FI81114B - Foerfarande foer framstaellning av antibiotika bbm-1675 a1, a2, a3, a4 och b1 och b2 med antitumoerverkan. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av antibiotika bbm-1675 a1, a2, a3, a4 och b1 och b2 med antitumoerverkan. Download PDFInfo
- Publication number
- FI81114B FI81114B FI841906A FI841906A FI81114B FI 81114 B FI81114 B FI 81114B FI 841906 A FI841906 A FI 841906A FI 841906 A FI841906 A FI 841906A FI 81114 B FI81114 B FI 81114B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- bbm
- methanol
- silica gel
- ch3oh
- chcl
- Prior art date
Links
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 323
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 102
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 62
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 62
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 claims description 48
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 37
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 34
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 32
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 25
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 21
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 230000009102 absorption Effects 0.000 claims description 18
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 15
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 15
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 15
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 14
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 241000201778 Actinomadura verrucosospora Species 0.000 claims description 13
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 13
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 13
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 11
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- GRONZTPUWOOUFQ-UHFFFAOYSA-M sodium;methanol;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OC GRONZTPUWOOUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 claims description 5
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 claims description 4
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical compound ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims 4
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 claims 3
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 2
- 101100083446 Danio rerio plekhh1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 claims 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 54
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 37
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 27
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 26
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 17
- DRSHXJFUUPIBHX-UHFFFAOYSA-N COc1ccc(cc1)N1N=CC2C=NC(Nc3cc(OC)c(OC)c(OCCCN4CCN(C)CC4)c3)=NC12 Chemical compound COc1ccc(cc1)N1N=CC2C=NC(Nc3cc(OC)c(OC)c(OCCCN4CCN(C)CC4)c3)=NC12 DRSHXJFUUPIBHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 14
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 10
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 8
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 8
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 description 8
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 5-{5-[2-chloro-4-(4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-yl)phenoxy]pentyl}-3-methylisoxazole Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1Cl FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 6
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 6
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- -1 acetyl nitrile Chemical class 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 4
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 4
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 3
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 3
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 3
- ZYVSOIYQKUDENJ-UHFFFAOYSA-N [6-[[6-[4-[4-(5-acetyloxy-4-hydroxy-4,6-dimethyloxan-2-yl)oxy-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-7-(3,4-dihydroxy-1-methoxy-2-oxopentyl)-4,10-dihydroxy-3-methyl-5-oxo-7,8-dihydro-6h-anthracen-2-yl]oxy]-4-(4-hydroxy-5-methoxy-6 Chemical compound CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(OC(C)=O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1OC(C)=O)CC1OC1CC(O)C(OC)C(C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 3
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000006877 oatmeal agar Substances 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 3
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 3
- 239000007196 tryptone yeast extract agar Substances 0.000 description 3
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UQZSVIGPZAULMV-DKWTVANSSA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N Compound IV Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1 FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000544912 Melanoides Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000007613 bennett's agar Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 2
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M potassium;methanol;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OC CASUWPDYGGAUQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001004 secondary ion mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- ABJSOROVZZKJGI-OCYUSGCXSA-N (1r,2r,4r)-2-(4-bromophenyl)-n-[(4-chlorophenyl)-(2-fluoropyridin-4-yl)methyl]-4-morpholin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide Chemical compound C1=NC(F)=CC(C(NC(=O)[C@H]2[C@@H](C[C@@H](CC2)N2CCOCC2)C=2C=CC(Br)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1 ABJSOROVZZKJGI-OCYUSGCXSA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJVXUVWGSCCGHT-GGJBBHSUSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;(3s,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO PJVXUVWGSCCGHT-GGJBBHSUSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-JRTVQGFMSA-N (2r,3s,4s,5r)-2,4,5,6-tetrahydroxy-3-methoxyhexanal Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-JRTVQGFMSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXGYYDRIMBPOMN-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethoxy)ethoxymethanol Chemical compound OCOCCOCO BXGYYDRIMBPOMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDWRIIDFYSUTDP-UHFFFAOYSA-N 6-methyloxane-2,4,5-triol Chemical group CC1OC(O)CC(O)C1O FDWRIIDFYSUTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000201753 Actinomadura coerulea Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 125000006519 CCH3 Chemical group 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394497 Caenorhabditis elegans toe-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WKAHILKZCKROET-UHFFFAOYSA-N Chromomycin A2 Natural products CCCC(=O)OC1C(C)OC(CC1(C)O)OC2CC(OC3CC(OC4C(Cc5cc6cc(OC7CC(OC8CC(O)C(OC)C(C)O8)C(OC(=O)C)C(C)O7)c(C)c(O)c6c(O)c5C4=O)C(OC)C(C)C(O)C(C)O)OC(C)C3O)OC(C)C2O WKAHILKZCKROET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N L-sorbitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019759 Maize starch Nutrition 0.000 description 1
- 241000014687 Maribacter flavus Species 0.000 description 1
- 238000003820 Medium-pressure liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-UHFFFAOYSA-N O3-methyl-D-galactose Natural products O=CC(O)C(OC)C(O)C(O)CO RMTFNDVZYPHUEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXETZQATVMJCFH-UHFFFAOYSA-N Olivomycin A Natural products COC(C1Cc2cc3cc(OC4CC(OC(=O)C)C(OC5CC(O)C(OC)C(C)O5)C(C)O4)cc(O)c3c(O)c2C(=O)C1OC6CC(OC7CC(OC8CC(C)(O)C(OC(=O)C(C)C)C(C)O8)C(O)C(C)O7)C(O)C(C)O6)C(=O)C(O)C(C)C MXETZQATVMJCFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000961042 Pseudopleuronectes americanus Ice-structuring protein A Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 239000006159 Sabouraud's agar Substances 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WURKLEUBADSHTC-AJVJTBPOSA-N [(2s,3s,4s,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[[(2s,3s)-6-[(2s,4r,5s,6r)-4-acetyloxy-5-[(2r,4r,5r,6r)-4-hydroxy-5-methoxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-3-[(1s,3s,4r)-3,4-dihydroxy-1-methoxy-2-oxopentyl]-8,9-dihydroxy-1-oxo-3,4-dihydro-2 Chemical compound O([C@@H]1[C@H](OC(C)=O)C[C@@H](O[C@@H]1C)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 WURKLEUBADSHTC-AJVJTBPOSA-N 0.000 description 1
- WPLCTUHONLQGIX-TWTCTLMISA-N [(2s,3s,4s,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[(2r,3r,4r,6s)-6-[[(2s,3s)-6-[(2s,4r,5s,6r)-5-acetyloxy-4-[(2r,4r,5r,6r)-4-hydroxy-5-methoxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-3-[(1s,3s,4r)-3,4-dihydroxy-1-methoxy-2-oxopentyl]-8,9-dihydroxy-7-methyl-1-oxo-3,4- Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 WPLCTUHONLQGIX-TWTCTLMISA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 238000002814 agar dilution Methods 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N alpha-D-arabinopyranose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N beta-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 230000025938 carbohydrate utilization Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- OQNGCCWBHLEQFN-UHFFFAOYSA-N chloroform;hexane Chemical compound ClC(Cl)Cl.CCCCCC OQNGCCWBHLEQFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000013022 formulation composition Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- QQFHCCQSCQBKBG-UHFFFAOYSA-N methyl 2-amino-4,5-dimethoxybenzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C=C1N QQFHCCQSCQBKBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- OCOLTXUAPMAMPP-AJVJTBPOSA-N olivomycin A Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(=O)C(C)C)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 OCOLTXUAPMAMPP-AJVJTBPOSA-N 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJMBCXLDXJUMFB-UHFFFAOYSA-K trisodium;5-oxo-1-(4-sulfonatophenyl)-4-[(4-sulfonatophenyl)diazenyl]-4h-pyrazole-3-carboxylate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=NN(C=2C=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)C(=O)C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 UJMBCXLDXJUMFB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1 81114
Menetelmä kasvainten vastaisten antibioottien BBM-1675 A3, A2, a3, a4 ja Bt ja B2 tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmä kasvainten vastais-5 ten antibioottien BBM-1675 A1# A2, A3, A4, B3 ja B2 tuottamiseksi, jolloin komponentilla BBM-1675 Ax on seuraavat ominaisuudet: (a) se muodostaa valkoisesta vaaleankeltaiseen vaihtelevia kiteitä, 10 (b) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent-seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (c) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-15 la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (s) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olennaisesti kuvan 9 mukainen, (e) liuotettuna CDCl3:een sillä on olennaisesti 20 kuvan 10 mukainen protonimagneeninen resonanssispektri, (f) sen sulamispiste on noin 156-158 °C, (g) sen optinen kiertokyky on [a]” * -191° (c = 0,5, CHC13).
(h) sen näennäinen molekyylipaino on 1248 massa- 25 spektroskopialla määritettynä, (i) sen alkuainekoostumus on noin 52,17 % hiiltä, 6,15 % vetyä, 4,63 % typpeä, 9,09 % rikkiä ja 27,96 % happea, (j) sen Rf-arvo on 0,74 ohutkerroskromatografiassa 30 silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,18 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (k) liuotettuna metanoliin konsentraationa 0,01356 g/1 sen ultraviolettiabsorption maksimikohdat ja absorp- 35 tiot ovat seuraavat: 2 81114 ^maks(ng|> absorptio 320 12,4 280 olkapää 253 25,1 5 210 25,5 ilman merkitseviä muutoksia lisättäessä happoa tai emästä, (1) sen retentioaika HPLCrssä on 13,3 minuuttia pylväskromatografioitaessa C18-käänteisfaasisilikageelil-10 lä liuotinsysteemillä CH3CN-CH30H-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), komponentilla BBM-1675 A2 on seuraavat ominaisuudet: (a) se muodostaa valkoisia kiteitä, 15 (b) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent-seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hiili tetrakloridiin, (c) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-20 la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (d) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olennaisesti kuvan 12 mukainen, (e) liuotettuna CDCl3:een sillä on olennaisesti 25 kuvan 13 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, (f) sen sulamispiste on noin 147-149 °C, (g) sen optinen kierto on [a]87 - -179,4° (c = 0,5, CHC13), (h) sen näennäinen molekyylipaino on 1248 massa- 30 spektroskopialla määritettynä, (i) sen alkuainekoostumus on noin 52,71 % hiiltä, 5,94 % vetyä, 3,94 % typpeä, 9,39 % rikkiä ja 28,01 % happea, (j) sen Rf-arvo on 0,71 ohutkerroskromatografiässä 35 silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) 3 81114
Ja 0,21 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillö CH3CN-H20 (75:25 t/t), (k) liuotettuna metanoliin konsentraatlona 0,02052 g/1 sen ultravlolettlabsorptlon makslmlkohdat ja absorp- 5 tlot ovat seuraavat:
Amaks(n,) absorptio 320 12,2 282 16,3 282 26,2 10 214 25,8 ilman merkitseviä muutoksia lisättäessä happoa tai emästä, (l) sen retentioaika HPLCrssä on 17,3 minuuttia pylväskromatografioitaessa C18-käänteisfaasisilikageelil- 15 lä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), komponentilla BBM-1675 A3 on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, 20 asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen 25 reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- Ja antronitesteissä, (c) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olennaisesti kuvan 3 mukainen, (d) liuotettuna CDCl3:een, sillä on olennaisesti kuvan 7 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, 30 (e) sen sulamispiste on noin 125-127 ®C, (f) sen optinen kierto on [a]” - -161® (c «= 0,5, CHC13), (g) sen alkuainekoostumus on noin 54,55 % hiiltä, 6,46 % vetyä, 3,73 % typpeä, 7,49 % rikkiä ja 27,77 % 35 happea, 4 81114 (h) sen Rf-arvo on 0,72 ohutkerroskromatografiassa silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,28 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), 5 (i) liuotettuna metanoliin 0,01-n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV nm (Ej*„) :253 (286) metanolissa 282 (158) 10 320 (122) UV Amak. nm (E^J :253 (287) 0,01-n HC1 -CH30H:ssa 282 (160) 320 (126) UV λΒ(*. nm (Ej*B) :252 (280) 15 0,01-n NaOH-CH3OH: ssa 282 (162) 318 (120) (j) sen retentioaika HPLCrssä on 8,0 minuuttia pyiväskromatografiässä C18-käänteisfaasisilikageelillä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 20 t/t), komponentilla BBM-175 A4 on seuraavat ominaisuu det : (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- 25 seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, 30 (c) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olen naisesti kuvan 4 mukainen, (d) liuotettuna CDCl3:een, sillä on olennaisesti kuvan 8 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, (e) sen sulamispiste on noin 123-126 eC, 35 (f) sen optinen kierto on [α]87 * -176° (c - 0,5, 5 81114 CHC13), (g) sen alkuainekoostumus on noin 54,65 % hiiltä, 6,29 % vetyä, 3,51 % typpeä, 8,07 % rikkiä ja 27,48 % happea, 5 (h) sen Rf-arvo on 0,71 ohutkerroskromatografiassa silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,78 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (i) liuotettuna metanoliin 0-01-n HCl-CH30H:hon ja 10 0,01-n NaOH-CHjOH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV X>ak. nm (E^) :253 (257) metanolissa 282 (153) 320 (117) 15 UV λΒ<ϋς. nm (E^) :253 (258) 0,01-n HC1-CH30H:ssa 282 (155) 320 (118) UV Xnak> nm (E^) :252 (266) 0,01-n Na0H-CH30H:ssa 282 (160) 20 318 (118) (j) sen retentioaika HPLC:ssä on 5,1 minuuttia pylväskromatografiässä C18-käänteisfaasisilikageelillä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), 25 komponentilla BBM-1675 Bt on seuraavat ominaisuu det : (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent-seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii- 30 litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (c) sen sulamispiste on noin 159-161 °C, 35 (d) sen optinen kierto on [a]” = -171° (c - 0,5, 6 81114 CHC13), (e) sen Rf-arvo on 0,63 ohutkerroskromatografiassa silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,23 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika- 5 geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (f) liuotettuna metanoliin 0,01-n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n Na0H-CH30H:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV λΒβΚ. nm (E^) :253 (225) 10 metanolissa 282 (140) 320 (104) uv^, nm (E}^) :253 (225) 0,01-n HC1 -CH30H:ssa 282 (140) 320 (105) 15 UV λ nake nm (Ej*n) :252 (236) 0,01-n Na0H-CH30H:ssa 282 (141) 318 (105) ja komponentilla BBM-1675 B2 on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, 20 asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hiili tetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen 25 reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (c) sen sulamispiste on noin 156-159 °C, (d) sen optinen kierto on [α]£7 = -122° (c = 0,5, CHC13), (e) sen Rf-arvo on 0,60 ohutkerroskromatografiassa 30 silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,16 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (f) liuotettuna metanoliin 0-01,n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit 35 ovat seuraavat: i 7 81114 UV nm (E^) :248 (212) metanolissa 279 (141) 318 (103) UV ABak. nm (E^) :248 (210) 5 0,01-n HCl-CH30H:ssa 279 (140) 318 (103) UV xmäka nm (E^) :248 (233) 0,01-n Na0H-CH30H:ssa 278 (150) 318 (110) 10 Käsiteltävänä olevan keksinnön kasvaimia estävien antibioottiyhdisteiden rakennetta ei vielä ole pystytty selvittämään. Mutta yhdisteiden ainutlaatuisten fysikaalisten, kemiallisten ja biologisten ominaisuuksien perusteella uskotaan, että BBM-1675 antibiootit ovat uusia ai-15 neita.
Euroopan patenttijulkaisussa 95154A1 on julkistettu mikro-organismin Actinomadura pulveraceus sp. nov. nro 6049 (ATCC 39100) fermentointi kasvaimien vastaisten, WS 6049-A ja WS 6049-B merkittyjen antibioottien tuottami-20 seksi. WS 6049-antibioottien rakennetta ei ole vielä selvitetty, mutta antibiooteille ilmoitetut tunnusarvot antavat aiheen olettaa, että WS 6049-A ja WS 6049-B saattavat rakenteellisesti olla sukua käsiteltävänä olevan keksinnön BBM-antibiooteille. Mutta spektriarvot osoittavat, 25 ettei WS 6049-A eikä WS 6049-A ole identtinen BBM-1675 komponenttien kanssa. Euroopan patenttihakemuksessa 95154A1 kuvattu tuotanto-organismi voidaan selvästi erottaa käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytetystä Actinomadura verrucososporasta, koska sen ilmamyseelin väri on 30 erilainen ISP-kasvualustoilla nro 2, 3 ja 4, sen maito-peptonisointi on positiivinen ja se pystyy käyttämään D-fruktoosia, D-mannitolia, trehaloosia ja selluloosaa.
Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa uuden kasvainten vastaisen antibioottikomoleksin, josta tässä käy-35 tetään merkintää BBM-1675. Kompleksia tuotetaan keksinnön 8 81114 mukaisesti viljelemällä antibioottikompleksia BBM-1675 tuottavaa Actinomadura verrusosospora-kantaa H964-92, ATCC 39334 tai Actinomadura verrucosospora-kantaa A1327Y, ATCC 39638, vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisäl-5 tää hiilen ja typen yhteyttämiskelpoisia lähteitä, pinnanalaisesta aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu organismi on viljelyalustassa tuottanut olennaisen määrän antibioottikompleksia BBM-1675.
Valinnaisesti kompleksi voidaan eristää viljely-10 alustasta. Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa myös BBM-1675-kompleksin kaksi bioaktiivista pääkomponenttia merkinnällä BBM-1675 A3 ja A2 sekä mainitun kompleksin neljä pienempää bioaktiivista komponenttia merkinnällä BBM-1675 A3, A4, Bt ja B2. Komponentit voidaan erottaa toisistaan 15 ja puhdistaa tavanomaisin kromatografisin menetelmin.
BBM-1675-kompleksilla ja sen bioaktiivisilla komponenteilla on sekä mikrobien vastainen että kasvaimia estävä aktiivisuus.
Piirustusten selitys 20 Kuvio 1 esittää osaksi puhdistetun BBM-1675 A3:n infrapuna-absorptiospektriä (KBr-tabletti).
Kuvio 2 esittää osaksi puhdistetun BBM-1675 A2:n infrapuna-absorptiospektriä (KBr-tabletti).
Kuvio 3 esittää BBM-1675 A3:n infrapuna-absorptio-25 spektiä (KBr-tabletti).
Kuvio 4 esittää BBM-1675 A4:n infrapuna-absorptiospektriä (KBr-tabletti).
Kuvio 5 esittää osaksi puhdistetun BBM-1675 A3:n protonimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (60 30 MHz).
Kuvio 6 esittää osaksi puhdistetun BBM-1675 A2:n protonimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (60 MHz) .
Kuvio 7 esittää BBM-1675 A3:n protonimagneettista 35 resonanssispektriä CDCl3:ssa (60 MHz).
9 81114
Kuvio 8 esittää BBM-1675 A4:n protonimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (60 MHz).
Kuvio 9 esittää puhdistetun BBM-1675 A3:n infrapu-na-absorptiospektriä (KBr-tabletti).
5 Kuvio 10 esittää puhdistetun BBM-1675 A3:n proto nimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (360 MHz).
Kuvio 11 esittää puhdistetun BBM-1675 A3:n ^-magneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (90,3 MHz).
Kuvio 12 esittää puhdistetun BBM-1675 A2:n infra-10 puna-absorptiospektriä (KBr-tabletti).
Kuvio 13 esittää puhdistetun BBM-1675 A2:n protonimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (360 MHz).
Kuvio 14 esittää puhdistetun BBM-1675 A2:n 13C-mag-neettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (90,3 MHz).
15 Tämä keksintö koskee siten uutta kasvainten vas taista antibioottikompleksia, josta tässä käytetään merkintää BBM-1675, ja sen valmistamista fermentoimalla määrättyjä Actinomadura verrucosospora-kantoja, mieluiten Actinomadura verrucososporan kantaa H964-92 ja sen mu-20 tanttia merkinnällä A1327Y. Yllä mainittu peruskanta eristettiin maanäytteestä, jonka keruupaikka oli Pto Es-peranza, Misiones, Argentina. Mikro-organismin biologisesti puhdas viljelmä on talletettu American Type Culture Collection'iin, Washington, D,C., ja liitetty sen pysy-25 vään mikro-organismikokoelmaan numerolla ATCC 39334. Myöhemmin saatiin mutanttikanta käsittelemällä tavalliseen tapaan kantaa H964-92 nitrosoguanidiinilla (NTG). Mutanttikanta talletettiin American Type Collection'iin numerolla ATCC 39638.
30 Kuten monissa antibiootteja muodostavissa viljel missä Actinomadura verrucosospora-kannan H964-92 tai kannan A1327Y fermentointi johtaa komponenttien seoksen tai kompleksin muodostumiseen. Fermentointlprosessissa muodostuneesta BBM-1675-kompleksista on voitu erottaa kaksi 35 bioaktiivista pääkomponenttia BBM-1675 A3 ja A2 ja neljä 10 81114 pienempää bioaktiivista komponenttia BBM-1675 A3, A4, B: ja B2.
BBM-1675 ja sen komponentit BBM-1675 Ax, A2, A3, A4, Bj ja B2 tehoavat mikrobien vastaisesti mikro-organis-5 mien laajaan kirjoon, mm. erityisesti gram-positiivisiin bakteereihin. BBM-1675-kompleksilla ja sen erotetuilla bioaktiivisilla komponenteilla on lysogeenisissä bakteereissa faageja indusoivia ominaisuuksia. Seulontatutkimuksissa in vivo on määritetty kahden komponentin eli 10 BBM-1675 Ax ja A2 vaikutus erilaisiin hiirikasvainsystee- meihin ja niillä on todettu L-1210 leukemian, P-388 leukemian, B16 melanooman ja Lewisin keuhkokarsinooman vastainen teho. BBM-1675 A3:n ja A4:n on todettu tehoavan hiiren P-388 leukemiaan. Siten kompleksia ja sen bioak-15 tiivisia komponentteja voidaan käyttää mikrobilääkkeinä tai syöpälääkkeinä nisäkäskasvainten inhiboimiseksi.
