à un système HPLC à moyenne pression et on l'amène à l'équilibre = avec 1500 ml d'éluant (50% d'acétonitrile , 20% de méthanol, 30% d'acétate d'ammonium 0,1 M). On dissout dans 2 ml d'acétonitrile du BBM-1675 partiellement purifié (76,9 mg) tel qu'obtenu par le procédé de l'exemple 2 et on l'introduit dans la boucle d'échantillon. On pompe l'échantillon dans la colonne. On élue la colonne avec l'éluant ci-dessus en recueillant des fractions de 87 ml. On surveille l'éluat à 254 et 340 nm. On rassemble les fractions 31 à 38 et on les extrait deux fois avec des aliquotes de 500 ml de chloroforme. On évapore le chloroforme à siccité pour recueillir 65,8 mg de BBM-1675 homogène.

‘ Le BBM-1675 est homogène dans 2 systèmes CCM, un système CCM à 2 dimensions et HPLC.

EXEMPLE 4 · ·

Procédé préféré d'extraction du BBM-16 75 Aj^

On introduit le bouillon de fermentation brut (6800 ml) obtenu suivant le mode opératoire général de 1'exemple 1 dans un récipient en polypropy-- lène (diamètre 12 cm au sommet et 10 cm au fond, hau teur 37 cm) dont le fond est muni d'un robinet. On y î. 5 introduit un volume égal de chloroforme. On agite le mélange à la bonne allure avec un agitateur pneumatique CRC pendant 2 heures. On ajoute environ 4 litres (1,3 kg) de Dicalite (auxiliaire de filtration) qu'on disperse. On filtre le mélange sur une couche de Dicalite déposée dans un entonnoir de Buchner n° 12.

CD.MJ - 75 -

On recueille le. filtrat dans une bouteille de 19 litres munie d'une prise de vide (Ace. N° 5396-06).

On lave la couche filtrante avec 2 litres de chloroforme. On introduit le filtrat dans une ampoule de séparation de 20 litres et on laisse les phases * » se séparer. On collecte la phase inférieure (chloroforme) .

s»

On garnit un tube Glenco d'un diamètre in-; térieur de 2,5 cm et d'une hauteur de 40 cm au moyen d'une dispersion de 91 g de gel de silice Woelm (granulométrie 63-200 ^um). A l'aide d'une pompe FMI RPY-2CSD, on pompe la phase chloroformique ci-dessus à travers la colonne. On rince la colonne avec 600 ml de chloroforme frais. On rejette cet éluat chloroformique. On élue la colonne ensuite avec 600 ml de méthanol à 105έ dans du chloroforme. On évapore la fraction ainsi éluée jusqu'à siccité pour obtenir 547 mg de résidu A.

; On dissout le résidu A dans 50 ml de chlo roforme. On ajoute la solution chloroformique à 20 g de Dicalite dans un ballon à fond rond d'une capacité de 1000 ml. On forme une suspension en ajoutant environ 200 ml de Skellysolve B. On chasse les solvants à 1'évaporateur rotatif. On disperse le résidu dans 300 ml de Skellysolve B. On verse la dispersion dans un tube chromatographique Ace (pièce N° B5872-14) (diamètre intérieur 41 mm, hauteur 45,7 cm) en appli-- quant la technique ci-après. On insère un tampon de laine de verre dans l'étranglement du bouchon entre v ' celui-ci et la colonne. On dépose sur la laine de verre une couche de 1 cm de sable d'Ottawa normalisé.

»

On chasse l'air du bouchon, du tampon de laine de verre et du sable en y faisant passer sous pression (0,39 bar) du Skellysolve B. On introduit la dispersion ensuite dans la colonne et on l'y laisse former CD.MJ _ 7fi - un lit pendant l'écoulement sous pression. On ne laisse jamais la colonne venir à sec. Après avoir obtenu un lit stable dans la colonne, on dépose une v couche de 2 cm de sable d'Ottawa au-dessus du lit.

