NL8401572A - Antibiotica. - Google Patents
Antibiotica. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8401572A NL8401572A NL8401572A NL8401572A NL8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A NL 8401572 A NL8401572 A NL 8401572A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- bbm
- methanol
- strain
- silica gel
- atcc
- Prior art date
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title description 12
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 221
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 81
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 36
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 34
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 34
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 30
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 23
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 claims description 22
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 241000201778 Actinomadura verrucosospora Species 0.000 claims description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 15
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000009102 absorption Effects 0.000 claims description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 9
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 9
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 claims description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 8
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N Anthron Natural products COc1cc2Cc3cc(C)cc(O)c3C(=O)c2c(O)c1C=CC(C)C FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 4
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 claims 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 3
- GRONZTPUWOOUFQ-UHFFFAOYSA-M sodium;methanol;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OC GRONZTPUWOOUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 3
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims 2
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 42
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 37
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 28
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 14
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 13
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 11
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 10
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- -1 L-ramnose Chemical compound 0.000 description 7
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 6
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 4
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 4
- FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 5-{5-[2-chloro-4-(4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-yl)phenoxy]pentyl}-3-methylisoxazole Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1Cl FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 101100005765 Arabidopsis thaliana CDF1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100007579 Arabidopsis thaliana CPP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001004 secondary ion mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- PJVXUVWGSCCGHT-GGJBBHSUSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(3s,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-GGJBBHSUSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-JRTVQGFMSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,4,5,6-tetrahydroxy-3-methoxyhexanal Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-JRTVQGFMSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000619 316 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- FDWRIIDFYSUTDP-UHFFFAOYSA-N 6-methyloxane-2,4,5-triol Chemical group CC1OC(O)CC(O)C1O FDWRIIDFYSUTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000201753 Actinomadura coerulea Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical group N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000006519 CCH3 Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WKAHILKZCKROET-UHFFFAOYSA-N Chromomycin A2 Natural products CCCC(=O)OC1C(C)OC(CC1(C)O)OC2CC(OC3CC(OC4C(Cc5cc6cc(OC7CC(OC8CC(O)C(OC)C(C)O8)C(OC(=O)C)C(C)O7)c(C)c(O)c6c(O)c5C4=O)C(OC)C(C)C(O)C(C)O)OC(C)C3O)OC(C)C2O WKAHILKZCKROET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N Compound IV Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1 FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000901842 Escherichia coli W Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000368546 Hypostomus luteus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000014687 Maribacter flavus Species 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLFHWLMXLIRLPS-DFWYDOINSA-N N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O.[Na] Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)O.[Na] SLFHWLMXLIRLPS-DFWYDOINSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-UHFFFAOYSA-N O3-methyl-D-galactose Natural products O=CC(O)C(OC)C(O)C(O)CO RMTFNDVZYPHUEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJVXUVWGSCCGHT-HJYCITFRSA-N OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O.OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-HJYCITFRSA-N 0.000 description 1
- MXETZQATVMJCFH-UHFFFAOYSA-N Olivomycin A Natural products COC(C1Cc2cc3cc(OC4CC(OC(=O)C)C(OC5CC(O)C(OC)C(C)O5)C(C)O4)cc(O)c3c(O)c2C(=O)C1OC6CC(OC7CC(OC8CC(C)(O)C(OC(=O)C(C)C)C(C)O8)C(O)C(C)O7)C(O)C(C)O6)C(=O)C(O)C(C)C MXETZQATVMJCFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000183024 Populus tremula Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 239000006159 Sabouraud's agar Substances 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPLCTUHONLQGIX-TWTCTLMISA-N [(2s,3s,4s,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[[(2s,3s)-6-[(2s,4r,5s,6r)-5-acetyloxy-4-[(2r,4r,5r,6r)-4-hydroxy-5-methoxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-3-[(1s,3s,4r)-3,4-dihydroxy-1-methoxy-2-oxopentyl]-8,9-dihydroxy-7-methyl-1-oxo-3,4- Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 WPLCTUHONLQGIX-TWTCTLMISA-N 0.000 description 1
- SAHIZENKTPRYSN-UHFFFAOYSA-N [2-[3-(phenoxymethyl)phenoxy]-6-(trifluoromethyl)pyridin-4-yl]methanamine Chemical compound O(C1=CC=CC=C1)CC=1C=C(OC2=NC(=CC(=C2)CN)C(F)(F)F)C=CC=1 SAHIZENKTPRYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002814 agar dilution Methods 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N alpha-D-arabinopyranose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N beta-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 235000021074 carbohydrate intake Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- OQNGCCWBHLEQFN-UHFFFAOYSA-N chloroform;hexane Chemical compound ClC(Cl)Cl.CCCCCC OQNGCCWBHLEQFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- ZJULYDCRWUEPTK-UHFFFAOYSA-N dichloromethyl Chemical compound Cl[CH]Cl ZJULYDCRWUEPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003450 growing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- KELXKDDAALYTDI-BTVCFUMJSA-N nitric acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound O[N+]([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O KELXKDDAALYTDI-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- OCOLTXUAPMAMPP-AJVJTBPOSA-N olivomycin A Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 OCOLTXUAPMAMPP-AJVJTBPOSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
t 4 %
^ VO 631U
Antibiotisch anti-tumorcomplex, BBM-1675, bereiding en winning daarvan
...........;....................iJ
De uitvinding heeft betrekking op nieuwe antibiotische anti-tumor-stoffen en op de bereiding en winning daarvan.
De structuur van de antibiotische anti-tumorverbindingen van de onderhavige uitvinding is nog niet geïdentificeerd. Met het oog op hun unie-5 ke, fysische, chemische en biologische eigenschappen is aanvrager evenwel van mening dat de BBM-1675 antibiotica nieuwe stoffen zijn.
De Europese octrooipublicatie nr. 9515A1 beschrijft de fermentatie van Actinomadura pulveraceus sp. nov. nr. 60U9 (ATCC 319100) ter vorming van anti-tumor-antibiotica, aangeduid als WS 60U9-A en WS 6ok9-B.
10 De structuren van de WS 60*+9-antibiotica zijn nog niet opgehelderd, maar de karakteristieke eigenschappen van de antibiotica wijzen erop dat WS 60^9-A en WS 60^9-B wat structuur betreft verwant kunnen zijn aan de BBM-1675 antibiotica van de uitvinding. Spectrale gegevens tonen evenwel aan, dat noch WS 60*+9-A noch WS 60H9-B identiek is aan de BBM-1675-compo-15 nenten van aanvrager. Bovendien kan het in de Europese octrooipublicatie nr. 9515UA1 beschreven produktie-organisme wat de kleur van zijn lucht-myceliüm op ISP medium nrs. 2, 3 en U, zijn positieve melkpeptonisering en positieve verbruik van D-fructose, D-mannitol, trehalose en cellulose betreft, duidelijk worden onderscheiden van het in de onderhavige uitvinding 20 toegepaste Actinomadura verrucosospora.
De onderhavige uitvinding voorziet in een nieuw antibiotisch anti-tumorcomplex, hierin aangegeven als BBM-1675, dat wordt bereid door een in waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden een BBM-1675-producerende stam 25 Actinomadura verrucosospora, met de meeste voorkeur Actinomadura verrucoeospora stam H96h-92 (ATCC 3933*0 of Actinomadura verrucocospora stam A1327I (ATCC 39638) of een mutant daarvan te kweken tot door genoemd organisme in genoemd kweekmedium een aanzienlijke hoeveelheid van genoemd BBM-1675-complex is gevormd, waarbij naar keuze het complex uit het cul-30 tuurmedium wordt gewonnen. De uitvinding voorziet tevens in twee bioactie-ve hoofdcomponenten van het BBM-1675-complex, aangeduid als BBM-1675-A^ en A^ en vier ondergeschikte bioactieve componenten van genoemd complex aangeduid als BBM-I675-A2, A^, B.j en Bg. De componenten kunnen via gebruikelijke 8401572 Ί ' ί ' \ \ ]-2- chromatografische procedures worden geïsoleerd en gezuiverd. Het BBM-1675-complex en de bioactieve componenten daarvan vertonen zowel anti-micro-biële als anti-tumor-activiteit.
Beschrijving van de tekeningen 5 Fig. 1 toont het infraroodabsorptiespectrum. van gedeeltelijk gezui verd BBM-I675 A (KBr tablet), fig. 2 toont het infrarood absorptiespectrum van gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A2 (KBr tablet), fig. 3 toont het infraroodabsorptiespectrum van BBM-1675 (KBr 10 tablet), fig. k toont het infraroodabsorptiespectrum BBM-1675 A^ (KBr tablet), fig. 5 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A^ in CDCl^ (60 MHz), fig. 6 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gedeel-15 telijk gezuiverd BBM-1675 A^ in CDCl^ (60 MHz), fig. 7 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van BBM-1675 A3 in CDC13 (60 MHz), fig. 8 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van BBM-1675 A^ in CDC13 (60 MHz), 20 fig. 9 toont het infraroodabsorptiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A.j (KBr tablet), fig. 10 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A1 in CDCl^ (360 MHz), fig. 1 toont het magnetisch C-resonantiespectrum van gezuiverd 25 BBM-1675 A1 in CDC13 (90,3 MHz), fig. 12 toont het· infraroodabsorptiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A2 (KBr tablet), fig. 13 toont het magnetisch protonkernresonantiespectrum van gezuiverd BBM-1675 A in CDC1 (360 MHz), o 13 30 fig. 1^ toont het magnetisch ^C-resonantiespectrum.van gezuiverd BBM-1675 A2 in CDC13 (90,3 MHz).
De onderhavige, uitvinding heeft betrekking op een nieuwe antibiotisch anti-tumorcomplex, hierin aangeduid als BBM-1675 en op de bereiding daarvan door fermentatie van bepaalde stammen van Actinomadura verrucocospora 35 in het bij zonder de Actinomadura verrucocospora stam H96U—92 en een mutant daarvan aangeduid als de Actinomadura verrucocospora stam A1327Y. De voor- 8401572 > \ -3- noemde hoofdstam werd geïsoleerd uit een grondmonster, verzameld hij PTO Esperanza, Misiones, Argentinië. Een biologisch zuivere kweek van het organisme is gedeponeerd hij de American Type Culture Collection, Washington, D.C. en aan zijn permanente collectie van micro-organismen toegevoegd als 5 ATCC-3933^·. Aansluitend werd de mutantstam A1327Y verkregen door een gebrui kelijke nitrosoguanidine (NTG) behandeling van de stam H96U-92 en bij de American Type Culture Collection gedeponeerd als ATCC-39638,
Zoals bij vele antibiotica-vormende cultures het geval is, leidt de fermentatie van de Actinomadura verrucocospora stam H96U-92 of A1327Y tot 10 de bereiding van een mengsel of complex van componentstoffen. Twee belangrijke bioactieve componenten, BBM-1675 A^ en Ag» en vier minder actieve componenten, BBM-1675 A^, A^, B^ en B^ zijn uit het tijdens de fermentatie-werkwijze gevormde BBM-1675-complex geïsoleerd.
BBM-1675 en de componenten daarvan BBM-1675 , A^, Ag, A^, B.] en 15 vertonen een antimicrobiële activiteit ten opzichte van een breed spectrum van micro-organismen, in het bijzonder gram-positieve bacteriën. Het BBM-1675-complex en de geïsoleerde bioactieve componenten daarvan vertonen tevens faag-inducerende eigenschappen en lysogene bacteriën. Twee van de componenten, BBM-1675 A.j en A^, zijn in vivo onderzocht tegen verschillende 20 muizetumorsystemen en vertonen een remmende activiteit ten opzichte van L-1210 leukemie, P-388 leukemie, B16 melanoma en Lewis-longcarcinoom. Aangetoond is dat BBM-1675 Ag en A^ actief zijn tegen P-388 muizeleukemie. Het complex en de bioactieve componenten daarvan kunnen derhalve als antimicrobiële middelen of als anti-tumormiddelen voor het remmen van tumoren 25 bij warmbloedigen worden toegepast.
De actinoceet stam nr. H96i+-92 werd uit een grondmonster geïsoleerd en via gebruikelijke procedures als biologisch zuivere culture voor typering bereid. De stam H96^-92 vormt op het luchtmycelium korte sporen-ketens, die een rechte, kronkelige of haakvorm vertonen. De sporen zijn bolvormig 30 of ovaalvormig en hebben een wratachtig oppervlak. Op de meeste media wordt slechts weinig luchtmycelium gevormd. De luchtmassakleur is wit, die later roseachtig wordt of in sommige agarmedia verder in een blauwachtige tint verandert. De kleur van substraatmycelium is neutraal of licht-rose.
De groeitemperatuur varieert van 15 tot k3°C. De aminozuursamenstelling van 35 de celwand en hydrolysaatsuikereomponenten van de gehele cel tonen aan, dat de stam R96U-92 tot het celwandtype III behoort. Het menachion werd ge-identificeerd als MK-9 (Hg)’MK-9 (Hg).
8401572 i -1+-
Gebaseerd op de morfologische, kweek en fysiologische hoofdeigenschappen, tezamen met de eigenschappen van de chemische celwandsamenstel-ling kan de stam H961+-92 worden ingedeeld in het genus Actinomadura.
Hoewel de oorspronkelijke stam H961+-92 slechts een matige groei ver-5 toonde met nauwelijks luchtmycelia, werd een variant, die goede groei en verbeterde vorming van luchtmycelium vertoonde, verkregen door H961+-92 met NTG (nitrosoguanidine) te behandelen. De variant, aangeduid als stam A1327Ï} vergemakkelijkte verder taxonomisch onderzoek en werd aansluitend geïdentificeerd als Actinomadura, verrucocospora.
10 De media en procedures, toegepast voor het onderzoeken van de kweek- eigenschappen en koolhydraatverbruik waren die, aanbevolen door het International Streptomyces Project (inti. J. Syst. Bacteriol. j6_: 313-31+0, 1966). Tevens werden media toegepast beschreven door: S.A. Waksman (The Actinomycetesm bd 2) en G.M. Lvedemann (Inti. J. Syst. Bacteriol. 21: 15 21+0-21+7, 1971)· De aminozuursamenstelling van de celwand en de suikercom-ponenten van gehele celhydrolysaat werden geanalyseerd volgens de methoden beschreven door: Becker et al. in Appl. Microbiol. 13: 236-21+3, 1965 en door Lechevalier en Lechevalier in The Actinomycetes, Uitg. H. Prauser,
Jena, Gustav Fischer Verlag, blzn. 393-1+05, 1970. Het menachinon werd ge-20 identificeerd door massaspectra-analyse volgens de procedures van Collins et al, in J. Gen. Microbiol. 100: 221-230, 19779 en de menachinonsamenstel-ling werd voorgesteld gebaseerd op het systeem beschreven door Yamada et al, in J. Gen. Appl. Microbiol. 23: 331-335} 1977·
Morfologie 25 Stam H961+-92 vormt zowel substraat als luchtmycelia. Het substraat- mycelium is lang, vertakt en niet in korte draden gesplitst. In het lucht-mycelium worden korte sporenketens monopodiaal of aan de top van de schim-meldraad gevormd. Nabij de schimmeldraad top worden tevens kransachtige vertakkingen van sporenrrketens waargenomen. Deze sporen-ketens bevatten 2-10 30 sporen per keten en hebben een rechte, kronkelige of haakvorm. De sporen hebben een wratachtig oppervlak en een ronde tot elliptische (0,5-0,6 x 0,6-1,!+ yum)-vorm met afgeronde of puntige uiteinden. Na het rijpen wordt elke spoor dikwijls met een ledige schede geïsoleerd. Bij geen van de onderzochte media werden mobiele sporen, sporanchiën of sclerotische granulaten 35 waargenomen.
8401572 -5- »
Kweek- en fysiologische eigenschappen
In zowel chemisch gedefinieerde media als natuurlijke organische media is de groei van de stam H96U-92 gering. De vorming van luchtmycelium is in het algemeen gering maar matig in havermoutagar (ISP nr. 3 medium), 5 anorganische zouten - zetmeelagar (ISP nr. ^ medium) en Bennet's agar. Spontane varianten zonder luchtmycelium komen veelvuldig voor. De kleur van luchtmycelium is wit, die later licht-rose wordt in havermout-agar, anorganische zouten-zetmeelagar en glycerol-asparagine-agar (ISP nr. 5 medium) . De kleur van de luchtmassa verandert verder na lang incuberen (5 10 maanden) in havermout-agar, glycerol-asparagine-agar en tyrosine-agar in een blauwachtige tint. De kleur van substraatmycelium is neutraal tot geelachtig in Czapek's-agar, tyrosine-agar, gistextract-moutèxtract-agar (ISP nr. 2 medium), pepton-gistextract-ijzeragar (ISP nr. 6 medium) en Bennet's-agar en roseachtig in glucose-asparagine-agar en glycerol-asparagine-agar.
15 Er worden geen melanoide en andere diffundeerbare pigmenten gevormd.
Een variant nr. A1327Y, die werd verkregen uit de oorspronkelijke stam, vormt overwegend lichtblauw luchtmycelium en draagt een overvloed van luchtsporenmassa.
De stam H964-92 groeit bij 15°C, 28°C, 37°C en U3°C, maar niet bij 20 10°C of bij Vf0C. Hij is gevoelig voor NaCl bij 7% en resistent ten opzichte van lysozym bij 0,01$.
De kweek en fysiologische eigenschappen van de producerende stam worden resp. in tabellen A en B getoond. Het verbruik van koolbronnen wordt aangegeven in tabel C.
8401572
A
-6-
TABEL A
Kweekeigenschappen van stam H96U-92 (oorspronkelijke stam ATCC-3933^· en variant A1327Y)
Stam nr. E96U-92
Oorspronkelijke Variant Actinomadura stam (ATCC 3933^) nr. 132TY verrucocospora _ _ KCC A-0lVr .