Actinomyces-kanta H964-92 eristettiin maanäyt-teestä ja preparoitiin tavanomaisin menettelyin biologisesti puhtaana viljelynä karakterisointia varten. Kannan 20 H964-92 ilmamyseelissä muodostuu lyhyitä itiöketjuja, jotka muodoltaan ovat suoria, mutkittelevia tai koukku-maisia. Itiöt ovat pyöreitä tai soikeita ja pinta on nys-tyrämäinen. Useimmilla kasvualustoilla ilmamyseeliä muodostuu heikosti. Ilmamyseelimassa on väriltään valkoinen 25 ja saa myöhemmin vaaleanpunertavan vivahteen tai muuttuu edelleen eräillä agaralustoilla sinertäväksi. Substraat-timyseeli on väritöntä tai heikosti vaalean punaista. Kasvulämpötila on 15-43 °C. Soluseinämän aminohappokoostumus ja kokosoluhydrolysaatin sokerikomponentit osoit-30 tavat, että kanta H964-92 kuuluu soluseinämätyyppiin IIIB. Menakinoni identifioitiin MK-9(H6)·ΜΚ-9(Ηβ):ksi.
Morfologisten, viljely- ja fysiologisten tunnusar-vojen sekä soluseinämän kemiallisen koostumuksen tunnus-arvojen perusteella voidaan kanta H964-92 luokitella kuu-35 luvaksi sukuun Actinomadura.
11 81114
Joskin alkuperäisen kannan H964-92 kasvu oli vain keskinkertainen ja kanta kehitti heikosti ilmamyseeliä, saatiin hyvin kasvava ja paremmin ilmamyseeliä muodostava variantti käsittelemällä kantaa H964-92 NTG:llä (nitroso-5 guanidiinilla). Variantin, joka nimettiin kannaksi A1327Y, taksonomiaa tutkittiin edelleen ja myöhemmin se identifioitiin Actinomadura verrucososporaksi.
Viljelytunnusarvojen ja hiilihydraattien hyväksikäytön tutkimisessa käytettiin International Streptomyces 10 Project'in (Inti. J. Syst. Bacteriol. 16: 313-340, 1966) suosittelemia kasvualustoja ja menettelyjä. Lisäksi käytettiin kasvualustoja, joita ovat kuvanneet S. A. Waksman (The Actinomycetes, Voi. 2) ja G. M. Lvedemann (Inti. J. Syst. Bacteriol 21: 240-247, 1971). Soluseinämän amino-15 happokoostumus ja kokosoluhydrolysaatin sokerikomponentit analysoitiin menetelmin, joita ovat kuvanneet Becker et ai., Appi. Microbiol. 13: 236-243, 1965 ja vastaavasti Lechevalier ja Lechevalier, The Actinomycetes, Ed. H. Pr-auser, Jena, Gustav Fischer Verlag, s. 393-405, 1970. Me-20 nakinoni identifioitiin massaspektri-analyyttisesti Col lins et ai., J. Gen. Microbiol. 100: 221-230, 1977, menetelmien mukaan, ja menakinonin koostumus on esitetty Yamada et ai., J. Gen. Appi. Microbiol. 23: 331-335, 1977, kuvaaman systeemin mukaan.
25 Kanta H964-92 muodostaa sekä substraatti- että il mamyseeliä. Substraattimyseeli on pitkää, haarautunutta ja se ei ole fragmentoitunut lyhyiksi filamenteiksi. II-mamyseelissä muodostuu lyhyitä itiöketjuja varsijatkoi-sesti tai sienirihmojen kärjissä. Lähellä sienirihmojen 30 kärkiä voidaan myös havaita kiehkuramaisia haarautumia. Näiden itiöketjujen ketjussa on 2-10 itiötä ja ketjut ovat muodoltaan suoria, mutkittelevia tai koukkumaisia. Itiöiden pinta on nystyrämäinen ja muodoltaan ne ovat palloja tai soikioita (0,5-0,6 x 0,6-1,4 pm), joiden päät 35 ovat pyöreitä tai ulkonevia. Kypsymisen jälkeen jokainen i2 81114 itiö erkanee usein itiökelmu tyhjänä. Missään tutkitussa alustassa ei voitu havaita liikkuvia itiöitä, itiöpesäk-keitä eikä kovettuneita jyväsiä.
Kanta H964-92 kasvaa huonosti tai kohtalaisesti 5 sekä kemiallisesti määritellyissä alustoissa että orgaanisissa luonnonalustoissa. Ilmamyseelin muodostuminen on yleensä heikkoa, mutta on kohtalainen kaurajauho-agarissa (1SP nro 3 kasvualusta), epäorgaanisia suoloja ja tärkkelystä sisältävässä agarissa (ISP nro 4 kasvu-10 alusta) ja Bennettin agarissa. Erittäin usein esiintyy spontaaneja variantteja, joista puuttuu ilmamyseeli. II-mamyseeli on väriltään valkoinen ja muuttuu myöhemmin vaaleanpunaiseksi kaurajauhoagarissa, epäorgaanisia suoloja ja tärkkelystä sisältävässä agarissa ja glyseroli-15 asparagiiniagarissa (ISP nro 5 kasvualusta). Kun inkuboi-daan pitkään (viisi kuukautta) kaurajauhoagarissa, glyse-roli-asparagiiniagarissa ja tyrosiiniagarissa, ilmamysee-limassan väri muuttuu edelleen sinertäväksi. Substraatti-myseelin väri vaihtelee värittömästä kellertävään Czape-20 kin agarissa, tyrosiiniagarissa, hiivauute-mallasuute- agarissa (ISP nro 2 kasvualusta), peptoni-hiivauute-rau-ta-agarissa (ISP nro 6 kasvualusta) ja Bennettin agarissa ja substraattimyseeli on vaaleanpunertava glukoosi-asparagiiniagarissa ja glyseroli-asparagiiniagarissa. Ei muo-25 dostu melanoidi- eikä muita diffundoituvia pigmenttejä. Eräs variantti, nro A1327Y, joka saatiin alkuperäisestä kannasta, muodostaa pääasiassa vaaleansinistä ilmamysee-liä ja sen ilmaitiömassaa on runsaasti.
Kanta H964-92 kasvaa lämpötilassa 15 eC, 28 °C, 37 30 °C ja 43 °C, muttei lämpötilassa 10 eC tai 47 eC. Se on herkkä natriumkloridille konsentraationa 7 % ja resistentti lysotsyymille konsentraationa 0,01 %.
Tuotantokannan viljely- ja fysiologiset tunnusar-vot ilmenevät vastaavasti taulukoista 1 ja 2. Hiililäh-35 teiden hyväksikäyttö ilmenee taulukosta 3.
i3 81114
Taulukko 1
Kannan H964-92 viljelytunnusarvot (alkuperäiskanta ATCC
39334 ja variantti A1327Y) 5
Kanta nro H964-92
Alkuperäiskanta Variantti Actinomadura verruco- (ATCC 39334) AI 327Y_ sospora KCC A-014 7
Tryptoni- G: runsas,höytä- kohtalainen, höy- kohtalainen, höy- hiiva- lemäinen, se- tälemäinen, sedi- tälemäinen, sedi- 10 uuteagar dimentoitunut, mentoitunut, ei mentoitunut, ei (ISP nro 1) ei pigmenttiä pigmenttiä pigmenttiä
Sakkaroo- G: kohtalainen niukka niukka sinitraat- R: väritön väritön väritön tiagar A: niukka, vaa- olematon tai niuk- olematon tai niuk-(Czapekin leanharmaasta ka vaaleanpuner- ka, vaaleansininen agar) (264) vaalean- tavan valkoinen (185) punaiseen (9) (7) D: ei ei ei
Glukoosi- G: kohtalainen niukka niukka 20 aspara- R: valkoisesta väritön väritön giiniagar tumman keller- • tävän vaalean punaiseen (27) A: olematon tai olematon tai hy- olematon tai hy- 25 hyvin niukka, vin niukka, vai- vin niukka, val- heikosti vaa- koinen koinen leanpun. (7) D: ei ei ei
Glyseroli- G: niukasta koh- kohtalainen kohtalainen 30 asparagii- talaiseen agar (ISP R: värittömästä vaalean keller- vaalean kellertä- nro 5) vaalean kel- tävän vaaleanpun- vän vaaleanpun.(28) lertävän vaa- nainen (28) syvän kellertävän leanpunaiseen vaaleanpunaiseen (28) , 5 kk (27) 35 kuluttua vaalean sinertävän har-maa (190) D: ei ei ei i4 81114
Epäorg. G: runsas kohtalainen kohtalainen suolatärk- R: kellertävän vaalean kellertä- vaalean keller- kelysagar valkoinen (92) vän vaaleanpunai- tävän vaaleanpu- (ISP nro 4) nen (28) nainen (28) A: runsas, heikos- kohtalainen, vaa- runsas, vaalean- ti vaaleanpu- lean sinertävän sininen (185) naisesta (4) harmaa (190) vaaleanpunertavan harmaaseen 10 (10) D: ei ei ei
Tyrosiini- G: kohtalainen kohtalainen kohtalainen agar R: kellertävän vai- voimakkaan keller- voimakkaan kel- (ISP nro 7) koinen (92) tävän vaaleanpu- lertävän vaalean- nainen (26) punainen (26) A: niukka, vaalean kohtalainen, vai- kohtalainen, val-kellertävän vaa- koisesta heikosti koisesta heikosti leanpunainen vaalean punaiseen vaaleanpunaiseen (28), paljon myö- (4) (4) hemmin (5 kk) 2q osaksi vaalean si nertävän harmaa (190) D: ei ei ei
Nutrient- G: niukasta kohta- niukka niukka tiagar laiseen R: vaaleankeltai- värittömästä hei- värittömästä hei- 25 nen (89) kosti vaaleanpu- kosti vaaleanpunaiseen (7) naiseen (7) A: ei ei ei D: ei ei ei
Hiivauute- G: runsas runsas runsas 30 mallasuu- R: vaaleankeltai- voimakkaan keller- voimakkaan keller- teagar nen (89) tävän vaaleanpu- tävän vaaleanpu- (ISP nro 2) nainen (26) nainen (26) A: niukka, valkoi- niukka, valkoises- niukka, valkoises-nen (263) ta vaaleanpunai- ta vaaleanpunaiseen (7) seen (7) 35 D; ei ei ei is 81114
Kaurajau- G: kohtalainen niukka niukka hoagar R: värittömästä heikosti keller- heikosti keller- (ISP nro heikosti vaale- tävän vaaleanpu- tävän vaaleanpu- 5 3) anpunaiseen (7) nainen (31) nainen (31) A: niukka, vaalean- hyvin niukka, he- hyvin niukka, he- punertavan vai- leän vaaleansini- leän vaaleansi-koisesta (9) nen (184) ninen (184) vaalean sinertä-vän harmaaseen (190) D: ei ei ei
Bennettin G: runsas runsas runsas agar R: harmahtavan kel- voimakkaan keller- voimakkaan keller- tainen (90) tävän vaaleanpu- tävän vaaleanpu- ^ nainen (26) nainen (26) A: kohtalainen, kohtalainen, hei- ei valkoisesta (263) kosti kellertävän kellertävän vaaleanpunainen (31) valkoiseen (92) ja sinertävän valkoi nen (189) 20 D: ei ei ei
Peptoni- G: kohtalainen runsas runsas hiivauute- Rs väritön väritön väritön agar (ISP A: ei ei ei nro 6) D: ei ei ei 25 • * Havainnot kolmiviikkoisen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa.
** Lyhenteet: G = kasvu, R = kääntöpuolen väri, A = ilmamyseeli, D = diffundoituva pigmentti *** Väri ja sulkeissa oleva numero väristandardin "Kelyy, K. L. & D. B. Judd, ISCC-NBS color-name charts illustrated with 30 Centroid Colors. U.S. Dept, of Comm. Cir. 553, Washington, D. C., Nov., 1975" mukaan.
35 ie 81114
Taulukko 2
Kannan H964-92 fysiologiset tunnusarvot Testi Vaste Menetelmä ja kasvualusta
Kasvun lämpö- Maksimikasvu 28-37°C: Bennettin agar 5 tila-alue ssa, kohtalainen 20°C: ssa ja 43°C:ssa, ei kasvua 10°C:ssa eikä 47°C:ssa
Gelatiinin Nesteytyy Glukoosi-peptoni-gelatiini- 10 nesteytys kasvualusta Tärkkelyksen Hydrolysoituu Tärkkelysagarmalja hydrolyysi
Reaktiot ras- Ei koaguloidu, täydel- Difcon rasvaton maito vattomassa linen peptonisoitumi- 15 maidossa nen
Melanoidipig- Ei muodostu Tyrosiiniagar, peptoni- mentin muodos- hiivauute-rauta-agar ja tuminen tryptoni-hiivauuteliemi
Nitraatin pel- Ei pelkisty Czapekin glukoosi-nitraatti- 20 kistys liemi ja glukoosi-hiiva- uuteliemi
NaCl-resis- Kasvua, kun kons. on Tryptoni-hiivauuteagar tenssi 5 % tai pienempi, ei kasvua, kun kons. 7 % 25 Lysotsyymi Resistentti. Kasvua, Tryptoni-hiivauuteagar kun kons. 0,01 % tai pienempi, ei kasvua, kun kons. 0,1 % pH Kasvua alueella 5,0- Tryptoni-hiivauuteagar 30 9,5, ei kasvua arvois sa 4 , 5 ja 10 , 0 i7 81114
Taulukko 3
Hiililähteiden hyväksikäyttö Kanta nro H964-92 Actinomadura
Alkuperäis- Variantti verrucosospora kanta A1327Y KCC A-0147 5 Glyseroli + + + D (-)-arabinoosi - L (+ )-arabinoosi + + + D-ksyloosi + + + D-riboosi + 10 L-ramnoosi + + + D-glukoosi + + + D-galaktoosi - D-fruktoosi + + + D-mannoosi - 15 L (-)-sorboosi -
Sakkaroosi + + +
Laktoosi - - -
Sellobioosi + + +
Melibioosi - - - 20 Trehaloosi + + +
Raffinoosi - D ( + )-meletsitoosi -
Liukoinen tärkkelys + + +
Selluloosa + + + 25 Dulsitoli - -
Inositoli + - - D-mannitoli + + + D-sorbitoli -
Salisiini - - - 30 Havainnot kolmiviikkoisen inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa
Peruskasvualusta: Pridham-Gotliebin epäorgaaninen kasvualusta ie 81114
Kannan H964-92 puhdistettu soluseinämä sisältää mesodiaminopimeliinihappoa, muttei glysiiniä. Kokosolu-hydrolysaatissa on maduroosia (3-0-metyyli-D-galaktoosi), glukoosia ja riboosia. Soluseinämän aminohappokoostumus 5 ja kokosolusokerikomponentit osoittavat, että kanta H964-92 on soluseinämätyyppiä III„. Menakinonin pääkomponentit todettiin olevan MK-9(H6) ja MK-9(He).
Kannan H964-92 päätunnusarvot ovat: (1) ilmaitiö-ketjut: lyhyitä, suoria, mutkittelevia tai koukkumaisia, 10 (2) itiöt: nystyrämäinen pinta, (3) ilmamyseeli: väril tään vaaleanpunertava tai sinertävä, (4) substraattimy-seeli; joissakin kasvualustoissa vaaleanpunertava, (5) diffundoituva pigmentti: ei ole, (6) mesofiili, (7) solu-seinämätyyppi IIIB (8) menakinonisysteemi: MK-9(H6) ja 15 MK-9(He).
Nämä päätunnusarvot osoittavat että kanta H964-92 kuuluu sukuun Actinomadura. Actinomadura-suvun aikaisemmat lajit on eristetty nisäkkäistä. Eräitä kantoja on myös eristetty kasviaineksista. Mutta monet viime aikoina 20 esitetyt uudet lajit on eristetty maaperästä. Goodfellow et ai., J. Gen. Microbiol. 112: 95-111 (1979) esittämien Actinomaduraa ja vastaavia actinomyces-lajeja koskevan numeroin ilmaistun taksonomian ja yleiskatsauksen perusteella useimmat maaperästä eristetyt Actinomaduralajit 25 luokitellaan kuuluviksi klusteriin nro 7 neljästätoista kuvatusta klusterista. Kanta nro H964-92 muistuttaa lähinnä klusterin 7 lajeja. Nonomura ja Ohara, J. Ferment. Technol. 49: 71-77 (1971) raportoivat viisi Actinomadura-sukuun kuuluvaa saprofyyttistä lajia ja Nonomura (J. Fer-30 ment. Technol. 52: 7177 (1971)) ja Preobrazhenskaya et ai. (Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38 (1977)) ovat julkaisseet kaavion Actinomaduralajien identifioimiseksi ja luokittelemiseksi. Vertailun perusteella, jonka kohteena olivat kolmenkymmenen lajin, mm. pa-35 tenteissä julkistettujen lajien kuvaus, kanta H964-92 i 19 81114 muistuttaa lähinnä Actinomadura coeruleaa, joka on kuvattu yllä mainitussa Preobrazhenskaya et ai.:n viitteessä, ja Actinomadura verrucososporaa, joka on kuvattu yllä mainituissa Nonomuran viitteissä.
5 Kantaa nro H964-92 verrattiin suoraan A. verroco- sospora-kantaan KCC A-0147 ja havaittiin, että se morfologisilta, viljely- ja fysiologisilta ominaisuuksiltaan muistutti läheisesti A. verrucososporaa. Niinpä kanta H964-92 on luokiteltu Actinomadura verrucososporan uudek-10 si kannaksi.
On selvää, että BBM-1675:n tuottamisessa käsiteltävänä oleva keksintö, joskin yksityiskohtaisesti kuvattuna erityisen kannan eli Actinomadura verrucosospora-kannan H964-92 (ATCC 39334) ja sen A1327Y (ATCC 39638) 15 merkityn mutanttikannan avulla, ei rajoitu näihin mikro-organismeihin tai tässä julkistettuihin, viljelytunnusar-vojensa avulla tarkoin määriteltyin mikro-organismeihin. Keksintö käsittää erityisesti kannan H964-92.
Käsiteltävänä olevan keksinnön BBM-1685 anti-20 biootit valmistetaan keksinnön mukaisesti viljelemällä antibioottikompleksia BBM-1675 tuottavaa Actinomadura verrucosospora-kantaa H964-92, ATCC 39334 tai sen mu-tanttikantaa A13274, ATCC 39638 vesipitoisessa ravinto-alustassa, joka sisältää hiilen ja typen yhteyttämiskel-25 poisia lähteitä, pinnanalaisesti aerobisissa olosuhteis sa, kunnes mainittu organismi on viljelyalustassa tuottanut olennaisen määrän antibioottikompleksia BBM-1675 ja eristetään sitten antibioottikomponentit BBM-1675 Ax, A2, A3, A4, B2 ja B2 viljelyalustasta tavanomaisin kromatogra-30 fisin menetelmin. Mikro-organismia kasvatetaan ravinto- alustassa, joka sisältää actinomyces-lajien tunnettuja ravintolähteitä, ts. hiilen ja typen yhteyttämiskelpoisia lähteitä sekä valinnaisesti epäorgaanisia suoloja ja muita tunnettuja kasvutekijöitä. Suurehkojen antibiootti-35 määrien tuottamiseksi käytetään mieluiten pinnanalaisia 20 81 1 1 4 aerobisia olosuhteita, joskin pienehköjä määriä voidaan myös tuottaa pintaviljelyllä ja viljelemällä kolveissa. Käsiteltävänä olevassa keksinnössä voidaan soveltaa muiden actinomyces-lajien viljelyssä käytettyjä yleismenet-5 telyj ä.
Ravintoalustan on sisällettävä asianmukaista yh-teyttämiskelpoista hiilen lähdettä kuten glyserolia, L(+)-arabinoosia, D-ksyloosia, D-riboosia, L-ramnoosia, D-glukoosia, D-fruktoosia, sakkaroosia, sellobioosia, 10 liukoista tärkkelystä, D-mannitolia tai inositolia. Typen lähteenä voidaan käyttää ammoniumkloridia, ammoniumsul-faattia, ureaa, ammoniumnitraattia, natriumnitraattia jne. joko yksinään tai yhdistelmänä typen lähteiden kuten peptonin, lihauutteen, hiivauutteen, maissin lio-15 tusveden, soijajauheen, puuvillansiemenjauheen jne. kans sa. Tarvittaessa voidaan myös lisätä epäorgaanisia ra-vintosuoloja natriumin, kaliumin, kalsiumin, ammoniumin, fosfaatin, sulfaatin, kloridin, bromidin, karbonaatin, sinkin, magnesiumin, mangaanin, koboltin, raudan ja vas-20 taavien lähteinä.
BBM-1675 antibiootteja voidaan tuottaa kaikissa lämpötiloissa, jotka mahdollistavat tuotanto-organismin hyvän kasvun, esim. 15-45 °C:ssa, edullisesti lämpötilassa n. 27-32 °C. Tavallisesti optimituotanto saavutetaan 25 n. 68-180 tunnin inkuboinnin jälkeen riippuen siitä, käytetäänkö ravistelukolvi-, sekoitusastia- tai tankkifer-mentointia. Tankkifermentointia käytettäessä on suotavaa valmistaa vegetatiivinen siirrostus ravintoliemessä siir-rostamalla liemiviljelmä tuotanto-organismin vinopinta-30 tai maaviljelmällä tai lyofilisoidulla viljelmällä. Kun tällä tavoin on saatu aktiivi siirrostus, tämä siirretään aseptisesti fermentointitankissa olevaan alustaan. Anti-bioottituotantoa voidaan tarkkailla paperikiekkoagardif-fuusiomenetelmällä, jossa testiorganismina käytetään 35 Staphylococcus aureus 209P:tä.