On élue le lit ensuite avec encore 600-700 ml de Skellysolve B. On élue le lit avec 500 ml de toluène. On évapore l'éluat toluénique à siccité pour recueillir 93 mg de résidu B. En appliquant le mode opéra-, toire de l'exemple 3, on peut purifier davantage ce BBM-1675 A^ partiellement purifié.

EXEMPLE 5

Fermentation du complexe BBM-1675 avec le variant H964-92-A1327Y

On utilise le variant A1327Y, obtenu au départ d'Actinomadura verrucosospora N° H964-92 par traitement au NTG, pour inoculer un milieu végétatif contenant 2% d'amidon soluble, 1% de glucose, 0,5% d'extrait de levure, 0,5% d'amine NB type A et 0,1% de CaCOg, le pH étant ajusté à 7,0 avant stérilisation. On met la culture végétative à incuber à 32°C pendant 4 jours dans un secoueur rotatif (250 tours par minute) et on transfère 5 ml de la culture dans une fiole d'Erlenmeyer de· 500 ml contenant 100 ml d'un milieu de fermentation comprenant 3% de mélasse de canne, 1% d'amidon de maïs, 1% de farine de poisson, 0,005% de CuSO^.Sf^O, 0,05% de MgS04.7H20 et 0,1% de CaC03 , le pH étant ajusté à ; 7,0 avant stérilisation.

On exécute la fermentation à 28°C pendant s * 7 jours sur un secoueur rotatif. La production d'an tibiotique atteint un maximum d'environ 1,5 ^ug/ml. EXEMPLE 6 /

Isolement et purification des composants du BBM-1675 On sépare le bouillon de fermentation récolté dans l'exemple 5 (3000 litres, pH 7,6) en un CD.mj - 77 - gâteau mycélien et un liquide surnageant, à l'aide d'une centrifugeuse Sharpless. On agite le gâteau mycélien avec 2000 litres de méthanol pendant 1 heure et on sépare les insolubles par filtration. On extrait dans 1800 litres de n-butanol l'activité contenue dans le liquide surnagent. On combine les extraits dans le méthanol et le n-butanol et on les concentre par azéotropie avec addition occasionnelle d'eau pour obtenir une solution aqueuse (20 litres) qui dépose la majeure partie de l'antibiotique sous la forme d'un solide huileux. On agite le mélange trois fois avec 20 litres d'acétate d'éthyle à chaque reprise pour extraire l'activité. On rassemble les extraits, on en sépare les insolubles par filtration et on les évapore sous vide jusqu'à 4 litres. On verse le concentré dans 30 litres de n-hexane sous agitation pour obtenir le complexe BBM-1675 brut sous la forme d'un solide jaune pâle (81,7 g, titre: 59^ug/mg). Ce complexe se révèle à la CCM et à la HPLC être un mélange de deux composants majeurs, à savoir BBM-1675 et Ä2,et de quelques composants mineurs. On les sépare et on les purifie par une série de chromatographies qu'on effectue en chambre froide pour éviter la détérioration.

On dissout le complexe BBM-1675 brut (20 g) dans du méthanol (20 ml) et on le dépose sur une colonne de'Sephadex LH-20 (0 5,5 cm, hauteur 85 cm). On Γ développe la colonne au méthanol et on surveille l'élu- tion par dosage biologique contre Staphylococcu^ v * aureus 209P. On rassemble les éluats actifs, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir » le complexe BBM-1675 solide semi-pur (4,86 g, titre: 203^ug/mg). On chromatographie le solide ensuite sur une colonne de gel de silice (0 3,0 cm, hauteur 70 cm) au moyen de chloroforme additionné d'une quantité crois- CD.MJ - 78 - santé (1 à 5%) de méthanol comme solvant de développement. On rassemble les éluats sur base de l’activité antibactérienne contre £>_. aureus et sur base de la .CCM (S1O2, CHCl3-MeOH = 5:1, v/v) et on les concentre sous vide. On élue le BBM-1675 A^ (425 mg après évaporation, titre: 960 ^ug/mg) d'abord avec 2% de méthanol dans du chloroforme, puis on élue un mélange des BBM-1675 A£, A^ et A^ (732 mg, titre: 340 ^ug/mg) . et ensuite le complexe BBM-1675 B (200 mg, titre: 190 ^ug/mg) avec 3% de méthanol dans du chloroforme.