Trypton-gist- G: overvloedig, matig, floc- matig, floccose, extractagar floccose, gesedi- cose, gese- gesedimenteerd (ISP No. 1) menteerd en niet- dimenteerd en niet-gepig- gepigmenteerd en niet-ge- menteerd pigmenteerd
Saccarose-nitraat- G: matig gering gering agar (Czapek's R: neutraal neutraal- neutraal agar) A: gering; licht- geen of wei- geen of weinig; grijs (26U), tot nig; rose- lichtblauw lichtrose (7) achtig-wit (185) (9) geen D: geen geen geen
Glucose-asparagine- G: matig gering gering agar R: wit (263) tot diep kleurloos kleurloos geel-rose (27) A: geen of zeer wei- geen of zeer geen of zeer nig; licht- weinig; weinig; rose (7) wit wit D: geen geen geen
Glycerol-aspara- G: weinig tot matig matig licht licht geelachtig gine-agar R: neutraal tot licht geelachtig rose (28) tot (ISP- Nr. 5) geelachtig rose rose (28) diep geelachtig (28) rose (27) A: gering; licht matig; wit gematigd; wit geelachtig rose tot licht- tot fel-rose (28), na 5 maanden rose (U) (2) li cht-blauwacht i g grijs (190) D: geen geen geen
Anorganische zouten- G: overvloedig matig matig zetmeelagar R: geelachtig wit licht geel- licht geelachtig (ISP nr. U) (92) achtig rose rose (28) A: overvloedig; licht-(28) overvloedig; rose (1*) tot rose- matig; licht lichtblauw achtig grijs (10) blauwachtig (185) grijs (190) D: geen geen geen
Tyrosine-agar G: matig matig matig (ISP Nr. 7) R: geelachtig wit fel geel- fel geelachtig (92) achtig rose rose (26) (26) 8401572 -7- TABEL A (vervolg) A: gering; licht- matig; wit matig; wit tot geelachti rose tot licht- licht-rose ' (28), veel later rose (U) {k) (5 maanden) gedeeltelijk licht blauwachtig grijs (190) D: geen geen geen
Voedingsagar G: gering tot matig gering gering R: lichtgeel (89) kleurloos kleurloos tot tot licht- lichtrose (7) rose (7) A: geen geen geen D: geen geen geen
Gistextract-mout- G: overvloedig overvloedig overvloedig extract-agar R: lichtgeel (89) fel geel- fel geelachtig (ISP nr. 2) achtig rose (26) rose (26) A: gering; wit (263) - gering; wit gering; wit tot licht- tot lichtrose (7) rose (7) D: geen geen geen
Havermeelagar G: matig gering gering (ISP nr. 3) R: kleurloos tot licht geel- licht geelach- lichtrose (7) achtig tig rose (31) rose (31) A: gering; rose- zeer weinig; _ zeer weinig; achtig-wit (9) helder licht- helder licht- tot lichtblauw- blauw (18U) blauw (18U) achtig grijs (190) D: geen geen geen
Bennet's agar G: overvloedig overvloedig overvloedig R: grijsachtig fel geel- fel geelachtig geel (90) achtig ro- rose (26) se (26) A: matig; wit (2β3) matig; licht geen tot geelachtig geelachtig wit (92) rose (31) en blauwachtig wit (189) D: geen geen geen
Peptongistextract- G: matig overvloedig overvloedig ijzeragar (ISP nr.6) , . , . , _ R: neutraal neutraal neutraal A: geen geen geen D: geen geen geen 55 waargenomen na incubatie bij 37°C gedurende 3 weken 5=3 afkorting: G = groei 8401572 -8- R = kleurachterkant; A = luchtmycelium D = diffundeerbaar pigment sss kleur en getal tussen haakjes volgens de kleur standaard in "Kelly, K.L. & B.D. Judd; ISCC-NBS kleurnaamkaarten geïllustreerd met Centroid Colors. U.S. Dept. of Cornm. Cir. 553, Washington, D.C.,
Nov., 1975h
TABEL B
Fysiologische eigenschappen van stam Η96ί-92
Proef_ Respons_ _Methode en medium
Temperatuur voor groei Maximale groei bij Bennet's agar 28-37°C.
Middelmatig bij 20 en U30C. Geen groei bij 10°C en U7°C.
Vloeibaarmaking gelatine Vloeibaar gemaakt Glucose-pepton-gelatine- medium
Zetmeelhydrolyse Gehydrolyseerd Zetmeelagarplaatjes
Reacties in tapte melk Niet-gecoaguleerd Difco-tapte melk en volledig gepep-toniseerd
Vorming van melanoide Niet geproduceerd Tyrosine-agar, pepton- pigment gist-ijzeragar en trypton- gistextractvloeistof
Nitraatreductie Niet gereduceerd Czapek’s-glucose-nitraat- sap en glucose-gist-extract-nitraatsap
Resistent tegen NaCl Groei bij 5% of Trypton-gistextractagar minder. Geen groei bij 1%
Lysozym Resistent. Groei bij Trypton-gistextractagar 0,01$ of minder.
Geen groei bij 0,1$ pH Groei in 5,0 tot 9,5· Trypton-gistextractagar
Geen groei bij ^,5 en 10,0 8401572 > -9-
TABEL C
Verbruik van koolstofbronnen_ _ Stam nr. H964-92 Actinomadura
Originele Variant ver rucosospora stam No. A1327Y KCC A-0147
Glycerol + + + D(-)-Arabinose - L(+)-Arabinose + + + D-Xylose + + + D-Ribose + “ “ L-Rhamnose + « + + D-Glucose + + + D-Galactose - D-Fructose + + + D-Mannose - L (-)-Sorbose -
Saccharose + + +
Lactose -
Cellobiose + + +
Melibiose
Trehalose · + + *
Raffinose - D(+)-Melezitose -
Oplosbaar zetmeel + + +
Cellulose + + +
Dulcitol -
Inositol + D-Manhitol + + + D-Sorbitol ' Salie in e
Waargenomen gedurende 3 weken incubatie bij 28°C Basaal medium: Pridham-Gottlieb anorganisch medium 8401572 ; -10-
Celwandsamenstelling en suikercomponenten van de gehele cel
Gezuiverde celwand van de stam H96U-92 bevat mesodiaininopimeline-zuur maar geen glycine. Het gehele celhydrolysaat vertoont de aanwezigheid van madurose (3-o-methyl-D-galactose), glucose, en ribose. Het celwand-5 aminozuur en de gehele celsuikercomponenten geven aan, dat de stam H96l·-92 zich in het celwandtype III bevindt. Twee hoofdcomponenten van menachinon
B
werden geïdentificeerd als MK-9 (Hg) en MK-9 (Hg).
Taxonomische positie van stam H96*4~92
Stam H9ÖU-92 heeft de volgende hoofdeigenschappen: 10 (1) luchtsporehketens: kort, recht, kronkelig of haakvormig, (2) sporen: wratachtig oppervlak, (3) luchtmycelium: roseachtige of blauwachtige kleur, (!+) substraat mycelium: roseachtig in sommige media, (5) diffundeerbaar pigment: geen, 15 (6) mesofiel, (7) celwandtype III^, (8) menachinonsysteem: MK-9(Hg) en MK-9(Hg).
Deze hoofdeigenschappen geven aan, dat stam B.9Sk-92 zich in het ge-nus Actinoma-dura bevindt. De vroegere soorten van het genus Actinomadura 20 werden uit zoogdieren geïsoleerd. Sommige stammen werden tevens uit planten-materialen verkregen. Vele van de recent voorgestelde nieuwe soorten werden evenwel uit grond geïsoleerd. Volgens de numerieke taxonomie en het overzicht van de Actinomadura en verwante actinomyceten door Goodfellow et al. in J, Gen. Microbiol. 112: 95-222 (1979) zijn de meeste uit grond afkomstige 25 Actinomadura soorten onder de 14 beschreven clusters onder cluster nr. 7 geklassificeerd. Stam nr. H96b~92 is het meest verwant met de soort van cluster J. Nonomura en Ohara in J. Ferment. Technol. j+£: 90^-912 (1971) vermelden vijf saprofytische soorten van het genus Actinomadura en Nonomura [J. Ferment. Technol. 52: 71-77 (197*0 en Preobrazhenskaya et al.
30 [Actinomycetes and Helated Organisms 12: 30-38 (1977)] publiceerden de sleutels voor het identificeren en classificeren van de Actinomadura-soor-ten. Als resultaat van een vergelijking met beschrijvingen van 30 soorten met inbegrip van in octrooischriften beschreven organismen, blijkt de stam H96k-92 de meeste verwantschap te hebben met Actinomadura coerulea beschre-35 ven door Preobrazhenskaya et al. als bovengenoemd en met Actinomadura 8401572 -11- verrucocospora als "beschreven in de Nonomura referenties als hoven vermeld.
De stam Nr. H96U—92 werd direkt vergeleken met de A. verrucosospora stam KCC A-01*+7 en bleek ten aan zien van de morfologische, kweek- en fysiologische eigenschappen nauw verwant te zijn met A. verrucosospora. Aldus 5 is stam H96*+-92 als een nieuwe stam van Actinomadura verrucosospora ge-. klassificeerd.
Opgemerkt wordt dat voor de bereiding van BBM-1Ö75 de onderhavige uitvinding, hoewel in bijzonderheden beschreven met betrekking tot de bepaalde stam Actinomadura verrucosospora H96*+-92 (ATCC 3933*0 en de mutant-10 stam daarvan, aangegeven als de stam A1327Y (ATCC 39638) niet tot deze mi-cro-organismen of door de hierin aan de hand van de kweekeigenschappen volledig beschreven micro-organismen is beperkt. Hèt wordt in het bijzonder beoogd dat de uitvinding de stam H96*+-92 en alle natuurlijke en kunstmatige BBM-l675-producerende varianten en mutanten daarvan omvat.
15 De BBM-l675-antibiotica van de onderhavige uitvinding kunnen worden bereid door een BBM-1675-producerende stam van Actinomadura verrucosospora, bij voorkeur een stam van Actinomadura verrucosospora met de identificatie-eigenschappen van ATCC 3933*+ of ATCC 39638, of een mutant daarvan, in een gebruikelijk waterig voedingsmedium te kweken. Het organisme wordt ge-20 kweekt in een voedingsmedium dat .bekende voedingsbronnen voor actinomyceten bevat, d.w.z. assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof plus naar keuze anorganische zouten en andere bekende groeifactoren. Voor de bereiding van grote hoeveelheden antibioticum worden bij voorkeur submerse aerobe omstandigheden toegepast, hoewel voor de bereiding van beperkte hoeveelheden 25 tevens oppervlaktecultures en kolven kunnen worden gebruikt. Algemene procedures, toegepast voor het kweken van andere actinomyceten, zijn tevens van toepassing op de onderhavige uitvinding.
Het voedingsmedium moet een geschikte assimileerbare koolstofbron bevatten, zoals glycerol, L(+)-arabinose, D-xylose, D-ribose, L-ramnose, 30 D-glucose, D-fructose, saccharose, cellobiose, oplosbaar zetmeel, D-manni-tol of inositol. Als stikstofbron kunnen ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ureum, ammoniumnitraat, natriumnitraat, enz. of afzonderlijk of in combinatie met organische stikstofbronnen, zoals pepton, vleesextract, gist-extract, maisweeksap, sojapoeder, katoenzaadmeel, enz. worden toegepast.
35 Tevens kunnen zonodig anorganische voedingszouten, waaruit bronnen van natrium, kalium, calcium, ammonium, fosfaat, sulfaat, chloride, bromide, car-bonaat, zink, magnesium, mangaan, kobalt, ijzer, enz. worden verkregen, 8401572 -12- worden toegepast.
De "bereiding van de BBM-1675-antibiotica kan· worden uitgevoerd "bij elke temperatuur die leidt tot een geschikte groei van het producerende organisme "bijvoorbeeld 15-^5°C, en wordt doelmatig uitgevoerd bij een tem-5 peratuur rond 27-32°C. In het algemeen wordt een optimale produktie verkregen na incubatieperioden van ongeveer 68—180 uur, afhankelijk van het type fermentatie, zoals in een schudkolf, roerfles of tank, dat wordt toegepast. Voor het uitvoeren van de fermentatie in een tank is het gewenst een vegetatief inoculum in een voedingsvloeistof te bereiden door de kweek-10 vloeistof met een schuine kweek of grondkweek of een gelyofiliseerde kweek van het producerende organisme te inoculeren. Nadat op deze wijze een actief inoculum is verkregen, wordt dit aseptisch in het fermentatietankme-dium overgebracht. Het bewaken van de produktie van het antibioticum kan geschieden via de papierschijf-agardiffusie-analyse met Staphylococcus 15 aureus 209P als proeforganisme.
Wanneer de fermentatie is voltooid kan het BBM-1675-complex door middel van gebruikelijke isolatieprocedures, bij voorbeeld oplosmiddelextrac-tie, uit de vloeistof worden verkregen. Bij voorbeeld kan de gehele vloeistof door middel van filtratie of centrifugeren in myceliumkoek en boven-20 staande vloeistoflaag worden gescheiden. Het antibioticum in de myceliumkoek kan worden gewonnen door de koek in methanol te suspenderen, onoplosbare materialen af te filtreren en het methanolische extract te concentreren. De actieve stof in de bovenstaande vloeistofkan worden gewonnen door extractie met n-butanol. De bovengenoemde n-butanol- en -methanolextracten 25 kunnen dan worden gecombineerd en azeotropisch ingedampt tot een waterige oplossing, waaruit de grootste hoeveelheid van het actieve antibioticum als olieachtige vaste stof wordt neergeslagen. De vaste stof kan dan in methanol worden opgelost en de oplossing gefiltreerd. Het filtraat wordt geconcentreerd en aan een mengsel van ethylacetaat en water toegevoegd. Het 30 verkregen organische extract bevat het ruwe BBM-1675-complex, dat uit de oplossing kan worden neergeslagen door toevoeging van een anti-oplosmiddel, zoals n-hexaan.
Het ruwe BBM-1675-complex is een mengsel van verscheidene componenten met inbegrip van twee bioactieve hoofdcomponenten, BBM-1675 en 35 en vier ondergeschikte bioactieve componenten, BBM-1675 A^, A^, B^ en Deze bioactieve componenten kunnen via gebruikelijke chromatografische procedures worden gescheiden en gezuiverd. Volgens een procedure wordt het 8401572 -13- ruwe BBM-1675 eerst in methanol opgelost en gezuiverd door Sephadex LH-20-kolomchromatografie onder toepassing van methanol als eluent. Dit gedeeltelijk gezuiverde complex kan dan over een silicagelkolom worden gechroma-tografeerd en trapsgewijze met chloroform plus een toenemende concentratie 5 van methanol geëlueerd, onder vorming van BBM-1675 A^, een mengsel van BBM-1675 A^, A^ en A^ en een mengsel van BBM-1675 en Bg. De A^-component kan verder worden gezuiverd via kolomchromatografie over Sephadex KL-20 met methanol als eluent. Het mengsel van Ag, Ag en A^ kan door chro-matografie over een kolom van Bondapak (Water Associates, Ine.) wor-10 den gescheiden met toenemende concentraties van waterig acetonitril als eluent. Het mengsel van B^- en Bg-componenten kan worden gescheiden door silicagelkolomchromatografie onder toepassing van een mengsel van chloroform en methanol als eluent. Verdere bijzonderheden van de voorkeurschroma-tografische scheidingsprocedures worden vermeld in de hierna volgende voor-15 beelden.
De zes bioactieve componenten van het BBM-1675-complex worden van elkaar onderscheiden door twee TLC-systemen zoals vermeld in de volgende tabel.
TABEL E
TLC wi BBM-1675 Componenten
Rf waarden
SiO * 2 Gesilanizeerd
Component CHC13-CH30H(5:1 v/v) CH3CN-H?Q(75;25 v/v) BBM-1675 Αχ 0,74 0,18 BBM-1675 A2 0,71 0,21 BBM-1675 A3 0,72 0,28 BBM-1675 A4 0,71 0,78 BBM-1675 Βχ 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16 C 8 omgekeerde fase silicagel 8401572 _ll+_
De scheiding van BBM-1675 Ag, A^ en was moeilijk via gebruikelijke TLC-fasesystemen, maar kon door middel van een omgekeerde fase TLC worden bereikt.
De afzonderlijke BBM-1675-componenten vertonen oplosbaarheid en 5 kleurreacties, die aan elkaar gelijk zijn. Ze zijn bij voorbeeld oplosbaar in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetra-chloride. Zij geven positieve reacties met ferrichloride. Ehrlich- en Tollens-reagentia, maar negatieve responsies in Sakaguchi, ninhydrine en 10 anthronproeven.
Karakteristieke fysisch-chemische eigenschappen van BBM-l675-compo-nenten worden vermeld in tabel E.
TABEL E
Fysisch-chemische eigenschappen van BBM-1675 componenten BBM-1675 Α.χ Aj A3 A4 Βχ Bj
Smeltpunt (ontl.). i$e . isa°c 147 - i49»c 12s - 127-c 123 - I2e*c 159 - i6i»c 156 - i59»c [a]p7 (e 0.5, CHCIO : -191* -179.4» -161* -176» -171» -122»
Anal, gevonden w c.· 51,52 53,81 55,00 53,67 H: 5,81 6,31 6,52 6,35 N: 4,02 3,82 3,57 3,45 (door verschil) O: 38,65 36,06 34,91 36,53 in C330H s 253 (325) 253 (281) 253 (286) 253 (257) 253 (225) 248 (212) 282 (195) 282 (172) 282 (158) 282 (153) 282 (140) 279 (141) 320 (143) 320 (128) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N BCl-CH3OH : 253 (323) 253 (276) 253 (287) 253 (258) 253 (225) 248 (210) 282 (192) 282 (167) 282 (160) 282 (155) 282 (140) 279 (140) 320 (144) 320 (128) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01N HaOH-CH3OH ·. 252 (325) 252 (289) 252 (280) 252 (266) 252 (236) 248 (233) 283 (172) 283 (171) 283 (162) 283 (160) 282 (141) 278 (ISO) 318 (136) 318 (122) 318 (120) 318 (118) 318 (105) 318 (110) moi. gew.
(benaderde waarde)* l*3oo ΐ,ιοο ι,ιοο 1*400 (Gel HPLC, FinepaJ? GEI.-101)
De UV absorptiemaxima van BBM-1675 componenten werden bij 253, 282 en 320 nm waargenomen, die zich niet verplaatsen in zure of alkalische oplossing. De IR- en PMR-spectra van BBM-1675 A^, Ag, en A^ worden weergegeven in resp. fig. 1-1) en fig. 5-8. De 360 MHz PMR van BBM-1675 A1 toonde 8401572 -15- éên acetyl (i:2,11 dpm), een N-CH3 (2,52 dpm), vier OCH3 (3,^2, 3,80, 388 en 3,98 dpm) en één exomethyleen (U,57 en 5S^8 dpm) groepen, tezamen met twee aromatische (7950 en 8,59 dpm) en één NH (11,79 dpm) protonen.