2i 81114
Fermentoinnin päätyttyä BBM-1675-kompleksi voidaan saada liemestä tavanomaisin eristämismenetelmin, esim. liuotinuutolla. Niinpä esim. liemi voidaan kokonaisuudessaan erottaa suodattamalla tai linkoamalla myseelikakuksi 5 ja liemisupernatantiksi. Myseelikakussa oleva antibiootti voidaan eristää suspendoimalla kakku metanoliin, poistamalla liukenematon aines suodattamalla ja konsentroimalla metanoliuute. Liemisupernatantissa oleva aktiivisuus voidaan eristää uuttamalla n-butanolilla. Sitten yllä maini-10 tut n-butanoli- ja metanolluutteet voidaan yhdistää ja haihduttaa atseotrooppiseksi vesiliuokseksi, josta antibioottinen aktiivisuus saostuu suurimmaksi osaksi öljy-mäisenä kiintoaineena. Sitten kiintoaine voidaan liuottaa metanoliin ja liuos suodatetaan. Suodos konsentroidaan ja 15 jäännös lisätään etyyliasetaatin ja veden seokseen. Muodostunut orgaaninen uute sisältää epäpuhtaan BBM-1675-kompleksin, joka voidaan saostaa liuoksesta lisäämällä vastaliuotinta kuten n-heksaania.
Epäpuhdas BBM-1675-kompleksi muodostuu useiden ko-20 mponenttien seoksesta, mm. kahdesta bioaktiivisesta pää-komponentista BBM-1675 A2 ja A2 sekä neljästä pienemmästä bioaktiivisesta komponentista BBM-1675 A3, A4, Bx ja B2. Nämä bioaktiiviset komponentit voidaan erottaa toisistaan ja puhdistaa tavanomaisin kromatografisin menettelyin.
25 Eräässä menettelyssä epäpuhdas BBM-1675-kompleksi ensin liuotetaan metanoliin ja puhdistetaan pylväskromatografi-oimalla Sephadex LH-20:llä eluoiden metanolilla. Sitten tämä osaksi puhdistettu kompleksi kromatografioidaan si-likageelipylväässä eluoiden vaiheittain kasvavia määriä 30 metanolia sisältävällä kloroformilla, jolloin saadaan BBM-1675 Ax, BBM-1675 A2:n, A3:n ja A4:n seos ja BBM-1675 B,:n ja B2:n seos. A2-komponentti voidaan puhdistaa edelleen pylväskromatografloimella Sephadex LH-20:llä eluoiden metanolilla. A2:n, A3:n ja A4:n seoksen komponentit 35 voidaan erottaa toisistaan pylväskromatografioimalla Bon-dapak Cie:lla (Waters Associates, Inc.) eluoiden aseto- 22 81 1 1 4 nitriilipitoisuudeltaan kasvavalla asetoninitriilin ja veden seoksella. Bx:n ja B2:n seoksen komponentit voidaan erottaa toisistaan silikageelipylväskromatografioimalla eluolden kloroformin ja metanolin seoksella. Seuraavlssa 5 esimerkeissä kuvataan yksityiskohtaisemmin suositeltavia kromatografisia erotusmenetelmiä.
BBM-1675-kompleksin kuusi bioaktiivista komponenttia voidaan erottaa toisistaan kahden TLC-systeemin avulla, kuten alla olevasta taulukosta ilmenee.
10 Taulukko 4 BBM-167 5-komponenttienohutkerroskromatografia _Rf-arvot_ S102 *Silanoitu
Komponentti CHC1,-CH,0H( 5:1 t/t) CH,CN-H,0 (75:25 t/t) 15 BM-1675 A3 0,74 0,18 BBM-1675 A2 0,71 0,21 BBM-1675 A3 0,72 0,28 BBM-1675 A4 0,71 0,78 BBM-1675 B1 0,63 0,23 20 BBM-1675 B2 0,60 0,16 * C18-käänteisfaasisilikageeli BBM-1675 A2, A3 ja A4 oli hankala erottaa toisistaan tavanomaisten faasi-TLC-systeemien avulla, mutta erottaminen onnistui käänteisfaasi-TLC:n avulla.
25 BBM-1675:n yksittäiskomponenttien liukoisuus ja värireaktiot muistuttavat toisiaan. Ne esim. liukenevat kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenevat jossain määrin bentseeniin ja veteen ja ovat liukenemattomia n-heksaaniin ja hiilitetra-30 kloridiin. Ne antavat positiivisen reaktion ferriklori- dilla, Ehrlichin ja Tollenin reagensseilla, mutta reaktio on negatiivinen Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitestissä.
BBM-1675-komponenttien tunnusomaiset fysikaalis-35 kemialliset ominaisuudet ilmenevät alla olevasta taulukosta 5.
23 81114 υ 9ι «η · ν η η ο©**» μ ο ο Η Μ Η « ο <-«^0 Π (Λ Η Μ η Η Η Γ4 Η Η η Η Η rw ι 9-4 ^ w w «- μ· - www β ( « «9« ·«» <ρο»α (Λ «o r- *-« «» Η H N Ν Λ Ν N n ν Π
4J .U
(U -Λ ψγ* w · v>o« mom «nm * «-·»-» Ν ·· ο Ν ^ Ο η «Τ Ο ? Γ* ΝΗΗ ΝΗΗ ΝΗΗ
S β I
, 9» ΠΝΟ fINO ΝΝ· *Γ1 ΙΟ M0DN ΐη·Ν «1·Η fj} Ή ΝΓ<η ΝΝΟ Ρ4ΝΟ
G
•H U
s · υ n · r« m ιο <*> r- m r- o m ο « ο α Η ιΑ ιο Π ^ ΐΛ ιΟ *Λ «-< m in Η to iO Η 1 f Γ» ««»·. N ri Η Μ *-4 *-4 Ν Η Η , » » ^ «η \β η β www www www ο ^ < « ιη ο ο (β ο ΟΝο πνο r«neo ** ,—ι η man man v>coh , m n r* η in o* n n ν η Η 3 *Η r-» Λ ^ Λ ^ Λ „ Λ Ρ η · of^r^H ιο α n h ο Ό ΟΝΟ Λΐ »-4 h ototooi oomr* ce to n ο ο π 5 tO ·.«»·, N H H N H H N H ^
t *~4 IO tO Π V www www www O
I O | m n O
rfl «Cm (*> (N o n n o n n e «-* , n m o n *οο3Γ4 m»-4 *r* <-4 n N rt Λ4 M Π Γ* ΓΜ »-t ·-* m »-i
G M
0 CO · · V V 9* «9 TJ r_j « «. H H N IO HM· tr h * 9ν·»4Γ4 .»5 ^ **4 9* co ro 09 o e r· n Ko in to r* p CO r- ·»·*«,·» n h h o# «h **4 m -h h H *>. n ι h o to n to www www www o
1 iTV K \ »o ro O
^ 'N r* n n o o n o n n as h
Cd » m <d in m a) n «ooo·-* r* C4 r~t N «N o r* M n «-4 0)
*H U
<' * « __________ ^ m «o viinn nov onio P f* h · r* h n m n ot v n » « ror-o η» to h tn co o to n m »h π h h n h h w >-t I 9* K «. M M WWW www WWW o 5 ι ή *h m tn o 0 Z «e l m ry n n o n n o ι*ο n e ry . . rv am ιπβθΓ4 m a> rt m co «-< g β·-« p< n ro n <n ό n n ^ «-* f * 12 ιο w —' ^ n '"m ^ tn tn O tl ^ 2, _, ΐ tn > a 'o mTI ..k moi r1 222- — EC O toe 1 »G 5G 3 So ro ή S g °ro κ CU,
S „ 2 ·· «K* £C CJ <U
+Jtntn «ω V x u
. r-j ^ ö *^ ·—I O tttJiJ
£ ° ' tuSfl o <o o n ft - «rj toctn x 2 c « x ^ “ .*. S? tn tn h :ttj ι o d ^ e* a x · c c < ε ·ήη j* w S X I I Dj Ή ι-t ι
n λ O -E O -h -h · X 0) J
"VJ-3 2 μ /< m o O r-ι -H a> W
,2öp 5 id > a - » o «-· o o w · 5 υ o o s--- 24 81 1 1 4 BBM-1675-komponenttien UV-absorptiomaksimit havaittiin kohdissa 253, 282 ja 320 nro, jotka eivät siirtyneet happamassa tai emäksisessä liuoksessa. BBM-1675 Ax:n, A2:n, A3:n ja A4:n IR- ja PMR-spektrit ilmenevät 5 vastaavasti kuvista 1-4 ja 5-8. BBM-1675 A3:n PMR-spektri 360 MHz osoitti yhden asetyyliryhmän (σ * 2,11 ppm), yhden N-CH3-ryhmän (2,52 ppm), neljä OCH3-ryhmää (3,42, 3,80, 3,88 ja 3,98 ppm) ja yhden eksometyleeniryhmän (4,57 ja 8,59 ppm) sekä kaksi aromaattista protonia 10 (7,50 ja 8,59 ppm) ja yhden NH -protonin (11,79 ppm).
BBM-1675 A3:n CMR-spektri osoitti 55 signaalia, mm. trip-letti-intensiteettisignaalin (6 = 56,0 ppm, 0CH3). BBM-1675 A3:n molekyylikaavaksi saatiin C57H72N4032 protoni-ja 13C-NMR-spektrien, mikroanalyysin ja HPLC:llä ja 15 SIMS:illä (sekundaarinen ionimassaspektrometria) suoritetun molekyylipainomäärityksen nojalla.
Käsiteltäessä 0,5-n HC1-CH30H: 11a huoneenlämpötilassa BBM-1675 A2 menettää bioaktiivisuutensa ja hajoaa lipofiiliseksi kromoforiaineeksi (yhdiste I) ja useiksi 20 tunnistamattomiksi fragmenteiksi. Yhdisteen I UV-absorp-tio on samanlainen kuin kanta-antibiootin, mikä osoittaa yhdisteen I säilyttäneen BBM-1675 Ax:n kromoforiraken-teen. Kaksi muuta yhdistettä I muistuttavaa kromofori-fragmenttia saadaan emäshydrolysoimalla BBM-1675 A7:n 25 hydrolyysi 0,05-n KOH-CH30H: 11a tunti 55 °C:ssa antaa yhdisteen II, jonka UV-absorptiomaksimit ovat kohdissa 252, 284, 297 (olkapää) ja 322 nm ja reaktio 1-n KOH-CH30H:ssa antaa happaman kromoforiaineen, jota kutsutaan yhdisteeksi III. Yhdisteiden I, II ja III fysikaalis-kemialliset 30 ominaisuudet ilmenevät alla olevasta taulukosta 6.
25 81 1 1 4
Taulukko 6
Yhdisteiden I, II ja III ominaisuudet
Yhdiste I Yhdiste II Yhdiste III
Sp. : 82- 83 °C 133° 253 - 255 °C
5 M°9 : -100° 0 0
Molekyyli- kaava : C^H^NO^ C^H^NOg C^H^NOg 10 λ CH-,ΟΗ .,.
UV maksJ nm : 244 (21 ,850) 252(26,600) 248 (26,900) 276 (9,400) 283(11,200) 295(14,400) 318 (6,300) 297(sh8,800) 310(13,500) 322 (1 1,700) 15 MS m/z : 457 (M+) 295 (M+) 281 (M+) 425 280 263 341 263 236 281 251 222 20 264 248 218
TLC
(ksyleeni-*MEK- CH3OH=5:5:1 til.): Rf 0,58 0,66 0,13 25 *MEK=metyylietyyliketoni 26 81 1 1 4
Yhdisteiden II ja III rakennetta koskeva informaatio saatiin seuraavista spektriarvoista ja kemiallisesta transformaatiosta. 13C- ja protoni-NMR osoitti neljä OCH3-ryhmää, yhden =CH2 -ryhmän, seitsemän -C= -ryhmän, kaksi 5 >C=0 -ryhmää ja yhden >NH -ryhmän yhdisteessä II. Yhdis teen III ja II NMR-spektrit olivat samanalaiset sillä ainoalla erolla, että yhdisteestä III puuttui yksi yhdisteen II neljästä OCH3 -ryhmästä. Tämä ero ja yhdisteen III hapan luonne osoittavat, että yhdiste II on yhdisteen 10 III metyyliesteri. Kuumennettaessa pystyjäähdyttäen 1-n KOH-metanolissa yhdiste II muuttui kvantitatiivisesti yhdisteeksi III ja käsiteltäessä diatsometaanilla yhdiste III muuttui yhdisteeksi II. Käsittelemällä yhdistettä II NaBHtllä C2H50H:ssa saatiin pelkistystuote (yhdiste IV, 15 M+: m/z 267), jossa NMR:n mukaan oli -CH20H -ryhmä yhdis teen II -COOCH3 -ryhmän asemasta. Hydrattaessa palladium-hiilellä yhdisteestä II saatiin dihydrojohdannainen (yhdiste V, M+: m/z 297). Yhdisteen V protoni-NMR-spekt-rissä oli uusi dublettimetyylisignaali ja siitä puuttui 20 yhdisteen II eksometyleeniryhmä. Lisäksi yksi 0CH3 -ryhmistä oli yhdisteessä V suurjännitekentässä (6 « 3,50 ppm). Näiden tulosten perusteella yhdisteessä II on ryhmä -C=CH, 0CH3 25 joka pelkistettiin hydraamalla yhdisteen V ryhmäksi -<pH-CH3 0CH3
Yhdistettä II kuumennettiin 1,5-n vetykloridi-me-tanolissa kolme tuntia 80 eC:ssa, hydrolysaatti kromato-30 grafioitiin silikageelipylväässä ja saatiin heikosti emäksinen yhdiste (yhdiste VI, M*: m/z 211). IR-spektri ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet osoittavat, että yhdiste VI sisälsi NH2 -ryhmän. Vertaamalla tämän yhdisteen ja autenttisen näytteen IR- ja NMR-spektrejä yhdiste 35 VI identifioitiin metyyli-4,5-dimetoksiantranilaatiksi. Siten yhdisteiden II ja VI rakenteet määritettiin alla 27 81 1 1 4 esitetyllä tavalla.
Yhdisteiden II, III, IV, V 1a VI rakenteet
c Yhdiste II Yhdiste III
3
^ //Η2 . λ //CH2 CH-jO-r^^^^y-NH-CO-C 0H- \_Nh-CO-C
3 | %°«3 -22-* I i 0CH3
10 CHjCf^^-^COOCHj CHjfT^i^^d^coCH
\ NaBH4
'v N. Yhdiste IV
15 \ \ CH.
V
H+AMeOH \ -Λν. 0a \ CH _ 0 ' 2 20 \
\/ 'V Yhdiste V
Yhdiste VI ^ CH
25 ch-o^"\_nh nh-co-c:/ 3 ΠΓ 2 I I \ | ! I °«3 CH3Oa^AoOCH3 01,0-%^ C00CH3 30 Käsittelemällä 0,05-n KOH-CH3OH: 11a 55°C:ssa yh diste I lohkaistiin uudeksi kromoforiseksi fragmentiksi (yhdiste VII, C15H21N07, M*: m/z 327) ja sokeriksi (yhdiste VIII). Yhdisteen VII NMR-spektrissä oli yksi singletti C-CH3 ja kaksi suurjännitekentän OCH3 -ryhmää kolmen 35 pienjännitekentän OCH3 -ryhmän ja kahden aromaattisen
protonin lisäksi, jotka ovat yhteisiä yhdisteille II, V
28 81 1 1 4 ja VI. Lisäksi yhdisteen VII hydrolyysi 1,5-n vetyklori-di-metanolilla antoi yhdisteen VI, joka oli identtinen edellä yhdisteestä II saadun yhdisteen kanssa. Yhdisteen VI poistamisen jälkeen hydrolysaattia käsiteltiin 2,4-di-5 nitrofenyylihydratsiinilla ja muodostui keltainen kiinto-ainesakka, joka identifioitiin palorypälehapon 2,4-dinit-rofenyylihydratsoniksi. Siten yhdiste VII on metyyli-4,5-dimetoksi-N-(2',2'-dimetoksipropionyyli)antranilaatti. Yhdisteessä VIII ei ollut molekyyli-ionipiikkiä, mutta 10 siinä oli M-OCH3-piikki massaspektrin kohdassa m/z 131, mikä on sopusoinnussa molekyyli kaavan C7H1404 kanssa. NMR-spektri osoitti yhdisteellä VIII olevan 2,6-dideoksihek-sopyranoosirakenteen. Tätä päättelyä tuki yhdisteen I 13C-NMR-spektri, jossa oli yksi C-CH3-hiili, yksi CH2- 15 hiili, kolme 0-CH< -hiiltä ja yksi anomeerinen hiili viidentoista hiilisignaalin lisäksi, jotka johtuvat yhdisteestä VII. Sokerin C3-protoni ilmeni pienjännitekentässä (6 = 5,39 ppm, oktetti), mikä osoitti, että yhdisteen VII karboksyyliryhmä oli esteröinyt sokerin C3-0H -ryhmän.
20 Alla on yhteenveto yllä esitetyistä tuloksista.
Yhdisteiden I, VII ja VIII rakenteet
Yhdiste I Yhdiste VII
0CH3 Γ~ - OCH,
3 I il | 3 OH /CH-OH I
25 I och3 -^1 ch3o^\^-co-c-ch3 G33cr^i:55t^i^co '1 0CH3 V) CH-O^S^^COOCH, \_/°H 3
/ \ Yhdiste VIII
30 p Yhdiste VI CH3°\ „·>· CH30-^\pNH2 _ °-<CH3 CT 3 COOCH ^
—CH3-C0-C00H
35 29 81 1 1 4
Yhdisteen I molekyylipaino (457) muodostaa suunnilleen kolmanneksen BBM-1675 A3:n koko molekyylistä (ehdotettu kaava C57H72N4032, laskettu molekyylipaino 1324). BBM-1675 AL:n osarakenteen oletetaan olevan seuraava: 5 CH -O—NH-CO-C*sCH 3 ! I 12 I OCH-
°N_r°H
9 US-patenttihakemuksen 495 231 jättöpäivän jälkeen 15 havaittiin, että yllä kuvatut ja alla olevan esimerkin 2 mukaan valmistetut komponentit BBM-1675 AI ja A2 eivät itse asiassa olleetkaan täysin puhtaita ja että määrätyt näiden komponenttien tunnistamiseksi käytetyt tunnusarvot ovat virheellisiä. Komponentit BBM-1675 A2 ja A2 puhdis-20 tettiin edelleen kromatografisin puhdistusmenetelmin kuten alla on tarkemmin selostettu esimerkeissä 3 ja 6 ja eristettiin puhtaammassa muodossa ja karakterisoitiin täysin alla kuvatulla tavalla. Myös komponenttien A3 ja A4 alkuaineanalyysiarvot korjattiin osoittamaan näiden 25 yhdisteiden rikkipitoisuus ja näille kahdelle komponentille laskettiin HPLC-retentioajat. Alla on yhteenveto BBM-1675-komponenttien korjatuista fysikaalis-kemial-lisista ominaisuuksista.
BBM-1675 A, 30 Kuvaus: valkoisesta vaaleankeltaiseen vaihtelevia kiteitä, sp. 156-158 eC (hajoaa)
Alkuaineanalyysi:
Analyysi 1 Analyysi 2 Keskiarvo C: 51,60 % C: 52,74 % C: 52,17 % 35 H: 6,31 % H: 5,99 % H: 6,15 % 3o 81114 N: 5,31 % N: 3,94 % N: 4,63 % S: 8,47 % S: 9,71 % S: 9,09 % O(erotuksena): O(erotuksena): 0(erotuksena): 28,31 % 27,62 % 27,96 % 5
Ultraviolettiabsorptiospektri: Laite Varian UV, Cary 219, liuotin metanoli, konsentraatio 0,01356 g/1 /. Bak, (nm) Absorptio 320 12,4 10 280 sh (olkapää) 253 25,1 210 25,5
Happo ja emäs eivät aiheuta merkitseviä muutoksia Optinen kierto: liuotin CHC13, [a]p4 = -207° (c=0,0351) 15 Toisessa analyysissa optinen kierto [a]” * -191° (c = 0,5, CHC13)
Infrapuna-absorptiospektri: ks. kuva 9 Pääabsorptiokaistat (KBr): 985, 1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 20 1668, 1715, 2920, 2960, 3360, 3440 cm*1
Massaspektri: Laite VG-ZAB-2F, FAB-MS-tioglyseroli, mole-kyylimassa-alueen ionit (m/z): 1249, 1357, 1463, NaCl-li-säys (m/z); 1271, 1379, 1485, 1597.
FAB-MS-MB (MB: matriisi, mp. 154): 1249, 1283, 1403, 25 1555, NaCl-lisäys (m/z): 1249, 1271, 1303, 1425, 1483, 1577, FAB-MS-glyseroli-DMSO: molekyylimassa-alueen ionit (m/z): 1215, 1247, 1279, 1293, 1325, 1353, NaCl-lisäys (m/z): 1215, 1237, 1247, 1269, 1325, 1347, 1375.
Laite Kratos MS-50, FAB-MS-tioglyseroli, molekyylimassa-30 alueen ionit (m/z): 1357, 1463.
Molekyylipaino (yllä olevien massaspektriarvojen perusteella): näennäinen mp. 1248
Ydinmagneettinen resonanssispektri: Laite WM360 Brucker, liuotin: CDC13, 1NMR: 360 MHz 6 (ppm): 11,75 (1H, s), 35 8,55 (1H, s), 7,45 (iH, s), 6,61 (1H, m), 6,23 (1H, leveä 3i 81114 s), 6,17 (1H, leveä s), 5,93 (1H, d, J = 9,3), 5,82 (1H, d, J = 9,3), 5,7 (1H, leveä s), 5,49 (1H, m), 5,45 (1H, d, J = 2,3), 5,38 (1H, leveä s), 4,95 (1H, d, J = 10,2), 4,64 (2H, m), 4,54 (1H, d, J = 2,3), 4,2 (1H, s), 4,15-5 3,35 (26-28H), [4,10 (1H, m), 4,02 (1H, leveä s), 3,95 (3H, s), 3,85 (3H, s), 3,79 (3H, s), 3,46 (1H, m), 3,40 (3H, s)], 2,82-2,70 (3H, leveä m), 2,50 (3H, s), 2,47 (1H, m), 2,38-2,22 (5H), 2,12 (1H, m), 2,11 (3H, s), 1,60 1,05 (22H), 1,39 (3H, d,J = 6,3), 6,31 (3H, d, J = 6,3), 10 1,29 (3H, d, J = 6,3), 1,08 (6H)
Ks. kuvio 10 13C-NMR: 90,3 MHz Ks. kuvio 11
Erilliskokeella määritettiin puhdistetun BBM-1675 15 Ax:n 13C-NMR-spektri CDCl3:een liuotetulla näytteellä (80 MHz). Pääpiikit ilmenevät alla.