On rechromatographie le BBM-1675 A^ ci-dessus sur du gel de silice (colonne 0 2,2 cm x 44 cm) avec 2% de méthanol dans du benzène. On examine les éluats bioactifs par HPLC (Lichrosorb RP-18 : CH3CN-MeOH-0,lMCH3COONH4 5:2:3 , v/v) et on concentre par évaporation à siccité les fractions contenant du BBM-1675 A1 homogène. On cristallise le soldie résiduel dans le méthanol (10 ml) pour obtenir des prismes incolores de BBM-1675 A^ (197 mg, . titre: 1000 ^ug/mg).

On sépare le complexe des BBM-1675 A3, A3 et A4 (537 mg) par chromatographie sur une colonne de

Bondapak C18 (Waters, 0 2,0 cm, hauteur 42 cm). On exécute l'élution avec de 11acétonitrile aqueux et on examine les éluats bioactifs par CCM (Merck, sila- né : CH^N-t^O = 75:25 , v/v). On élue les composants mineurs BBM-1675 A^ (45 mg, titre: 410 ^,ug/mg) et A3 (19 mg, titre: 300 ^ug/mg) successivement avec de l4.a- cétonitrile à 20%, puis un composant majeur, à savoir BBM-1675 A2 (203 mg),avec de 1'acétonitrile à 50%.

. ' On cristallise la fraction de BBM-1675 A«'dans le v 2 chloroforme-n-hexane pour obtenir un dépôt de bâton- i nets incolores (70 mg, titre: 290 ^,ug/mg) . On chromatographie le solide contenant le mélange des BBM-1675 B sur une colonne de gel de silice (0 3,0 cm, hauteur 40 cm) avec du chloroforme et du méthanol comme solvant de dé- CD.MJ - 79 - veloppement. On rassemble les fractions actives éluées avec 4% de méthanol dans le chloroforme et on les évapore pour obtenir le BBM-16 75 B^ pur (7 mg, titre: 180 ^ug/mg). On élue une autre fraction active à une concentration en méthanol de 5% pour obtenir par évaporation le BBM-1675 B£ (8 mg, titre: 140^ug/mg).

s » CD.MJ - 80 -

Claims (23)