Het CMR-spectrum van ΒΒΜ-ΐβ75Α^ vertoonde 55 koolstofsignalen met inbe-5 grip van een triple intensiteitssignaal (δ :5^,0 dpm, 0CH3). De moleculaire formule van BBM-1Ó75A1 wordt afgeleid als 32 gebaseerd op proton en 13C NMR-spectra, micro-analyse en molecuulgewichtsbepaling door HPLC en SIMS (secondaire ionen massaspectrometrie).
Onderzoek structuur van BBM-1675 A^ 10 Na behandeling met 0,5N HC1 CHjOH bij kamertemperatuur zal BBM-1675 A zijn bioactiviteit verliezen en een lipofiele chromofore substantie (verbinding I) geven tezamen met verscheidene, niet-geïdentificeerde fragmenten. Verbinding I vertoont UV-absorptie gelijk aan die van het hoofd-anti-bioticum, waardoor wordt gesuggereerd dat verbinding I de chromofore struc-15 tuur van BBM-1675 A^ behoudt. Twee andere chromofore fragmenten, die aan verbinding I verwant zijn, worden verkregen door alkalische hydrolyse van BBM-1675 A^: hydrolyse met 0,05iT KOH-CH OH bij 55°C gedurende één uur geeft verbinding II met UV-absorptiemaxima bij 252, 2dh, 297 (schouder) en 322 nm, terwijl de reactie met 1N KOH-CH^OH een zure chromofore substantie geeft, 20 aangeduid als verbinding II. De fysisch-chemische eigenschappen van verbindingen I, II en III worden samengevat in tabel F.
840157? -16-
TABEL F
Eigenschapen van verbindingen I, II en III
Verbinding I Verbinding - II Verbinding III
Smp. : 82 - 83*C 133* 253 - 255*C
[a]*9(c 0.2 CHClj) : -100* 0 0
Moleculaire formule : c2iH3iNOio ci4Hi7N06 c13h15noó ον 1^3011 nm (ε) : 244 (21,850) 252 (26,600) 248 (26,900) aaX 276 (9,400) 283 (11,200) 295 (14,400) 318 (6,300) 297(sh8,800) 310 (13,500) 322 (11,700) MS Bi/S : 457 (M+) 295 (M+) 281 (H+) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 264 248 218
TIC
(Xyleen-*1®*"^08-’*5*! ▼/▼) : Rf 0.58 0.66 0.13 * MEK mathyl^ethyl'keton
Structuurinformatie omtrent verbindingen II en III werd verkregen 13 via de volgende spectrale gegevens en chemische omzetting. Het C- en pro-ton-NMR gaf de aanwezigheid van vier OCH^, één = CHg, zeven yC=, twee sC=0 en één ^NH-groep(en) in verbinding II aan. Het NMR-spectrum van ver-5 binding III was gelijk aan dat van II, met alleen het verschil, dat êén van de vier OCH^-groepen, waargenomen voor verbinding II, afwezig was. Dit verschil, tezamen met het zure karakter van verbinding III, suggereerde, dat verbinding II een methylester van de verbinding III is. Bij verhitting onder terugloop met 1N methanolisch Κ0Η, werd verbinding II kwantitatief in 10 verbinding III omgezet, terwijl verbinding III in verbinding II werd omgezet door behandeling met diazomethaan. De behandeling van verbinding II met ïïaBH^ in C^H^-OH gaf een reductieprodukt (verbinding IV, M+: m/z 267), dat in het NMR een -CH^OH-groep toonde in plaats van de -COOCH^-groep van verbinding II. Na hydrogenering over palladium-op-kool leverde verbinding II 15 een dihydroderivaat (verbinding V, M+: m/z 297). Het NMR-protonspectrum van verbinding V toonde een nieuw methyldoubletsignaal en de afwezigheid van de oxomethyleengroep, aanwezig in verbinding II. Verder verscheen één van de OCH^-groepen bij een hoger veld (f:3,5 dpm) in verbinding V. Deze re- 8401572 -17- sultaten wijzen op de aanwezigheid van een -OCH- I 2 och3 groep in verbinding II, die door hydrogenering werd gereduceerd tot -CH-CH, I 3 och3 5 groep in verbinding V, Verbinding II werd met 1,5N methanolisch waterstof-chloride gedurende 3 uur bij 80°C verhit en het hydrolysaat gechromatogra-feerd over een silicagelkolom, waarbij een zwak-zure verbinding werd verkregen (verbinding VI, M+:m/z 211). Het IR-spectrum en de fysisch-chemische eigenschappen gaven aan dat verbinding VI een NH^-groep bevatte. Verbin-10 ding VI werd geïdentificeerd als methyl-U,5-dimetho2cy-antranilaat door vergelijkende IR- en NMR-studies met een authentiek monster. Aldus werden de structuren van verbindingen II, III, IV, V en V0 bepaald als aangegeven in het reactieschema A van het formuleblad.
Na behandeling met 0,05N KOH-CH OH bij 55°C werd verbinding I ge-15 splitst in een nieuw chromofoor fragment (verbinding VII), Ο^Η^^ΝΟ^., M :m/z 327) en een suiker (verbinding VIII). Het NMR-spectrum van VII vertoonde één singlet C-CH3 en twee hoogveld-OCH^groepen, behalve drie laagveld 0CH3-groepen en twee aromatische protonen normaal waargenomen voor verbinding II, V en VI. Verdere hydrolyse van VII met 1,5N methanolisch waterstofchloride 20 gaf verbinding VI, die identiek was aan de eerder uit II verkregen verbinding. Na verwijdering van VI, werd het hydrolysaat met 2,U-dinitrofenylhy-drazine behandeld en werd een gele vaste stof neergeslagen, die werd geïdentificeerd als 2,i+-dinitrofenylhydrazon van pyrodruivezuur. Aldus is verbinding VII methyl-i,5-dimethoxy-N-(2',2’-dimethoxypropionyl)antranilaat. Ver-25 binding VIII vertoonde niet de moleculaire ionenpiek, maar wel de M-OCH^-piek bij m/z 131 in het massaspectra overeenkomend met de moleculaire formule van C^H-i^O^. Het NMR-spectrum gaf een 2,6-dideoxyhexopyranosestruc-tuur voor verbinding VIII aan. Deze identificatie werd ondersteund door het 13 C-NMR van verbinding I dat één C-CH^, één -CH^, drie 0-CH·^ en één anomerisch 30 koolstofatoom aantoonde, behalve li koolstofsignalen toe te schrijven aan 8401572 -18- de verbinding VII. Het C^-proton van de suiker verscheen bij het lage veld (5:5,39 dpm, octet), aanduidende dat C^-OH van de suiker door de carboxyl-groep van VII was veresterd. De boven beschreven resultaten met de structuren van verbindingen I, VII en VIII worden samengevat in reactieschema B 5 van het formuleblad.
Het molecuulgewicht van verbinding I (^57) betreft ongeveer eenderde deel van. het gehele molecuul van BBM-1675 A^ (voorgesteld door de formule berekend molgewicht = 1321+). Aangenomen wordt dat de deelstructuur van BBM-1675 A^ wordt aangegeven door formule I’ van het for-10 muleblad.
Na de indieningsdatum van de Amerikaanse hoofdaanvrage nr. U95.231, werd gevonden dat de boven beschreven en volgens het onderstaande voorbeeld II geproduceerde componenten BBM-1675 A^ en k^ in feite niet geheel zuiver waren en dat sommige van de karakteriserende eigenschappen toege-15 past voor het definiëren van dergelijke verbindingen onjuist waren. Na verdere chromatografische zuiveringsprocedure, zoals nader in voorbeelden III en VI toegelicht, werden BBM-1675 A^ en Ain meer gezuiverde vorm geïsoleerd en volledig gekarakteriseerd, zoals hierna beschreven. Tevens werden de elementairanalysegegevens voor componenten A^ en A^ herzien, waarbij de 20 aanwezigheid van zwavel in deze verbindingen werd aangetoond en vervolgens werden voor deze twee verbindingen de HPLC-retentietijden berekend. Hierna worden de herziene fysisch-chemische eigenschappen van de BBM-1675-com-ponenten samengevat.
BBM-1675 A1 25 Beschrijving: wit tot lichtgele kristallen; smeltpunt 156-1580 (ontl.)
Elementairanalyse
Analyse- 1 Analyse.. 2 Gemiddeld C: 51,60% C: 52,74% C; 52,17 H: 6,31% H: 5,99 H: 6,15 N; 5,31% N: 3,94% N; 4,63% S; 8,47% S: 9,71% S: 9,09% 0 (door verschil):28,31% 0 (door verschil):27,62% 0 (door verschil):27,96% 8401572 -19-
Ultraviolet ahsorptiespectrum: Instrument-Varian UV, Cary 219
Oplosmiddel - methanol
Concentratie - 0.01356 g/1 \ ,(nm) absorDties max_ _*- 320 12,4 280 Sh (schouder) 253 25,1 210 25,5 8401572 -20- G-een significante waardering'met zuur of-"base
Optische rotatie: Oplosmiddel - CÏÏCl^ [a]^4 = -207° (C=0.0351)
Een tweede analyse toonde de volgende optische rotatie: [«,f = -191° (C=0.5/ CHC13).
Infrarood absorptie spectrum: Zie FIG. 9
Belangrijkste absorptietanden (KBr): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440, cm"1
Massaspectra: Instrument - VG-ZAB-2F
'FAB-MS-thioglycerol
Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1249, 1357, 1463;met toevoeging van NaCl (m/z): 1271, 1379, 1485, 1597.
FAB-MS-MB (MB:matrix, m.w. 154); Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1249, 1283, 1403, 15 55; met toevoeging van NaCl (m/z): 12 49, 1271, 1303, 1425, 1483, 1577. FAB-MS-glycerol-DMSO: Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325, 1353; met toevoeging van Na Cl (m/z): 1215, 1237, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375. Instrument: Kratos MS-50 FAB-MS-thioglycerol; Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 1357, 1463.
Molecuulgewi cht (gebaseerd op bovenbeschreven Molecuulgewicht kennelijk 12U8 mas s aspe ct raalgegevens): 8401572 -21-
Magnetisch kernresonantiespectrs: Instrument - WM3éO Brucker Oplosmiddel: CDCl^ 1NMR: 360 MHz δ(ρρΐη): 11.75 (1H, s); 8.55 (1H, s); 7.45 (1H, s); 6.61 (1H, m); 6.23 (1H, brs) ; 6.17 (1H, brs); 5.93 (1H, d, J=9.3); 5.82 (1H, d, J-9.3); 5.7 (1H, brs); 5.49 (1H, m); 5.45 (1H, d, J=2.3); 5.38 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J*10.2); 4.64 (2H, m); 4.54 (1H, d, J=2.3); 4.2 (1H, s); 4.15-3.35 (26-28H) [4.10 (1H, m); 4.02 (1H, brs); 3.95 (3H, s); 3.85 (3H, s)r 3.79 (3H, s); 3.46 v (1H, m); 3.40 (3H, s)]; 2.82-2.70 (3H, brm); 2.50 C3H, s), 2.47 (1H, m); 2.38-2.22 (5H); 2.12 (1H, m); 2.11 (3H, s); 1.60-1.05 (22H) [1.39 (3H, d, J=6.3); 6.31 (3H, d, J-6.3); 1.29 (3H, d, J=6.3)/ 1.08 (6H)]
Zie PIG. 10 13C NMR: 90.3 MHz
Zie PIG. 11 13
In een afzonderlijke proef werd het C-NMR-spectrum van gezuiverd Bbm-1675 vastgesteld voor een monster, opgelost in CDCl^ (80 MHz).
De hoofdpieken worden hierna aangegeven.
8401572 -22- CMRvan BBM-1675A^ (80 MHz in CDCL^) R\
Chemische verschuiving in dpm (Multipliciteit ) BBM-löTSAj^ 13.7(q) 16.6(q) 17.5(q) 19.8(q) 22.2(q) 22.6(g) 23.4(q) 29.0(b) 34.0(t) 35.1(b) 39.5(b) 47.2(d) 52.5(g) 55.6(u) 56.0(q) 57.1(d) 62.4(b) 64.5(d) 67.7(d) 63.2(d) 68.8(b) 69.2(d) 69.6(b) 70.2(d) 71.9(d) 76.0(d) 76.6(d) 77.1(u) 77.3(d) 83.4(S) ' 86.6(d) 88.4(s) 90.5(b) 97.2(d) 98.3(s) 99.0(d) 99.6(d) 103.8(d) 107.6(s) 112.5(d) 123.1(d) 124.9(d) 130.1(d) 131.5(s) 134.9(s) 136.7(s) 144.0(s) 147.2(e) 153.8(e) 154.4{s) 155.0(s) 160.7(s) 166.4(s) 191.8(s) * Multipliciteit- q = quartet; d = doublet; U = onbepaald t = triplet; s * singlet BBM-1675A2
Beschrijving: witte kristallen; smp. 1^7-1^9°C
Elementair analyse C: 52,71% H: 5,94% N: 3,94% S: 9,39% O(door verschil): 28,01% 8401572 -23-
Ultraviolet absorptie spectra: Instrument - Varian UV, Cary 219
Oplosmiddel: methanol
Concentratie : 0.02052 g/1 λ (nm) absorpties .
max_ __ 320 12,2 282 16,3.
252 26,2 214 25,8
Geen significante verandering met zuur of base.
Optische rotatie: [α]^ = -179Λ0 (c 0>5, CHCl^)
Infraroodspectra: Zie fig. 12
Instrument: Beckman IR Model U2U0
Hoofd absorptie banden (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, .
2940, 2980, 3440, cm1.
MassaSpectra: Instrument: VG-ZAB-2F
FAB-MS-thioglycerol
Moleculaire massa bereik ionen (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569; met toevoeging van -NaCl (m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593 FAB-MS-MB (MB: matrix, m.w. 154); Moleculaire massa bereik ionen (m/2): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587; met toevoeging van NaCl (m/z): 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577.
FAB-MS-glycerol-DMSO ; Moleculaire massa bereik ö Δ 0 1 K “7 Q ionen (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, O 4 U I 0 / £ 1293f 1309/ 1325, 1326, 1341, 1353, 1369.
-2b-
Molecuulgewicht : Schijnbaar MW = 1248 ( gebaseerd op bovenbeschreven .
massa spectraal gegevens)
Mafnetische kern- : 'Zie PIG. 13
Resonantie spectra
Instrument: WM 360 Brucker
Oplosmiddel ·: CDC1 ^ 1H'NMR 360 MHz δ(ρρπΐ): 11.91 (1H, s); 8.62 (1H, s); 7.58 (1H, s); 6.56 (1H, m); 6.22 (1H, s); 6.15 (1H, brs); 5.91 (1H, d, J=9.6); 5.83 (1H, d, J=9.6); 5.70 (1H, m); 5.45 (1H, d, J-2.2); 5.44 (1H, s), 5.34 (1H, brs); 4.95 (1H, d, J-10.2); 4.75 (1H, m); 4.65 (1H, d, J-6.8); 4.54 (1H, d, J=2.2); 4.47 (1H, m); 4.18 (1H, s); 4.10 (1H, brs), 4.05-3.50 (20-24H); [3.96 (3H, s); 3.87 (3H, s); 3.77 (3H, s)]; 3.46 (1H, m); 3.39 (3H, s); 2.79 (1H, m); 2.73 (2H, m); 2.50 (3H, s); 2.50 (1H, m); 2.38-2.22 (3H); 2.14 (1H, m); 2.10 (3H, s); 1.98 (2H, m) ; 1.65-1.45 (6-8H); 1.38 (3H, d, J-6.0); 1.34 (3H, d, J-6.0); 1.22 (3H, d, J-6.8)? 1.10 (6H).
13C NMR 90.3 MHz
Zie FIG. 14 13
In een afzonderlijke proef werd C-NMR-spectrum van gezuiverde BBM-1675 bepaald voor een monster, opgelost in CDCl^ (80 MHz). De belangrijkste pieken worden hierna aangegeven.
8401572 -25- BBM-1675A2 13.7 16.9 17.5 19.8 22.3 22.7 23.4 33.1 34,1 35.1 39.3 47.6 52.6 55.7 56.0 56.1 57.6 62.4 64.5 64.9 65.9 68.3 69.2 69.7 71.9 73.6 75.8 76.1 77.1 77.7 78.1 78.3 83.3 86.2 88.4 90.4 97.2 98.3 99.1 99.5 99.6 103.8 107.1 112.4 123.2 124.8 129.9 137.3 144.1 154.2 154.5 160.9 167.9 192.2 TABEL g
Fysisch-chemisehe eigenschappen van BBM-1675 Ao, Aij; B-|, B2 _ A4_ B1 . B2
Smeltpunt (ontl.) 12s - i27*c 123 - i26*c 159 - I6i*c 156 - I59*c
[a]*7 (c 0.5, CHCI3): -161«C -176“C -171’C -122*C
Analfievonden : C: 54.55 54.65 Ξ: 6.46 6.29 N: 3.73 3.51 S: 7.49 3.07 m nn (E*^) s 253 (286) 253 (257) 2S3 (225) 248 (212) in MeOH 282 (153) 282 (153) 282 (140) 279 (141) 320 (122) 320 (117) 320 (104) 318 (103) in 0.01N HCl-MeOH : 253 (287) 253 (2S8) 253 (225) 248 (210) 282 (160) 282 (1S5) 282 (140) 279 (140) 320 (126) 320 (118) 320 (105) 318 (103) in 0.01H NaOH-MeOH s 252 (280) 252 (266) 252 (236) 248 (233) 283 (162) 283 (160) 283 (141) 278 (150) 318 (120) 318 (118) 318 (105) 318 (110)
Dunnelaagchromatografie (TLC) en hoge capaciteit vloeistof chromatografie (HPLC) gegevens betreffende BBM-1675 componenten_ A._Studie Nr. 1 - Samenvatting 8401572 -26-
Tabel H TLC en HPLC van BBM-1675 componenten _TLC (Rf)_ HPLC ( retentietijd, in minuten)__
SiO^ ^Gesilanizeerd Lichtosorb RP-18 CHCl3-MeOH CH3CN-H20 CH3CN-MeOH-0.1M CH3COONH4 (5:1 v/v) (75:25 v/v) (5:2:3 v/v) BBM-1675A1 0.74 0.18 13.3 3BM-16 7'5A2 0.71 0.21 17.3 BBM-1675A3 0.72 0.28 8.0 BBM-16 75A. 0.71 0.78 5.1 4 BBM-1675B1 0.63 0.23 BBM-1675B2 0.60 0.16 * C^g omgekeerde fase silicagel B. Studie nr. 2 - TLC en HPLC voor gezuiverde A^- en Ag-componenten TLC-chromatografie
Voor alle normale fasechromatografie werden Analtech GHLF silicagel uniplaten toegepast. De platen met een afmeting van 2,5 x 10 cm werden 5 voor ééndimensionaal TLC gebruikt. Zij werden ontwikkeld in glazen cilinders met afmetingen van 6,1+ cm (buitendiameter) x 12 cm en bevatten 10 ml eluent. Platen met afmetingen van 7,5 x 10 cm werden voor twee dimensionaal TLC toegepast. Het monster werd op de onderste linkerhoek 1 cm van de ran-ij den aangebracht. De plaat werd eerst in een tank (breedte 12,7 cm, diep- 10 te 8,6 cm, hoogte 30 cm) die 50 ml van de eerste eluent bevatte ontwikkeld.