BBM-1675 A,:n CMR (80 MHz 80 CDCl,:ssa)
Kemiallinen siirtymä ppm (kerrannaisuus *) BBM-1675 A1 20 3,7 (q) 16,6 (q) 17,5 (q) 19,8 (q) 22,2 (q) 22,6 (q) 23.4 (q) 29,0 (t) 34,0 (t) 35,1 (t) 39,5 (t) 47,2 (d) 52.5 (q) 55,6 (u) 56,0 (q) 57,1 (d) 62,4 (t) 64,5 (d) 67,7 (d) 68,2 (d) 68,8 (t) 69,2 (d) 69,6 (t) 70,2 (d) 71,9 (d) 76,0 (d) 76,6 (d) 77,1 (u) 77,3 (d) 83,4 (s) 25 86,6 (d) 88,4 (s) 90,5 (t) 97,2 (d) 98,3 (s) 99,0 (d) 99.6 (d) 103,8 (d) 107,6 (s) 112,5 (d) 123,1 (d) 124,9 (d) 130,1 (d) 131,5 (s) 134,9 (s) 136,7 (s) 144,0 (s) 147,2 (s) 153,8 (s) 154,4 (s) 155,0 (s) 160,7 (s) 166,4 (s) 191,8 (s) 30 * Kerrannaisuus: q kvartetti, d - dubletti, u = epävar ma, t = tripletti, s = singletti BBM-1675 A,
Kuvaus: valkoisia kiteitä, sp. 147-149 °C Alkuaineanalyysi C: 52,71 %, H: 5,94 %, N: 3,94 %, 35 S: 9,39 %, 0 (erotuksena): 28,01 % 32 81114
Ultraviolettiabsorptiospektri: Laite Varian UV, Cary 219 Liuotin metanoli, konsentraatio 0,02052 g/l > aak,( nm) Absorptio 320 12,2 5 282 16,3 252 26,2 214 25,8
Happo ja emäs eivät aiheuta merkitseviä muutoksia Optinen kierto: [a]*7 = -179,4° (c = 0,5, CHC13) 10 Infrapunaspektri: ks. kuvio 12 Laite Beckmann IR malli 420 Pääabsorptiokaistat (KBr): 950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, 1405, 1450, 1520, 1595, 1610, 1685, 1735, 2940, 2980, 3440 cm'1 15 Massaspektri: Laite VG-ZAB-2F, FAB-MS-tioglyseroli, mole-kyylimassa-alueen ionit (m/z): 968, 1249, 1355, 1357, 1463, 1569, NaCl-lisäys (m/z): 990, 1271, 1379, 1485, 1593, FAB-MS-MB (MB: matriisi, mp. 154), molekyylimassa-alueen ionit (m/z): 1249, 1403, 1419, 1555, 1571, 1587, 20 NaCl-lisäys (m/z); 1249, 1271, 1425, 1441, 1457, 1483, 1577, FAB-MS-glyseroli-DMSO, molekyylimassa-alueen ionit (m/z): 1215, 1231, 1247, 1263, 1279, 1293, 1309, 1325, 1326, 1341, 1353, 1369.
Molekyylipaino (yllä olevien massaspektriarvojen perus-25 teella): näennäinen mp. 1248
Ydinmagneettinen resonanssispektri: ks. kuvio 13, laite WM 360 Brucker, liuotin CDC13, ^-NMR 360 MHz 6 (ppm): 11,91 (1H, s), 8,62 (1H, s), 7,58 (1H, s), 6,56 (1H, m), 6,22 (1H, s), 6,15 (1H, leveä s), 5,91 (1H, d, J - 9,6), 30 5,83 (1H, d, J = 9,6), 5,70 (1H, m), 5,45 (1H, d, J - 2.2) , 5,44 (1H, s), 5,34 (1H, leveä s), 4,95 (1H, d, J = 10.2) , 4,75 (1H, m), 4,65 (1H, d, J= 6,8), 4,54 (1H, d, J = 2,2), 4,47 (1H, m), 4,18 (1H, s), 4,10 (1H, leveä s), 4,05-3,50 (20-24H), [3,96 (3H, s), 3,87 (3H, s), 3,77 35 (3H, s)], 3,46 (1H, m), 3,39 (3H, s), 2,79 (lH,m), 2,73 33 81 1 1 4 (2H, m), 2,50 (3H, s), 2,50 (lH,m), 2,38-2,22 (3H), 2,14 (1H, m), 2,10 (3H, s), 1,98 (2H, m), 1,65-1,45 (6-8H), 1,38 (3H, d, J = 6,0), 1,34 (3H, d, J = 6,0), 1,22 (3H, d, J = 6,8), 1,10 (6H).
5 13C-NMR 90,3 Mhz
Ks. kuvio 14
Erilliskokeessa määritettiin puhdistetun BBM-1675 A2:n 13C-NMR-spektri CDCl3:een liuotetulla näytteellä (80 MHz). Pääpiikit ilmenevät alla.
10 BBM-1675 A? 13,7 16,9 17,5 19,8 22,3 22,7 23,4 33,1 34,1 35,1 39,3 47,6 52,6 55,7 56,0 56,1 57,6 62,4 64,5 64,9 65,9 68,3 69,2 69,7 71,9 73,6 75,8 76,1 77,1 77,7 78,1 78,3 83,3 86,2 88,4 90,4 97,2 98,3 99,1 99,5 15 99,6 103,8 107,1 112,4 123,2 124,8 129,9 137,3 144,1 154,2 154,5 160,9 167,9 192,2 BBM-1675 A^, , B1 ja B2:n fysikaalis-kemialliset ominaisuudet _ _ _Α^____A^________Βα___________B2______
Sulamispiste (hajoaa): 125-127°C 123-126°C 159-161°C 156-159°C
20 /06/27 (c 0/5f chc^) -161 °C -176°C -171°C -122°C
Analyysi saatu (%): C: 54,55 54,65 H: 6,46 6,29 N: 3,73 3,51 . S: 7,49 8,07 UVAmaksnm(E1%cm,Me0H:SSa: 253<286> 253(257) 253(225) 248(212) 25 282(158) 282(153) 282(140) 279(141) 320(122) 320(117) 320(104) 318(103) 0,01-n HCl-MeOH:ssa: 253(287) 253(258) 253(225) 248(210) 282(160) 282(155) 282(140) 279(140) 320(126) 320(118) 320(105) 318(103) 30 0,01-n NaOH-MeOH:ssa: 252(280) 252(266) 252(236) 248(233) 283(162) 283(160) 283(141) 278(150) 318(120) 318(118) 318(105) 318(110) 35 BBM-1675-komponenteille ohutkerroskromatografialla 34 81 1 1 4 (TLG) ja suuren suorituskyvyn nestekromatografiällä (HPLC) saadut arvot A. Tutkimus nro 1 - Yhteenveto
Taulukko 8
5 BBM-1675-komponenttien TLC ja HPLC
_TLC _ HPLC (retentioaika min»)
SiC>2 *Silanoitu Lichrosorb RP-18 CHC13- CH3CN-H20 CHjCN-MeOH-O,1-m 10 MeOH (75:25 t/t) CH3COONH4 (5:1 t/t) (5:2:3 t/t) BBM-1675 A1 0,74 0,18 13,3 BBM-1675 A2 0,71 0,21 17,3 BBM-1675 A3 0,72 0,28 8,0 15 BBM-1675 A4 0,71 0,78 5,1 BBM-1675 B1 0,63 0,23 BBM-1675 B2 0,60 0,16 *C.Q-käänteisfaasisilikageeli Ί ö B. Tutkimus nro 2 - Puhdistettujen komponenttien 20 A1 ja A2 TLC ja HPLC TLC-kromatografia
Kaikessa normaalifaasikromatografioinnissa käytettiin Analtech GHLF Silicagel Uniplates-levyjä. Yksiulotteisessa TLC:ssä käytettiin levyjä, joiden mitat olivat 2,5 cm x 10 cm. Nämä kehitettiin lasilieriöissä, joiden 25 mitat olivat 6,4 cm (ulkohalkaisija) x 12 cm ja jotka sisälsivät 10 ml eluenttia. Kaksiulotteisessa TLCrssä käytettiin levyjä, joiden mitat olivat 7,5 cm x 10 cm. Näyte pantiin vasempaan alakulmaan 1 cm reunoista. Levy kehitet-ensin tankissa (pohjan mitat 12,7 cm x 8,6 cm, korkeus 30 13 cm), jossa oli 50 ml ensimmäistä eluenttia. Sitten levy kuivattiin ilmassa, käännettiin 90° vastapäivään ja kehitettiin toisessa tankissa, jossa oli 50 ml toista eluenttia.
Kaikessa käänteisfaasikromatografioinnissa käytet-35 tiin Whatmanin analyyttisiä, esipäällystettyjä C-18-sili- 35 81 1 1 4 kageelilevyjä. Levyt, joiden mitat olivat 2,5 cm x 7,6 cm, kehitettiin lasilieriöissä, joihin mahtui 10 ml eluenttia.
Normaalifaasilevyjä tarkasteltiin ensin 254 nm UV-lampun alla. Sitten levyt työnnettiin lasilieriöön (ulko-5 halkaisija 6,4 cm x 12 cm), jossa oli I2~kiteitä. Sitten levyjä tutkittiin uudelleen n. kahden minuutin kuluttua. Kään-teisfaasilevyjä tarkasteltiin vain 254 nm UV-lampun alla. Vyöhykkeet todettiin panemalla merkille levyyn kyllästetyn väriaineen fluoresenssin häviäminen.
10 Analyyttinen HPLC
Analyyttisen HPLC-systeemin rakentamisessa käytettiin seuraavia komponentteja: Waters Associates malli 6000A-liuottimien syöttöpumppu, Varian Varichrom malli VUV-10 uv/ näkyvä-detektorisarja aallonpituus 254 nm, optinen tiheys 15 0,1, Fisher Recordal sarja 5000-piirturi, Waters Associates malli 660-liuotinohjelmoija, Waters Associates malli U6K-injektori, Alltech, yu-Bondapak (10 /1) -kolonni (sisähal-kaisija 4,6 mm x 25 cm) varustettuna Whatman Co. Pell ODS (0,03 - 0,038 mm)- suojakolonnilla (sisähalkaisija 4,6 mm x 20 5 cm). Komponentit liitettiin toisiinsa ruostumatonta te rästä 316 olevilla putkilla (ulkohalkaisija 1,6 mm, sisähalkaisi ja 0,23 mm). Kaikissa analyyseissä eluentin pump-pausnopeus oli 2 ml/min.
Preparatiivinen HPLC
25 Keskipainenestekromatografiasysteemin rakentamisessa käytettiin seuraavia komponentteja: Fluid Metering, Inc. malli RP-SY 2CSC FMI-laboratoriopumppu, Fluid Metering,
Inc. malli PD-60LF FMI-sykkeenvaimennin, 15 ml:n näytekie-rukka, joka muodostui polypropeeniputkesta (ulkohalkaisija 30 3,0 mm, sisähalkaisija 1,5 mm) kiedottuna pahviputken ympä rille (ulkohalkaisija 8,65 cm), Glenco sarja 3500 LC-yleis-kolonneja, Instrument Specialties Co. malli UA-5 absorbanssi/ fluoresenssimonitori varustettuna optisella yksiköllä tyyppi 6, Instrumentation Specialties Co. malli 590 virtauksen 35 katkaisuventtiilillä sekä Instrumentation Specialties Co.
36 81 1 1 4 malli 328 -fraktionkerääjä. Komponentit yhdistettiin toisiinsa polypropeeni- ja teflonputkilla (ulkohalkaisija 3,0 mm, sisähalkaisija 1,5 mm) ja Glenco multifit-liittimillä ja -venttiileillä mainitussa järjestyksessä.
5 Vakiotekniiköita käyttäen Glenco-sarjän 3500 LC- yleiskolonnit pakattiin liettämällä määritellyllä absorben- tilla ilmoitetussa liuottimessa. Laskeutuneen täytteen ja putken yläpään välinen tyhjä tila täytettiin Ottawa-stan- dardihiekalla. Eluentti pumpattiin maksiminopeudella, jossa 2 10 vastapaine 4,2 kg/cm ei ylittynyt (n. 20 ml/min).
Gradienttieluointi
Kaikissa gradienttieluoinneissa käytetään Glencon gradienttieluointilaitteistoa, joka muodostui kahdesta saman halkaisijan, korkeuden ja tilavuuden omaavasta kammiosta lii-15 tettyinä peräkkäin teflonventtiilien välityksellä. Toinen kammio toimi sekoituskammiona ja toinen staattisena säiliönä. Aluksi poolittomampi liuotin pidettiin sekoituskammi-ossa. Poolisempi liuotin pidettiin staattisessa säiliössä. Molempiin kammioihin asetettiin teflonilla päällystetty mag-20 neettisauva (1,0 x 3,7 cm) ja sauvoja pyöritettiin Thomas malli 15 Magne-matic-sekoittimilla. Eluentti pumpattiin se-koituskammiosta keskipaine-HPLC-systeemiin polypropeeniput-ken kautta (sisähalkaisija 1,5 mm, ulkohalkaisija 3,0 mm). Samalla kun eluenttia poistui sekoituskammiosta, se korvau-25 tui staattisesta säiliöstä vapaasti virtaavalla liuottimena ja näin eluentissa syntyi lineaarinen gradientti.
BBM-1675 A^:n ja An TLC-analyysl Alla oleva taulukko 9 on yhteenveto BBM-1675 A^rllä ja A2.’lla havaituista R^-arvoista normaalifaasilevyillä. R^ 30 on laskettu jakamalla vyöhykkeen keskipisteen etäisyys näytteen asetuskohdasta liuotinrintaman mitatulla etäisyydellä näytteen asetuskohdasta.
37 81 1 1 4
Taulukko 9 Rf
Systeemi/yhdiste BBM-1675 BBM-1675 A^ 4 % metanolia kloroformissa 0,33 0,30 5 % metanolia dietyylieetterissä 0,39 5 50 % asetonia Skellysolve B:ssä 0,38 0,31
Alla oleva taulukko 10 on yhteenveto BBM-1675 A^:llä ja Ä2:lla havaituista R^-arvoista normaalifaasilevyillä, jotka on kehitetty kaksiulotteisesti. Täplien sijainnit on ilmaistu Cartesiuksen koordinaateilla. X-koordinaatti tar-10 koittaa taulukossa toisen liuotinsysteemin R^-arvoja.
Y-koordinaatti tarkoittaa taulukossa ensimmäisen liuotinsysteemin R^-arvoja.
Taulukko 10 R^
Systeemi/liuotin BBM-1675 A^ BBM-1675 A^
15 4 % metanolia kloroformissa VS
5 % metanolia dietyylieetterissä (0,34, 0,33) (0,28, 0,23)
4 % metanolia kloroformissa VS
50 % asetonia Skellysolve B:ssä 0,33, 0,29
Alla oleva taulukko 11 on yhteenveto BBM-1675 A^:llä 20 ja Ä2:lla havaituista R^-arvoista C-18 käänteisfaasi-TLC-levyillä, jotka on kehitetty binaarieluenteissa.
Taulukko 11 Rf
Systeemi/yhdiste BBM-1675 A^ BBM-1675 A^ 25 % 0,5-m NaCl asetonitriilissä 0,18 0,21 25 25 % vettä asetonitriilissä 0,00 0,00
Alla oleva taulukko 12 on yhteenveto BBM-1675 A^tllä ja A2:lla havaituista R^-arvoista C-18 käänteisfaasi-TLC-levyillä, jotka on kehitetty ternaarieluenteilla.
38 8 1 1 1 4
Taulukko 12 Rf
Systeemi/yhdiste BBM-1675 BBM-1675 A^,
Asetonitriili: metanoli: 0,5-m NaCl 80 % : 10 % : 10 % 1,00 1,00 5 60 % : 10 % : 30 % 0,57 0,50 40 % : 30 % : 30 % 0,32 0,22 30 % : 50 % : 20 % 0,44 0,33 50 % : 30 % : 20 % 0,62 0,54 40 % : 40 % : 20 % 0,60 0,49 10 50 % : 20 % : 20 % 0,42 0,34 60 % : 20 % : 20 % 0,74 0,69
Asetonitriili : metanoli : vesi 40 % : 30 % : 20 % 0,00 0,00
Asetonitriili : metanoli : 0,1-m NH4OAC 15 40 % : 30 % : 30 % 0,32 0,22
Asetonitriili : metanoli : 0,1-m Nal^PO^ 40 % : 30 % : 30 % 0,00 0,00 BBM-1675 A^:n ja A^:n HPLC-analyysi BBM-1675 A^ ja A2 analys°itiin käyttäen yhtä, binaari-20 ja ternaarieluenttia C-18-käänteisfaasisilikageelikolon-neissa. Alla olevat taulukot 13, 14 ja 15 ovat yhteenvetoja näillä yhdisteillä havaituista K'-arvoista. K' laskettiin seuraavasta kaavasta: , _ TR - To K To 25 jossa TR on retentioaika mitattuna injektioajankohdasta piikin huippuun ja To on kuolluttilavuuden aika.
Taulukko 13 K,
Systeemi/yhdiste BBM-1675 A^ BBM-1675 A^ 30 Asetonitriili a a
Tetrahydrofuraani a a
Metanoli 0,00 0,00 a = yhdiste ei eluoitunut kolonnista
Taulukko 14 K1 39 81 1 1 4
Systeemi/yhdiste BBM-1675 A1 BBM-1675 A2 25 % vettä asetonitrlillssä a a 25 % vettä metanolissa 1,25 1,25 5 a = yhdiste ei eluoitunut kolonnista
Taulukko 15
Ternaarieluentit K *_
Systeemi/yhdiste BBM-1675 A1 BBM-1675
Asetonitriili: metanoli: vesi 10 40 % : 30 & : 30 % a a
Asetonitriili: metanoli: 0,1-m NH.OAc 4 40 % : 30 % ; 30 % 1,7 3,0 50 % : 20 % ; 30 % 3,8 6,5 43,5 %: 23,5 % : 33,3 % 6,1 b 15 42,5 %: 22,5 % : 35,0 % 7,8 b 41 ,5 %: 21,5 % : 37,0 % 9,7 b a = ei eluoitunut, b = ei määritetty BBM-1675-komponenttien mikrobien vastainen aktiivisuus määritettiin useiden bakteerien (gram-positiivisia, 20 gram-negatiivisia ja haponkestäviä) ja sienten suhteen kaksinkertaisella agarsarjalaimennusmenetelmällä. Gram-positiivisille ja gram-negatiivisille bakteereille käytettiin ravintoagaralustaa ja haponkestäville bakteereille kasvualustaa nro 1001 (3 % glyserolia, 0,3 % natrium-L-25 glutamaattia, 0,2 % peptonia, 0,31 % Na2HP04, 0,1 % KH^P04, 0,005 % ammoniumsitraattia, 0,001 % MgSO^ ja 1,5 % agaria). Sienille käytettiin Sabouraudin agarkasvualustaa. Kuten taulukosta 16 käy ilmi, kaikilla kuudella BBM-1675-kompo-nentilla (A1, A^r A4, B1, B2> oli laaja mikrobien 30 vastainen tehokirjo. Erityisesti BBM-1675 A^, A^, A^ ja A4 tehosivat erittäin hyvin gram-positiivisiin bakteereihin.
40 81 1 1 4
Taulukko 16 BBM-1675 komponenttien mikrobien vastainen aktiivisuus
Kanta -—^ ^g/ml ____ _ BBW-167S At *3 A« Bj aureus 209P <0,0008 0,0063 0,0063 0,0125 0,012 0,0063 aureus Smith <0,0008 0,0031 0,0063 0,0125 0,012 0,012 !L· subtills PCI 219 <0,0008 0,05 0,0125 0,0125 0,05 0,05
Mj, luteus 1001 0,0016 0,0063 0,0125 0,0125 0,1 0,1 M. flavus <0,0008 0,0016 0,0063 0,0125 0,025 0,025
Mvcobscterium 607 °i05 0,1 ei hoid. ei hoid . 0,05 0,025
Cj. coli MIHJ <V 0,8 1,W 3,1- 0,8 3,1 pneumoniae Dll °|4 0,8 1,6 3,1 0,8 0,8 P^ aeruginosa DlS °i® 1,6 3,1 3,1 3,1 C. albicans IAM «888 M 0,4 1,6 6,3 3,1 1,6 C. ncoformans lj6 3,1 1,6 6,3 6,3 12,5
Suoritettiin toinen mikrobien vastaisen tehon määri-tyskoe puhdistetulla Akilla ja A2:lla (valmistettu esimerkissä 3 alla) sekä komponenteilla A^ ja A^. Tulokset ilmenevät 15 alla yhteenvetona. apt:11a määritetty MIC (pm/ml) _Kanta BDM-1675 Aj A3 A< S. aureus 209P <0,0008 0,0063 0,0063 0,012 li aureua Smith <0,0008 0,0031 0,0063 0,012 subtilis PCI 219 <0,0008 0,05 0,012 0,025 li luteus 1001 0,0016 0,0063 0,012 0,05 h. flavus <0,0008 0,0016 0,0063 0,012 20 Mycobacterium 607 0,05 0,1 0,16 0,16 E. coli NIHJ 0,1 0,8 1,6 3,1 £l pneumoniae Dll 0,4 0,8 1,6 3,1 P. aeruginosa D15 0,8 1,6 3,1 3,1 B. fragills A20928 0,2 1,6 0,2 0,4 C_J_ difficile A2167S 0,4 0,8 0,05 0,4 O perfringens A9635 0,05 0,8 0,4 0,4 C. albicans IAM 4888 0.4 0.4 l.t «
o C ’ - I 1 1 w J
Δζ> C. neoformans 1}6 3,1 1,6 6,3 BBM-16 75-komponenttien esifaagi-induktioaktiivi- suus lysogeenisessä bakteerissa E. coli (λ) määritettiin Lein et ai., Nature 196: 783-784 (1962) menetelmän mukaan. Plakit laskettiin agarmaljoista, jotka käsittivät testiaineksen (T) 30 ja kontrollimar jän (C) . Plakkien lukumäärän T/C-suhdetta suurempi kuin 3,0 pidettiin merkitsevänä ja lysogeeninen in-duktioaktiivisuus (ILB-aktiivisuus) ilmaistiin testiyhdisteen induktiokyvyn minimikonsentraationa. Kuten taulukosta 17 käy ilmi, BBM-1675-komponenteilla oli voimakas ILB-aktiivi-35 .
suus lysogeenisissä bakteereissa. Tämä viittaa snhen, että komponentit saattavat tehota kasvaimiin.
i 4i 81114
Taulukko 1 7 BBM-1675-komponenttien lysogeeninen induktioaktii-visuus
Antibiootti MIC* (jmn/ml) 5 BBM-1675 A1 0,0063 BBM-1675 A2 0,0125 BBM-1675 A3 0,05 BBM-1675 A4 0,10 BBM-1675 B1 0,10 10 BBM-1675 B2 0,20 * induktiokyvyn minimikonsentraatio BBM-1675 A^:n ja A2:n teho kasvaimiin määritettiin erilaisilla hiirikasvainsysteemeillä. Lymfosyyttinen leukemia P-388, lymfoidinen leukemia L-1210, melanoottinen mela-15 nooma B16 ja Lewisin keuhkokarsinooma siirrettiin intraperito-neaalisti BDF.-koirashiiriin siirrostusmäärän ollessa vastaa- /* J-C C £ vasti 10 , 10 , 5 x 10 ja 10 solua per hiiri. Testi-yhdisteitä annettiin hiirille intraperitoneaalisti asteittain muuttuvina määrinä 24 tuntia kasvaimella siirrostamisen 20 jälkeen. Lääkeainetta annettiin vain kerran ensimmäisenä päivänä, 1., 4. ja 7. päivänä (q3d x 3), kerran päivässä 9 päivää (qd1—*9) tai 11 päivää (qd 1 —>11). Komponentteja A^ ja A4 testattiin vain P-388 leukemiaan ohjelmalla q3d x 3 aineksen vähyyden vuoksi.