1. 2. L'antibiotique antitumoral BBM-1675 qui, sous forme sensiblement purifiée : (a) se présente en cristaux blancs; (b) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faiblement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; - (c) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique et les réactifs d'Ehrlich et de Tollens et » une réaction négative dans les épreuves de Sakaguchi, S? à la ninhydrine et à 1'anthrone; (d) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr) sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 12; (e) en solution dans le CDClg , présente un spectre de résonance magnétique des protons sensiblement tel CD.MJ - 82 - qu'illustré à la Fig. 13; (f) a un point de fusion d'environ 147 à 149°C; 27 (g) a une rotation optique [«]β de -179,4e (c = 0,5, CHC13); (h) a un poids moléculaire apparent de 1248 tel que déterminé par spectroscopie de masse; (i) a la composition élémentaire approximative 52,71% de carbone, 5,94% d'hydrogène, 3,94% d'azote, 5 9,39% de soufre et 28,01% (par différence) d'oxygène; (j) présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice un Rf de 0,71 avec le système solvant CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) et présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice à inversion de phase un Rf de 0,21 avec le système solvant CH^CN-î^O (75:25 v/v); (k) en solution dans -le méthanol à une concentration de 0,02052 g/litre,présente lès maxima d'absorption et absorptivités dans l'ultraviolet ci-après: λ (nm) Absorptivités max_ ___ 320 12,2 282 16 ,3 252 26,2 214 25 ,8 sans' modification sensible par addition d'un acide ou d'une base; (l) présente à la chromatographie liquide à haute performance un temps de rétention de 17,3 minutes sur une colonne de gel de silice à inversion de phase C18 avec le système solvant CH3CN-CH3OH-0,1M CH3COONH4 “ (5:2:3 v/v); . (m) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries et champignons de diverses espèces; (n) induit le prophage dans les bactéries lysogènes, et (o) est efficace pour inhiber le développement de la leucémie P-388 , de la leucémie L-1210, du mélanome B16 et du carcinome pulmonaire de Lewis chez la souris.
2. 3. L'antibiotique antitumoral BBM-1675 qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faiblement soluble dans le benzène et 1'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique et les réactifs d'Ehrlich et de Tollens et une réaction négative dans les épreuves de Sakaguchi, à la ninhydrine et à 1'anthrone; (c) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr) sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 3; (d) en solution dans le CDCl^, présente un spectre de résonance magnétique des protons sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 7; (e) . a un point de fusion d'environ 125 à 127°C; 27 (f) a une rotation optique [(Χ]β de -161e (c = 0,5, CHC13); (g) a la composition élémentaire approximative 54,55% de carbone, 6,46% d'hydrogène, 3,73% d'azote, 7,49% de soufre et 27,77% (par différence) d'oxygène; (h) présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice un Rf de 0,72 avec le système solvant CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) et présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice à inversion de phase un Rf de 0,28 avec le système solvant CH^CN-ï^O - (75:25 v/v); (i) présente les maxima d'absorption dans l'ul- ’ traviolet ci-après après dissolution dans le méthanol, le HG1 0,01N-CH3OH et le NaOH 0,01N-CH30H UV X nm (E^ ) 253 (286) max 1 cm méthanol 282 (158) 320 (122) /-*τ\ RJf T O A uv nm (EÎ* ) 253 <287) max ± cm HCl 0,01N-CH3OH 282 (160) 320 (126) UV λ nm (E^ ) 252 (280) max 1 cm c NaOH 0,01N-CH3OH 283 (162) 318 (120) * (j) présente à la chromatographie liquide à haute performance un temps de rétention de 8,0 minutes sur une colonne de gel de silice à inversion de phase C18 avec le système solvant CH3CN-CH3OH-0,IM CH3C00NH^ (5:2:3 v/v) ; (k) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries et champignons de diverses espèces; (l) induit le prophage dans les bactéries lysogè-nes, et (m) est efficace pour inhiber le développement de la leucémie P-388 chez la souris.