8401572 -27-
De plaat werd daarna aan de lucht gedroogd, 90° tegen de klok in gedraaid, en in een tweede houder die 50 ml van de tweede eluent bevatte, ontwikkeld.
Whatman-analytische voorbeklede C-18-silicagel-platen werden voor alle omgekeerde fase-chromatografie toegepast. Platen met afïnetingen van 5 2,5 cm x 7,6 cm werden in glazen cilinders met 10 ml eluent ontwikkeld.
Eerst werden normale platen onder 25^ nm UV-licht bekeken. De platen werden vervolgens in een glazen cilinder (6,U cm buitendiameter x 12 cm) gebracht en na ongeveer 2 minuten opnieuw onderzocht. Omgekeerde faseplaten werden alleen onder 25^ nm UV-licht bekeken. Zones werden gede-10 tecteerd door te letten op uitdoving van de fluirescentie van een geïmpregneerde kleurstof.
Analytisch HPLC
De volgende componenten werden toegepast om een analytisch HPLC-systeem te construeren: Waters Associates Model 6000A oplosmiddel afgifte-15 systeempomp: Varian Varichrom Model WV-10 uv/vis Detector ingesteld op 25^ nm 0,1 buitendiameter; Fisher Recordal Series 5000 Recorder; Waters Associates Model 660 oplosmiddel Programmer; Waters Associates Model UÖK injector; Alltechj^m-Bondapak C^g (10 ^,um) kolom (U,6 mm inwendige diameter x 25 cm) met een Whatman Co. Pell 0DS (0,03-0,038 mm) waakkolom 20 {k,6 mm inwendige diameter x 5 cm). De componenten werden verbonden met 316 roestvrij stalen buizen (1,6 mm buitendiameter - 0,23 mm binnendiame-ter). Voor alle analyses werd de eluent met 2 ml per minuut ingepompt.
Preparatieve HPLC
De volgende componenten werden toegepast om een mediumdruk vloei-25 stof chromatografiesysteem te construeren: Fluid Metering, Inc. Model RP-SY 2CSC FMI Lab Pump; Fluid Metering, Inc. Model PD-60LF FMI pulsdemper; een 15 ml monsterlus gemaakt van polypropeen buizen (3,0 mm buitendiameter x 1,5 mm binnendiameter) gewikkeld om een kartonnen buis (8,65 cm buitendiameter); Glenco Series 3500 Universal LC kolommen; Instrument 30 Specialties Co. Model UA-5 absorptie/fluorescentie Monitor met een Type 6 optische eenheid; Instrumentation Specialties Co. Model 590 stroomonder-brekerklep; en een Instrumentation Specialties 'Co. Model 328 fractiever-zamelaar. De componenten werden verbonden met polypropeen en Teflon-buizen (3,0 buitendiameter x 1,5 mm binnendiameter) en Glenco Multifit Connectors 35 en kleppen in de vermelde volgorde.
8401572 -28-
De Glencoserie 3500 Universal LC-kolommen werd met het gedefinieerde ahsorptiemiddel onder toepassing van standaardtechnieken in het aangegeven oplosmiddel gesuspendeerd. De ledige ruimte tussen het vaste bed en de bovenkant van de buis werd met standaard Ottawa-zand gevuld. De eluent 5 werd verpompt met een maximale snelheid waarbij een 60 psi terugdruk (ongeveer 20 ml/minuut) niet zou worden overschreden.
Gradiëntelutie
Voor alle gradiënteluties werd een Glenco-gradiënt-elutie-inrich-ting, bestaande uit twee kamers van gelijke diameter, hoogte en volume die 10 in tanden met een Reflonklep was verbonden, toegepast. Een kamer diende als mengkamer en één als een statisch reservoir. Het minder polaire oplosmiddel werd aanvankelijk in de mengkamer bewaard. Het meer polaire oplosmiddel werd in de statische kamer bewaard. In beide kamers werden met Teflon beklede magnetische roerstaven (1,0 x 3,7 cm) aangebracht, die door 15 middel van Thomas-Model 15 mange-matic roerders werden aangedreven. De eluent werd via polypropeenbuizen (1,5 mm inwendige diameter x 3,0 mm uitwendige diameter) uit de mengkamer naar het mediumdruk HPL-systeem gepompt. Naarmate eluent uit de mengkamer werd verwijderd, kon dit zonder belemmering door het oplosmiddel uit het statisch reservoir worden vervangen, waar-20 door een lineaire gradiënt van de eluent werd verkregen.
TLC-analyse van BM-1675 A.j en Ag
Samengevat in tabel I zijn de waargenomen FL-waarden voor BBM-1675 Γ A.| en A2 op normale faseplaten, De wordt berekend door de gemeten afstand van het centrum van een zone vanaf het punt waarop het monster is aan-25 gebracht door de gemeten afstand van het oplosmiddelfront vanaf het punt van monsteraanbrenging te delen.
TABEL I
Rf BBM-1675A. BBM-1675A2
Systeem/verbinding 1 4% methanol in chloroform 0,33 0,30 5% methanol in diethylsether 0,39 50% aceton in Skellysolve B 0,38 0,31 8401572 -29-
Samengevat in tabel J zijn de waargenomen R -waarden van BBM-16T5 en Ag op normale faseplaten, die in twee dimensies zijn ontwikkeld.
De plaats van de vlekken wordt uitgedrukt in Cartesiaanse coördinaten.
De X-coördinaat- is de R^-waarde van het tweede vermelde oplosmiddelsysteem.
5 De Y-coördinaat betreft de R^-waarden van het eerste vermelde oplosmiddel-systeem.
TABEL J
Rf
Systeem/verbinding ' BBH-1675A1 BBM-1675A2 4% methanol in chloroform vs 5% methanol in diethyls ether (0,34/ 0,33) (0,28, 0,23) 4% methanol in chloroform vs 50% aceton in Skellysolve B (0,33, 0,29)
Samengevat in tabel K zijn de waargenomen R -waarden voor BBM-16T5 Γ A1 en Ag op C—18 omgekeerde fase TLC-platen, in binaire eluenten ontwikkeld.
TABEL ,K
si 0 ^ . B3M-1675A. BBM-1675A-
Systeem/verbinding . 1 2 25% 0.5 M NaCl in acetonitril 0,18 0,21 25% water in acetonitril 0,00 0,00
Samengevat in tabel L zijn de waargenomen R -waarden van BBM-1Ö75 J? A.j en Ag op C-18 omgekeerde fase TLC-platen, ontwikkeld met ternaire eluen- 8401572 -30- ten .
TABEL L
Rf
Systeem/verbinding B3M-1675A^ BBM-1675A2
Acetonitril : Methanol : 0.5M NaCl 80% : 10% : 10% 1,00 1,00 60% : 10% : 30% 0,57 0,50 40% : 30% : 30% 0,32 0,22 30% : 50% : 20% 0,44 0,33 50% : 30% : 20% 0,62 0,54 40% : 40% : 20% 0,60 0,49 50% : 20% : 20% 0,42 0,34 60% : 20% : 20% 0,74 0,69
Acetonitril : Methanol : water 40% : 30% : 30% 0,00 0,00
Acetonitril : Methanol : 0.1M NH^OAc 40% : 30% : 30% 0,32 0,22
Acetonitril : Methanol : 0.1M NaHjPO^ 40% : 30% : 30% 0,00 0,00 HPLC-analyse van BBM-1675 A^ en A^ BBM-1675 A^ en BBM-1Ö75 A^ werden onder toepassing van enkelvoudige, binaire en ternaire eluenten op C—18 omgekeerde fase-silicagelkolom geanalyseerd. Samengevat in tabellen Μ, N en 0 zijn de waargenomen K’-waarden voor deze verbindingen. De K’ werd berekend via de volgende formule K' = TR-To To waarin TR de retentietijd is, gemeten vanaf de injectietijd tot de top van 8401572 -31- de piek terwijl TO de lege volumetijd is.
IAB.EL M
IL
BBM-1675A, BBM-1675A-
Systeem/verbinding 1 c
Acetonitril a a
Tetrahydrofuran a a
Methanol 0,00 0,00 a = de verbinding werd niet uit de kolom geëlueerd.
K/_
Systeem/verbinding B3M-1675A1 B3M-1675A2 25% water in acetonitril a a 25% methanol in water 1,25 1,25 a = verbinding werd niet uit de kolom geëlueerd.
84 0 1 5 72 * -32- TABEL O Ternaire eluenten κι
Systeem/vertin ding 3BM-1675A^ BBM-1675A2
Acetonitril : Methanol : water 40% : 30% : 30%. a a
Acetonitril : Methanol : 0.1M NH^OAc 40% : 30% : 30% 1,7 3,0 50% : 20% : 30% 3,8 6,5 43,3% 23,3% : 33,3% 6,1 b 42,5% : 22,5% : 35,0% 7,8 b 41,5% : 21,5% : 37,0% 9,7 b a= werd. niet geëlueerd b= tiet bepaald
Biologische eigenschappen van BBM-l675-componenten
De anti-microhiële activiteit van de BBM-1675-componenten werd voor een verscheidenheid van bacteriën (grampositieve, gramnegatieve en zuur-vaste) en schimmels bepaald via de tweevoudige agar-verdunningsmethode.
5 Een voedingsagarmedium werd toegepast voor grampositieve en gramnegatieve bacteriën en nr. 1001 medium (3%'s glycerol, 0,3% natrium L-glutamine, 0,2% pepton, 0,31% NagHPO^, 0,1% KHgPO^, 0,005% ammoniumcitraat, 0,001% MgSO^ en 1,5% agar) voor zuurvaste organismen. Voor schimmels werd Sabouraud agarmedium toegepast. Zoala aangetoond in tabel P gaf elke van 10 zes BBM-1675 componenten (A^, Ag, A^, A^, B^, Bg) een breed spectrum van antimicrobiële activiteit te zien. Met name BBM-1675 A^, Ag, A^ en A^ waren bijzonder actief tegen grampositieve bacteriën.
6401572 -33-
TABEL F
Antimicrobiële activiteit van BBH-1675 componenten MIC in mca/ml
Stam BBM-167S Ax Aj , Aj A4 _ B2 S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.0125 0.012 0.0063 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.0125 0.012 0.012
Bj_ subtilis PCI 219 <0.0008 0.05 0.0125 0.0125 0.05 0.05 M. lateus 1001 0.0016 0.0063 0.0125 0.0125 0.1 0.1 M, flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.0125 0.025 0.025
Mycobacterium 607 0.05 0.1 NT NT 0.05 0.025 E. colt NIHJ 0.1 0.8 1.6 3.1’ 0.8 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 0.8 0.8 P. aeruginosa D15 0.8 1.6 1.6 3.1 3.1 3.1 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 3.1 1.6 C. neoformans 1.6 3.1 1.6 6.3 6.3 12.5
Een tweede antimicrobiële proef werd uitgevoerd aan gezuiverd en Ag (als bereid in voorbeeld III) en aan de componenten A^ en A^. De gegevens worden hierna samengevat.
MIC door ADT (mcg/ml)_.
Stam BBM-1675 Αχ A2 Α3 λ4_ S. aureus 209P <0.0008 0.0063 0.0063 0.012 S. aureus Smith <0.0008 0.0031 0.0063 0.012
Bj, subtiiis PCI 219 <0.0008 0.05 0.012 0.025 H. luteus 1001 0.0016 0*0063 0.012 0.05 M. flavus <0.0008 0.0016 0.0063 0.012
Mycobacterium 607 0.05 0.1 0.16 0.16 E. coli NIHJ 0.1 0*8 1*6 3.1 K. pneumoniae Dll 0.4 0.8 1.6 3.1 P. aeruginosa DIS 0.8 1.6 3.1 3;1 B. fragills A20928 0.2 1.6 0.2 0.4 C. difficile A21675 0.4 0.8 0.05 0.4 C. perfringens A9635 0.05 0.8 0.4 0.4 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 1.6 6.3 C. neoformans . 1.6 3.1 1.6 6.3
De activiteit van profaag inductie in lysogene bacteriën E. coli W 1709 ()\) werd bepaald voor BBM-1675-componenten volgens de methode van Lein et al in Nature 196: 783-78^· (1962). De plaque-telling werd uitgevoerd op agarplaten, die plaatmateriaal (T) en controleplaat (c) bevatten.
Een T/C-verhouding van de plaque-tellingen groter dan 3,0 werd als significant beschouwd en de lysogene inductie-activiteit (iLB-activiteit) werd uitgedrukt als de minimale induceerbare concentratie van de proefverbinding.
8401572 -3^-
Zoals aangetoond in tabel Q, waren BBM-1675-componenten bijzonder ILB-ac-tief tegen de lysogene bacteriën, waardoor er aanwijzing is, dat zij anti-tumor-activiteit bezitten.
'tabel q
Lysogene inductie activiteit van BBM-1675 componenten_
Antibioticum MIC* (mcg/inl) BBM-1675 h1 0,0063 BBM-1675 A2 0,0125 BBM-1675 A3 °>05 BBM-1675 A4 °>10· BBM-1675 B1 °»10 BBM-1675 B2 °/20 * minimale induceerbare concentratie
De anti-tumoractiviteit van BBM-1675 A^ en Ag werd in verschillende 5 muizetumorsystemen bepaald. Lymfocytische leukemie P-388, lymfoide leukemie L-1210, melanotisch melanoma B-16 en Lewis-longcarcinoom werden intra-peritoneaal bij mannetjes BDF -muizen geïmplanteerd bij een inoculum hoe-veelheid van resp. 10 , 10 , 5 x ΙΟ'5 en 10° cellen/muis. Gegradeerde doses van de proefverbindingen werden 2k uur na inoculeren van de tumor intraperi-10 toneaal aan de muizen toegediend. De behandelingen werden eenmaal op alleen de eerste dag, op dag 1, h en 7 (q3d x 3), eenmaal per dag gedurende 9 dagen (qd.1 —? 9) of 11 dagen (qd 1 —> 11) gegeven. De componenten A^ en A^ werden door gebrek aan materiaal alleen getest tegen P-388 leukemie op een q3d x 3 schema.
15 BBM-1675 A1, Ag, A^ en A^ werden opgelost in 0,9^’s pekel, die 10% dimethylsulfoxyde bevatte en de als referentie toegepaste verbinding chromycine A^ (Tomycine Takeda) werd in 0,9%'s pekel opgelost. Afsterving of overleving van de behandelde en niet-behandelde muizen werd dagelijks geregistreerd, en de gemiddelde overlevingstijd (MST) voor elke tests (T) 20 en controle (C)-groepen berekend. Een T/C-waarde gelijk aan of niet groter dan 125% betekent, dat een significant anti-tumoreffekt werd bereikt.
8401572 -35- ' De resultaten worden vermeld in de tabellen R, S, T, U, V enW, BBM-1675 A^ en A2 vertoonden een buitengewoon krachtige anti-tumor-activiteit tegen P-388 leukemie met een maximum T/C-waarde van 160$. Zij zijn uitgedrukt als minimum-effektieve dosis ongeveer 100-3000 x meer ac-5 tief dan chromycine A^. BBM-1675 A^ en waren evenwel minder actief dan de componenten A^ of Ag tegen P-388 leukemie (tabel S). BBM-1675 A^ en A^ waren eveneens actief tegen L—1210 leukemie (tabel U, B—16 melanoma (tabel V) en Lewis longcarcinoom (tabel W). De giftigheid van BBM-1675 A^ en Ag werd bepaald in mannetjes DDY-muizen door intraperitoneale of intrave-10 neuze toediening; hierbij bleek dat BBM-1675 A^ ongeveer 10 x giftiger was dan BBM-1675 Ag (tabel X). De therapeutische indices van BBM-1675 A en Ag waren ten opzichte van het P-388 leukemie-systeem (tabel Y) resp. U-8 en 8-20 x beter dan die van chromycine A^. Tweede proeven werden uitgevoerd door intraveneuze toediening van BBM-1675-componenten tegen P-388 en L- . . 5 ï+ 15 1210 leukemie, die intraveneus m een hoeveelheid van resp. 5 x 10 en 10 cellen per muis werden geinoculeerd. In deze proeven werd adrimycine als re- ferentiemiddel toegepast, dat werd opgelost in 0,9%'s pekel en toegediend op de dagen 1, !+ en 7. De resultaten worden vermeld in de tabellen Z en AA.
Beide componenten A^ en A^ waren beter dan adrimycine uitgedrukt in de ma- 20 ximum-T/C-waarde, de minimale effectieve dosis en het activiteitstraject.
8401572
TABEL R
Effect van bbm-1675 componenten op P-388 Leukemie (Dag 1 behandeling) -36-
Gem. gew. Overlevenden Dosis ip <BT T/c wardering op (mqAq/dag1) (dagen) (%) dag 5 (<?) dag_5_ daS 45 BBM-1675 A1 0-03 19.0 (152) -2.6 5/5 0/5 0.01 19.0 (Ï5?) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 ÓAA) -1.0 5/5 0/5 0.001 20.0 (l6Ö) -1.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 (Hip 0.0 5/5 0/5 .