25 BBM-1675 A1, A2, A^ ja A4 liuotettiin 0,9-%:iseen keittosuolaliuokseen, jossa oli 10 % dimetyylisulfoksidia, ja vertailuyhdisteenä käytettiin kromomysiini A^:a (Toyomycin, Takeda) liuotettuna 0,9-%:iseen keittosuola-liuokseen. Hoidettujen ja hoitamattomien hiirien kuolemi-30 nen tai eloonjääminen merkittiin päivittäin muistiin ja kullekin testiryhmälle (T) ja kontrolliryhmälle (C) laskettiin eloonjäämisajän keskiarvo. T/C-arvo, joka oli yhtä suuri tai suurempi kuin 125 %, osoitti, että oli saavutettu merkitsevä kasvaimen estovaikutus. Tulokset ilmenevät 35 taulukoista 18 - 23. BBM-1675 A^ ja A2 tehosivat erittäin 42 81 1 1 4 voimakkaasti P-388 leukemiaan T/C-maksimiarvon ollessa 160%. Minimitehoannokseksi laskettuna ne olivat suunnilleen 100-3000-kertaa aktiivisempia kuin kromomysiini · BBM-1675 A^ ja A^ tehosivat kuitenkin heikommin P-388 leukemiaan kuin 5 komponentti A tai A2 (taulukko 19). BBM-1675 A^ ja A2 tehosivat myös L-1210 leukemiaan (taulukko 21), B16 melanoomaan (taulukko 22) ja Lewisin keuhkokarsinoomaan (taulukko 23). BBM-1675 A^ :n ja Ä2tn toksisuus määritettiin ddY-koi-rashiirellä antamalla intraperitoneaalisti tai laskimoon; 10 BBM-1675 A^ oli noin 10-kertaa toksisempi kuin BBM-1675 A2 (taulukko 24). BBM-1675 A^:n ja A2:n terapeuttiset indeksit olivat 4 -8- ja vastaavasti 8-20~kertaa parempia kuin kromomysiini A^lla P-388 leukemiasysteemissä (taulukko 25). Suoritettiin toinen koesarja antamalla laskimoon 15 BBM-1675 komponentteja P-388 ja L-1219 leukemiaa vastaan, 5 jotka siirrostettiin laskimoon määrinä 5 x 10 ja vastaavasti 10^ solua per hiiri. Näissä kokeissa käytettiin vertailuaineena adriamysiiniä, joka liuotettiin 0,9 %:iseen keitto-suolaliuokseen ja annettiin 1., 4. ja 7. päivänä. Tulokset 20 ilmenevät taulukoista 26 ja 27. T/C-arvona, minimitehoan-noksena ja aktiivisuusalueena ilmaistuna sekä komponentti A^ että A2 oli parempi kuin adriamysiini.
Taulukko 18 43 8 1 1 1 4 BBM-1675 komponenttien vaikutus P-388 leukemiaan (Hoito 1. päivänä)
Annos i.p. MST T/C Keskim.pai- Eloonjääneet 5 (mg/kg/vrk*) (vrk) (%) nonmuutos 5.p:nä 45.p:nä _ 5.p:nä (g) BBM-1675 A °/03 19l° -2,6 5/5 0/5 1 0,01 19, 0 (XsT) -1,0 5/5 0/5 0,003 18,0 Su) -1,0 5/5 0/5 0,001 20,0 (Ϊ60) -1,4 5/5 0/5 0,0003 16,0 (ΠΊΡ 0,0 5/5 0/5 Ί 0 0,0001 15,0 120 -0,2 5/5 0/5 0,00003 14,0 112 -0,2 5/5 0/5 BBM-1675 A °/3 61° 48 ~3;8 3/5 0/5 2 0,1 20,0 (160} -1,8 5/5 0/5 0,03 18,0 (Up -1,4 5/5 0/5 0,01 17,0 ¢36} -0,6 5/5 0/5 0,003 17,0 (US) -0,4 5/5 0/5 0,001 16,0 (128) 0,0 5/5 0/5 0,0003 15,0 120 0,0 5/5 0/5 0,0001 14,0 112 0,0 5/5 0/5
Kromomysiini A 1 19,0 (IT2) -0,2 4/5 0/5 20 0,3 17,0 (Up +0,6 5/5 0/5 0,1 16,0 (m) +0,8 5/5 0/5 0,03 14,0 112 0,0 5/5 0/5 0,01 14,0 112 -0,2 5/5 0/5 Välitysaine " 12'5 ’ +0'1 10/10 0/10 25 * 1. p:nä
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 19 BBM-1675 komponenttien vaikutus P-388 leukemiaan (Hoito 1., 4. ja 7. p:nä) 44 8 1 1 1 4
Annos i.p. MST T/C Keskim. pai- Eloonjääneet 5 (mg/kg/vrk*) (vrk) (%) nonmuutos 5. 5.p:nä 45.p:nä -_ _ _ o;nä (g) _ .
BBM-1675 A1 0,03 7,0 56 -2,8 5/5 0/5 0,01 19,0 . vyp -i;o 5/5 0/5 0,003 19,0 (tip -0,6 5/5 0/5 0,001 16,0 -0,6 5/5 0/5 0,0003 17,0 (ne) -0,4 5/5 0/5 10 0,0001 16,0 /Γ2Τ) -0,2 5/5 0/5 0,00003 14,0 112 +0,4 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0,3 toks. - - 2/5 0/5 0,1 11,0 88 -1,0 5/5 0/5 0,03 18,0 (iTj) -1,2 5/5 0/5 0,01 18,0 (UV -0,4 5/5 0/5 0,003 18,0 0·4 4> -0,4 5/5 0/5 0,001 17,0 (I3p -0,4 5/5 0/5 0,0003 16,0 (ΐίβ) -0,4 5/5 0/5 0,0001 16,0 (I2jp -0,2 5/5 0/5 0,00003 15,0 120 -0,4 5/5 0/5 BBM-1675 A^ 0,01 17,5 (l40^ +0,2 4/4 0/4 2q 0,001 15,0 120 +0,6 4/4 0/4 0,0001 13,5 108 +0,6 4/4 0/4 BBM-1675 A4 0,01 16,5 /ίΤΓ) +0,2 4/4 0/4 0,001 14,0 112 +0,4 4/4 0/4 0,0001 12,5 100 +0,6 4/4 0/4 25 Kromomysiini A^ 0,3 18,0 (^144) +0,6 5/5 1/5 0,1 18,0 (^44) +0,6 5/5 0/5 0,03 17,0 (Π<p -0,2 5/5 0/5 0,01 14,0 112 0,0 5/5 0/5 Välitysaine ....
12,5 - +0,4 10/10 0/10 30 * 1., 4. ja 7. p:nä i.p.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen
Taulukko 20 45 81 1 1 4 BBM-1675 komponenttien vaikutus P-388 leukemiaan (Hoito kasvava annos 1 —>9)
Annos i.p. MST T/C Keskim. pai- Eloonjääneet 5 (mg/kg/vrk1) (vrk) (%) nonmuutos 5. 5.p:nä 45.p:nä ___ _ p:nä (g) _ _ BBM-1675 A °f01 7»° 56 -1,8 5/5 0/5 1 0,003 13,0 104 -1,0 5/5 0/5 0,001 19,0 <5ZD _1l2 5/5 0/5 0,0003 19,0 £152? -0,8 5/5 0/5 0,0001 18,0 (144) 0,0 5/5 0/5 0,00003 16,0 (128) +0,2 5/5 0/5 0,00001 16,0 (12?) -0,2 5/5 0/5 BBM-1675 A2 0,1 6^0 48 _2;2 4/5 0/5 0,03 13,0 104 -1,4 5/5 0/5 0,01 18,0 £144) -1,0 5/5 0/5 15 0,003 18,0 (L44? -0,6 5/5 0/5 0,001 18,0 (m) -0,8 5/5 0/5 0,0003 17,0 (ni) -0,4 S/5 0/5 0,0001 16,0 (lii) -0,4 5/5 0/5 0,00003 15,0 120 -0,6 5/5 0/5 0,00001 15,0 120 +0,4 5/5 0/5 20 Kromomysiini A-j0,3 9,0 72 -2,0 5/5 0/5 0,1 18,0 (T44) +0,4 5/5 0/5 0,03 18,0 dTP 0,0 5/5 0/5 0,01 15,0 120 -0,2 5/5 0/5 0,003 13,0 104 -0,2 5/5 0/5 Välitysaine _ 12,5 - +0,4 10/10 0/10 25 qd 1-99, i.p.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 21 BBM-1675 komponenttien vaikutus L-1210 leukemiaan 46 81 1 1 4
Annos MST T/C Keskim.pai- Eloonjääneet (mg/kg/vrk*) (vrk) (%) nonmuutos 5.p:nä 45.p:nä 5.p:nä (g) BBM-1675 A1 0,003 14,5 (j5T) -1,7 6/6 0/6 0,001 12,0 (l2§) -0,5 6/6 1/6 0,0003 12,0 (Πδ} +0,3 6/6 0/6 0,0001 11,0 116 +1,0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 o,03 10,5 111 -1,5 6/6 0/6 0,01 13,5 (TT?) -1,2 6/6 0/6 0,003 13,0 (Ϊ37) -0,2 6/6 0/6 0,001 11,0 116 +1,3 6/6 0/6 0,0003 10,5 111 +1,0 6/6 0/6
Kromomysiini A °f3 8,5 89 -1,2 6/6 °/6 1 5 0,1 11,5 121 +1,2 6/6 0/6 0,03 11,0 116 +1,2 6/6 0/6 0,01 11,0 116 +1,3 6/6 0/6 0,003 10,0 105 +1,5 6/6 0/6 Välitysaine - 9,5-+1,4 12/12 0/12 20 * qd 1-99, i.p.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 22 BBM-1675 komponenttien teho B16 melanoomaan 47 8 1 1 1 4 5 Annos MST T/C Keskim.pai- Eloonjääneet (mg/kg/päivä*) (vrk) (%) nonmuutos 5.p:nä 45.p:nä 5. p:nä _ (g)_ BBM-1675 Aj 0,003 10,0 61 -0,7 6/6 0/6 0,001 31,5 ^liT) 0,0 6/6 0/6 0,0003 40,5 (24jp +0,3 6/6 0/6 1 0 0,0001 27,0 Ö-lsQ +0,8 6/6 0/6 0,00003 22,0 +1,8 6/6 0/6 0,00001 18,0 109 +2,2 6/6 0/6 BBM-1675 A 0,03 11,0 67 -0,8 6/6 0/6 2 0,01 26,5 (I6p +0,3 6/6 0/6 0,003 29,5 (fTp +0,2 6/6 0/6 0,001 26,0 OsO +0, 8 6/6 0/6 0,0003 22,0 (Hp +0,2 6/6 0/6 0,0001 18,0 109 +0,2 6/6 0/6 0,00003 17,0 103 +1,7 6/6 0/6
Kromomysiini A 0)1 1i5 6/s °/6 20 J 0,03 23,0 (yp +2,2 6/6 0/6 0,01 21,0 (l2TJ +2,3 6/6 0/6 0,003 18,0 109 +2,2 6/6 0/6 Välitysaine - 16,5 - +2,1 12/12 0/12 * qd l-»9, i.p.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 23 BBM-1675 komponenttien teho Lewisin keuhkokarsinoomaan 48 81 1 1 4 fäg?tg/päiva*) ^vrk) T/C Keskim.pai- Eloonjääneet -3 (%) nonmuutos 5.p:nä 45.p:nä ------ -- -5.p:nä (ql. ----- - BBM-1675 Aj 0;003 1.0,0 91 -1,7 5/6 0/6 °l001 31,S /28?) -0,7 6/6 1/6 °;0003 21,5 (19¾ -0,7 6/6 0/6 °)0001 21,0 (m) +1,0 6/6 0/6 0,00003 13,0 H8 +1,0 6/6 0/6 10 0,00001 11,5 105 +1,0 6/6 0/6 BBM-1675 A2 °>03 10,0 91 -1,8 6/6 0/6 °/01 25,5 (XrQ ' -1;7 6/6 0/6 °;003 28,5 (259) 0,0 6/6 1/6 °;°°1 17,0 (155) -0,3 6/6 0/6 15 0,0003 15,0 (136) +1,2 6/6 0/6 0,0001 10,5 95 +0,S 6/6 0/6 0,00003 11,0 100 +0,8 6/6 0/6
Kromomysiini A.0,1 21,5 (i?j> +1,2 6/6 1/6 °;03 17,0 +1,7 5/5 0/5 °/01 17,0 (15?) +1,5 6/6 0/6 20 0,003 11,5 105 +1,7 6/6 0/6 Välitysaine - 11,0 - +0,8 12/12 1/12 * qd 1->11 , i. p.
25
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 24 BBM-1675 komponenttien toksisuus LD5q(mg/kg/päivä) 49 81 1 1 4
Kerta-annos moninkertainen annos (qd1-^9) 5 .
1.p. l.V. 1.p.
BBM-1675 A1 0,019 0,010 0,00046 BBM-1675 A2 0,18 0,10 0,0072
Kromomysiini A^ 0,81 0,41 0,23
Taulukko 25 10 Terapeuttiset indeksit ld5Q/med* P-388
Kerta qd 1 -» 9 L-1210 B16 Lewis 15 BBM-1675 A1 63 >46 2 155 BBM-1675 A2 180 72 2 24 24
Kromomysiini A^ 8 8 tehoton 23 23 * minimitehoannos
Taulukko 26 BBM-1675 komponenttien teho laskimoon siirrettyyn P-388 leukemiaan so 81114 5 Annos MST T/C Keskim.painon.
(mg/kg/päivä*) (vrk) (%) muutos 5.p:nä Eloonjääneet (g) 5.p:nä 45.p:nä BBM-1675 Ai 0,01 9,5 106 -1,7 6/6 0/6 0,003 14,0 /lii) -0,3 6/6 0/6 0,001 11,5 (l2jp +0,3 6/6 0/6 10 0,0003 9,0 100 +0,3 6/6 0/6 BBM-1675 A2 0,1 7,0 78 -3,7 6/6 0/6 0,03 15,0 (lip -1,0 6/6 0/6 0,01 12,0 -0,5 6/6 0/6 0,003 9,0 100 +1,0 6/6 0/6 15 Adriamysiini 30 toks - - 0/6 0/6 10 9,0 100 -1^5 6/6 0/6 3 12,0 (I33) +0,7 6/6 0/6 1 9,0 100 +1,7 6/6 0/6 Välitysaine ~ 9,0 _ +1,7 12/12 0/12 20 * 1., 4., ja 7. p:nä, l.v.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
Taulukko 27 51 81114 BBM-1675 komponenttien teho laskimoon siirrettyyn L-1210 leukemiaan
Annos MST T/C Keskim.painon. Eloonjääneet 5 (mg/kg/päivä*) (vrk) (%) muutos 5.p:nä 5.p:nä 45.p:nä _ _ _(g)_ _ _ BBM-1675 A 0,008 9,5 119 -2r0 4/6 0/6 1 0,004 14,0 (ίΤΓ) -0,2 6/6 0/6 0,002 13,0 Q.6 3J +0,2 6/6 0/6 0,001 9,5 119 +0,8 6/6 0/6 0.0005 9,0 113 +0.8 6/6 0/6 10 11 ' BBM-1675 A2 0,063 11,0 (TTT) -1,8 6/6 0/6 0,032 14,0 (HV +0,2 6/6 0/6 0,016 10,5 (in) +0,8 6/6 0/6 0,008 8,0 100 +1,2 6/6 0/6 0,004 8,0 100 +0,8 6/6 0/6 15
Adriamysiini 16 toks. ·* - 2/6 0/6 8 12,0 6JÖ) +0,2 6/6 0/6 4 9,0 113 +1,5 6/6 0/6 2 8,0 100 +1,7 6/6 0/6 Välitysaine - 8,0 - +1^4 12/12 0/12 20 * 1., 4. ja 7. p:nä i.v.
Rengastus osoittaa merkitsevän kasvainten estovaikutuksen.
52 81 1 1 4 BBM-1675 komponenttien A1 ja teho kasvaimiin määritettiin myös toisessa kokeessa P-388 leukemialla, L-1210 leukemialla ja B16 melanoomalla hiiressä. Näiden kokeiden tulokset ilmenevät alla taulukoista 28, 29 ja 5 30. Näissä kokeissa käytettyjen menetelmien yksityis kohdat ilmenevät Cancer Chemother.Rep. 3: 1-87 (osa 3), 1972.
Taulukko 28 BBM-1675 A.:n ja A0:n teho P-338 leukemiaan Keskim.pai- Eloon-Aines Hoito, Unnog itp. ug/kg/. MST Teho «on mHu£os Iaä»neet 1 o _ohjelma_palva_ (vrkl_5. p: na 5. p; na *NSN 38270 gdl-? 9 400 13·0 163 -°j6 s/s 200 11.0 138 -0,9 6/6 DMSO-keitto- l.p:nä 51,2 2o,o 250 -2,1 4/6 suolaliuos 25t* 18|0 22S -1,8 6/6 12,8 16, S 206 -1,1 6/6 6.4 13,0 163 *0,1 6/6 1 5 3,2 12,0 150 -0,3 6/6 1.6 11,0 138 -0,3 6/6 0,8 10,5 131 0 6/6 0,4 10,0 125 *0,4 6/6 0,2 10,0 125 »0,3 6/6 0,1 10,0 125 0 6/6 1 ä 25,6 8,0 100 -1,8 6/6 20 1*1* 13,5 169 -1^5 6/6 6.4 16,5 206 -0,8 6/6 3.2 16,0 200 -0,8 6/6 - 1,6 15,5 194 »0,3 6/6 0,8 12,5 156 *0,3 6/6 0,4 12,0 150 -0,1 6/6 0,2 11( 5 144 *0,2 6/6 0,1 12,0 ISO *0,8 6/6 25 0,05 10,0 125 *0,8 6/6 qdl-^9 12i8 toks. toks. toks. 1/6 V 6;° 75 -1,5 4/6 3.2 13r° 163 -1,2 6/6 1.6 14/5 181 -1,6 6/6 0,8 16/s 206 -2,3 6/6 30 0,4 16»° 200 -0,9 6/6 °l2 lS)° 188 -0,8 5/5 °»1 13f° 153 -0,4 6/6 °»05 12,0 ISO *0,1 6/6 0,035 13,0 150 -0,7 6/6 35
Taulukko 28 (jatkoa) 53 8 1 1 1 4 5 BBM-1675 A l.p:nä 256 toks. toks. toks. o/6 2 128 12,5 156 -3,5 4/6 84 27,0 338 -1,9 6/6 32 26,0 325 -2,0 6/6 16 16,0 200 -1,8 6/6 8 15,5 194 -1,9 6/6 4 15,0 188 -0,7 6/6 2 12,0 150 -0,5 6/6 1 g 1 12,0 150 0 6/6 0,5 10,0 125 +0,2 6/6 l.p:nä 128 toks. toks. toks. 0/6 6* toks. toks. toks. ’ 0/6 32 . , . . -1,3 2/6 toks. toks. r 16 24,5 306 -1,3 5/5 8 17,5 219 -1,1 6/6 15 4 15,0 188 0 6/6 2 15,0 188 +0,1 6/6 1 12,5 156 -0,4 6/6 0,5 12,0 150 -0,4 6/6 BBM-1675 A2 o,25 __ Uf0 us -o,4 6/6 DMSO-keittosuola- 64 toks. ,0VS. to^. 1/6 20 liuos qdl 9 32 6,0 75 -2,9 4/6 16 8,0 100 -.1,9 6/6 8 15,5 194 -1,3 6/6 4 17,0 213 -1,8 6/6 2 15,0 188 -1,1 6/6 1 14,0 175 -0,5 6/6 0,5 14,0 175 -0,6 6/6 °I25 12,0 150 -°rl 6/6 25 0,125 12,0 150 ^l1 6/6 fi 0 - 4-0.5 10/10
Kontrolli Keitto- 1 1 suolaliuos
Kasvaininokulaatti: 10^ askites-solua siirretty i.p.