3. 4. L'antibiotique antitumoral BBM-1675 qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faiblement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique, les réactifs d1Ehrlich et de Tollens et une réaction négative dans les épreuves de Sakaguchi, à la ninhydrine et à -1'anthrone ; (c) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr) sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 4; s (d) en solution dans le CDC13 , présente un spectre de résonance magnétique des protons sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 8; (e) a un point de fusion d'environ 123-126°C; 27 (f) a une rotation optique [οί]β de -176° (c = 0,5, CHC13); (g) a la composition élémentaire approximative 54,65% de carbone, 6,29% d'hydrogène, 3,51% d'azote, 8,07% de soufre et 27,48% (par différence) d'oxygène; (h) présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice un Rf de 0,71 avec le système solvant CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) et présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice à inversion de phase un Rf de 0,78 avec le système solvant CH^CN-t^O (75 :25 v/v) ; (i) présente les maxima d'absorption dans l'ultra violet ci-après après dissolution dans le méthanol, le HCl 0,01N-CH3OH et le NaOH 0 ,01N-CH3OH UV λ nm (E^ ) 253 (257) max 1 cm méthanol 282 (153) 320 (117) UV> nm (E** ) 253 (258) max 1 cm HCl 0,01N-CH3OH .282 (155) 320 (118) UVA nm (eJ* ) 252 (266) max 1 cm NaOH 0,01N-CH3OH 283 (160) 318 (118) (j) présente à la chromatographie liquide à haute performance un temps de rétention de 5,1 minutes sur une colonne de gel de silice à inversion de phase C^g avec le système solvant CH^N-CHgOH-0,1M CH3C00NH4 (5:2:3 v/v); - (k) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries et champignons de diverses espèces ; 9 (l) induit le prophage dans les bactéries lysogè-nes, et (m) est efficace pour inhiber le développement de la leucémie P-388 chez la souris. rn m.t _ a fi _ f f
4. 5. L'antibiotique antitumoral BBM-1675 B^ qui : (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate 1 d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faible ment soluble dans le benzène et l'eau, et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique et les réactifs d'Ehrlich et de Tollens et une réaction négative aux épreuves de Sakaguchi, à la ninhydrine et à 1'anthrone; (c) un point de fusion d'environ 159 à 161"C; (d) a une rotation optique de -171° (c = 0,5, CHC13); (e) présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice un Rf de 0,63 avec le système solvant CHClj -CH'^OH (5:1 v/v) et présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice à inversion de phase un Rf de 0,23 avec le système solvant CH^CN-i^O (75 :25 v/v); (f) présente les maxima d'absorption dans l'ultraviolet ci-après après dissolution dans le méthanol,le HCl 0,01N-CH3OH et le NaOH 0 ,01N-CH3OH ÜV λ nm (E?·* ) 253 (225) max 1 cm méthanol 282 (140) 320 (104) ÜV λ nm (E^ , 253 (225) max 1 cm) HCl 0,01N-CH3OH 282 (140) 320 (105) - ÜV Λ nm (E^ ) 252 (236) max 1 cm . NaOH 0,01N-CH3OH 283 (141) 318 (105) (g) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries et champignons de diverses espèces, et CD.MJ - 87 - (h) induit le prophage dans les bactéries lysogènes.
5. 6. L'antibiotique antitumoral BBM-1675 B£ qui: (a) est soluble dans le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétone, l'éthanol et le méthanol, faiblement soluble dans le benzène et l'eau et insoluble dans le n-hexane et le tétrachlorure de carbone; (b) donne une réaction positive avec le chlorure ferrique et les réactifs d'Ehrlieh et de Tollens et -, une réaction négative dans les épreuves de Sakaguchi, à la ninhydrine et à 1'anthrone; (c) un point de fusion d'environ 156 à 159°C; 27 (d) a une rotation optique de -122e (c = 0,5, CHC13); (e) présente à la chromatographie en couche mince sur ge-1 de silice un Rf de 0 ,60 avec le système solvant CHClg-CH^OH (5:1 v/v) et présente à la chromatographie en couche mince sur gel de silice à inversion de phase un Rf de 0,16 avec le système solvant Cf^CN-t^O (75:25 v/v); (f) présente les maxima d'absorption dans l'ultraviolet ci-après après dissolution dans le méthanol, le HCl 0,01N-CH3OH et le NaOH 0,OlN-CH3OH ÜV-X nm (E?* ) 248 (212) max 1 cm méthanol 279 (141) 318 (103) UV λ nm (E^ ) 248 (210) max 1 cm HCl 0,01N-CH3OH 279 (140) 318 (103) ϋνλ nm (E^ ) ΓΠ3.Χ X Crn oxo / O O O \ NaOH 0,OIN-CH_0H 248 (Z33) 0 278 (150) 318 (110) (g) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries et champignons de diverses espèces, et A L (h) induit le prophage dans les bactéries lysogenes.
6. 7. Procédé pour produire 1'antibiotique antitumoral BBM-1675 A^, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d1Actinomadura verrucosospora produc- ; trice de BBM-1675 A^ dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d ' a-zote dans les conditions de l'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 A^ par l'organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 A^ du milieu de culture.
7. 8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'organisme producteur de BBM-1675 a les caxactéristiques d'identification d'Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334), d'Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci.
8. 9. Procédé pour produire 1'antibiotique antitumoral BBM-1675 A^, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d'Actinomadura verrucosospora produc-trice de BBM-1675 A^ dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans les conditions de l'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 A^ par 1'organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 A^ <3u milieu de culture.