0.0001 15.0 120 -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 -0.2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3' 6.0 48 -3.8 3/5 0/5 0.1 20.0 ClsÖ) -1.8 5/5 0/5 0.03 18.0 (I4p -1.4 5/5 0/5 0.01 17.0 -0.6 5/5 0/5 0.003 17.0 (XÏÏ) -0.4 5/5 0/5 0.001 16.0 (ΐϊζ) 0.0 5/5 0/5 0.0003 15.0 120 0.0 5/5 0/5 0.0001 14.0 112 0.0 5/5 0/5
ChromomycineA^ 1 1910 (152) -0.2 4/5 0/5 0.3 17.0 (Uë) +0.6 5/5 0/5 0.1 16.0 (128) +0.8 5/5 0/5 0.03 14.0 112 0.0 5/5 0/5 0.01 14.0 112 -0.2 5/5 0/5
Drager - 12.5 - +0.1 10/10 0/10 8401572 dag 1, i.p.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
Effectvan B3M-167S componenten op P-388-Leukemie (Dagen l, 4 and 7 behandelingen)
T ABEL S
-37-
Gem. gew. Overleven-
Dosig ip hst t/c verandering op den op (rwAg/dag*) (dagen) (%> dag5 (g) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.03 7.0 56 -2.8 5/5 0/5 0.01 19.0 , 1?D -1.0 5/5 0/5 0.003 19.0 ίίίΌ -0.6 5/5 0/5 0.001 16.0 (128) -0.6 5/5 0/5 0.0003 17.0 (lis) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 /128) -0.2 5/5 0/5 0.00003 14.0 112 +0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0.3 tox. - - 2/5 0/5 0.1 11.0 88 -1.0 5/5 0/5 0.03 18.0 . /f44) -1.2 5/5 0/5 0.01 18.0 ÓJO -0.4 5/5 0/5 0.003 18.0 CuO -0.4 5/5 0/5 0.001 17.0 ' (Up -0.4 5/5 0/5 0.0003 16.0 /128) -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (12jp -0.2 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.4 5/5 0/5 BBM-1675 A3 0.01 17.5 (140) +0.2 4/4 0/4 0.001 15.0 120 +0.6 4/4 0/4 0.0001 13.5 108 +0.6 4/4 0/4 BBM-1675 A4 0.01 16.5 /13?) +0.2 4/4 0/4 0.001 14.0 112 +0.4 4/4 0/4 0.0001 12.5 100 +0.6 4/4 0/4
Chromoraycire A^ 0.3 18.0 /lTj) +0.6 5/5 1/5 0.1 18.0 (144) +0.6 5/5 0/5 0.03 17.0 (Ojp -0.2 5/5 0/5 0.01 14.0 112 0.0 5/5 0/5
Drager - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 *Dagen 1, 4 en 7, i.p.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
8401572
Effect van bbm-1675 componenten op P-388 Leukemie (cd 1—9 Behandelingen) -38-
T A B E L T
Gem. gew. Overleven- t, . . verandering den op
Dosis, ip mst T/C op ö (mq/kq/dag1) (dags) (%) dag 5 (q) dag 5_ dag 45 BBM-1675 Αχ 0.01 7.0 56 -1. 8 5/5 0/5 0.003 13.0 104 -1.0 5/5 0/5 0.001 19.0 </l52) -1.2 5/5 0/5 0.0003 19.0 (Up -0.8 5/5 0/5 0.0001 18.0 (ΐΰ) 0.0 5/5 0/5 0.00003 16.0 (128) +0.2 5/5 0/5 1 0.00001 16.0 (128) -0.2 5/5 0/5 Β3Μ-1675 Α2 0.1 6.0 48 -2.2 4/5 0/5 0.03 13.0 104 -1.4 5/5 0/5 0.01 18.0 /144) -1.0 5/5 0/5 0.003 18.0 (Up -0.6 5/5 0/5 0.001 18.0 (144) -0.8 5/5 0/5 0.0003 17.0 (HP -0.4 5/5 0/5 0.0001 16.0 (Op -0.4 5/5 0/5 0.00003 15.0 120 -0.6 5/5 0/5.
0.00001 15.0 120 +0.4 5/5 . 0/5
Chromomyciie A^ 0.3 9.0 72 -2.0 5/5 0/5 0.1 18.0 ./144) +0.4 5/5 0/5 0.03 18.0 (HP O-Ο 5/5 0/5 0.01 15.0 120 -0.2 5/5 0/5 0.003 13.0 104 -0.2 5/5 0/5
Drager - 12.5 - +0.4 10/10 0/10 8401572 qd i.p.
Cirkel geeft een significante antitumoractiviteit aan.
TABEL U
-39- sffectvan bbh-1675 componenten op L-121Q Leukemie
Gem. gew. Overleven- M._ . verandering den op
Dosis 1451 T/c op (mq/kq/dag*) (dagen) (%) dag 5 (q) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 14.5 (βζ) -1.7 6/6 0/6 0.001 12.0 (l2fp -0.5 6/6 1/6 0.0003 12.0 (Πδ) +0.3 6/6 0/6 0.0001 11.0 116 +1.0 6/5 0/6 BBM-1675 A2 , 0.03 10.5 111 -1.5 6/6 ' 0/6 0.01 13.5 (142) -1.2 6/6 0/6 0.003 13.0 (lij) -0.2 6/6 0/6 0.001 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.0003 10.5 111 +1.0 6/6 0/6
Chromomvcire A^ 0.3 8.5 89 -1.2 6/6 0/6 0.1 11.5 121 +1.2 6/6 0/6 0.03 11.0 116 +1.2 ' 6/6 0/6 0.01 11.0 116 +1.3 6/6 0/6 0.003 10.0 105 +1.5 6/6 0/6
Drager - 9.5 - +1.4 12/12 0/12 * qd l-*-9, i.p.
Cirkel geeft een significante antitumoractiviteit aan.
8401572
Effect vaflBBM-1675 componenten op BI6 Melanoma -1+0-
TAB E L V
Gem. gev. Overleven- ' Dosis «ST t/c ^rendering dan op (mq/kq/dag*) . (dagen) (%) dag 5 (q) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 61 -0.7 6/6 0/6 0.001 31.5 (ÜT? 0.0 ' 6/6 0/6 0.0003 40.5 (2 Al) +0.3 6/6 0/6 0.0001 27.0 (164? +0.8 6/6 0/6 0.00003 22.0 (Uj) +1.8 6/6 0/6 0.00001 18.0 109 +2.2 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 11.0 67 -0.8 6/6 0/6 0.01 26.5 (m? +0.3 6/6 0/6 0.003 29.5 (179? +0.2 6/6 0/6 0.001 26.0 (158? +0.8 6/6 0/6 0.0003 22.0 (ffP +0.2 6/6 0/6 0.0001 18.0 109 +0.2 6/6 0/6 0.00003 17.0 103 +1.7 6/6 0/6
Chromomyciffi A^ 0.1 25.5 +2.3 6/6 0/6 0.03 23.0 (139? +2.2 6/6 0/6 0.01 21.0 (L27? +2.3 6/6 0/6 0.003 18.0 109 +2.2 6/6 0/6
Drager - 16.5 - +2.1 12/12 0/12 * qd l-*-9, i.p.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
8401572 -Ui-
TABEL W
Effect "van bbm-1675 componenten op Lewis long Carcinoom
Gem. gew. Overleven- t. . m verandering den op
Dosis MST T/C & * (inq/kq/dag*) .(dagen) (%) lag 5 (g) dag 5 dag 45 BBM-1675 Αχ 0.003 10.0 91 -1.7 5/6 0/6 0.001 31.5 (286) -0.7 6/6 1/6 0.0003 21.5 (I9p -0.7 6/6 0/6 0.0001 21.0 (Ï9Ï) +1.0 6/6 0/6 0.00003 13.0 118 +1.0 6/6 0/6 0.00001 11.5 105 +1.0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.03 10.0 91 -1.8 6/6 0/6 0.01 25.5 /132) -1.7 6/6 0/6 0.003 28.5 (Up 0.0 6/6 1/6 0.001 17.0 (155) -0.3 6/6 0/6 0.0003 15.0 (136) +1.2 6/6 0/6 0.0001 10.5 95 +0.5 6/6 0/6 0.00003 11.0 100 +0.8 6/6 0/6
Chromomyciie A^ 0.1 21.5 /lip +1.2 6/6 1/6 0.03 17.0 (lip +1.7 5/5 0/5 0.01 17.0 (lip +1.5 6/6 0/6 0.003 11.5 105 +1.7 6/6 0/6
Drager - 1112/12 1/12 * qd 1-11, i.p.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
8401572 _i|2-
TABEL X
Giftighgid - van BBM-1675 componenten - LD50 (mg/kg/dag)
Multiple dosis
Enkele dosis (qd 1*9) i.p. ' i.v ' ' i.p.___ BBM-1675 Αχ 0.019 0.010 0.00046 BBM-1675 A2 0.18 0.10 0.0072
ChromomycineA^ 0.81 0.41 0.23 TABEL Y Therapeutische indices ld50/med* P-388
Enkel . qd l-*9 L1210 B16 LL
BBM-1675 Αχ 63 >46 2 15 5 BBM-1675 A2 180 12 2 24 24
Chromomycine A2 8 8 inactief 23 23 * minimale effectieve dosis 8401572 * _1ι3- TABEL- Ζ
Effect van ΒΒΜ-1675 componenten op Intraveneus geïmplanteerde P-383 Leukemie
Gem. gew. Overlevenden Dose mst T/C verandering op (mq/kq/dag*) (dagen) (%) ¾a,g 5 (g) da?· 5 dag- 45 BBM-1675 Αχ . 0.01 9.5 106 -1.7 6/6 0/6 0.003 14.0 fiFêD -0.3 6/6 0/6 0.001 11.5 (I2jp +0.3 6/6 0/6 0.0003 9.0 100 +0.3 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0.1 7.0 78 -3.7 6/6 0/6 0.03 15.0 (lip -1.0 6/5 0/6 0.01 12.0 (ΐ||) -0.5 6/6 0/6 0.003 9.0 100 +1.0 6/6 0/6
Adriamycine 30 tox. - - 0/6 0/6 10 9.0 100 -1.5 6/6 0/6 3 12.0 (lij) +0.7 6/6 0/6 1 9.0 100 +1.7 6/6 0/6
Drager - 9·0 - +1-7 12/12 0/12 s
Dagen 1, 4 en 7, i.v.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
8401572 *
-ΗΤΑ B E L AA
Effectv811 BBM-1675 componenten op intraveneus geïmplanteerde L-1210 Leukemie
Gem. gew. Overleven- . . „ST T/c verandering den op
Dosis , > op , „ a fmo/kq/dag*) (dagen) (%) dag 5 (g) _ dag 5 dag 43 BBM-1675 A, 0.008 9.5 119 -2.0 4/6 0/6 1 0.004 14.0 (VIS) -0.2 6/6 0/6 0.002 13.0 +0.2 6/6 0/6 0.001 9-5 · 119 +0.8 6/6 0/6 0.0005 · 9.0 113 +0.8 6/6 0/6 BBM-1675 A_ 0.063 11.0 ^3j) -1.8 6/6 0/6 2 0.032 14.0 (Ï7p +0.2 6/6 0/6 0.016 10. S (lip +0.8 6/6 0/6 0.008 8.0 100 +1.2 6/6 0/6 0.004 8.0 100 +0.8 6/6 0/6 ,. . . . 1fi tox - - 2/6 0/6
Adriamycme 15 ._ 8 12.0 Oio)· +0.2 6/6 0/6 4 9.0 113 +1.5 6/6 °/5 2 8.0 100 +1.7 6/6 0/6 n . 8.0 - +1.4 12/12 0/12
Drager °
Sdagen 1» 4 en 7» i.v.
Cirkel geeft een significante antitumor activiteit aan.
De anti-tumoractiviteit van de componenten BM-1Ö75 A^ en werd tevens bepaald door een tweede proef tegen P-388 leukemie, L-1210 leukemie en B—16 melanoma bij muizen. De resultaten van deze proeven worden vermeld in tabellen BB, CC en DD. Bijzonderheden van de in deze proeven toegepaste methoden zijn beschreven in Cancer Chemother. Rep. 3: 1-87 (deel 3), 1972.
8401572 » -^5-
T A B E JL, BB
Effekt'van BBM-1675 Αχβη AjOp P-388 Leukemie
Behande- Effect awc, Over-
Mate- lings- Dosis, ip mst mst ga levenden .riaal_schema._uqAg/dgr_dagen_\ t/c_dj_d.5 (30) * NSC 33270 qdl-9 <00 13.0 163 -0.6 6/6 200 11.0 138 -0.9 6/6 SBK-1675A1 d.1 51.2 20.0 2S0 -2.1 4/6 DMSO-pekel 25.6 18.0 225 -1.8 6/6 12.8 16.5 206 -1.1 6/6 6.4 13.0 163 +0.1 6/6 3.2 12.0 150 -0.3 5/6 1.6 11.0 138 -0.3 6/6 0.8 10.5 131 0 6/6 0.4 10.0 125 +0.4 6/6 0.2 10.0 125 +0.3 6/6 0.1 10.0 125 0 6/6 d.1, 5 t 9 25.6 8.0 100 -1.8 6/6 12.8 13.5 169 -1.5 6/6 6.4 16.5 206 -0.8 6/6 3.2 16.0 200 -0.8 6/6 1.6 15.5 194 +0.3 6/6 0.8 12.5 156 +0.3 6/6 0.4 12.0 150 -0.1 6/6 0.2 11.5 144 +0.2 6/6 0.1 12.0 150 +0.8 6/6 0.05 10.0 125 +0.8 6/6 qdl-9 „ 12.8 TOX TOX TOX 1/6 6*4 6-0 7!S -1.5 4/6 3·2 13.0 163 -1.2 6/6 l·6 14.5 181 -1.6 6/6 °·8 16.5 206 -2.3 6/6 0.4 16.0 200 -0.9 6/6 0*2 15.0 138 -0.8 5/5 0*1 13.0 163 -0.4 6/6 0.05 12.0 150 +0.1 6/6 0.025 12.0 150 -0.7 6/6 8401572 * ‘ -h6- T .A B E L BB (vervolg) EBM-1675A2 d. 1 256 TOX TOX TOX 0/6 DMSO-pekel 128 12.5 156 -3.5 4/6 64 27.0 338 -1.9 .6/6 32 26.0 325 -2.0 6/6 16 16.0 200 -1.8 6/6 8 15.5 194 -1.9 6/6 4 15.0 188 -0.7 6/6 2 12.0 ISO -0.5 6/6 1 12.0 150 0 6/6 0.5 10.0 125 +0.2 6/6 d.1, 5 S 9 128 TOX TOX TOX 0/6 64 TOX TOX TOX 0/6 32 TOX TOX -1.3 2/6 16 24.5 306 -1.3 5/5 8 17.5 219 -1.1 6/6 4 15.0 188 0 6/6 2 15.0 188 +0.1 6/6 1 12.5 156 -0.4 6/6 0.5 12.0 ISO -0.4 6/6 3BM-1675 A2' DMSO-pekel 0.25 , 11.0 . 138 -0.4 6/6 qdl"*9 64 TOX ' TOX TOX 1/6 32 6.0 7!S -2.9 4/6 16 . 8.0 100 -J..9 6/6 8 IS.S 194 -1.3 6/5 4 17.0 213 -1.8 6/6 2 ' 15.0 188 -1.1 6/6 1 14.0 175 -0.5 6/6 0.5 14.0 175 -0.6 6/6 0.25 12.0 150 -0-1 6/6 0.12S 12,0 150 +0.1 6/s controle pekel 8-0 ~ 10/10
Tumor inoculum: 10^ ascites cellen geïmplanteerd i.p.
Gastheer : CDF^ ? muizen
Tox. : <£l+/6 muizen levend op dag 5
Evaluatie : MST = gem. overlevingstijd
Effekt : % T/C = (MST behandeld/MST controle) x 100
Criteria : % T/C >125 beschouwd als significante antitumoractiviteit
^ÏÏSC 38270 = olivomycine A
8401572 -^7-
TABEL. CC
Effect YanBBM-1675 A^ en A^ op L-1210 Leukemie
Behande— Effect awc,
Mate- lings- Dosis., xp mst mst gm Overlevenden ~,riaal-_sgjlêga ._ug/kg/ini_dagen % τ/c d.s_a.s oo)_ BSM-1675 Aj_ d. 1 51.2 12.0 171 -1.1 5/6 25.6 7.0 100 -2.3 6/6 12.8 9.0 129 -1.1 5/6 6.4 9.5 136 -0.5 6/6 3.2 6.0 86 -1.7 6/6 1.6 7.0 100 -0.8 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.0 100 +0.3 6/6 0.2 7.0 100 -0.5- 5/6 0.1 7.0 100 +0.8 5/6 d.1, 5 S 9 25.6 TOX TOX TOX 1/6 12.8 9.0 129 -1.8 6/6 6.4 9.0 129 -0.8 6/6 3.2 8.0 114 -1.9 6/6 1.6 8.S 121 0 6/6 0.8 8.0 114 -0.4 6/6 0.4 7.5 107 -1.3 6/6 0.2 3.0 114 0 5/6 0.1 8.0 114 +0.4 5/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 <Jd 1-9 12.8 TOX TOX -2.4 3/6 6.4 8.0 114 -1.6 6/6 3.2 8.0 114 -1.7 6/6 1.6 9.0 129 -2.1 6/6 0.8 8.5 121 -1.6 6/6 0.4 8.0 114 -1.0 6/6 0.2 8.0 114 -0.5 5/6 0.1 7.0 . 100 +0.3 6/6 0.05 7.0 100 +0.3 6/6 0.025 6.0 86 -0.6 6/6 B3M-1675 A2 d.1 256 . TOX TOX TOX 0/6 128 7.0 100 -1.8 5/6 64 7.5 107 -1.3 4/6 32 8.0 114 -2.2 5/6 16 7.0 100 -2.3 6/6 8 9.5 136 -1.4 6/6 4 8.5 121 -1.1 5/6 2 8.0 114 -0.8 6/6 1 8.0 114 0 6/6 0.5 8.0 114 -0.1 6/6 8401572 ♦ -1+8-
TABEL PD
Effect van 3BM-16 7 5 A, en . a, op B16 Melanoma . - * ....... * - .............. - «k
Effect AWC
Mate- Dosis, IP MST MST cp Overlevenden ; r^aal_pg (m) of mgAq/ini ' dagen_% T/C_dji_d.10 (61) BBM-1675 Αχ 3.2M TOX TOX -1.8 2/10 1.6 16.0 64 -1.8 10/10 0.8 34.5 168 -1.8 10/10.
0.4 56.5 226 -0.9 10/10(2)fa 0.2 47.0 188 -0.7 10/10 0.1 37.0 148 -0.4 10/10 BBM-1675 A2 16M 13.0 52 -2.1 10/10 8 29.5 118 -2.0 10/10 4 43.5 174 -1.1 10/10 2 50.5 202 -2.1 10/10(3)b 1 0.5 140 -1.0 10/10 0.5 38.0 152 -1.1 10/10
Controle pekel 25.0 - -0.1 10/10 9»
Slechts éin zonder tumor; MST d.m.o. = 55>0 (220l)
Twee zonder tumor; MST d.m.o. = 16,0 (181$)
Tumor inoculum: 0,5 ml van de 10$ brei, ip
Gastheer : BDF„ ? muizen
Behandeling : qd 1—> 9
Tox : ^7/10 muizen levend op dag 10
Evaluatie : MST = gemiddelde overlevingstijd
Effekt : % T/C = (MST behandeld/MST controle) x 100
Criteria : % T/C > 125 beschouwd als significante antitumoractiviteit
Na verdere zuivering van BBM-1675 A^ volgens voorbeeld VI, werden monsters van de gezuiverde verbinding beproefd tegen L—1210 leukemie, P-388 leukemie en B—16 melanoma bij muizen. De resultaten van deze proeven worden in de volgende tabellen vermeld.
8401572
TABEL EE
-ί+9-
Effekt van gezuiverd ΒΒΜ-ΐ675Αχοί P388 Leukemie (Dag 1 behan deling) Gem.gew.^ Overle-
Verbin- Dosis MST T/c verandering venden ding (mgAa/dosis Route. schema dagen (%) op dag 5 dag 5_ BBM-1675A^ 0.1024 i.p., qd x 1 TOX TOX 0/6 0.0512 17.5 159 -1.8 4/6 0.0256 16.5 150 -2.6 6/6 0.0128 17.5 159 -1.4 6/6 0.0064 15.5 141 -2.2 6/6 0.0032 15.5 141 -2.5 6/6 0.0016 16.5 150 -1.0 6/6 0.0008 15.0 136 -1.2 6/6 0.0004 15.0 136 -2.0 6/6 0.0256 i.p., q4d x 3; TOX TOX -1.5‘ 1/6 0.0128 10.0 91 -2.5 5/6 0.0064 17.5 159 -1.9 6/6 0.0032 17.0 155 -0.8 6/6 0.0016 17.0 155 -2.0 6/6 0.0008 1S.0 136 -1.7 6/6 0.0004 15.0 136 -0.4 6/6 0.0002 13.0 118 -0.8 6/6 0.0001 13.0 118 -1.3 6/6 0.00005 13.5 123 -1.0 6/6 0.0128 i.p., qd x 5; TOX TOX 0/6 0.0064 TOX TOX ---3.6 3/6 0-0032 17.5 155 -2.2 5/6 0.0016 14.5 132 -2.0 6/6 0.0008 15.5 141 -2.2 6/6 0.0004 16.0 145 -2.8 6/6 0.0002 17.0 155 -1.3 6/6 0.0001 14.0 127 -1.6 5/6 0.00005 15.0 136 -1.6 6/6 0.000025 15.0 136 -1.0 6/6
Controle (drager) 1 x 106 i.p.,q4dx3; 11.0 100 -0.7 9/9
Gaatheer: CDF1 vrouwtjes muizen
Implantatie niveau en plaat: 1 x 10^ cellen, i.p.
8401572
TABEL FF
-50-
Effekt van gezuiverd bbm-167sa^ of l-1210 Leukemie "(Dag 1 ^behandeling) Gem. gew. Overle-
Verbin- Dosis mst verandering venden ding (mq/ka/dosis Route, schema dagen (%) op dag 5 dag 5_ BBM-1675A1 0.1024 i.p., qd x 1 TOX TOX 1/6 0.0512 TOX TOX -2.0 0/6 0.0256 8.0 114 -2.9 4/6 0.0128 11.0 157 -2.0 6/6 0.0064 11.0 157 -1.9 6/6 0.0032 10.0 143 -2.0 6/6 0.0016 10.0 143 -2.6 5/6 0.0008 8.0 114 -0.4 6/6 0.0256 i.p., q4d x 3 TOX TOX -2.3 2/6 0.0128 10.5 150 -1.7 6/6 0.0064 11.0 157 -1.8 6/6 0.0032 11.0 157 -1.4 6/6 0.0016 10.5 150 -1.9 6/6 0.000 8 9.0 129 -0.6 6/6 0.0004 8.5 121 -0.7 6/6 0.0002 8.0 114 -0.5 6/6 0.0128 i.p., qd x 5 TOX TOX -2.8 2/6 0.0064 7.0 100 -1.8 5/6 0.0032 11.5 164 -1.0 6/6 0.0016 11.0 157 -1.5 6/6 0-0008 10.0 143 -1.6 5/6 0.0004 8.5 121 -0.4 6/6 0.0002 8.5 121 0.1 6/6 0.0001 8.5 121 0.0 6/6
Controle (drager) l χ ίο6 i.p., qd x s 7.0 100 0.1 10/10
Gastheer: CDF1 vrouwtjes muizen Implantatieniveau en plaats: 1 x 10^ cellen, i.p.
1401572
TABEL GG
-51-
Effekt van gezuiverd 3BM-i675Ajop. Βίε Melanoma (Dag _1-Behandeling) Gem.gew. Overle-
Verbin- Dosis ffiT verandering venden ding(ma/kq/dosis Route schema dagen t%) op dag j dag s *BBM-1S75A^ 0.0064 i.p.,q4dx3 16.5 110 -3.8 8/10 0.0032 22.5 150 -3.0 10/10 0.0016 25.0 167 -1.8 10/10 0.0008 22.0 147 -2.3 10/10 0.0004 24.0 160 -1.8 9/10 0.0016 i.p., qd x 9 27.0 180 -3.7 10/10 0.0008 27.0 180 -2.9 10/10 0.0004 26.0 173 -2.3 10/10 0.0002 24.5 163 -2.4 10/10 0.0001 25.5 170 -2.3 10/10
Controle (drager) 0.5 ML i.p.. qd x 9 15.o loo -o.3 10/10 **SBM-1675Aj 0.0064 i.v., q4d x 3 15.0 86 ”4.7 10/10 0.0032 32.5 186 -2.1 0.0016 26.0 149 -1.4 10/10 0.0008 24.0 137 ”0.4 10/10 0.0004 24.5 140 -0.0 10/10 0.0064 i.p.,q4dx3 18.0 103 ”2.7 10/10 0.0032 23.0 131 -1.4 10/10 0.0016 · 24.0 137 -0.7 10/10 0.0008 25.5 146 ”0.8 10/10 0.0004 21.5 123 -1.4 10/10
Controle (drager) 0.2 ml i.v.,q4dx3 17.5 100 -o.4 10/10
Gastheer: CDF1 vrouwtjes muizen SImplantatieniveau en plaats: 0,5 ml 10$ brei, i.p.
SSImplantatieniveau en plaats: Fragment. s.c.
De bovengenoemde analysegegevens tonen aan dat de gezuiverde BBM-5 1675 A^-component nagenoeg dezelfde anti-tumoreigenschappen heeft als het eerder onderzochte minder gezuiverde monster. De verbinding heeft een uitzonderlijk hoge kracht, aangezien de activiteit daarvan is aangetoond bij een dosering van 25 nanogram/kg op een schema van 5 x per dag tegen P-388 leukemie bij muizen. Volgens proeven tegen P-388 en L-1210 leukemie, is 10 BBM-1675 A.j effektief, hetzij toegediend als enkelvoudige injectie, dag 1, 8401572 -52- elke vierde dag 3 injecties, of 5 x per dag. Tegen B—16 melanoma was de verbinding even effektief · bij intraveneuze toediening aan dieren met sub-cutane tumors als bij intraperitoneale toediening aan dieren, met IP-tumors implantaten. Deze eigenschap van een succesvolle farmacologisch afgifte 5 van een geneesmiddel aan een tumor op een verwijderde plaats is bij antitumor antibiotica ongewoon.
Zoals boven aangetoond bezitten de BBM-l675-componenten een krachtige antimicrobiële activiteit, waardoor zij bruikbaar zijn voor de therapeutische behandeling van zoogdieren en andere dieren tegen dergelijke micro-10 organismen, veroorzaakte infectieziekten. Bovendien zijn de componenten geschikt voor andere gebruikelijke toepassingen van desinfectiemateriaal zoals voor medische en tandheelkundige apparatuur.
De profaaginductie in lysogene bacteriën en de activiteit tegen tu-morsystemen bij muizen bewijzen dat de BBM-1675-componenten eveneens thera-15 peutisch geschikt zijn voor het remmen van de groei van tumoren bij zoogdieren.
De onderhavige uitvinding voorziet aldus in een werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer die is aangetast door een microbiële infectie of door een kwaadaardige tumor, waarbij aan genoem-20 de gastheer eenueffektieve antimicrobiële of tumor-remmende dosis van BBM-1675 Αί, A2, A3, A^, B1 of Bg, of een farmaceutische preparaat daarvan wordt toegediend.
In een ander aspect voorziet de onderhavige uitvinding in een farmaceutisch preparaat in de vorm van een effektieve antimicrobiële of tumor-25 remmende hoeveelheid van BBM-1675 A^, Ag, A^, A^, B^ of Bg, in combinatie met een inerte farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunningsimiddel.
Deze preparaten kunnen zijn samengesteld uit elke farmaceutische vorm, die geschikt is voor parenterale toediening.
Preparaten volgens de uitvinding voor parenterale toediening omvat-30 ten steriele waterige of niet-waterige oplossingen, suspensies of emulsies. Zij kunnen tevens worden gemaakt in de vorm van steriele, vaste preparaten, die onmiddellijk voor gebruik in steriel water, fysiologische pekel of een ander steriel injecteerbaar middel kunnen worden opgelost.
Opgemerkt wordt dat de feitelijke voorkeurshoeveelheden van BBM-1675-35 antibiotica zullen variëren, al naar gelang de specifieke component, het specifiek samengestelde preparaat, de wijze van toediening en de specifieke plaats, gastheer en ziekte. De vakman zal rekening houden met de vele fac- 8401572 -53- toren, die de werking van het geneesmiddel modificeren zoals leeftijd, gewicht, sexe, diëet, tijd van toediening, route van toediening, excretié-, snelheid, toestand van het subject, geneesmiddelcombinaties, reactiegevoe-lighedén en ernst van de ziekte. De toediening kan continu of periodiek 5 geschieden binnen de maximaal getolereerde dosis. De vakman zal aan de hand van gebruikelijke doseringsproeven via de boven gegeven richtlijnen in staat zijn bij een bepaalde combinatie van omstandigheden een optimale toedieningsroute vast te stellen.
De volgende voorbeelden dienen ter verdere illustratie van de uit-10 vinding zonder beperkend te zijn.
Voorbeeld I
Fermentatie van BBM-I675
Actinomadura stam nr. H96U-92 werd gekweekt en gehandhaafd op een schuine agarcultuur, die 1$ moutextract, 0,\% glucose, 0,h% gistextract, ' 15 0,05% CaCOg en 1,6$ agar bevatte. Een goed gekweekte schuine agarcultuur werd toegepast voor het inoculeren van een vegetatief medium, dat 3$ oplosbare zetmeel, 3% droge gist, 0,3$ K^HPO^, 0,1$ KJ^O^, 0,05% MgSO^T^O, 0,2$ UaCl en 0,1$ CaCO^ bevatte, waarbij de pH v66r sterilisatie werd ingesteld op 7,0. De vegetatieve cultuur werd gedurende 72 uur bij 32°C op 20 een roterende schudinrichting (250 tpm) geïncubeerd en 5 nil van het kweek-materiaal werd overgebracht in een 500 ml Elenmeyer-kolf, die 100 ml van het fermentatiemedium bevatte, samengesteld uit 3$ suikerriet, 1$ maïszetmeel, 1$ vismeel, 0,1$ CaCO^ en 0,005$ CuSOj^H^O (pH 7,0 v66r sterilisatie). De fermentatie werd bij 28°C gedurende 6 dagen uitgevoerd op de 25 roterende schudinrichting. De antibiotische activiteit in de fermentatie-vloeistof werd bepaald door papierschijfagardiffusie onder toepassing van Staphylococcus aureus 209P als proeforganisme. De antibiotische capaciteit bereikte een maximum van.ongeveer 1 mcg/ml na 5 dagen fermentatie.
De fermentatie van BBM-1675 werd tevens uitgevoerd in fermentatie-30 kolven, voorzien van een roermechanisme. 500 ml van de inoculumkweek als boven bereid werd overgebracht in fermentatiekolven van 20 1, die 10 1 fermentatiemedium bevatte, bestaande uit dezelfde ingrediënten als toegepast bij de fermentatie in schudkolven. De fermentatie werd uitgevoerd bij 32°C met een beluchtingssnelheid van 12 1/minuut en een roersnelheid van 35 250 tpm. Onder deze omstandigheden bereikte de antimicrobiotische produk-tie een maximum van ongeveer 0,9 mcg/ml na een fermentatieperiode van 68-76 uur.
8401572 -5h-
Fermentatiestudies werden tevens uitgevoerd in fermentatietanks.
Een entcultuur werd gedurende h dagen bij 30°C geschud in Erlenmeyer-kolven die vegetatief medium bevatten, bestaande uit 3% oplosbaar zetmeel, 3% droge gist, 0,3% KgHPO^, 0,1% ΚΗ^ΡΟ^, 0,05% MgSO^HgO, 0,2% NaCl en 0,1% CaCO .
5 De entcultuur.werd geïnoculeerd in een 200 1 enttank, die 130 1 entmateri-aal van dezelfde samenstelling als boven vermeld, bevatte en gedurende 31 uur bij 30°C met 2^0 tpm geroerd. De tweede entcultuur werd toegepast voor het inoculeren van 3000 1 van fermentatiemedium, dat 1% maïszetmeel, 3% suikerriet, 1% vismeel, 0,005% CuSOj^HgO en 0,1% CaCO^ bevatte. De pro-10 duktietank werd ingesteld op 28° bij lèk tpm met een beluchtingssnelheid van 2000 l/minuut. De pH van de vloeistof steeg geleidelijk met het verloop van de fermentatie en bereikte na 1U0-180 uur 7,7-7,8, waarbij een antibiotische piekactiviteit van 1,7 kcg/ml werd geproduceerd.
Voorbeeld II
15 Isolatie en zuivering van BBM-1675-componenten
De geoogste fermentatievloeistof (3000 1, pH 7,8) werd met behulp van een Sharpless-centrifuge in myceliumkoek en een bovenstaande vloeistof-laag gescheiden. De myceliumkoek werd in 1,600 1 methanol gesuspendeerd en het mengsel gedurende 1 uur geroerd. De onoplosbare materialen werden 20 afgefiltreerd en het methanolische extract werd in vacuum tot k3 1 geconcentreerd. De in de vloeistofbovenlaag verkregen activiteit werd daaruit gewonnen door extractie met 2 x 1000 1 delen n-butanol. De n-butanolextrac-ten en het geconcentreerde methanolextracten werden gecombineerd en azeotro-pisch ingedampt onder zo nu en dan toevoeging van water aan een waterige 25 oplossing (20 l) waaruit het grootste deel van de antibiotische activiteit als een olieachtige vaste stof werd neergeslagen. De vaste stof werd in 30 1 methanol opgenomen en onoplosbaar materiaal werden door filtratie verwijderd. Het methanolextract werd dan in vacuum tot een 10 1 oplossing geconcentreerd, waaraan HO 1 ethylacetaat en 30 1 water werden toegevoegd.
30 Nadat gedurende 30 minuten was geroerd werd de organische laag afgescheiden, op natriumsulfaat gedroogd en in vacuum tot k 1 ingedampt. Na toevoeging van het concentraat aan 20 1 n-hexaan verkreeg men een lichtgele vaste stof van ruw BBM-1675-complex (90,1^ g, activiteit: 55 mcg/mg). Het complex bestond volgens TLC uit een mengsel van twee hoofdcomponenten, BBM-1675 A^ en 35 Ag, en verschillende ondergeschikte componenten. Deze werden afgescheiden en gezuiverd door herhaalde chromatografie, dat in een gekoeld vertrek werden uitgevoerd om ontleding te voorkomen.
8401572 -55-
Het BBM-1675-complex (20 g) werd in methanol (20 ml) opgelost en in een kolom van Sephadex LH-20 (5,5 x 85 cm) geladen. De kolom werd met methanol ontwikkeld en de elutie gevolgd door biolanalyse onder toepassing van Staphylococcus aureus. 2Q9P. De actieve eluaten werden gecombineerd, in 5 vacuum geconcentreerd en gelyofiliseerd, waarbij een half-zuivere vaste stof van het BBM-1675-complex (i+,19 g) werd verkregen. De vaste stof werd vervolgens gechromatografeerd over een kolom van silicagel (0 5,0 x 50 cm) met chloroform plus een toenemende hoeveelheid (1 — 5% v/v) van methanol als eluenten.
10 De eluaten werden verzameld op basis van antibacteriële activiteit (vs. £3. aureus) en TLC (SiOgj CH^Cl^-CH^OH =5:1 v/v) en onder vacuum geconcentreerd. Nagenoeg homogeen BBM-1675 (opbrengst na indampin: 351 mg) werd eerst geëlueerd met 2% methanol in chloroform en daarna een mengsel van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (507 mg) gevolgd door een BBM-1675 B-mengsel 15 (210 mg) met 3%'s methanol in chloroform. De vaste stof van BBM-1675 A^ werd aangebracht op een kolom van Sephadex LH-20 {φ 2,0 x 80 cm), die met methanol werd ontwikkeld. De actieve fracties werden onder vacuum tot droge toestand geconcentreerd en het vaste residu uit methanol gekristalliseerd, waarbij kleurloze plaatjes van zuiver BBM-1675 A^ (12¾ mg) werden verkre-20 gen (dit materiaal is het uitgangsmateriaal voor voorbeeld IIIA). Het complex BBM-1675 Ag, A3 en A^ werd afgescheiden door chromatografie over een kolom van Bondapak C^g (Waters, φ 3,0 x 50 cm). De elutie werd uitgevoerd met waterig acetonitril en de bioactieve eluaten werden onderzocht door TLC (Merck, 1gesilaniseerd: CH^CN-HgO = 75:25 v/v). De ondergeschikte com-25 ponenten A^ (33 mg) en Ag (18 ml) werden achtereenvolgens in die volgorde geëlueerd met 20%'s acetonitril, gevolgd door een andere hoofdcomponent Ag (301 mg) (dit materiaal is het uitgangsmateriaal voor voorbeeld IIIB) met 50%'s acetonitril.
De vaste stof die BBM-1675 B^ en Bg bevatte werd gechromatografeerd 30 over een kolom van silicagel {φ 3,0 x Uo cm) met chloroform en methanol als ontwikkelingsoplosmiddel. De actieve fracties geëlueerd met k%'s methanol in chloroform werden gecombineerd en ingedampt, waarbij zuiver BBM-1675 B^ (7 mg) werd verkregen. Een andere actieve fractie werd geëlueerd bij een % concentratie van methanol, waarbij na indamping BBM-1675 Bg (8 mg) werd 35 verkregen.
8401572 C^g omgekeerde fase silicagel -56-
Voorbeeld III
Verdere zuivering van BBM-1675 A^ en A. Zuivering van BBM-1675 A^
Een 2,67 cm inwendige diameter x 75 cm Gleneo-kolom werd gepakt met 5 een suspensie van aan Baker gebonden fase octadecyl (C 18) silicagel (deeltjesafmeting 40 micron) in methanol. De kolom werd verbonden met een mediumdruk HPLC-systeem en in evenwicht gebracht met 1,5 eluent (1+1,6% acetonitril-21,6% methanol-36,8% 0,1 M ammoniumacetaat). Gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 A^ (100,5 mg), verkregen volgens de zuiveringsprocedure 10 van voorbeeld II, werd opgelost in 2 ml acetonitril en in de monsterlus getrokken. Het monster werd op de kolom gepompt. De kolom werd met de bovengenoemde eluent geëlueerd, waarbij fracties van 87 ml werden verzameld.
De eluent werd gevolgd bij 25^· nm en 3^-0 nm. De fracties 55-71 werden gecombineerd en twee maal met 1500 ml aliquots chloroform geëxtraheerd.
15 Het chloroform werd tot droge toestand ingedampt en men verkreeg 89,8 mg van residu C.
Een 1,5 cm inwendige diameter x 20 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van 12 g Woelm silicagel (deeltjesafmeting 60-200 micron).
Het residu C werd in de kolom aangebracht in een chloroformoplossing.
20 De kolom werd met een 500 ml lineaire gradiënt van chloroform tot 10% methanol in chloroform geëlueerd, waarbij - fracties van 20-25 ml werden verzameld. Na analyse volgens TLC over silicagel werden fracties 6-9 verzameld en tot droge toestand ingedampt, waarbij 73 mg van residu D werd verkregen .
25 Een 1,5 cm inwendige diameter x 20 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van 12 g Woelm silicagel (deeltjesafmeting 63-200 micron) in Skellysolve B. Het residu D werd in ongeveer 2 ml CHCl^ opgelost en in de kolom aangebracht. Het chloroform werd vervangen door 25 ml Skellysolve B. De kolom werd daarna geëlueerd met een 500 ml lineaire gradiënt van 30 Skellysolve B tot 60% aceton in Skellysolve B, waarbij fracties van 28-25 ml werden verzameld. De fracties 19-23 werden verzameld en vervolgens drooggedampt onder vorming van 65,6 mg zuiver BBM-1675 A^.
Dit residu was homogeen in drie TLC-systemen (5% methanol in chloroform; 5% methanol in ether; en 50% aceton in Skellysolve B over silica-35 gel) en HPLC (C—18 silicagel-Ul,5% acetonitril:21,5% methanol:37,0% 0,1 M ammoniumacetaat).
8401572 -57-
Gelpermeatiechromatografie met gezuiverd BBM-1675 Α^
Een 2,5 cm inwendige diameter x k5 cm Pharmacia-kolom werd gepakt met een suspensie van Sephadex LH-20 in methanol tot een 33 Λ cm chromato-grafiebed. Gezuiverd BBM-1675 A (ongeveer 120 mg) werd opgelost in 2 ml 5 methanol en overgebracht naar een 2,5 ml monsterreservoir. Het monster werd op de kolom aangebracht en de elutie met methanol gestart met 1,75 ml/minuut, waarbij fracties van 10 ml werden verzameld [Pharmacia FRAC-100 fractieverzamelaar]. De eluent werd gevolg bij 25k nm met een Iscro UA-5 detector. Waargenomen werd, dat BBM-1675 A^ bij Ve/Vt van 0,79-10 0,91 werd geëlueerd (Ve = elutievolume; Vt = bedvolume).
B. Zuivering van BBM-1675 A^
Een 2,65 cm inwendige diameter x 75 cm Glenco-kolom werd gepakt met een suspensie van Baker-gebonden fase-octadecyl (C l8)-silicagel (^0 micron deeltjesafmeting) in methanol. De kolom werd met het mediumdruk ΗΡΙΟ-Ι 5 systeem verbonden en in evenwicht gebracht met 1,5 1 eluent (50% acetoni-tril-20% methanol-30% 0,1 M ammoniumacetaat). Gedeeltelijk gezuiverd BBM-1675 Α^ (76,9 mg), verkregen volgens de procedure van voorbeeld II werd in 2 ml acetonitril opgelost en in de monsterlus getrokken. Het monster werd op de kolom gepompt. De kolom werd met de voomoemde eluent geëlueerd, 20 waarbij fracties van 87 ml werden verzameld. De eluent werd gevolgd bij 25^ en 3^-0 nm. Fracties 31-38 werden samengevoegd en 2 x met 500 ml aliquots chloroform geëxtraheerd. Het chloroform werd drooggedampt en men verkreeg 6598 mg homogeen BBM-1675 Ag.
BBM-1675 Ag was homogeen in 2 TLC-systemen, een 2-d TLC-analyse en 25 HPLC.
Voorbeeld IV
Voorkeursextractiewerkwijze voor BBM-1675 A^
Een ruw fermentaat (6,8 l) verkregen volgens de algemene procedure van voorbeeld I werd overgebracht in een polypropeenemmer (12 cm D top; 30 10 cm D, bodem; 37 cm hoog), aan de bodem voorzien van een kraan. Een gelijk volume chloroform werd toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur goed geroerd met behulp van een CRC-lucht aangedreven roerder. Ongeveer b 1 (1,3 kg) Dicalite (filterhulpmiddel) werd toegevoegd en ingedampt. Het mengsel werd via een dicalite-prop, bevestigd in een nr. 12 Buchmer-trechter, ' 35 gefiltreerd. Het filtraat werd verzameld in een kolf van 19 1 voorzien van een vacuumaftakking (Ace. nr. 5396-06). Het vlies werd met 2 1 chloroform gewassen. Het filtraat werd naar een scheidingstrechter van 20 1 overge- 8401572 -58- bracht, waarin men fasescheiding liet plaatsvinden. De onderste fase (chloroform) werd verwijderd.
Een 2,5 cm inwendige diameter x lO cm Glenco-huis werd gepakt met een suspensie van 91 g Woelm silicagel (deeltjes van 63-200 micron). On-5 der toepassing van een FMI RPY-2CSD pomp werd de voornoemde ehloroformfase door de kolom gepompt. De kolom werd met 600 ml vers chloroform gespoeld.
De chloroformeluent werd afgevoerd. De kolom werd vervolgens met 600 ml 10%'s methanol in chloroform geëlueerd. Deze eluent werd tot droge toestand ingedampt en men verkreeg 5^7 mg van residu A.
10 Residu A werd in 50 ml chloroform opgelost. De chloroformoplossing werd aan 20 g Dicalite in een rondhodemkolf van 1 1 overgebracht. Door toevoeging van ongeveer 200 ml Skellysolve B werd een suspensie gevormd.
De oplosmiddelen werden in een roterende verdamper gebracht. Het residu werd in 300 ml Skellysolve B gesuspendeerd. De suspensie werd via de vol-15 gende procedure in een Ace-kolf-chromatografiebuis (deel nr. 8B5ÖT2—1U) (41 mm inwendige diameter x U5,7 cm) gepakt. In de hals van de kraan tussen de kraan en de kolombuis werd een glaswolprop aangebracht. Boven het glaswol werd een laag van 1 cm standaard Ottawa-zand ingebracht. De kraan, het glaswol en het zandbed werden van lucht gezuiverd door een'vooraf onder 20 druk gebrachte (5,7 psi) stroom van Skellysolve B door te leiden. De suspensie werd vervolgens aan de kolom toegevoegd en door een drukstroom tot een gepakt bed gevormd. Men liet de kolom nooit droog worden.. Nadat een stabiel kolombed was verkregen, werd op de top van het bed een laag van 2 cm Ottawa-zand aangebracht. Het bed werd dan geëlueerd met extra 600-700 ml 25 Skellysolve B. Het bed werd met 500 ml tolueen geëlueerd. De tolueeneluent werd drooggedampt en men verkreeg 93 mg van residu B. Dit gedeeltelijk gezuiverde BBM-1675 A kan dan verder volgens de procedure van voorbeeld III worden gezuiverd.
Voorbeeld V
30 Fermentatie van BBM-1675-complex onder toepassing van variant H96^-92-A1327Y Een variantstam A1327Y, verkregen door NTG-behandeling van een Actinomadura verrucosospora stam nr. H-96U-92, werd toegepast voor het inoculeren van vegetatief medium, dat 2$ oplosbare zetmeel, 1% glucose, 0,5% gistextract, 0,5% ÏÏB-amine-type A en 0,1% CaCO^ bevatte, waarbij de pH v6or 35 sterilisatie op 7,0 werd ingesteld. De vegetatieve cultuur werd gedurende dagen op een roterende schudinrichting (250 tpm) bij 32°C geïncubeerd en 5 ml van de kweek overgebracht in een 500 ml Erlenmeyerkolf, die 100 ml 8401572 #' -59- fermentatiemedium bevatte, bestaande uit 3# suikerriet, \% maïszetmeel, 1# vismeel, 0,005# CuS0^.5H20, 0,05# MgSO^.T^O en 0,1# CaC03, waarbij de pH vóór sterilisatie op 7,0 werd ingesteld.
De fermentatie werd gedurende 7 dagen bij 28°C op de roterende schud-5 inrichting uitgevoerd. De produktie van antibioticum bereikte een maximum van ca 1,5 mcg/ml.
Voorbeeld VI
Isolering en zuivering van BBM-1675-componenten
De geoogste fermentatievloeistof van voorbeeld V (3000 1, pH 7,6) 10 werd gescheiden in myceliumkoek en een bovenstaande vloeistof door toepassing van een Sharpless-centrifuge. De myceliumkoek werd met 2000 1 methanol gedurende êén uur geroerd en het onoplosbare materiaal door filtratie verwijderd. De in de bovenstaande vloeistof aanwezige actieve component werd daaruit met 1.800 1 n-butanol geëxtraheerd. De methanol en n-butanolextrac-15 ten werden gecombineerd en azeotropisch door nu en dan toevoegen van water tot een waterige oplossing (20 l) geconcentreerd, waaruit het grootste deel van het actieve antibioticum werd neergeslagen als een olieachtige vaste stof. Het mengsel werd 3 x met 20 1 ethylacetaat geschud om de actieve component te extraheren. De extracten werden verzameld, gefiltreerd ter ver-20 wijdering van het onoplosbare materiaal en in vacuum tot 1+ 1 ingedampt.
Na toevoeging van het concentraat aan 30 1 n-hexaan onder roeren verkreeg men een lichtgele vaste stof van ruw BBM-1675-complex (81,7 g, activiteit: 59 mcg/mg). Volgens TLC en HPLC bestond het complex uit een mengsel van twee hoofdcomponenten, BBM-1675 A^ en A2 en verschillende ondergeschikte 25 componenten. Deze werden afgescheiden en gezuiverd via een reeks chromato-grafiebehandelingen, die in een koud vertrek werden uitgevoerd om ontleding te voorkomen.
Het ruwe BBM-1675-complex (20 g) werd in methanol (20 ml) opgelost en geladen op een kolom van Sephadex LH-20 (φ 5,5 x 85 cm). De kolom werd 30 ontwikkeld met methanol en de elutie gevolgd door bioanalyse onder toepassing van Staphylococcus aureus 209P. De actieve eluaten werden verzameld, in vacuum geconcentreerd en gelyofiliseerd, waarbij een half-zuivere stof van het BBM-1675-complex werd verkregen (1+,86 g, activiteit: 203 mcg/mg).
De vaste stof werd vervolgens over een kolom van silicagel (¢5 3,0 x 70 cm) 35 gechromatografeerd onder toepassing van chloroform en een toenemende hoeveelheid (1-5#) methanol als ontwikkelingsoplosmiddelen. De eluaten werden verzameld op basis van antibacteriële activiteit tegen _S. aureus en TLC
8401572 -60- (Si02, CHCl^-MeOH =5:1, v/v) en in vacuum geconcentreerd.'Het BBM-1675 A^ (1+25 mg na indamping, activiteit: 960 mcg/mg) werd eerst geëlueerd met 2$ methanol in chloroform en vervolgens een mengsel van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (732 mg, activiteit: 3^+0 mcg/mg) gevolgd door BBM-1675 B-complex (200 mg, 5 activiteit: 190 mcg/mg) met 3$’s methanol in chloroform. Het "bovengenoemde BBM-1675 A^ werd opnieuw over silicagel gechromatografeerd (kolom: φ 2,0 x 1+1+ cm) met 2% methanol in henzeen. De bioactieve eluaten werden geanalyseerd volgens HPLC (Lichrosorb HP-18: CH^N-MeOH-0,1M CH COONH^ = 5:2:3, v/v) en de fracties die homogeen BBM-1675 A^ bevatten werden in vacuum tot droge 10 toestand ingedampt. De restvaste stof werd gekristalliseerd uit methanol (10 ml) en men verkreeg kleurloze prisma’s van BBM-1675 A^ (197 mg, activiteit: 1000 mcg/mg).
Het complex van BBM-1675 Ag, A^ en A^ (537 mg) werd gescheiden door kolomchromatografie over Bondapak C^g (Waters, Φ 2,0 x 1+2 cm). De elu-15 tie werd uitgevoerd met waterig acetonitril en de bioactieve eluaten werden onderzocht met TLC (Merck, gesilaniseerd: CH CN-Ho0 = 75:25, v/v).
3 k
De ondergeschikte componenten BBM-1675 A^ (1+5 mg, activiteit: 1+10 mcg/mg) en Ag (10 mg, activiteit: 300 mcg/mg) werden achtereenvolgens met 20$ acetonitril geëlueerd, gevolgd door een hoofdcomponent, BBM-1675 A^ 20 (203 mg) met 50$ acetonitril. De BBM-1675 Ag-fractie wrrd gekristalliseerd uit chloroform-n-hexaan, waarbij kleurloze staafjes werden neergeslagen (70 mg, activiteit: 290 mcg/mg). De vaste stof die het BBM-1675 B-mengsel bevatte werd gechromatografeerd over een kolom van silicagel {φ 3,0 x 1+0 cm) met chloroform en methanol als ontwikkelingsoplosmiddel. De actieve frac-25 ties, geëlueerd met l+$’s methanol in chloroform werden verzameld en ingedampt en men verkreeg zuiver BBM-1Ö75 B^ (7 mg, activiteit: 180 mcg/mg).
Een andere actieve fractie werd geëlueerd bij een methanolconcentratie, en leverde na indamping BBM-1675 Bg (8 mg, activiteit: 1U0 mcg/mg).
8401572
Claims (26)
1. Anti-tumor antibioticum BBM-1675 A^ dat in nagenoeg gezuiverde vorm (a) het uiterlijk heeft van witte tot lichtgele kristallen; (b) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, in lichte mate oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in 5 n-hexaan en koolstoftetrachloride; (c) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens-reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe-ven; (d) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) vertoont, zoals in wezen 10 getoond in fig. 9; (e) indien opgelost in CDCl^ een magnetisch protonkernresonantie-spectrum geeft, zoals in wezen getoond in fig. 10; (f) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 156—15Ö°C; (g) een optische rotatie heeft van [a]^ = -191° (c 0,5, CHCl^); 15 (h) een schijnbaar molecuulgewicht heeft van 12U8 als bepaald vol gens. massaspectroscopie; (i) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 52,17$ koolstof, 6,15$ waterstof, 63$ stikstof, 9*09$ zwavel en 27,96$ (door verschil) zuurstof; 20 (j) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van Γ 0,7^ met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en in omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,18 met een oplosmi d-delsysteem CH3CN-H20 (75=25 v/v) bezit; (k) bij oplossing in methanol in een concentratie van 0,01356 g/1 25 de volgende ultraviolette absorptiemaxima en absorpties vertoont: \ (nm) Λ max_ Absorpties 320 12,U 280 schouder 253 25,1 30 210 25,5 zonder significante verandering bij toevoeging van zuur of base; (l) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 13,3 minuten met een C g-omgekeerde fasesilicagelkolom en een oplosmiddel- 8401572 -62- systeem C^CN-C^OH-O,IM-CH^OONH^ (5:2:3 v/v) vertoont; (m) effektief is voor het remmen van de groei van verschillende bacteriën en schimmels; (n) profaag induceert in lysOgene bacteriën; en 5 (o) effektief is voor het remmen van de groei van P-3Ö8 leukemie, L-1210 leukemie, B16 melanoma en Lewis-longcarcinoom bij muizen.
2. Anti-tumor-antibioticum BBM-1Ö75 , dat in nagenoeg gezuiverde vorm: (a) de vorm heeft van witte kristallen; 10 (b) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; (c) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens-reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe- 15 ven; (d) een infraroodabsorptiespeetrum (KBr) vertoont zoals in wezen voorgesteld in fig. 12; (e) na oplossing in CDCl^ een magnetische proton kernresonantie-epectrum geeft, zoals in wezen aangegeven in fig. 13; 20 (f) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer lVjT-1^9°C; 27 (g) een optische rotatie heeft van {a]^ = -179,1* (c 0,5, CHCl^); (h) een schijnbaar molecuulgewicht heeft van 12^8, zoals bepaald volgens massaspectroscopie; (i) een benaderde elementaire samenstelling heeft van ongeveer 25 52,71$ koolstof, 5,9^$ waterstof, 3,9*1$ stikstof, 9,39$ zwavel en 28,1$ (door verschil) zuurstof; (j) in dunnelaag silicagelchromatografie een R_-waarde van 0,71 met £ het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (25:1 v/v) en in omgekeerde fasesilica- geldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,21 met het oplosmiddel- £ 30 systeem CH^OH-H^O (75:25 v/v) bezit; (k) bij oplossing in methanol in een concentratie van 0,02052 g/1 de volgende ultraviolet-absorptiemaxima en absorpties vertoont: 8401572 -63- ^ max Absorpties 320 12,2 282 16,3 282 26,2 5 25,8 zonder significante verandering bij toevoeging van zuur of base; (1) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 1TS3 minuten vertoont met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplosmiddelsysteem CH^N-CI^OH-O,1M CHgCOONH^ (5:2:3 v/v); 10 (m) het actief is in het remmen van de groei van verschillende bac teriën en schimmels; (n) profaag induceert in lysogene bacteriën; en (o) effektief is in het remmen van de groei van P-388 leukemie,
15 L—1210 leukemie, B16 melanoma en Lewis longcarcinoom bij muizen.
3. Anti-tumor-antibioticum BBM-16T5 A3, dat (a) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; 20 (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride. Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antron-proeven; (c) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) vertoont, zoals in wezen voorgestel! in fig. 3; 25 (d) bij oplossing in CDC13 een magnetisch protonkernresonantiespec- trum geeft zoals in wezen getoond in fig. 7; (e) een smeltpunt heeft in een traject van ongeveer 125-127°C; 2*7 q een optische rotatie heeft van [α]^ = -I61 (c 0,5, CHC13); (g) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 5^355% kool-30 stof, 6,k6% waterstof, 3,73% stikstof, 7S^9% zwavel en 27,77% (door verschil) zuurstof; (h) in silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit van 0,72 met het oplosmiddelsysteem CHC13-CH30H (5:1 v/v) en in omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^,-waar de van 0,28 met het oplosmid- Γ 35 delsysteem CI^CN-HgO (75:25 v/v) bezit; (i) bij oplossing in methanol de volgende ultraviolet absorptiemaxi-ma geeft 0,01N HCl-CH^H en 0,01N NaOH-CE^OH 8401572 -6k- ÜV \v nm (E** ) : 253 (286) max lcm in methanol 282 (158) 320(122) 07 Ό : 253 (287.> in 0.01N HC1-CH30H 282 (160) 320 (126) w nm . ! 252 l280) in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (162) 318 (120) ; (j) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografieretentietijd van 8,0 minuten geeft met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplos-middelsysteem CHgCN-CHgOH-O,1M CïïgCOONH^ (5:2:3 v/v); (k) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-5 teriën en schimmels; (l) profaag induceert in lysogene bacteriën; en --------------- (m) effektief is in het remmen van de groei van P-388 leukemie bij muizen.
10 U. Anti-tumor-antibioticum BBM-1675 dat: (a) oplosbaar is in chlorform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigs zins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride. Erlich en Tollens 15 reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproe- ven; (c) een infraroodabsorptiespectrum (KBr) geeft zoals in wezen getoond in fig. H; (d) bij oplossing in CDCl^ een magnetisch protonkernresonantiespec-20 tra vertoont, zoals in wezen voorgesteld in fig. 8; (e) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 123-126°C; (f) een optische rotatie heeft van [a]^ = -1j60 (c 0,5, CHClg); (g) een elementaire samenstelling heeft van ongeveer 5)+,65% kool- 8401572 -65- stof, 6,29% waterstof, 3,51% stikstof, 8,07% zwavel en 27,^8% (door verschil) zuurstof; (h) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit Γ van 0,71 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (25,1 v/v) en in omgekeer-5 de fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R -waarde van 0,78 met het Γ oplosmiddelsysteem CHgCN-HgO (75:25 v/v) bezit; (i) de volgende ultraviolet absorptiemaxima vertoont bij oplossing in methanol, 0,01N HCl-CH^H en 0,01N Na0H-CH30H m tEiL> : 253 ‘258> in 0.01N HC1-CH30H 282 (155) 320 (118) Xmax n” 'O : 252 <2««> in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (160) 318 (118) ; ov Nnax nm (Eïom) ! 253 <257> in methanol 282 (153) . 320 (117) (j) een hoge capaciteitsvloeistofchromatografie-retentietijd van 10 5,1 minuut vertoont met een C^g omgekeerde fase-silicagelkolom en het oplosmiddelsysteem CH2CN-CH30H-0,1M CHgCOONH^ (5:2:3 v/v); (k) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bacteriën en schimmels; (l) profaag induceert in lysogene bacteriën; en 15 (m) effektiefis in het remmen van de groei van P-388 leukemie bij muizen.
5. Anti-tumor-antibioticum BBM-1675 dat: (a) oplosbaar is in hcloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n-hexaan 20 en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi- ninhydrine en antronproe-ven; 8401572 -66- (c) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 159—161°C; (d) een optische rotatie heeft van [a]j^ -171° (c 0,5, CHCl^); (e) in silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde hezit van 0,63 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en volgens omgekeer- 5 de fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,23 met het oplosmiddelsysteem CH^CN-ïïgO (75:25 v/v) bezit; (f) de volgende ultravioletabsorptiemaxima vertoont bij oplossing in methanol, 0,01N HC1-CH OH en 0,01N NaOH-CH OH DV \nax “ (8i«> : 253 12251 in methanol 282 (140) 320 (104) 07 niïl <Eicm> : 253 12251 in 0.01N HCl-CH3OH 282 (140) 320 (105) m Xmax 9« ‘Bïa> 8 252 12361 in 0.01N NaOH-CH3OH 283 (141) 318 (105) ; (g) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-10 teriën en schimmels; en (h) profaag induceert in lysogene bacteriën.
6. Anti-txmior-antibioticum BBM-1675 B^, dat: (a) oplosbaar is in chloroform, ethylacetaat, aceton, ethanol en methanol, enigszins oplosbaar in benzeen en water en onoplosbaar in n- 15 hexaan en koolstoftetrachloride; (b) een positieve reactie geeft met ferrichloride, Erlich en Tollens reagentia en een negatieve reactie in Sakaguchi, ninhydrine en antronproeven; (c) een smeltpunt heeft in het traject van ongeveer 15β-159°0; (d) een optische rotatie heeft van [a]^ -122° (c.0,5, CHCl^); 20 (e) volgens silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde bezit van 0,60 met het oplosmiddelsysteem CHCl^-CH^OH (5:1 v/v) en volgens omgekeerde fase-silicagel-dunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,16 met 8401572 -67- het oplosmiddelsysteem CH^CN-HgO (75:25 v/v) “bezit; (f) de volgende ultraviolet absorptiemaxima geeft bij oplossing in methanol, 0,0W HCl-CH^H en 0,011 NaOH-CH^OH UV Ly nm (E1'ij : 248 (212) max lcm in methanol 279 (141) 318 (103)
07 Xmax nm (ElL> = 248 ‘210) in 0.01N HCl-CH3OH 279 (140) 318 (103) «V ^ » <b“,J = 2« (233) .in 0.01N NaOH-CH3OH 278 (150) 318 (110) ; (g) effektief is in het remmen van de groei van verschillende bac-5 teriën en schimmels; en (h) profaag induceert in lysogene bacteriën.
7. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^, met het kenmerk, dat een BBM-1675 -producerende stam van Aetinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare bronnen 10 van koolstof en stikstof bevat onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen.
8. Werkwijze volgens conclusie 7S met het kenmerk, dat het BBM-1675 A^-15 producerende organisme de identificatie-eigenschappen heeft van de stam Aetinomadura verrucosospora H96U-92 (ATCC 3933^), de stam Aetinomadura verrucosospora A 1327Y (ATCC 39638) of een mutant daarvan,
9. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 Ag met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^-producerende stam van Aetinomadura 20 verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat assimileerbare koolstof en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemde organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke 8401572 * -68- hoeveelheid BBM-1675 is gevormd en vervolgens BBM-1Ö75 A2 uit het cul-tuurmedium wordt gewonnen.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het BBM-1675 Ag-producerende organisme de identificatie-eigenschappen heeft van
5 Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*0. Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638) of een mutant daarvan.
11. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^ met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^,-producerende stam van Actinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat assimileerbare koolstof- 10 en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemde organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen.
12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het BBM-1675 15 A^-producerende organisme de identificerende eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*)·), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.
13. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 A^, met het kenmerk, dat een BBM-1675 A^-producerende stam van Actinomadura 20 verrucosospora in een waterig voedingsmedium met assinileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 A^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 A^ uit het cultuurmedium wordt gewonnen. 25 1*+. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat het BBM-1675 A^-producerende organisme de identificatie eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam H96*+-92 (ATCC 3933*+), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.
15. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675
30 B^ met het kenmerk, dat een BBM-1675 B^-producerende stam van Actinomadura verrucosospora in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd kweekmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 B^ is gevormd en vervolgens BBM-1675 B^ uit het cul-35 tuurmedium wordt gewonnen.
16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het BBM-1675 B^-producerend organisme de identificerende eigenschappen heeft van 8401572 % -69- Actinomadura verrucosospora stam H96U-92 (ATCC 3933^), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.
17. Werkwijze ter bereiding van het anti-tumor-antibioticum BBM-1675 B2 met het kenmerk, dat een BBM-1675 B^-producerende stam van Actinomadura 5 verrucosospora in een waterig voedingsmedium dat. assimileerbare koolstof-en stikstofbronnen bevat, onder submerse aerobe omstandigheden wordt gekweekt tot door genoemd organisme in genoemd cultuurmedium een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1675 Bg.is gewonnen en vervolgens BBM-1675 Bg uit het cultuurmedium wordt gewonnen.
18. Werkwijze volgens conclusie 17» met het kenmerk, dat het BBM-1675 B2-producerende organisme de identificatie eigenschappen heeft van Actinomadura verrucosospora stam Η96^~92 (ATCC 3933^-), Actinomadura verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), of een mutant daarvan.
19. Werkwijze voor de therapeutische behandeling van een dierlijke gast-15 heer, die is aangetast door een microbiële infectie, met het kenmerk, dat aan genoemde gastheer een effektieve antimicrobiële dosis van BBM-1675 , BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B2 wordt toegediend.
20. Werkwijze voor de therapeutische behandeling van een dierlijke 20 gastheer, aangetast door een kwaadaardige tumor, met het kenmerk, dat aan genoemde gastheer een effektieve tumor-remmende dosis wordt toegediend van BBM-1675 Ar BBM-1675 A2, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B .
21. Farmaceutisch preparaat met het kenmerk, dat dit een effektieve 25 antimicrobiële hoeveelheid omvat van BBM-1675 A^, BBM-1675 A2, BBM-1675 A3» BBM-1675 A^, BBM-1675 B^ of BBM-1675 Bg in combinatie met een farmaceutische drager of verdunningsmiddel.
22. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit een effektieve tumorremmende hoeveelheid van BBM-1675 A^, BBM-1675 Ag, BBM-1675 A3, BBM-1675 A^, BBM-1675 B1 of BBM-1675 B2 in combinatie met een farmaceu- 30 tische drager of verdunningsmiddel.
23. Biologisch zuivere cultuur van het micro-organisme Actinomadura verrucosospora stam H96^-92 (ATCC 3933^·) , welke cultuur in staat is bij kweken in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen bevat een aanzienlijke hoeveelheid van het antibioticum BBM- 35 1675 te leveren. 2k. Biologisch zuivere cultuur van het micro-organisme Actinomadura 8401572 -70- verrucosospora stam A1327Y (ATCC 39638), welke cultuur in staat is bij kweken in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare koolstof- en stik-stofbronnen bevat, een aanzienlijke hoeveelheid van het antibioticum BBM-1675 te leveren. 8401572
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49523183A | 1983-05-16 | 1983-05-16 | |
| US49523183 | 1983-05-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8401572A true NL8401572A (nl) | 1984-12-17 |
Family
ID=23967812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8401572A NL8401572A (nl) | 1983-05-16 | 1984-05-16 | Antibiotica. |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS59232094A (nl) |
| KR (2) | KR840008817A (nl) |
| AT (1) | AT393691B (nl) |
| AU (1) | AU569294B2 (nl) |
| BE (1) | BE899667A (nl) |
| CA (1) | CA1241282A (nl) |
| CY (1) | CY1465A (nl) |
| DE (1) | DE3418023A1 (nl) |
| DK (1) | DK163127C (nl) |
| ES (1) | ES8700267A1 (nl) |
| FI (1) | FI81114C (nl) |
| FR (1) | FR2547594B1 (nl) |
| GB (1) | GB2141425B (nl) |
| GR (1) | GR81581B (nl) |
| HK (1) | HK9889A (nl) |
| HU (1) | HU193928B (nl) |
| IE (1) | IE57444B1 (nl) |
| IL (1) | IL71824A (nl) |
| IT (1) | IT1175498B (nl) |
| KE (1) | KE3846A (nl) |
| LU (1) | LU85362A1 (nl) |
| NL (1) | NL8401572A (nl) |
| NZ (1) | NZ208013A (nl) |
| PT (1) | PT78590A (nl) |
| SE (1) | SE460364B (nl) |
| SU (1) | SU1344249A3 (nl) |
| YU (1) | YU43846B (nl) |
| ZA (1) | ZA843591B (nl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR78648B (nl) * | 1982-07-26 | 1984-09-27 | Bristol Myers Co | |
| IL79519A0 (en) * | 1985-08-27 | 1986-10-31 | Bristol Myers Co | Bbm-1675c and d antitumor antibiotics |
| US4837206A (en) * | 1987-04-29 | 1989-06-06 | Bristol-Myers Company | Esperamicin derivatives |
| US4996305A (en) * | 1988-02-29 | 1991-02-26 | American Cyanamid Company | Process for producing the antibiotic and antitumor agents LL-E33288.epsilon.ε-Br |
| CA2027601A1 (en) * | 1989-11-06 | 1991-05-07 | Koko Sugawara | Antitumor antibiotic bu-3983t |
| CA3213700A1 (en) * | 2021-03-17 | 2022-09-22 | Nissui Corporation | Method of purification and purified products |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4195079A (en) * | 1979-01-31 | 1980-03-25 | Pfizer Inc. | New polycyclic ether antibiotic |
| JPS56113791A (en) * | 1980-02-15 | 1981-09-07 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Novel antibiotic and its preparation |
| GR78648B (nl) * | 1982-07-26 | 1984-09-27 | Bristol Myers Co | |
| US4539203A (en) * | 1984-11-13 | 1985-09-03 | Warner-Lambert Company | CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use |
-
1984
- 1984-05-01 NZ NZ208013A patent/NZ208013A/en unknown
- 1984-05-08 GR GR74646A patent/GR81581B/el unknown
- 1984-05-08 AU AU27791/84A patent/AU569294B2/en not_active Ceased
- 1984-05-08 CA CA000453762A patent/CA1241282A/en not_active Expired
- 1984-05-11 ZA ZA843591A patent/ZA843591B/xx unknown
- 1984-05-11 FI FI841906A patent/FI81114C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-05-14 ES ES532476A patent/ES8700267A1/es not_active Expired
- 1984-05-14 IL IL71824A patent/IL71824A/xx unknown
- 1984-05-15 GB GB08412368A patent/GB2141425B/en not_active Expired
- 1984-05-15 SU SU843744582A patent/SU1344249A3/ru active
- 1984-05-15 DE DE19843418023 patent/DE3418023A1/de active Granted
- 1984-05-15 DK DK239784A patent/DK163127C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 IE IE1200/84A patent/IE57444B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 BE BE0/212942A patent/BE899667A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 IT IT20928/84A patent/IT1175498B/it active
- 1984-05-15 LU LU85362A patent/LU85362A1/fr unknown
- 1984-05-15 HU HU841877A patent/HU193928B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 FR FR8407477A patent/FR2547594B1/fr not_active Expired
- 1984-05-15 SE SE8402619A patent/SE460364B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 PT PT78590A patent/PT78590A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 KR KR1019840002636A patent/KR840008817A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-05-16 AT AT0160984A patent/AT393691B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 YU YU849/84A patent/YU43846B/xx unknown
- 1984-05-16 NL NL8401572A patent/NL8401572A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-05-16 JP JP59096758A patent/JPS59232094A/ja active Granted
-
1988
- 1988-11-21 KE KE3846A patent/KE3846A/xx unknown
-
1989
- 1989-02-02 HK HK98/89A patent/HK9889A/xx unknown
- 1989-05-04 KR KR1019890006047A patent/KR920001366B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-07-21 CY CY1465A patent/CY1465A/xx unknown
- 1989-08-24 JP JP1216009A patent/JPH02128693A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4675187A (en) | BBM-1675, a new antibiotic complex | |
| YOSHIDA et al. | A novel antifungal antibiotic, fr-900848 i. production, isolation, physico-chemical and biological properties | |
| US4518589A (en) | BBM-2478 Antibiotic complex | |
| EP0095154B1 (en) | Biologically active ws 6049 substances, a process for the production thereof and their pharmaceutical compositions | |
| HU184256B (en) | Process for producing citostatic antibiotic complexes | |
| NL8401572A (nl) | Antibiotica. | |
| NL8501708A (nl) | Antitumor antibioticum. | |
| US4916065A (en) | BU-3420T Antitumor antibiotic | |
| US4360458A (en) | Antitumor antibacterial agents | |
| KR920001448B1 (ko) | Bbm-2478 항생제 착화합물 | |
| Mizutani et al. | STUDIES ON THE IONOPHOROUS ANTIBIOTICS. XXIV LEUSERAMYCIN, A NEW POLYETHER ANTIBIOTIC PRODUCED BY STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS | |
| US4572895A (en) | Process for preparing an antibiotic complex by culturing actinomyces strain ATCC 39417 | |
| US4708872A (en) | Antitumor antibiotic complex | |
| CA2351222A1 (en) | Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical | |
| US4868117A (en) | BBM-1675, a new antitumor antibiotic complex | |
| US4451456A (en) | Antitumor antibacterial agents | |
| US4780416A (en) | Microorganism for BBM 928 production | |
| US5116845A (en) | BU-3420T antitumor antibiotic | |
| US4952572A (en) | BU-3420T antifungal antibiotic | |
| US5639735A (en) | Antitumor antibiotic compounds: hayumicins and analogs thereof | |
| JPS60226892A (ja) | 抗腫瘍剤 | |
| KR100489914B1 (ko) | 고추 역병균에 항균활성을 갖는 신규 레체발리에리아 에어로콜로니제네스 ｖｋ-ａ9 균주 및 이 균주로부터생산되는 신규 항생물질의 제조방법 | |
| CH663155A5 (en) | Antitumour antibiotics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| DNT | Communications of changes of names of applicants whose applications have been laid open to public inspection |
Free format text: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY |
|
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BV | The patent application has lapsed |