Kohde: CDF $ hiiri 3 0 i
Toksisuus: < 4/6 hiirtä elossa 5.p:nä Arvostelu: MST = eloonjäämisajän keskusarvo Teho: % T/C = (MST hoidetut/MST kontrolli) x 100 Kriteeri: % T/C >125=merkitsevä kasvaimen estovaikutus
* NSC 38270=olivomysiini A
35 54 81 1 1 4
Taulukko 29 BBM-1675 A :n ja A :n teho L-1210 leukemiaan Keskim. Eloon-*2 painon- jääneet
Aines Hoitj, Annos i.p. (jig/kg/ruiske) MST Teho muutos 5^g:nä BBM-1675 A l.p:nä 51,2 12i° 171 "V ' 5/fi 5 1 25,6 7,0 100 -2,3 6/6 12.8 9,0 129 -1,1 5/6 «1« 9,5 136 -0,5 6/6 9.2 6,0 86 -1,7 6/6 9.5 7,0 100 -0,8 6/6 0,8 9,0 114 -0,4 6/6 0,< 7,0 100 *0,3 6/6 0,2 7,0 100 -0,S 5/6 1 Q 0,1 7,0 100 +0,8 5/6 l.ptnä 25,6 toks. toks. toks. 1/6 22.8 9,0 129 -1,8 6/6 *,4 9,0 129 -0;β 6/6 2.2 8,0 114 -1,9 6/6 1.6 8,5 121 0 6/6 °,8 8,0 114 -0,4 6/6 15 014 7,5 107 -1,3 6/6 0,2 8,0 114 0 6/6 0,1 8,0 114 +0,4 5/6 0,05 7,0 100 +0,3 6/6 qdl-> 9 12<8 toks· toks· -2,4 3/6 6,4 8,0 114 -1,6 6/6 3.2 8,0 114 -1,7 6/6 20 1,6 9,0 129 -2,1 6/6 0,8 8,5 121 -1,6 6/6 0,4 8,0 114 -1,0 6/6 0,2 8,0 114 -0,5 5/6 0,1 7,0 100 +0,3 6/6 0,05 7,0 100 +0,3 6/6 0,025 6,0 86 -0,6 6/6 2 5 BBM-1675 A 1. p: nä 256 toks. toks. toks. 0/6 2 12B 7,0 100 -1,8 5/6 64 7,5 107 -1,3 4/6 32 8,0 114 -2,2 5/6 16 7,0 100 -2,3 6/6 8 9,5 136 -1,4 6/6 4 8,5 121 -1,1 6/6 2 8,0 114 -0,8 6/6 30 1 8,0 114 0 6/6 0,5 8,0 114 -0,1 6/6 55 81 1 1 4
Taulukko 30 BBM-1675 A^:n ja A2:n teho B16 melanoomaan
Annos i.p. MST Teho Keskitti.painon Eloonjääneet yug(M)tai tng/kg/ruiske (vrk) MST muutos 5.p:nä 10.p:nä (61)
% T/C
5 Aines_________ BBM-1675 3;2M toks. toks. -1,8 2/10 A1 176 16,0 64 -1,8 10/10 °f8 34,5 168 -1,8 10/10 °r4 56,5 226 -0,9 10/10(2)b °t2 47,0 188 -0,7 10/10 10 °I1 37,0 148 -0f4 10/10 BBM-1675 16M 13,0 52 -2,1 10/10 A2 8 29,5 118 -2,0 10/10 4 43,5 174 -1,1 10/10 2 50,5 202 -2,1 10/10(3)b 1 0,5 140 -1,0 10/10 1 5 0,5 38,0 152 -1,1 10/10
Kontrolli Keittosuolaliuos 25j8 0,1 10/10 a vain yksi ilman kasvainta, MST d.m.o. = 55,0 (220%) b kaksi ilman kasvainta, MST d.m.o. = 46,0 (184 %)
Kasvaininokulaatti: 0,5 ml 10%:ista suspensiota, i.p.
Kohde: BDF^ <£ hiiri
Toksisuus: <_ 7/10 hiirtä elossa 10.päivänä 25 Arvostelu: MST=eloonjäämisajan keskusarvo
Teho: % T/C=(MST hoidetut/MST kontrolli) x 100 Kriteeri: % T/C >125= merkitsevä kasvaimen estovaikutus 56 81 1 1 4
Kun BBM-1675 oli .esimerkissä 6 kuvatulla tavalla puhdistettu lisää, puhdistetusta yhdisteestä otettuja näytteitä testattiin L-1210 leukemiaan, P-388 leukemiaan ja B16 melanoomaan hiiressä. Näiden kokeiden tulokset ilmene-5 vät alla.
i 57 81114
Taulukko 31 PUknÄosetUn BBM“1675 Ajin teho P-388 leukemiaan Yhdiste ^mg/kg/ Antotie, MST T/C Keskim.painon- Eloonjääneet -annos)_ohjelma_(vrk)_(%) muutos 5.p:nä 5.p:nä_ BBM-1675 0,1024 i.p.. qd « 1 *-oks toks^ ~ o/6 5 A 0,0512 17,5 * 159 -1,8 4/6 * 0,0256 16,5 150 -2,6 6/6 0,0128 17,5 159 -1,4 b/b 0,0064 15,5 141 -2,2 6/6 0,0032 15',5 141 -2^5 6/6 0,0016 16,5 150 -1,0 6/6 0,0008 15,0 136 -1,2 b/6 0,0004 15,0 136 -2,0 6/6 10 0,0256 i.p., q4d x 3; toks . tok S . -1i5 1/6 0,0128 10,0 91 -2,5 5/6 0,0064 17,5 159 -1,9 6/6 0,0032 17,0 155 -0,8 6/6 0,0016 17,0 155 -2,0 6/6 0,0008 15,0 136 -1,7 6/6 1 5 0,0004 15,0 136 -0,4 6/6 0,0002 13,0 118 -0,8 6/6 0,0001 13,0 118 -1,3 6/6 0,00005 13,5 123 -1,0 6/6 °10128 i.p.. qd x 5; toks. toks . 0/6 °i°oe< toks. toks. _Jr6 3/6 20 0,0032 17,5 155 -2,2 5/6 °;0016 14,5 132 -2,0 6/6 0,0008 15,5 141 -2,2 6/6 0,0004 16,0 145 -2,8 6/6 0,0002 17,0 155 -1,3 6/6 0,0001 14,0 127 -1,6 5/6 0,00005 15,0 136 -1,6 6/6 0,000025 15,0 136 -1,0 6/6 25
Kontrolli , ,„6 . . 1 x 10 i.p., q4d x 3; 11,0 100 -0.7 9/9 (välitys- ' ' aine)
Kohde: CDFi naarashiiri inokulaatin määrä ja kohta: 1 x 10 solua, i.p.
30 58 81 1 1 4
Taulukko 32
Puhdistetun BBM-1675 A^:n teho L-1210 leukemiaan (hoito l.p:nä)
Yhdiste Annos Antotie, MST T/C Keskim,pai-r Eloonjääneet _(mg/kg/annos) ohjelma_(vrk) (%) 5°p?nä S_5.p:nä_ BBM-1675 o,i024 i.p.. qd x l toks. toks. i/6 0,0512 toks. toks. -2,0 0/6 °i°256 8,0 114 -2,9 4/6 0,0128 11,0 157 -2,0 6/6 0,0064 11,0 157 -1,9 6/6 0,0032 10,0 143 -2,0 6/6 0,0016 10,0 143 -2,6 5/6 10 0,0006 8,0 114 -0,4 6/6 0,0256 i.p.,q4dx3 toks . toks . -2,3 2/6 0,0128 10,5 150 -1,7 6/6 0,0064 11,0 157 -1,8 6/6 0,0032 11,0 157 -1,4 6/6 0,0016 10,5 150 -1,9 6/6 0,0008 9,0 129 -0,6 6/6 1 5 0,0004 8,5 121 -0,7 6/6 0,0002 8,0 114 -0,5 6/6 °’0128 i-p·. qd x 5 toks . toks . -2,8 2/6 °f0064 V 100 -1,8 5/6 V032 11,5 164 -1,0 6/6 °/°016 H|0 157 -1 5 6/6 20 °'°008 10«° I” -1,6 5/6 °l0004 8,5 121 -0,4 6/6 °f0002 «,5 121 0,1 6/6 °l0001 »,5 121 0,0 6/6
Kontrolli 1 x 10® i.p., qd x S 7,0 100 0,1 10/10 (Välitysaine) 25 -—-----
Kohde: CDF naarashiiri 1 ^ inokulaatin määrä ja kohta: 1 x 10 solua, i.p.
Taulukko 33 59 81 1 1 4
Puhdistetun BBM-1675 A^:n teho B16 melanoomaan (Hoito 1. p:nä) ... . Annos Antotie, MST T/C Keskim.pai- Eloonjääneet
Yhdiste . . „ . . , , , . nonmuucos r _(mg/kg/annos) ohjelma_(vrk)_(%) 5 ,p:nä_5.p;na_ 5 *BBM- 0,0064 i.p., q4d X 3 lSfS 110 -3,8 '8/10 1675 A 0,0032 22,5 150 -3,0 10/10 1 0,0016 25,0 167 -1, 8 10/10 0,0008 22,0 147 -2,3 10/10 0,0004 24,0 160 -1,8 9/10 0,0016 i.p., qd X 9 27,0 180 -3,7 10/10 0,0008 27,0 180 -2,9 10/10 JO 0,0004 26,0 173 -2,3 10/10 0,0002 24,5 163 -2,4 10/10 0,0001 25,5 170 -2,3 10/10
Kontrolli (välitys- 0,5ml i.p., qd x 9 15,0 100 -o,3 10/10 aine) 0,0064 i.v., q4d X 3 15,0 86 -4,7 10/10 0,0032 32,5 186 -2,1 10/10 0,0016 26,0 149 -1,4 10/10 0,0008 24,0 137 -0,4 10/10 0,0004 24,5 140 -0,0 10/10 0,0064 i.p., q4d X 3 18,0 103 -2,7 10/10 0,0032 23,0 131 -1,4 10/10 20 0,0016 24,0 137 -0,7 10/10 0,0008 25,5 146 -0,8 10/10 0,0004 21,5 123 -1,4 10/10
Kontrolli 0,2 ml i.v., q«d x 3 17,5 100 -0,4 10/10 (välitys-aine) 25 _
Kohde: BDF^ naarashiiri * inokiilaatin määrä ja kohta: 0,5 ml 10-%:ista suspensiota, i.p.
** inokulaatin määrä ja kohta: fragmentti, s.c.
60 81 1 1 4
Yllä esitetyt seulontakokeiden tulokset osoittavat, että puhdistetulla BBM-1675 A1:llä oli olennaisesti sama teho kasvaimiin kuin aikaisempien seulontakokeiden vähemmän puhdistetulla näytteellä. Yhdiste on poik-5 keuksellisen voimakastehoinen, koska sen aktiivisuus on osoitettu annoksena 25 nanogrammaa per kg annostusohjel-malla viisi kertaa päivässä P-388 leukemiaan hiiressä. BBM-1675 hx tehosi P-388 ja L-1210 leukemiaan riippumatta siitä, annettiinko se yhtenä ruiskeena, ensimmäisenä päi-10 vänä, kolmena ruiskeena joka neljäs päivä tai viisi kertaa päivittäin. B16 melanoomaan yhdiste tehosi yhtä hyvin annettiinpa se laskimoon eläimille, joissa oli ihon alle siirrettyjä kasvaimia, tai eläimille, joissa oli vatsaonteloon siirrettyjä kasvaimia. Tämä ominaisuus eli että 15 voidaan menestyksellisesti suorittaa lääkkeen farmakologinen siirto etäällä olevaan kasvaimeen on harvinaista kasvainten vastaisille antibiooteille.
Kuten yllä käy ilmi on BBM-1675 komponenteilla voimakas mikrobien vastainen aktiivisuus ja siten niillä 20 voidaan hoitaa tällaisten mikro-organismien aiheuttamia infektiosairauksia nisäkkäissä ja muissa eläimissä. Lisäksi komponentteja voidaan käyttää muiden mikrobilääkeaineiden tapaan esim. lääketieteellisten ja hammaslääketieteellisten välineiden desifiointiin.
25 Esifaagien indusointi lysogeenisissä bakteereissa ja teho kasvainsysteemeihin hiiressä osoittavat, että BBM1675 komponentteja voidaan myös käyttää terapeuttisesti inhiboimaan kasvaimien kasvu nisäkkäissä.
Yhdisteet voidaan formuloida tavanomaiseen tapaan 30 farmaseuttisiksi koostumuksiksi, jotka muodostuvat mikrobien vastaisesti tai kasvaimia estävästi vaikuttavasta määrästä yhdistettä BBM-1675 Ax, A2,A3, A4, Bx tai B2 tehottoman, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimentimen kera. Nämä koostumukset voidaan työstää ha-35 luttuun parenteraaliin antoon sopivaan farmaseuttiseen muotoon.
61 81114
Parenteraalisti annettaviin valmisteisiin kuuluvat steriilit vettä sisältävät tai vedettömät liuokset, suspensiot ja emulsiot. Niistä voidaan myös valmistaa steriilejä kiintokoostumuksia, jotka välittömästi ennen 5 käyttöä voidaan liuottaa steriiliin veteen, fysiologiseen keittosuolaliuokseen tai johonkin muuhun steriiliin ruis-kelluokseen.
On huomattava, että BBM-1675 antibioottien kulloisetkin suositeltavat määrät vaihtelevat ko. komponen-10 tin, ko. formulaattikoostumuksen, antotavan sekä hoidettavan kohdan, kohteen ja sairauden mukaan. Ammattimies pystyy ottamaan huomioon monet lääkitykseen vaikuttavat tekijät kuten ikä, kehonpaino, sukupuoli, ruokavalio, annon ajankohta, antotie, ulostustiheys, kohteen tila, lää-15 keyhdistelmät, reaktioherkkyys ja sairauden vaikeusaste. Lääkettä voidaan antaa jatkuvasti tai jaksoittain mak-simisietoannoksen rajoissa. Ammattimies pystyy määrittelemään optimiannostuksen määrättyä tapausta varten tavanomaisten annostuksen laskemistestien avulla, joissa on 20 otettu huomioon yllä esitetyt näkökohdat.
Seuraavat esimerkit ovat pelkästään valaisevia keksinnön aluetta rajoittamatta.
Esimerkki 1 BBM-1675:n fermentointi 25 Actinomadura-kantaa H964-92 viljeltiin ja ylläpi dettiin agarvinopinnalla, jossa oli 1 % mallasuutetta, 0,4 % glukoosia, 0,4 % hiivauutetta, 0,05 % CaC0:ta ja 1,6 % agaria. Hyvin kasvaneella agarvinoviljelmällä siir-rostettiin vegetatiivinen kasvualusta, jossa oli 3 % liu-30 koista tärkkelystä, 3 % kuivahiivaa, 0,3 % K2P04:ää, 0,1 % KH2P04:ää, 0,05 % MgS04»7H20:ta, 0,2 % NaCl:ää ja 0,1 % CaC03:a. pH säädettiin arvoon 7,0 ennen sterilointia. Vegetatiivinen viljelmä inkuboitiin 72 tuntia 32 eC:ssa 35 pyörivässä ravistelijassa (250 kierr/min) ja siirrettiin 5 ml viljelmää 500 ml:n erlenmeyerkolviin, jossa oli 100
------ I
62 81 1 1 4 ml fermentointielatusliuosta, jossa oli 3 % sokeriruoko-melassia, 1 % maissitärkkelystä, 1 % kalajauhoa, 0,1 % CaC03:a ja 0,005 % CuS04·5H20:ta (pH 7,0 ennen sterilointia). Fermentointi suoritettiin kuusi vrk 28 eC:ssa pyö-5 rivässä ravistelijassa. Fermentointiliemen antibioottinen aktiivisuus määritettiin paperikiekko-agardiffuusiomene-telmällä käyttäen testiorganismina Staphylococcus aureus 209P:tä. Antibioottinen teho saavutti maksimiarvonsa n. 1 pg/ml viisivuorokautisen fermentoinnin jälkeen.
10 BBM-1675 fermentointiin myös sekoitetuissa astia- fermentoreissa. 500 ml siirrostusta, joka oli kasvatettu ja preparoitu kuten yllä, siirrettiin 20 litran astiafer-mentoreihin, joissa oli 10 litraa fermentointielatusliuosta, joka koostumukseltaan oli sama kuin ravis-15 telukolvifermentoinnissa. Fermentointi suoritettiin 32 °C:ssa, ilmas-tusmäärä oli 12 1/min ja ravistelunopeus 250 kierr/min. Näissä olosuhteissa antibioottituotanto saavutti maksiminsa n. 0,9 pg/ml 68-76 tunnin fermentoinnin jälkeen.
20 Fermentointia tutkittiin myös fermentointitankkien avulla. Ymppiviljelmää ravisteltiin 4 vrk 30 °C:ssa er-lenmeyerkolveissa, jotka sisälsivät 3 % liukoista tärkkelystä, 3 % kuivahiivaa, 0,3 % K2P04:ää, 0,1 % KH2P04:ää, 0,05 % MgS04*7H20:ta, 0,2 % NaClrää ja 0,1 % CaC03:a. Ymp-25 piviljelmällä inokuloitiin 200 litran ymppitankki, jossa oli 130 litraa yllä olevan koostumuksen omaavaa elatus-liuosta ja ymppitankkia sekoitettiin 240 kierr/min 31 tuntia 30 °C:ssa. Toisella ymppiviljelmällä inokuloitiin 3000 litraa fermentointielatusliuosta, jossa oli 1 % 30 maissitärkkelystä, 3 % sokeriruokomelassia, 1 % kalajau hoa, 0,005 % CuS04*5H20:ta ja 0,1 % CaC03:a. Tuotantotank-ki toimi 28 °C:ssa ravistelunopeudella 164 kierr/min ja ilmastusmäärällä 2000 1/min. Fermentoinnin edistyessä liemen pH kohosi vähitellen ja saavutti arvon 7,7 - 7,8 35 170-180 tunnin kuluttua, jolloin antibiootin maksimiak- tiivisuus oli 1,7 pg/ml.
63 81 1 1 4
Esimerkki 2 BBM-1675 komponenttien eristäminen ja puhdistaminen
Talteenotettu fermentointiliemi (3000 litraa, pH 5 7,8) erotettiin Sharpless-sentrifugilla myseelikakuksi ja supernatantiksi. Myseelikakku suspendoitiin 1600 litraan metanolia ja seosta sekoitettiin tunti. Liukenematon aines erotettiin suodattamalla ja metanoliuute konsentroitiin vakuumissa 43 litraksi. Liemen supernatantissa oleva 10 aktiivisuus eristettiin siitä uuttamalla kahdella 1000 litran annoksella n-butanolia. n-butanoliuutteet ja konsentroitu metanoliuute yhdistettiin ja haihdutettiin at-seotrooppisesti lisäten silloin tällöin vettä 20 litran vesiliuokseen, josta antibioottiaktiivisuus saostui suu-15 rimmaksi osaksi öljymäisenä kiintoaineena. Kiintoainetta digeroitiin 30 litrassa metanolia ja liukenematta jäänyt aines poistettiin suodattamalla. Sitten metanoliuute konsentroitiin vakuumissa 10 litran liuokseksi, johon lisättiin 40 litraa etyyliasetaattia ja 30 litraa vettä. Kun 20 oli sekoitettu 30 minuuttia, orgaaninen kerros erotettiin, kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja haihdutettiin vakuumissa neljäksi litraksi. Kun konsentraatti lisättiin 20 litraan n-heksaania, muodostui 90,14 g epäpuhdasta BBM-1675 kompleksia (teho 55 yg/mg) vaaleankeltaisena 25 kiintoaineena. TLC:n mukaan kompleksi muodostui kahden pääkomponentin eli Ax:n ja A2:n ja useiden pienempien komponenttien seoksesta. Ne erotettiin toisistaan ja puhdistettiin kromatografioimalla toistuvasti. Hajoamisen estämiseksi nämä toimenpiteet tapahtuivat kylmähuoneessa. 30 Liuotettiin 20 g BBM-1675 kompleksia 20 ml:aan me tanolia ja liuos laitettiin Sephadex LH-20 -pylvääseen (0 5,5 x 85 cm). Pylväs eluoitiin metanolilla ja eluoitumis-ta tarkkailtiin biomäärityksen avulla, jossa käytettiin Staphylococcus aureus 209P:tä. Aktiivieluaatit yhdistet-35 tiin, konsentroitiin vakuumissa, lyofilisoitiin ja saatiin 4,19 g BBM-1675 komleksia puolipuhtaana kiintoaineena.
64 81 1 1 4 Tämän jälkeen kiintoaine kromatografioitiin silikageeli pylväässä (0 5,0 x 50 cm) eluoiden kloroformilla ja kasvavilla määrillä (1-^5 t/t-%) metanolia.