9. 10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que 1 ' organisme producteur de BBM-1675 A^ a les caractéristiques d'identification d'Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334) , d'Actinoma- - * dura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci. »
10. 11. Procédé pour produire 1'antibiotique antitumoral BBM-1675 A^, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d'Actinomadura verrucosospora produc-trice de BBM-1675 A^ dans un milieu nutritif aqueux CD.MJ - 89 - § f ! f i contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans les conditions de 1'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 A^ par 1 Organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 A^ du milieu de culture.
11. 12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que l'organisme producteur de BBM-1675 A^ a les caractéristiques d'identification d'Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334), d'Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci.
12. 13. Procédé pour produire 1'antibiotique antitumoral BBM-1675 A^, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d'Actinomadura verrucosospora produc-trice de BBM-1675 A^ dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans les conditions de 1'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 A4 j par 1'organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 A. du milieu de culture. 4
13. 14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'organisme producteur de BBM-1675 A^ a les caractéristiques d'identification d'Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334) , d'Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci.
14. 15. Procédé pour produire 1'antibiotique C antitymoral BBM-1675 B^, caractérisé en ce qu'on cul tive une souche d^Actinomadura verrucosospora produc-- ; trice de BBM-1675 B^ dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans les conditions de 1'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 B1 par l'organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 B^ du milieu de culture. * CD .MJ - Qfl - \ i J i i *
15. 16. Procédé suivant la revendication 15, ca ractérisé en ce que l'organisme producteur de BBM-1675 B1 a les caractéristiques d'identification d'Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334) , d'Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci.
16. 17. Procédé pour produire l'antibiotique antitumoral BBM-1675 B2, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d '.Actinomadura verrucosospora productrice de BBM-1675 B2 dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans les conditions de l'aérobiose en submersion jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1675 B2 par l'organisme dans le milieu de culture, puis on isole le BBM-1675 B2 du milieu de culture.
17. 18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que l'organisme producteur de BBM-1675 B2 a les caractéristiques d'identification d1Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334) , d'Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de celles-ci.
18. 19. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte porteur d'une infection microbienne, l caractérisé en ce qu'on administre à l'hôte, en dose antimicrobiennne efficace, du BBM-1675 A^, du BBM-1675 A^, du BBM-1675 A-, du BBM-1675 A., du BBM-1675 B1 ou du BBM-1675 B2.
19. 20. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte porteur d'une tumeur maligne, caractérisé - en ce qu>on administre à l'hôte, en dose efficace pour inhiber la tumeur, du BBM-16 75 A^, du BBM-16 75 A2, du BBM-1675 A3, du BBM-1675 k^, du BBM-1675 B± ou du BBM-1675 B2.
20. 21. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en quantité antimicrobienne r*r\ Mt Q T ΐ efficace, du BBM-1675 Αχ, du BBM-1675 A2, du BBM-1675 A^, I du BBM-1675 A4, du BBM-1675 B^ ou du BBM-1675 B2 con jointement avec un excipient ou diluant pharmaceutique.
21. 22. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en quantité efficace pour in- - hiber une tumeur, du BBM-1675 A^, du BBM-1675 A^, du BBM-1675 A3, du BBM-1675 A4, du BBM-1675 B1 OU du * BBM-1675 B2 conjointement avec un excipient ou di luant pharmaceutique.
22. 23. Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura verrucosospora souche H964-92 (ATCC 39334) , caractérisée en ce qu'elle est capable de produire l'antibiotique BBM-1675 en quantité iso-lable par culture dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote.
23. 24. Culture biologiquement pure du microorganisme Actinomadura verrucosospora souche A1327Y (ATCC 39638) , caractérisée en ce qu'elle est capable de produire l'antibiotique BBM-1675 en quantité iso-lable par culture dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote. u 9