Eluaatit yhdistettiin bakteerien vastaisen aktii-5 visuuden (vs. S. aureus) ja TLC:n (Si02; CHC13-CH30H = 5:1, t/t) perusteella ja konsentroitiin vakuumissa. Ensin eluoitui lähes homogeeni BBM-1675 Ax (saanto haihduttamisen jälkeen 351 mg), kun käytettiin 2 % metanolia kloroformissa, ja sitten 507 mg BBM-1675 A2:n, A3:n ja A4:n 10 seosta ja tämän jälkeen 210 mg BBM-1675 B-seosta käytettäessä 3 % metanolia kloroformissa. Kiinteä BBM-1675 A3 syötettiin Sephadex LH20:a sisältävään pylvääseen (0 2,0 x 80 cm) ja eluoitiin metanolilla. Aktiivifraktiot haihdutettiin vakuumissa kuiviin, kiinteä jäännös kiteytet-15 tiin metanolista ja saatiin 124 mg puhdasta BBM-1675 Α2:-tä (tämä aines on lähtöaineena esimerkissä 3A). BBM-1675 A2:n, A3:n ja A4:n muodostama kompleksi erotettiin kom-ponenteikseen kromatografioimalla Bondapak C18:a sisältävässä pylväässä (Waters, 0 3,0 x 50 cm). Eluointi suori-20 tettiin vesipitoisella asetonitriilillä ja bioaktiiviset eluaatit tutkittiin TLCtllä (Merck, C18-käänteisfaasisil-ikageeli, silanoitu, CH3CN-H20 * 75:25, t/t). Pienemmät komponentit A4 (33 mg) ja A3 (18 mg) eluoituivat peräkkäin tässä järjestyksessä 20 %:isella asetonitriilillä sekä 25 tämän jälkeen toinen pääkomponentti A2 (301 mg) (tämä aines on lähtöaineena esimerkissä 3B) 50 %:isella asetonitriilillä.
Kiintoaine, joka sisälsi BBM-1675 Bx:tä ja B2:ta, kromatografioitiin silikageelipylväässä (0 3,0 x 40 cm) 30 eluoiden kloroformilla ja metanolilla. Aktiivifraktiot, jotka eluoituivat 4 %:illa metanolia kloroformissa, yhdistettiin, haihdutettiin ja saatiin 7 mg puhdasta BBM-1675 Bt:tä. Toinen aktiivifraktio eluoitui 5 %:n metano-likonsentraatiolla ja haihduttamisen jälkeen saatiin 8 mg 35 BBM-1675 B2:ta.
Esimerkki 3 65 81114 BBM-1675 A1:n ja A2:n edelleenpuhdistus A) BBM-1675 Ax:n puhdistus
Glenco-pylvääseen, sisähalkaisija 2,67 cm x 75 cm, pakattiin liettämällä Bakerin sldottufaasista oktadekyy-5 li(C18)silikageeliä (hiukkaskoko 40 mikronia) metanolis-sa. Pylväs liitettiin keskipaine-HPLC-systeemiin ja tasapainotettiin 1,5 litralla eluenttia (41,6 % asetonitrii-liä, 21,6 % metanolia, 36,8 % 0,1-m ammoniumasetaattia). Esimerkin 2 puhdlstusmenettelyn avulla saatu 100,5 mg 10 osaksi puhdasta BBM-1675 A1:tä liuotettiin 2 ml:aan ase-tonitriiliä ja imettiin näytekierukkaan. Näyte pumpattiin pylvääseen. Pylväs eluoitiin yllä kuvatulla eluentilla ja otettiin talteen 87 ml:n fraktioita. Eluoitumista tarkkailtiin aallonpituuksilla 54 mm ja 340 mm. Fraktiot 55-15 71 yhdistettiin ja uutettiin kahdesti 1500 ml:n osamää rillä kloroformia. Kloroformi haihdutettiin kuiviin ja saatiin 89,8 mg jäännöstä C.
Glenco-pylväs, sisähalkaisija 1,5 cm x 20 cm, pakattiin liettämällä 12 g:11a Woelm-silikageeliä (hiukka-20 skoko 60-200 mikronia). Jäännös C syötettiin pylvääseen kloroformiliuoksena. Pylväs eluoitiin 500 ml:11a liuosta, jossa lineaarinen gradientti kasvoi kloroformista 10 %:iin metanolia kloroformissa, ja otettiin talteen 20-25 ml:n fraktioita. Silikageelillä suoritetun TLC-analyysin 25 perusteella fraktiot 6-9 yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja saatiin 73 mg jäännöstä D.
Glenco-pylväs, sisähalkaisija 1,5 cm x 20 cm, pakattiin liettämällä 12 g:11a Woelm-silikageeliä (hiukkaskoko 63-200 mikronia) Skellysolve B:ssä. Jäännös D liuo-30 tettiin n. 2 ml:aan CHCl3:a ja liuos syötettiin pylvääseen. Kloroformi syrjäytettiin 25 ml:11a Skellysolve B:tä. Sitten pylväs eluoitiin 500 ml:11a liuosta, jossa lineaarinen gradientti kasvoi Skellysolve B:stä 60 %:iin asetonia Skellysolve B:ssä, ja otettiin talteen 28-25 ml:n 35 fraktioita. Fraktiot 19-23 yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja saatiin 56,6 mg puhdasta BBM-1675 A3:tä.
«6 81114 Tämä jäännös oli homogeeninen kolmessa TLC-systee-missä (5 % metanolia kloroformissa, 5 % metanolia eetterissä ja 50 % asetonia Skellysolve B:ssä silikageelillä) ja HPLC:ssä (C-18 silikageeli, 41,5 % asetonitriiliä, 5 21,5 % metanolia, 37,0 % 0,1-m ammoniumasetaattia).
Puhdistetun BBM-1675 Ax:n geelipermeaatiokromato- grafia
Pharmacia-pylväs, sisähalkaisija 2,5 cm x 45 cm, pakattiin liettämällä Sephadex LH-20:llä metanolissa ja 10 kromatografiakerros säädettiin 33,4 cm:n pituiseksi. Noin 120 mg puhdistettua BBM-1675 Ax:tä liuotettiin 2 ml:aan metanolia ja liuos siirrettiin 2,5 ml:n näytesäiliöön. Näyte syötettiin pylvääseen ja eluointi aloitettiin meta-nolilla 1,75 ml/min ja otettiin talteen 10 ml:n frak-15 tioita (Pharmacia Frac-100 fraktionkerääjä). Eluoitumista tarkkailtiin aallonpituudella 254 nm Isco UA-5 detektorilla. Havaittiin BBM-1675 Ax:n eluoituvan Ve/Vt-suhteella 0,79 ja 0,91 (V. eluointitilavuus, Vt * kerroksen tilavuus ).
20 B) BBM-1675 A2:n puhdistus
Glenco-pylväs, sisähalkaisija 2,65 cm x 75 cm, pakattiin liettämällä Bakerin sidottufaasisella oktadekyy-li-(C18)silikageelillä (hiukkaskoko 40 mikronia) metanolissa. Pylväs liitettiin keskipaine-HPLC-systeemiin ja 25 tasapainotettiin 1,5 litralla eluenttia (50 % asetonitriiliä, 20 % metanolia, 30 % 0,1-m ammoniumasetaattia). Esimerkin 2 menettelyn avulla saatu 76,9 mg osaksi puhdasta BBM-1675 A2:ta liuotettiin 2 ml:aan asetonitriiliä ja imettiin näytekierukkaan. Näyte pumpattiin pylvääseen. 30 Pylväs eluoitiin yllä kuvatulla eluentilla ja otettiin talteen 87 ml:n fraktioita. Eluoitumista tarkkailtiin aallonpituuksilla 254 ja 340 nm. Fraktiot 31-38 yhdistettiin ja uutettiin kahdesti 500 ml:n annoksilla kloroformia. Kloroformi haihdutettiin kuiviin ja saatiin 65,8 35 mg homogeeniä BBM-1675 A2:ta.
BBM-1675 A2 oli homogeeninen kahdessa TLC-systee- i 6? 81114 missä, yhden kaksiulotteisen TLC-analyysin ja HPLC:n mukaan.
Esimerkki 4 BBM-1675 Ajtn suositeltava uuttomenetelmä 5 Esimerkin 1 yleismenetelmän mukaan saatua 6,8 lit raa fermentointiraakalientä siirrettiin polypropeenisankoon (ylähalkaisija 12 cm, alahalkaisija 10 cm, korkeus 37 cm), jonka pohjassa oli hana. Lisättiin yhtä suuri tilavuus kloroformia. Seosta sekoitettiin kaksi tuntia suu-10 rella kierrosnopeudella ilmakäyttöisellä CRC-sekoittimel-la. Lisättiin n. 4 litraa (1,3 kg) Dicalite'a (suodatus-apuaine) ja sen annettiin sekoittua mukaan. Seos suodatettiin Dicalite-kerroksen läpi, joka oli Buchner-sup-pilossa nro 12. Suodos otettiin talteen 19 litran, vakuu-15 miliitännällä varustettuun liuotuspulloon (Ace. nro 5396-06). Kerros pestiin kahdella litralla kloroformia. Suodos siirrettiin 20 litran erotussuppiloon ja faasien annettiin erottua. Alempi faasi (kloroformi) poistettiin.
Glenco-pylväs, sisähalkaisija 2,5 cm x 40 cm, pak-20 attiin liettämällä 91 g:11a Woelm-silikageeliä (hiukka- skoko 63-200 mikronia). Yllä mainittu kloroformifaasi pumpattiin FMI RPY-2CSD pumpulla pylvään läpi. Pylvästä huuhdeltiin 600 ml:11a kloroformia. Kloroformieluaatti hylättiin. Sitten pylväs eluoitiin 600 ml:11a seosta, jossa 25 oli 10 % metanolia kloroformissa. Tämä eluaatti haihdutettiin kuiviin ja saatiin 547 mg jäännöstä A.
Jäännös A liuotettiin 50 ml:aan kloroformia. Klo-roformiliuos lisättiin 1 litran pyörökolviin, jossa oli 20 g Dicalite'a. Suspensio muodostettiin lisäämällä n.
30 200 ml Skellysolve B:tä. Liuottimet poistettiin pyörö- haihduttimessa. Jäännös lietettiin 300 ml:aan Skellysolve B:tä. Liete pakattiin Ace kolvikromatografiaputkeen (osa nro B5872-14, sisähalkaisija 41 mm x 45,7 cm) toimien seuraavasti. Sulkuhanan hanaosan ja pylvään väliseen yhdys-35 osaan työnnettiin lasivillatulppa. Lasivillan päälle levitettiin 1 cm paksu kerros Ottawa-standardihiekkaa. Ilma 68 81 1 1 4 poistettiin sulkuhanasta, lasivillasta ja hiekasta syöttämällä niiden läpi paineistettua (4 kg/cm2) Skellysolve B:tä. Sitten liete lisättiin pylvääseen ja annettiin pai-nevirtauksen alaisena laskeutua pakatuksi kerrokseksi.
5 Pylvään ei annettu koskaan valua kuiviin. Stabiilin pyl-väskerroksen muodostumisen jälkeen kerroksen päälle levitettiin 2 cm paksu kerros Ottawa-hiekkaa. Sitten kerros eluoitiin 600-700 ml:n lisä määrällä Skellysolve B:tä. Kerros eluoitiin 500 ml:11a tolueenia. Tolueenieluaatti 10 haihdutettiin kuiviin ja saatiin 93 mg jäännöstä. Tämä osaksi puhdas BBM-1675 Ax voidaan edelleenpuhdistaa kuten esimerkissä 3.
Esimerkki 5
BBM-1675 kompleksin fermentointi variantilla H964-15 92-A1327Y
Vegetatiivinen kasvualusta, jossa oli 2 % liukoista tärkkelystä, 1 % glukoosia, 0,5 % hiivauutetta, 0,5 % NB-amiinia tyyppi A ja 0,1 % CaC03:a ja jonka pH oli säädetty arvoon 7,0, ennen sterilointia inokuloitiin vari-20 anttikannalla A1327Y, joka saatiin käsittelemällä Ac- tinomadura verrucososporan kantaa nro H964-92 NGT:llä. Vegetatiivista viljelmää inkuboitiin neljä vuorokautta 32 eC:ssa pyörivässä ravistelijassa (250 kierr/min) ja viljelmästä siirrettiin 5 ml 500 ml:n erlenmeyerkolviin, 25 jossa oli 100 ml fermentointielatusliuosta, jonka koos tumus oli 3 % ruokosokerimelassia, 1 % maissitärkkelystä, 1 % kalajauhoa, 0,005 % CuS04*5H20:ta, 0,05 %
MgS04·7H20:ta ja 0,1 % CaC03:a säätäen pH ennen sterilointia arvoon 7,0.
30 Fermentoitiin 7 vuorokautta 28 °C:ssa pyörivässä ravistelukoneessa. Antibioottituotanto saavutti maksimiarvon n. 1,5 pg/ml.
Esimerkki 6 BBM-1675 komponenttien eristäminen ja puhdistami- 35 nen
Esimerkistä 5 talteenotettu fermentointiliemi i 69 81 1 1 4 (3000 litraa, pH 7,6) erotettiin Sharpless-sentrifugilla myseelikakuksi ja supernatantiksi. Myseelikakkua ja 2000 litraa metanolia sekoitettiin tunti ja liukenematon aines poistettiin suodattamalla. Liemen supernatantissa oleva 5 aktiivisuus eristettiin siitä uuttamalla 1800 litralla n-butanolia. Metanoli- ja n-butanoliuutteet yhdistettiin ja konsentroitiin atseotrooppisesti lisäten silloin tällöin vettä 20 litran vesiliuokseen, josta antibioottiak-tiivisuus saostui suurimmaksi osaksi öljymäisenä kiin-10 toaineena. Aktiivisuuden eristämiseksi seosta sekoitettiin kolmen 20 litran etyyliasetaattiannoksen kera. Uutteet yhdistettiin, suodatettiin liukenematta jääneen aineksen poistamiseksi ja haihdutettiin vakuumissa neljäksi litraksi. Lisäämällä konsentraatti sekoittaen 30 litraan 15 n-heksaania saatiin 81,7 g epäpuhdasta BBM-1675 kompleksia vaalean keltaisena kiintoaineena (teho 59 pm/ mg). TLC:n ja HPLCrn mukaan kompleksi muodostui kahden pääkom-ponentin eli BBM-1675 Ax:n ja A2:n ja useiden pienempien komponenttien seoksesta. Ne erotettiin toisistaan ja puh-20 distettiin kromatografiointisarjalla, joka hajoamisen estämiseksi suoritettiin kylmähuoneessa.
Liuotettiin 20 g epäpuhdasta BBM-1675 kompleksia 20 ml:aan metanolia ja liuos laitettiin Sephadex LH-20-pylvääseen (0 5,5 cm x 85 cm). Pylväs eluoitiin metano-25 lilla ja eluoitumista tarkkailtiin biomäärityksen avulla, jossa käytettiin Staphylococcus aureus 209P:tä. Aktiivi-eluaatit yhdistettiin, konsentroitiin vakuumissa, lyofi-lisoitiin ja saatiin 4,86 g BBM-1675 kompleksia (teho 203 pg/mg) puolipuhtaana kiintoaineena. Tämän jälkeen kiin-30 toaine kromatografioitiin silikageelipylväässä (0 3,0 x 70 cm) eluoiden kloroformilla ja kasvavilla määrillä (1-5 %) metanolia. Eluaatit yhdistettiin bakteerien vastaisen aktiivisuuden (vs. S. aureus) ja TLC:n (Si02, CHCl3-MeOH =5:1 t/t) perusteella ja konsentroitiin vakuumissa. En-35 sin eluoitui BBM-1675 Aa (haihduttamisen jälkeen 425 mg, teho 960 pg/mg), kun käytettiin 2 % metanolia klorofor- 70 81 1 1 4 missä, ja sitten BBM-1675 A2:n, A3:n ja A4:n seos (732 mg, teho 340 pg/mg) ja tämän jälkeen BBM-1675 B kompleksi (200 mg, teho 190 pg/mg) käytettäessä 3 % metanolia kloroformissa. Yllä mainittu BBM-1675 Ax kromatografioitiin 5 uudelleen silikageelillä (pylväs: 0 2,2 x 44 cm) käyttäen 2 % metanolia bentseenissä. Bioaktiiviset eluaatit tutkittiin HPLCtllä (Lichrosorb RP-18: CH3CN-MeOH-0,1-m CH3-C00NH4 * 5:2:3 t/t) ja homogeenista BBM-1675 Ax:tä sisältävät fraktiot haihdutettiin vakuumissa kuiviin. Kiin-10 teä jäännös kiteytettiin 10 ml:sta metanolia ja saatiin 197 mg BBM-1675 A3:tä värittöminä prismoina (teho 1000 pg/mg).
BBM-1675 A2:n, A,:n ja A4:n muodostama kompleksi (537 mg) erotettiin komponenteikseen kromatografioimalla 15 Bondapak C18:a sisältävässä pylväässä (Waters, 0 2,0 x 42 cm). Eluointi suoritettiin vesipitoisella asetonitriilil-lä ja bioaktiiviset eluaatit tutkittiin TLC:llä (Merck, silanoitu, CH3CN-H20 = 75:25, t/t). Pienemmät komponentit BBM-1675 A4 (45 mg, teho 410 pg/mg) ja A3 (19 mg, teho 20 300 pg/mg) eluoituivat peräkkäin 20-%:isella asetonitrii- lillä ja sitten eluoitui pääkomponentti BBM-1675 A2 (203 mg) 50-%:isella asetonitriilillä. BBM-1675 A2-fraktio kiteytettiin kloroformi-n-heksaanista, jolloin saostui 70 mg värittömiä neulasia (teho 290 pg/mg). Kiintoaine, joka 25 sisälsi BBM-1675 B-seosta, kromatografioitiin silikagee- lipylväässä (0 3,0 x 40 cm) eluoiden kloroformilla ja me-tanolilla. Aktiivifraktiot, jotka eluoituivat 4 %:lla metanolia kloroformissa, yhdistettiin, haihdutettiin ja s-aatiin 7 mg puhdasta BBM-1675 Bx:tä (teho 180 pg/mg). To-30 inen aktiivifraktio eluoitui metanolikonsentraatiolla 5 %. Haihduttamalla fraktio saatiin 8 mg BBM-1675 B2:ta (teho 140 pg/mg).
Claims (8)
- 71 81114 Patenttivaatimus Menetelmä kasvainten vastaisten antibioottien BBM-1675 Aj, A2, A3, A4, Bj ja B2 tuottamiseksi, jolloin 5 komponentilla BBM-1675 Ax on seuraavat ominaisuudet: (a) se muodostaa valkoisesta vaaleankeltaiseen vaihtelevia kiteitä, (b) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- 10 seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hiili tetrakloridiin, (c) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, 15 (s) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olen naisesti kuvan 9 mukainen, (e) liuotettuna CDCl3:een sillä on olennaisesti kuvan 10 mukainen protonimagneeninen resonanssispektri, (f) sen sulamispiste on noin 156-158 °C, 20 (g) sen optinen kiertokyky on [a]” = -191° (c * 0,5, CHC13). (h) sen näennäinen molekyylipaino on 1248 massa-spektroskopialla määritettynä, (i) sen alkuainekoostumus on noin 52,17 % hiiltä, 25 6,15 % vetyä, 4,63 % typpeä, 9,09 % rikkiä ja 27,96 % happea, (j) sen Rf-arvo on 0,74 ohutkerroskromatografiässä silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,18 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika- 30 geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (k) liuotettuna metanoliin konsentraationa 0,01356 g/1 sen ultraviuolettiabsorption maksimikohdat ja absorptiot ovat seuraavat: 35 72 81 1 1 4 λ maks1™"1 absorptio 320 12,4 280 olkapää 253 25,1 5 210 25,5 ilman merkitseviä muutoksia lisättäessä happoa tai emästä, (1) sen retentioaika HPLCrssä on 13,3 minuuttia pylväskromatografioitaessa C18-käänteisfaasisilikageelil-10 lä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), komponentilla BBM-1675 A2 on seuraavat ominaisuudet: (a) se muodostaa valkoisia kiteitä, 15 (b) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent-seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (c) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-20 la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (d) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olennaisesti kuvan 12 mukainen, (e) liuotettuna CDCl3:een sillä on olennaisesti 25 kuvan 13 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, (f) sen sulamispiste on noin 147-149 °C, (g) sen optinen kierto on [α]„7 - -179,4* (c 0,5, CHC13), (h) sen näennäinen molekyylipaino on 1248 massa- 30 spektroskopialla määritettynä, (i) sen alkuainekoostumus on noin 52,71 % hiiltä, 5,94 % vetyä, 3,94 % typpeä, 9,39 % rikkiä ja 28,01 % happea, (j) sen Rf-arvo on 0,71 ohutkerroskromatografiässä 35 silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) 73 81 1 1 4 ja 0,21 ohutkerroskromatografiässä käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-HzO (75:25 t/t), (k) liuotettuna metanoliin konsentraationa 0,02052 g/1 sen ultraviolettiabsorption maksimikohdat ja absorp- 5 tiot ovat seuraavat: ^maks*1*"1 absorptio 320 12,2 282 16,3 282 26,2 10 214 25,8 ilman merkitseviä muutoksia lisättäessä happoa tai emästä, (l) sen retentioaika HPLC:ssä on 17,3 minuuttia pylväskromatografioitaessa Cie-käänteisfaasisilikageelil- 15 lä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), komponentilla BBM-1675 A3 on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, 20 asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen 25 reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (c) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olennaisesti kuvan 3 mukainen, (d) liuotettuna CDCl3:een, sillä on olennaisesti kuvan 7 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, 30 (e) sen sulamispiste on noin 125-127 eC, (f) sen optinen kierto on [a]” = -161° (c = 0,5, CHC13), (g) sen alkuainekoostumus on noin 54,55 % hiiltä, 6,46 % vetyä, 3,73 % typpeä, 7,49 % rikkiä ja 27,77 % 35 happea, 74 81 1 1 4 (h) sen Rf-arvo on 0,72 ohutkerroskromatografiässä silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,28 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), 5 (i) liuotettuna metanoliin 0,01-n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV λΒβ1ι. nm (E» ) :253 (286) metanolissa 282 (158) 10 320 (122) UV Amak. nm (Ej^) :253 (287) 0,01-n HC1-CH30H:ssa 282 (160) 320 (126) UV λ.Λ. nm (E^) :252 (280) 15 0,01-n NaOH-CH3OH:ssa 282 (162) 318 (120) (j) sen retentioaika HPLC:ssä on 8,0 minuuttia pyiväskromatografiässä C18-käänteisfaasisilikageelillä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 20 t/t), komponentilla BBM-175 A4 on seuraavat ominaisuu det: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- 25 seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, 30 (c) sen infrapuna-absorptiospektri (KBr) on olen naisesti kuvan 4 mukainen, (d) liuotettuna CDCl3:een, sillä on olennaisesti kuvan 8 mukainen protonimagneettinen resonanssispektri, (e) sen sulamispiste on noin 123-126 °C, 35 (f) sen optinen kierto on [α]„7 * -176" (c - 0,5, 75 81114 CHC13), (g) sen alkuainekoostumus on noin 54,65 % hiiltä, 6,29 % vetyä, 3,51 % typpeä, 8,07 % rikkiä ja 27,48 % happea, 5 (h) sen Rf-arvo on 0,71 ohutkerroskromatografiässä silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,78 ohutkerroskromatografiässä käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (i) liuotettuna metanoliin 0-01-n HCl-CH3OH:hon ja 10 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV xBak. nm ( E Ϊ*m) :253 (257) metanolissa 282 (153) 320 (117)
- 15 UV *Bak, nm (Eji.) :253 (258) 0,01-n HC1-CH30H: ssa 282 (155) 320 (118) UV *Bake nm (ΕΪ*β) :252 (266) 0,01-n NaOH-CH3OH:ssa 282 (160) 20 318 (118) (j) sen retentioaika HPLC:ssä on 5,1 minuuttia pylväskromatografiässä C18-käänteisfaasisilikageelillä liuotinsysteemillä CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 t/t), 25 komponentilla BBM-1675 B3 on seuraavat ominaisuu det: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent-seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii- 30 litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (c) sen sulamispiste on noin 159-161 °C, 35 (d) sen optinen kierto on [a]87 -171° (c = 0,5, 76 8 1 1 1 4 CHC13 ), (e) sen Rf-arvo on 0,63 ohutkerroskromatografiassa silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,23 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika- 5 geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (f) liuotettuna metanoliin 0,01-n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit ovat seuraavat: UV λ.Λ. nm (E:253 (225) 10 metanolissa 282 (140) 320 (104) UV λβΑβ nm (E*^) :253 (225) 0,01-n HC1 -CHjOH:ssa 282 (140) 320 (105)
- 15 UV Aaaka nm (ΕΪ*η) :252 (236) 0,01-n NaOH-CH3OH:ssa 282 (141) 318 (105) ja komponentilla BBM-1675 B2 on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin, etyyliasetaattiin, 20 asetoniin, etanoliin ja metanoliin, liukenee hiukan bent- seeniin ja veteen ja on liukenematon n-heksaaniin ja hii-litetrakloridiin, (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridil-la, Ehrlichin ja Tollenin reagenssilla ja negatiivisen 25 reaktion Sakaguchi-, ninhydriini- ja antronitesteissä, (c) sen sulamispiste on noin 156-159 °C, (d) sen optinen kierto on [a]n7 = -122° (c * 0,5, CHC13), (e) sen Rf-arvo on 0,60 ohutkerroskromatografiassa 30 silikageelillä liuotinsysteemillä CHC13-CH30H (5:1 t/t) ja 0,16 ohutkerroskromatografiassa käänteisfaasisilika-geelillä liuotinsysteemillä CH3CN-H20 (75:25 t/t), (f) liuotettuna metanoliin 0-01,n HCl-CH3OH:hon ja 0,01-n NaOH-CH3OH:hon sen ultraviolettiabsorptiomaksimit 35 ovat seuraavat: 77 81 1 1 4 UV A>ake nm (E:248 (212) metanolissa 279 (141) 318 (103) UV Xuäkm nm (E^) : 248 (210) 5 0,01-n HCl-CHjOH:ssa 279 (140) 318 (103) UV *Baks nm (E\:248 (233) 0,01-n NaOH-CH3OH:ssa 278 (150) 318 (110) 10 tunnettu siltä, että viljellään antibioottikomp-leksia BBM-1675 tuottavaa Actinomadura verrucosospora-kantaa H964-92, ATCC 39334 tai sen mutanttikantaa A13274, ATCC 39638 vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää hiilen ja typen yhteyttämiskelpoisia lähteitä, pin-15 nanalaisesti aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu organismi on viljelyalustassa tuottanut olennaisen määrän antibioottikompleksia BBM-1675 ja eristetään sitten anti-bioottikomponentit BBM-1675 Ax, A2, A3, A4, Bx ja B2 vilje-lyalustasta tavanomaisin kromatografisin menetelmin. 78 81 1 1 4 Förfarande för framställning av antiobiotika BBM-1675 A:, A2, A3, A4, B3 och B2 med antitumörverkan, 5 varvid komponenten BBM-1675 A2 har följande egenskaper: (a) bildar vita tili blekgula kristaller, (b) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, etanol och metanol, ringa löslig i bensen och vatten och olöslig i n-hexan och koltetraklorid, 10 (c) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, ninhydrin- och antrontesten, (d) uppvisar ett infraröd-absorptionsspektrum (Kbr) i huvudsak säsom visas i figur 9, 15 (e) uppvisar vid upplösning i CDC13 ett proton- magnetresonansspektrum i huvudsak säsom visas i figur 10, (f) har en smältpunkt av cirka 156-158 °C, (g) har en optisk vridning av [a]” = -191° (c * 0,5, CHC13), 20 (h) har en skenbar molekylvikt av 1248 bestämd me- delst masspektroskopi, (i) har en approximativ elementaranalyssammansätt-ning av 52,17 % koi, 6,15 % väte, 4,63 % kväve, 9,09 % svavel och 27,96 % syre, 25 (j) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,74 med lösningsmedelssystemet CHC13-CH30H (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro-matografi ett Rf-värde 0,18 med lösningsmedelssystemet CH3CN-H20 ( 75 : 25 v/v), 30 (k) uppvisar vid upplösning i metanol i en kon- centration av 0,01356 g/1 följande ultraviolett-absorp-tionsmaxima och absorptiviteter: 35 79 81 1 1 4 λ max*"** absorptlvitet 320 12,4 280 skuldra 253 25,1 5 210 25,5 utan nägon signifikant ändring vid tillsats av syra eller bas, (1) uppvisar vid HPLC en retentionstid av 13,3 minuter med en C18-reversfassilikagelkolonn och lösningsme-10 delssystemet CH3CN-CH3OH-0,lm CH3c00NH4 (5:2:3 v/v), komponenten BBM-1675 A2 har följande egenskaper: (a) bildar vita kristaller, (b) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, etanol och metanol, ringa löslig i bensen och vatten och 15 olöslig i n-hexan och koltetraklorid, (c) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, ninhydrin- och antrontesten, (d) uppvisar ett infraröd-absorptionsspektrum 20 (Kbr) i huvudsak säsom visas i figur 12, (e) uppvisar vid upplösning i CDC13, ett proton-magnetresonansspektrum i huvudsak säsom visas i figur 13, (f) har en smältpunkt av cirka 147-149 °C, (g) har en optisk vridning av [a]87 = -179,4° (c = 25 0,5, CHC13), (h) har en skenbar molekylvikt av 1248 bestämd me-delst masspektroskopi, (i) har en approximativ elementaranalyssammansätt-ning av 52,71 % kol, 5,94 % väte, 3,94 % kväve, 9,39 % 30 svavel och 28,01 % syre, (j) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,71 med lösningsmedelssystemet CHC13-CH30H (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro-matografi ett Rf-värde 0,21 med lösningsmedelssystemet
- 35 CH3CN-H20 (75:25 v/v), 80 81 1 1 4 (k) uppvisar vid upplösning i metanol i en kon-centration av 0,02052 g/1 följande ultraviolett-absorp-tionsmaxima och absorptiviteter: λ max(n>) absorptivitet 5 320 12,2 282 16,3 282 26,2 214 25,8 utan nägon signifikanta ändring vid tillsats av syra 10 eller bas, (l) uppvisar vid HPLC en retentionstid av 17,3 minuter med en C18-reversfassilikagelkolonn och lösningsme-delssystemet CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 v/v), komponenten BBM-1675 A3 har följande egenskaper: 15 (a) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, etanol och metanol, ringa löslig i bensen och vatten och olöslig i n-hexan och koltetraklorid, (b) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, 20 ninhydrin- och antrontesten, (c) uppvisar ett infraröd-absorptionsspektrum (Kbr) i huvudsak säsom visas i figur 3, (d) uppvisar vid upplösning i CDC13, ett proton-magnetresonansspektrum i huvudsak säsom visas i figur 7, 25 (e) har en smältpunkt av cirka 125-127 °C, (f) har en optisk vridning av [a]” = -161° (c = 0,5, CHC13), (g) har en approximativ elementaranalyssammansätt-ning av 54,55 % koi, 6,46 % väte, 3,73 % kväve, 7,49 % 30 svavel och 27,77 % syre, (h) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,72 med lösningsmedelssystemet CHC13-CH30H (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro-matografi ett Rf-värde 0,28 med lösningsmedelssystemet
- 35 CH3CN-H20 (75:25 v/v), ei 81114 (i) uppvisar följande ultraviolett-absorptionsma-xima vid ± metanol, 0,01-n HC1-CH30H och 0,01-n NaOH-CH3OH UV λΒβχ nm (Ei*m) :253 (286) 5. metanol 282 (158) 320 (122) UV nm (Ei*m) :253 (287) i 0,01-n HCI-CH3OH 282 (160) 320 (126)
- 10 UV ληβχ nm (Ei*J :252 (280) i 0,01-n Na0H-CH30H 282 (162) 318 (120) (j) uppvisar vid HPLC en retentionstid av 8,0 minuter med en C18-reversfassilikagelkolonn och lösningsme- 15 delssystemet CH3CN-CH30H-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 v/v), komponenten BBM-1675 A4 har följande egenskaper: (a) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, etanol och metanol, ringa löslig i bensen och vatten och olöslig i n-hexan och koltetraklorid, 20 (b) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, ninhydrin- och antrontesten, (c) uppvisar ett infraröd-absorptionsspektrum (Kbr) i huvudsak säsom visas i figur 4, 25 (d) uppvisar vid upplösning i CDC13, ett proton- magnetresonansspektrum i huvudsak säsom visas i figur 8, (e) har en smältpunkt av cirka 123-126 °C, (g) har en optisk vridning av [a]„7 = -176° (c = 0,5, CHCI3), 30 (i) har en approximativ elementaranalyssammansätt- ning av 54,65 % koi, 6,29 % väte, 3,51 % kväve, 8,07 % svavel och 27,48 % syre, (j) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,71 med lösningsmedelssystemet CHC13-35 CH3OH (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro- 82 81 1 1 4 matografi ett Rf-värde 0,78 med lösningsmedelssystemet CH3CN-H20 ( 75 : 25 v/v), (i) uppvisar följande ultraviolett-absorptionsma-xima vid i metanol, 0,01-n HC1-CH30H och 0,01-n NaOH-5 CH30H UV λββχ nm (E\%ca) : 253 (257) i metanol 282 (153) 320 (117) UV λΒβχ nm (Ej*J :253 (258) 10 i 0,01-n HC1-CH30H 282 (155) 320 (118) UV λ-βχ nm (E^) :252 (266) i 0,01-n Na0H-CH30H 282 (160) 318 (118) 15 (j) uppvisar vid HPLC en retentionstid av 5,1 mi nuter med en C18-reversfassilikagelkolonn och lösningsmedelssystemet CH3CN-CH3OH-0,1-m CH3COONH4 (5:2:3 v/v), komponenten BBM-1675 Bx har följande egenskaper: (a) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, 20 etanol och metanol, ringa löslig i bensen och vatten och olöslig i n-hexan och koltetraklorid, (b) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, ninhydrin- och antrontesten, 25 (c) har en smältpunkt av cirka 159-161 °C, (d) har en optisk vridning av [a]” = -171° (c = 0,5, CHC13), (e) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,63 med lösningsmedelssystemet CHC13-
- 30 CH30H (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro- matografi ett Rf-värde 0,23 med lösningsmedelssystemet CH3CN-H20 (75:25 v/v), (f) uppvisar följande ultraviolett-absorptionsma-xima vid i metanol, 0,01-n HC1-CH30H och 0,01-n NaOH-
- 35 CH30H 83 81 1 1 4 UV λααχ nm (Ej*J :253 (225) i metanol 282 (140) 320 (104) UV λββχ nm (Ej^,) :253 (225) 5 i 0,01-n HCI-CH3OH 282 (140) 320 (105) UV λ-Μ nm (E^) :252 (236) i 0,01-n NaOH-CH3OH 283 (141) 318 (105) 10 och komponenten BBM-1675 B2 har följande egenskaper: (a) är löslig i kloroform, etylacetat, aceton, etanol och metanol, rlnga löslig i bensen och vatten och olösllg 1 n-hexan och koltetraklorid, (b) ger positiv reaktion med ferriklorid, Ehrlichs 15 och Tollens reagens och negativ reaktion i Sakaguchi-, ninhydrin- och antrontesten, (c) har en smältpunkt av cirka 156-159 eC, (d) har en optisk vridning av [a]” = -122° (c = 0,5, CHCI3), 20 (e) uppvisar vid silikageltunnskiktskromatografi ett Rf-värde av 0,60 med lösningsmedelssystemet CHC13-CH3OH (5:1 v/v) och vid reversfassilikageltunnskiktskro-matografi ett Rf-värde 0,16 med lösningsmedelssystemet CH3CN-H20 (75:25 v/v), 25 (f) uppvisar följande ultraviolett-absorptionsma- xima vid i metanol, 0,01-n HC1-CH30H och 0,01-n NaOH- CH3OH υνλΜ nm (E^) :253 (212) i metanol 282 (141) 30 320 (103) UV λ-Μ nm (Ε\χ„) :253 (210) i 0,01-n HCI-CH3OH 282 (140) 320 (103) UV λΒβχ nm (Eji.) :248 (233) 35 i 0,01-n NaOH-CH3OH 278 (150) 318 (110) 84 81 1 1 4 kännetecknad därav, att man odlar Actinomadu-ra verrucosospora-stammen H964-92, ATCC 39334 eller dess mutantstanunen A13274, ATCC 39638, vilka producerar an-tiobiotikakomplexet BBM-1675 i ett vattenhaltigt närings-5 medium, som innehäller assimilerbara källor av koi och kväve under submersa aeroba förhällanden tills den nämnda organismen har producerat en väsentlig mängd av antiobio-tikakomplexet BBM-1675 i odlingsmediet, varefter antio-biotikakomponterna BBM-1675 Ax, A2, A3, A4, Bx ja B2 sepa-10 rerar frän odlingsmediet medelst sedvanliga kromatogra-fiska metoder.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49523183A | 1983-05-16 | 1983-05-16 | |
| US49523183 | 1983-05-16 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI841906A0 FI841906A0 (fi) | 1984-05-11 |
| FI841906A FI841906A (fi) | 1984-11-17 |
| FI81114B true FI81114B (fi) | 1990-05-31 |
| FI81114C FI81114C (fi) | 1990-09-10 |
Family
ID=23967812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI841906A FI81114C (fi) | 1983-05-16 | 1984-05-11 | Foerfarande foer framstaellning av antibiotika bbm-1675 a1, a2, a3, a4 och b1 och b2 med antitumoerverkan. |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS59232094A (fi) |
| KR (2) | KR840008817A (fi) |
| AT (1) | AT393691B (fi) |
| AU (1) | AU569294B2 (fi) |
| BE (1) | BE899667A (fi) |
| CA (1) | CA1241282A (fi) |
| CY (1) | CY1465A (fi) |
| DE (1) | DE3418023A1 (fi) |
| DK (1) | DK163127C (fi) |
| ES (1) | ES8700267A1 (fi) |
| FI (1) | FI81114C (fi) |
| FR (1) | FR2547594B1 (fi) |
| GB (1) | GB2141425B (fi) |
| GR (1) | GR81581B (fi) |
| HK (1) | HK9889A (fi) |
| HU (1) | HU193928B (fi) |
| IE (1) | IE57444B1 (fi) |
| IL (1) | IL71824A (fi) |
| IT (1) | IT1175498B (fi) |
| KE (1) | KE3846A (fi) |
| LU (1) | LU85362A1 (fi) |
| NL (1) | NL8401572A (fi) |
| NZ (1) | NZ208013A (fi) |
| PT (1) | PT78590A (fi) |
| SE (1) | SE460364B (fi) |
| SU (1) | SU1344249A3 (fi) |
| YU (1) | YU43846B (fi) |
| ZA (1) | ZA843591B (fi) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR78648B (fi) * | 1982-07-26 | 1984-09-27 | Bristol Myers Co | |
| IL79519A0 (en) * | 1985-08-27 | 1986-10-31 | Bristol Myers Co | Bbm-1675c and d antitumor antibiotics |
| US4837206A (en) * | 1987-04-29 | 1989-06-06 | Bristol-Myers Company | Esperamicin derivatives |
| US4996305A (en) * | 1988-02-29 | 1991-02-26 | American Cyanamid Company | Process for producing the antibiotic and antitumor agents LL-E33288.epsilon.ε-Br |
| CA2027601A1 (en) * | 1989-11-06 | 1991-05-07 | Koko Sugawara | Antitumor antibiotic bu-3983t |
| CN115380211A (zh) * | 2021-03-17 | 2022-11-22 | 日本水产株式会社 | 精制的方法和经精制的产品 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4195079A (en) * | 1979-01-31 | 1980-03-25 | Pfizer Inc. | New polycyclic ether antibiotic |
| JPS56113791A (en) * | 1980-02-15 | 1981-09-07 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Novel antibiotic and its preparation |
| GR78648B (fi) * | 1982-07-26 | 1984-09-27 | Bristol Myers Co | |
| US4539203A (en) * | 1984-11-13 | 1985-09-03 | Warner-Lambert Company | CL-1577D And CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use |
-
1984
- 1984-05-01 NZ NZ208013A patent/NZ208013A/en unknown
- 1984-05-08 AU AU27791/84A patent/AU569294B2/en not_active Ceased
- 1984-05-08 GR GR74646A patent/GR81581B/el unknown
- 1984-05-08 CA CA000453762A patent/CA1241282A/en not_active Expired
- 1984-05-11 ZA ZA843591A patent/ZA843591B/xx unknown
- 1984-05-11 FI FI841906A patent/FI81114C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-05-14 IL IL71824A patent/IL71824A/xx unknown
- 1984-05-14 ES ES532476A patent/ES8700267A1/es not_active Expired
- 1984-05-15 DE DE19843418023 patent/DE3418023A1/de active Granted
- 1984-05-15 BE BE0/212942A patent/BE899667A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 GB GB08412368A patent/GB2141425B/en not_active Expired
- 1984-05-15 IT IT20928/84A patent/IT1175498B/it active
- 1984-05-15 DK DK239784A patent/DK163127C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 FR FR8407477A patent/FR2547594B1/fr not_active Expired
- 1984-05-15 SE SE8402619A patent/SE460364B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 SU SU843744582A patent/SU1344249A3/ru active
- 1984-05-15 IE IE1200/84A patent/IE57444B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 HU HU841877A patent/HU193928B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-05-15 LU LU85362A patent/LU85362A1/fr unknown
- 1984-05-16 KR KR1019840002636A patent/KR840008817A/ko not_active Application Discontinuation
- 1984-05-16 AT AT0160984A patent/AT393691B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 NL NL8401572A patent/NL8401572A/nl not_active Application Discontinuation
- 1984-05-16 JP JP59096758A patent/JPS59232094A/ja active Granted
- 1984-05-16 PT PT78590A patent/PT78590A/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-05-16 YU YU849/84A patent/YU43846B/xx unknown
-
1988
- 1988-11-21 KE KE3846A patent/KE3846A/xx unknown
-
1989
- 1989-02-02 HK HK98/89A patent/HK9889A/xx unknown
- 1989-05-04 KR KR1019890006047A patent/KR920001366B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-07-21 CY CY1465A patent/CY1465A/xx unknown
- 1989-08-24 JP JP1216009A patent/JPH02128693A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4675187A (en) | BBM-1675, a new antibiotic complex | |
| US4518589A (en) | BBM-2478 Antibiotic complex | |
| FI65631C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av a-21978-antibiotika | |
| CA1249235A (en) | 4'-deschlororebeccamycin and process for its preparation | |
| US4567143A (en) | Process for preparing 4'-deschlororebeccamycin | |
| FI81114B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antibiotika bbm-1675 a1, a2, a3, a4 och b1 och b2 med antitumoerverkan. | |
| FI67403C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av antibiotfoereningar med antitumoereffekt | |
| US4582639A (en) | Antitumor antibiotic compound | |
| US4360458A (en) | Antitumor antibacterial agents | |
| NZ229460A (en) | Antibiotic compound bu-3420t and its triacetate when produced from micromonospora chersina strain m956-1 (atcc 53710) | |
| US4626503A (en) | Antitumor agents LL-D49194α1, LL-D49194β1, LL-D49194β2, LL-D49194β3, LL-D49194γ, LL-D49194δ, LL-D49194ε, LL-D49194ξ, LL-D49194η, LL-D49194ω1, LL-D49194ω2, and LL-D49194ω3 | |
| Ogawa et al. | RUBEOMYCIN, A NEW ANTHRACYCLINE ANTIBIOTIC COMPLEX I. TAXONOMY OF PRODUCING ORGANISM, ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF RUBEOMYCIN A, A 1, B AND B 1 | |
| US4572895A (en) | Process for preparing an antibiotic complex by culturing actinomyces strain ATCC 39417 | |
| US4708872A (en) | Antitumor antibiotic complex | |
| CA1235081A (en) | ANTITUMOR AGENTS LL-D49194 .alpha..SUB.1, LL-D49194 .beta., LL-D49194 .beta..SUB.2, LL-D49194 UPSILON, LL-D49194 DELTA, LL-D49194 EPSILON, LL-D49194 ZETA, AND LL-D49194 ETA | |
| US4868117A (en) | BBM-1675, a new antitumor antibiotic complex | |
| US4599310A (en) | Process for producing antitumor antibiotic compound | |
| US5116845A (en) | BU-3420T antitumor antibiotic | |
| US4952572A (en) | BU-3420T antifungal antibiotic | |
| CH663155A5 (en) | Antitumour antibiotics | |
| EP0479505A1 (en) | Pradimicins L and FL and derivatives thereof | |
| EP0431323A1 (en) | Antitumor antibiotic BU-3983T |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY |