FI65631C - Foerfarande foer framstaellning av a-21978-antibiotika - Google Patents

Description

2 65631 (H. Naganawa et ai., J. Antibiotics 21, 55-1968); brevistiini (J. Shoji ja T.Kato, J.Antibiotics 29, 380-^389, 1976) sereksiini A (J. Shoji et ai., J. Antiobiotics 29, 1268-1274, 1976) ja sereksiini B (J. Shoji ja T. Kato, J. Antiobiotics 29, 1275-1280, 1976). Näistä tunnetuista antibiooteista brevistiini, sereksiini A ja sereksiini B muistuttavat eniten uusia A-21978C-antibiootteja.

Sereksiini A:n ja B:n antimikrobiaaliset spektrit on esitetty julkaisussa J. Shoji et ai., J. Antibiotics 28 (1975) 56-59. Brevistiinin antimikrobiaalinen spektri on kuvattu julkaisussa J. Shoji et ai., J. Antiobiotics 29 (1976) 375-379. Keksinnön mukaisten uusien A-21978C-antibioottien antimikrobiaaliset spektrit ovat huomattavasti näitä parempia MIC-arvojen (mikro-organismien kasvua estävät minimipitoisuudet) eron ollessa suuruusluokkaa 10-500.

Tämä keksintö koskee antibioottien valmistusta ja erityisesti useita tekijöitä sisältävän antibioottiseoksen valmistusta. A-21978-seos sisältää tärkeimpänä komponenttina tekijän C ja li-lisäksi tekijät A, B, D ja E. A-21978 tekijä C koostuu useasta antibioottitekij ästä, nimittäin A-21978-C-tekijöistä Cq, C^, C2, ja Cg. A-21978-tekijä C:stä käytetään tässä senvuoksi nimitystä A-21978C-seos. A-21978- ja A-21978C-seosten ja erillisten A-21978C-tekijöiden CQ, , C2, C.j, C4 ja Cg suolat kuuluvat myös keksinnön piiriin.

Ilmaisulla "seos" tarkoitetaan fermentoinnin yhteydessä ja tässä hakemuksessa yhdessä tuotettua erillisen antibioottitekijöi-den seosta. Antibioottien tuottamiseen fermentoimalla perehtynyt henkilö tietää, että antibioottiseoksessa olevien yksittäisten tekijöiden lukumäärä ja suhde vaihtelee riippuen käytetyistä fer-mentointiolosuhteista. A-21978C-seoksessa tekijöitä C^, C2 ja C^ on suuremmat määrät ja tekijöitä CQ, C^ ja Cg vähemmän.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tuotettuja antibiootteja nimitetään tässä A-21978-antibiooteiksi. Yksinkertaisuuden ja lyhyyden vuoksi käytetään seuraavassa nimitystä A-21978-antibiootti tarkoittamaan A-21978-seosta, A-21978C-seosta ja A-21978C-tekijöi-tä CQ, C^, C2» C-j, C^ ja Cg ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Keksinnön kohteena on täten menetelmä A-21978-seoksen valmistamiseksi viljelemällä aerobisessa submenssiviljelmässä kantaa 3 65631

Streptomyces reseosporus NRRL 11379 viljelyväliaineessa, joka sisältää assimiloituvan hiilihydraatin ja typen lähteitä ja epäorgaanisia suoloja, kunnes on tuotettu olennainen määrä antibiootteja.

Kun antibioottia on tuotettu olennainen määrä, A-21978-seos erotetaan fermentointiliemestä suodattamalla, suodoksen pH säädetään noin 3:ksi, jolloin muodostuu sakka, joka suodatetaan. Erotettua seosta voidaan puhdistaa edelleen uuttamalla. A-21978C-seoksen ja sen tekijöiden eristämiseen tarvitaan kromatografia-menetelmiä. A-21978-antibiootit ehkäisevät patogeenisten organismien, varsinkin gram-positiivisten bakteerien kasvua.

Liitteenä olevissa piirroksissa on esitetty seuraavien A-21978C-antibioottien (Na-suoloina) IR-absorptiospektrit (KBr-pelletti):

Kuvio 1 - A-21978C-seos Kuvio 2 - A-21978C tekijä

Kuvio 3 - A-21978C tekijä C2

Kuvio 4 - A-21978C tekijä

Kuvio 5 - A-21978C tekijä Cq

Kuvio 6 - A-21978C tekijä

Kuvio 7 - A-21978C tekijä Cg

Keksinnön mukaiset A-21978C-tekijät ovat läheistä sukua peptidiantibiooteille. Fermentointiliemessä saadaan talteen 6 anti-bioottitekijää seoksena, so. A-21978C-seoksena. Eri tekijät CQ,

Cl, C2, C^, C4 ja Cg eristetään erillisinä yhdisteinä seuraavassa kuvatulla tavalla.

A-21978C-tekijät ovat lähisukua happamille syklisille poly-peptidiantibiooteille, joiden pääteaminoryhmässä on rasvahappo-asyyliryhmä. Hydrolysoitaessa saatiin kustakin tekijästä seuraa-vat aminohapot:

Amihohappo Moolien luku

Aspartiinihappo * 4

Glysiini 2

Alaniini 1

Seriini 1

Treoniini 1

Tryptofaani 1

Ornitiini 1

Kynureniini 1 3-metyyliglutamiinihappo ** 1 * joista yksi voi olla asparagiini ** saattaa olla peräisin 3-metyyliglutamiinista 4 65631

Kukin A-21978C-tekijöistä sisältää rasvahapon. Taulukkoon I on koottu kunkin A-21978C-tekijän sisältämän rasvahapon hiili-atomien luku ja rasvahappo, milloin se on tunnistettu.

Taulukko I Rasvahappo A-21978C Hiiliatomien Tunnistettu rasvahappo tekijä luku C1 C11 8 -me tyy1idekaanihappo C2 C^2 10-metyyliundekaanihappo

C C

3 13 10-metyylidodekaanihappo C0 C10 C4 C12 C5 C13

Edman'in vähennysdegradointimenetelmällä on osoitettu että N-pääteaminohappo on tryptofaani ja että sitä lähinnä oleva aminohappo on aspartiinihappo.

Kaasukromatografiset massaspektritutkimukset ovat osoittaneet, että A-21978C tekijän C2 sarja saattaisi olla toinen seuraa-vista (Asx tarkoittaa aspartiinihappoa tai asparagiinia ja MeGlx tarkoittaa 3-metyyliglutamiinihappoa tai 3-metyyliglutamiinia): 0

tl H

1) C11H23C-N-Trp - Asx - Asx - Thr - Gly -

Orn - Asx - Ala - Asx - Gly - Ser - MeGlx - Kyn 0

" H

2) C1;LH23C-N-Trp - Asx - Thr - Gly - Orn -

Asx - Ala - Asx - Asx - Gly - Ser - MeGlx - Kyn A-21978C tekijän C2 entsymaattinen hydrolyysi karboksipepti-daasi Y:llä osoitti, että C-pääteaminohappo on kynureniini ja että C-pääteasemassa oleva COOH voi esteröidä treoniinin OH-ryhmän.

65631 5

Edellä olevien tutkimusten perusteella A-219780anti-biooteilla uskotaan olevan seuraava kaava: ^ L-Aspv^ D-Ala Gly f* ψ L-Asp D-Ser * 4

L-Orn 3MG

** 4

Gly L-Kyn

\ J

N L-Thr ^ * L-Asp f L-Asp f L-Trp

NH

R

jossa 3MG merkitsee L-treo-3-metyyliglutamiinihappoa ja R:llä on seuraavat merkitykset:

A-219 780teki jä R

8-metyylidekanoyyli C2 10-metyyliundekanoyyli

10-metyylidodekanoyyli CQ C^Q-alkanoyyli X

C12-alkanoyyli x c-^-aikanoyyii * x Ei ole vielä tunnistettu.

A-219780seos ja tekijät (Na-suoloina) ovat liukenevia veteen ja happamiin ja emäksisiin liuoksiin paitsi pH 3,5:n alapuolellaj alempiin alkanoleihin, kuten metanoliin, etanoliin, propanoliin ja butanoliin; dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksidiin, diok-saaniin ja tetrahydrofuraaniin; ne ovat niukkaliukoisia tai liukenemattomia asetoniin, kloroformiin, dietyylieetteriin, bentseeniin, 65631 etyyliasetaattiin ja hiilivetyihin. A-21978C-seoksen ja tekijöiden suolamuodot ovat liukenevia veteen/ metanoliin, dimetyyliformami-diin ja dimetyylisulfoksidiin; ne ovat liukenemattomia etanoliin, butanoliin ja dioksaaniin.

Taulukkoon II on koottu kunkin A-21978C-tekijän natrium-suolan likimääräinen alkuaineanalyysi.

7 65631

,λ 3 VO rH O VO

,, -P r> σ\ vo σν U (rt . . . . .

ro cn vo ro m o

CQ LO rH (N

$ oo in rr vo r> 0) ι-t n ro o o

^ t I » » I

M ^ VO ro in rH

^ in rH CN

ro

U

^ oo ov ro vo 3 'd* «N (N vo ro P I · · (

Hl ro vo ro in H

ro m rH cn 5 ro σ> r» h o -P r~- σ\ o oo •N" 0) · · · · · *· -¾ S 10 3 JQ ^ 3 3 in vo vo vo P oo o vo oo m ro · · · · · ro i—i vo ro m cn cn m r-ι cn u 5 :(0 -P t"· rH rH -Ν' 00 Γ0 Φ iH CN TT 00 ro H M · · · · ·

y/ W ro vo ro in iH

<3 2 ^ rH CN

M +J

H I

U w O oo 3 r~ ro oo σ\ ro

Jo r: -Ρ·<3·σνοθΗΟ

Ai cn S cn in ro vo cn 3 -h cn m .—i cni

rH CN

3 I r, ro < ih jj

Eh U -P σν ** cn vo cn <U oo rH m o ro tS/ (»ti*

ω rv vo ro vo rH

^ in H CN

3 r- m ro rH

-P o σι r" oo ·>3· ro · · · · · ro cn in cn m ro cn m rH cn o° 3

-P rH c^- ro 00 O

a) VO O VO CN rr V » · · · ·

ui CN VO ro vo rH

^ in rH CN

a> c

ro S

3 s 5 * co 3 g ·§

3 -P

•H ·Η ·Η Ή Q

a 3· & & ΰ s d ^ ^ S I * 65631 A-21978C-seoksen ja tekijöiden (Na-suoloina) IR-spektrit (KBr-pelletti) on esitetty kuvioissa 1-7. Taulukossa III on kunkin yhdisteen merkitsevimmät absorptiomaksimit.

9 65631 ouoooommo m in m m O'fHTfinN'fUi iHinmro ml coooiooiom^oo cm r-t o r>- U I rOnmrMrHHHr-l r-l r-l r-l oooommmm oomo cMmcMmincMinoi cm ιο 10 *9· ^<| οοσιιοιοιηττοο cm —i o r- iH U I COPOCMCMlHi-lr-lr-l r-l r-l r-l e O' 3 oooinoinom inootn •h r-t^rHcomcomoi cm id id ^ £ oo| coooioovomrfro cm «π o i" •H Ul COCOCMCMr-lr-lr-lr-l r-lrHr-1 U)

X

(0

B

I oooommoo m o m m HD5 rHiniH^ioromo cm id id ^ h h cm I ηοσιοοιοιη^ρ^τ cm o c~ H Ul COCOCMCMrHr-l.-lr-t H r-l r-l c o <u

X Ό X -H

3 :0 oooooinom oomin ι-Η·η ο^ιΗ^ιηοηιησι cm id id rr 3 h rHl roocriooiom^rco cm H o r~

3 X Ul COCOCMCMr-li—Ir—IrH ι—I r—( (—I

E-ι <D

-3 3 •ro oooooomm in m o m otnr-i^rinTfTfOi —ι m ιο ·*τ C o| Γοοσιοοιοιηττη cm pH ο c-

(1) Ul COCOCMCMrHHHrH i—IiHiH

«

X

0 Φ

Ui U cn ooooinooinoooinmininoo cd ο ιΗΐηι—ΐτίίητριησίι—i^riDiD^r^rini-) r~ a) ciooicoioin^oorocMi—lor^iDinin

Dl CD CO CO CM CM »—I t—I i—I i—I ι—( r—I I—I p—|

CN

< 10 65631

Taulukossa IV on kolmen pääasiallisen A-21978C-tekijän likimääräinen molekyylipaino ja bruttokaava.

Taulukko IV

A-21978C-tekijä Molekyylipaino Kaava C0 1622 C72H100N16°27 C1 1636 C73H102N16°27 C2 1650 C74H104N16°27 C3 1664 C75H106N16°27 C4 1650 C74H104N16°27 C5 1650 C74H104N16°27

Taulukossa V on A-21978C-kolmen päätekijän (Na-suolamuoto) UV-absorptiospektri neutraalissa etanolissa.

Taulukko V

UV-maksimit (neutraali-etanoli) e}% lcm nm C1 C2 C3 223 307 303 300 260 62 62 63 280 39 41 42 290 35 36 38 360 33 33 32

Taulukossa VI on kolmen pääasiallisen A-21978C-tekijän ja A-21978C-seoksen (Na-suolamuoto) elektrometrisen titrauksen tulokset 66-%:isessa vesipitoisessa dimetyyliformamidissa.

11 65631

Taulukko VI Titraus (66 % DMF) A-21978C pK -arvot a_

Tekijä xx 5,7, 5,9, 7,2, 7,6

Tekijä C2 xx 5,8, 5,93, 7,6, 7,63

Tekijä xx 5,73, 5,75, 7,54, 7,58

Seos 5,62, 7,16 x Kaikilla on vähäisempiä ryhmiä arvoissa 11,5-12 xx Kaksi määritystä

Taulukossa VII on A-21978C-tekijöiden (Na-suola) optinen kiertokyky määritettynä vedessä.

Taulukko VII Optinen kiertokyky A-21978C

Tekijä Kiertokyky CQ +11,9° (c 0,7, H20) C1 +16,9° (c 0,7, H20) C2 +18,6° (c 0,9, H20) C3 +20,9° (c 0,4, H20) C4 +14,8° (c 0,7, H20) C5 +17,9° (c 0,7, H20) A-21978C-tekijät voidaan erottaa toisistaan korkeapaine- nestekromatografiällä (HPLC) seuraavissa olosuhteissa:

Kolonni : lasi, 1 x 21 cm Täyte: silikageeli/C^g (Quantum LP-1)

Liuotin: vesi:metanoli:asetonitriili (95:30:75), joka sisältää 0,2 % etikkahappoa ja 0,2 % pyridiiniä Havaitseminen: UV aaltopituus 285 nm Paine: 690 kPa A-21978C-tekijöiden (Na-suola) viipymisajat nähdään taulukossa VIII.

65631 12

Taulukko VIII HPLC viipymisajät A-21978C Aika Biokoe (Micrococcus luteus) tekijä min. (yks./mg) C0 6 966 C1 8 1663 C4 9 1410 C2 13 1390 C5 14 1246 C3 19 803 A-21978c-seos voidaan erottaa A-21978 tekijöistä A, B, D ja E silikageeli-ohutkerroskromatografiällä (TLC). Edullinen liuotin-systeemi on asetonitriili:vesi (3:1), ja havaitsemiseen käytetään edullisesti Micrococcus luteus-bioautografiaa. Näiden A-21978-tekijöiden (Na-suoloina) R^-arvot nähdään taulukossa IX.

Taulukko IX

A-21978-tekijä R^-arvo A 0,66 B 0,57 C seos 0,31 D 0,51 E 0,48 A-21978C-seoksen tekijät voidaan erottaa toisistaan sopivim-min käänteisfaasi-silikageeliohutkerroskromatografialla (Quantum C^g). Edullinen liuotinsysteemi on vesi:metanoli:asetonitriili (45:15:40), joka sisältää 0,2 % pyridiiniä ja 0,2 % etikkahappoa. Havaitsemiseen voidaan käyttää pikäaaltoista UV-valoa (365 nm).

Eri A-21978C-tekijöiden (Na-suola) R^-arvot tässä systeemissä on esitetty taulukossa X.

V

13 65631

Taulukko X

A-21978C-tekijä Rf-arvQ

C0 0,71

Cx 0,64 C2 0,56 C3 0,47 C4 0,63 C5 0,53 A-21978c-tekijät ja A-21978C-seos ovat pysyviä 5°C:ssa ja 25°C:ssa vähintään 7 vrk liuoksessa, jonka pH on 2-9. Ne ovat pysymättömiä pH llrssä 5°C:ssa ja 25°C:ssa ja inaktivoituvat täysin 4 tunnissa.

A-21978- ja A-21978C-seokset ja yksittäiset A-21978C-tekijät Co, , C3, C3, C4 ja Cg pystyvät muodostamaan suoloja. Myös nämä suolat kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Tällaiset suolat ovat käyttökelpoisia esimerkiksi erotettaessa ja puhdistettaessa seoksia ja yksittäisiä tekijöitä. Lisäksi farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ovat erityisen käyttökelpoisia. "Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" ovat sellaisia, joissa yhdisteen toksisuus lämminverisiä eläimiä kohtaan ei ole lisääntynyt verrattuna ei-suolamuotoon.

On huomattava, että A-21978-antibiooteilla on viisi vapaata karboksyyliryhmää, jotka voivat muodostaa suoloja. Keksintö käsittää siten sekasuolat, osittaiset ja täydelliset suolat. Valmistettaessa tällaisia suoloja tulisi välttää pH-arvoja yli 10, koska antibiootit ovat pysymättömiä sellaisilla pH-tasoilla.

A-21978-antibiooteilla on myös kaksi vapaata aminoryhmää, ja ne voivat siten muodostaa mono- tai di-happoadditiosuoloja.

Erityisen edullisia suoloja ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät alkalimetalli-, maa-alkalimetalli- ja amiinisuolat sekä happo-additiosuolat. Esimerkkeinä A-21978-antibioottien sopivista alkalimetalli- ja maa-alkalimetallisuoloista voidaan mainita natrium-, kalium-, litium-, cesium-, rubidium-, barium-, kalsium- ja magne-siumsuolat. Sopivia A-21978-antibioottien amiinisuoloja ovat esimerkiksi ammoniumsuolat ja primaariset, sekundaariset ja tertiääri-set C^-C4-alkyyliammonium- ja hydroksi-Cj-C^-alkyyliammoniumsuolat.

65631 14

Esimerkkeinä amiinisuoloista voidaan mainita A-21978-antibiootin suolat reaktiossa ammoniumhydroksidin, metyyliamiinin, sek.-butyyli-amiinin, isopropyyliamiinin, dietyyliamiinin, di-isopropyyliamiinin, etanoliamiinin, trietyyliamiinin ja 3-amino-l-propanolin kanssa.

A-21978-antibioottien alkalimetalli- ja maa-alkalimetalli-suolat valmistetaan menetelmillä, joita yleensä käytetään kationi-suolojen valmistuksessa. Esimerkiksi A-21978C tekijän vapaa happomuoto liuotetaan sopivaan liuottimeen, kuten lämpimään metano-liin tai etanoliin, ja liuokseen lisätään liuos, joka sisältää stökiometrisen määrän haluttua epäorgaanista emästä liuotettuna vesipitoiseen metanoliin. Muodostunut suola voidaan eristää tavanomaisella tavalla, kuten suodattamalla tai haihduttamalla liuotin.

Suolat orgaanisten amiinien kanssa voidaan valmistaa samalla tavalla. A-21978C tekijän liuokseen sopivassa liuottimessa, kuten asetonissa voidaan lisätä kaasumaista tai nestemäistä amiinia ja liuotin ja ylimääräinen amiini voidaan poistaa haihduttamalla.

Esimerkkeinä A-21978-antibioottien sopivista happoadditio-suoloista voidaan mainita standardireaktioilla orgaanisten ja epäorgaanisten happojen kanssa muodostetut suolat, kuten kloorivety-hapon, rikkihapon, fosforihapon, etikkahapon, meripihkahapon, sitruunahapon, maitohapon, maleiinihapon, fumaarihapon, palmitiini-hapon, koolihapon, pamoiinihapon, mukiinihapon, D-glutamiinihapon, d-kamferihapon, glutaarihapon, glykolihapon, ftaalihapon, viinihapon, lauriinihapon, steariinihapon, salisyylihapon, metaanisulfoni-hapon, bentseenisulfonihapon, sorbiinihapon, pikriinihapon, bentsoe-hapon, kanelihapon suolat.

Eläinlääketieteessä on hyvin tunnettua, ettei antibiootti-muodolla ole suurtakaan merkitystä eläintä hoidettaessa antibiootilla. Useimmissa tapauksissa eläin muuttaa lääkkeen toiseen muotoon kuin missä se annettiin. Siten ei ole suurtakaan merkitystä sillä, minä suolamuotona antibiootti annetaan. Suolamuotoa vallittaessa otetaan kuitenkin huomioon taloudellisuus, tarkoituksemukai-suus ja myrkyllisyys.

Keksinnön mukaisen mikro-organismin tutkimisen ja karakterisoinnin suorittavat Frederick P. Mertz ja Ralph E. Kastner, Lilly Research Laboratories.

Uusi, A-21978C-antibioottien valmistuksessa käytettävä mikro-organismi eristettiin Ararat-vuorelta, Turkki, otetusta maanäyt- 15 65631 teestä. Organismi luokiteltiin uudeksi Streptomyces roseosporus-kannaksi, Falcao de Morias ja Dalia Maia 1961. Luokitus perustuu vertailuun julkaistujen kuvausten kanssa /R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams and Wilkins Company, 8. painos, 1974? ja E.B. Shirling ja D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces," Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 808-809 (1972) ”J.

Luokitus perustuu menetelmiin, joita on suositettu kansainväliselle Streptomyces-projektille /e.B. Shirling ja D. Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces Species," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)_/, sekä tiettyihin lisäkokeisiin. Hiilen hyväksikäyttö määritettiin ISP 7^ 9 perusväliaineella, johon oli lisätty hiililähteitä loppukonsentraa-tion saamiseksi 1,0 %:ksi. Hiililähteet steriloitiin suodattamalla, perusväliaine steriloitiin autoklaavissa. Lukema suoritettiin 14 vrk inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa. Soluseinäsokerit määritettiin Lechevalier'n menetelmän muunnoksella (M.P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera," Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, Dr. Thomas G. Pridham, Cconvenor? pidetty laitoksessa Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971. Diamino-pimeliinihapon isomeeri määritettiin Becker'in et al. /β. Becker, et ai., "Rapid Differentiation Between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates," Appi.

Microbiol. 11, 421-423 (1964)_/ menetelmällä. Aminohappoanalyysi suoritettiin pestyistä soluseinäfragmenteista. Melanoidi-pigmentit määritettiin käyttäen seuraavia: USP 1 (tryptoni-hiivauute-liemi), ISP 6 (peptonihiivauute-rauta-agar), ISP ^ 7 (tyrosiiniagar), modifioitu ISP 7 (ISP φφτ 7 ilman tyrosiinia), ja tyrosiinikoe suoritettiin Yuzuru Mikami'n et al./Yuzuru Mikami, et ai., "Modifiel Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 27(3), 290 (1977)J? kuvaamalla tavalla. Tärkkelyksen hydrolyysi määritettiin kokeilemalla jodilla tärkkelyksen läsnäolo.

Lämpötila-alue, NaCl-sieto, pH-alue ja antibioottiherkkyys-kokeet suoritettiin käyttäen ISP ΦΦ 2 agarväliainetta. Lämpötila- 65631 16 alueet olivat 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 ja 55°C. NaCl-sieto mitattiin lisäämällä NaCl:a agariin 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ja 12 %. Inkubointi suoritetaan 3Q°C:ssa. pH-alue määritettiin säätämällä agarin pH juuri ennen agarin valamista 3,Q:sta 11,0:aan 1,0 pH-yksikön välein. Antibioottiherkkyyskokeet suoritettiin asettamalla ympätyille agarlevyille antibioottipitoisia kiekkona.

Värien nimitykset noudattavat ISCC-NBC-menetelmää (K.L. Kelly and D.B. Judd "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names," U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C., 1955).

Suluissa olevat luvut viittaavat Tresner-Backus-värisarjoihin /h.D. Tresner ja E.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy," Appi. Microbiol. 11, 335-338 (1956)_7· Värimäärittelyt on alleviivattu. Maerz-Paul-värit ovat hakasuluissa (A. Maerz ja M.R. Paul, "Dictionary of Color," McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, N.Y., 1950).

A-21978-antibioottia tuottavan kannan karakterisointi

Morfologia A-21978-antibiootteja tuottavan kannan A-21978.6 viljelmän morfologia käsittää Rectus-Flexibilis (RF) luokkaan kuuluvia sporo-foreja. Itiöketjuissa on> 10 itiöitä ketjua kohti. Itiöiden pinta on sileä.

A-21978.6 viljelmä tuotti vallitsevasti punaista ilmaitiö-massaa, jonka alapuoli oli punertavanruskea. Havaittiin myös vaaleanruskeata vesiliukoista pigmenttiä. Nämä tunnusmerkit esiintyivät kolmella 14:sta agarviljelyväliaineesta (ISP φψ 2, ISP φφ 7, ΤΡΟ). Nämä kolme väliainetta olivat ainoat, joilla esiintyi runsasta ilmahuovastoa ja vegetatiivista kasvua.

Kahdella agarviljelyväliaineella, ISP ηφ 4 ja glukoosi-aspa-ragiiniagar, ilmaitiömassa oli väriltään valkeasta harmaaseen ja alapuoli oli keltainen. Vesiliukoista pigmenttiä ei havaittu. Näillä kahdella väliaineella saatiin hyvä, muttei runsas, ilmahuovastokasvu ja vegetatiivinen kasvu.

Ykdeksällä muulla agarviljelyväliaineella saatiin heikko kasvu tai ei lainkaan kasvua eikä itiönmuodostusta.Kun ilmahuovastoa muodostui, se oli heikkokasvuista ja väriltään valkeasta harmaaseen.

Melanoidipigmenttejä ei muodostunut. Soluseinämän pääaineosat 17 65631 olivat: LL-DAP, glysiini, glukoosi ja riboosi. Tämän perusteella soluseinämä oli tyyppiä I ja sokerimalli tyyppiä C (R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, Eds., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology," The Williams & Wilkins Company, 8. painos, 1974, s. 658).

Laboratoriokokeissa verrattiin A-21978.6-viljelmää seuraa- viin :

Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 Streptomyces candidus ISP 5141; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497 Nämä viljelmät kuuluvat värisarjoihin valkea ja punainen, niillä on RF-tyyppinen sporofori-morfologia, sileä itiöpinnan kuviointi ja ISP-kuvausten mukaan ne ovat melaniini-negatiivisia, eikä niillä ole selvää alapuolen väriä eikä vesiliukoisia pigmenttejä. Nämä tunnusmerkit sekä hiilen hyväksikäyttöinäni ja muut sekundaariset piirteet ovat samoja kuin A-21978.6-viljelmällä.

Kun näitä viljelmiä verrattiin laboratorio-olosuhteissa, niin neljä niistä hylättiin. S. candidus ja S.setonii muodostivat keltaisen ilmaitiömassan monilla väliaineilla ja erosivat siinä suhteessa A-21978.6-viljelmästä. S. albovinaceous ja S. moderatus muodostivat selvän tumman alapuolen värin, vesiliukoista pigmenttiä ja melanoidipigmenttejä, jotka ominaisuudet olivat erilaiset kuin A-21978.6-viljelmällä. ISP:n kuvauksessa S. moderatus-viljelmästä esitetään sillä olevan vahvanruskea alapuolen väri, muttei vastaavaa tunnusmerkkiä S. albovinaceous-viljelmälle. Kumpaakaan ei ole mainittu melamiinipositiiviseksi.

A-21978.6-viljelmä luokiteltiin siten Streptomyces roseosporus-kannaksi, Falcao de Morias ja Daliä Maial961. Tämä luokitus perustui vertailuun julkaistujen kuvausten kanssa ja labo-ratoriokuvausten kanssa. Seuraavassa on yhteenveto viljelytunnus-merkkien vertailututkimuksista.

1 8 65631

(N

CM

iH

m

G

Ph G

tn -H Ό

H <0 Ή G

4J O G

Il -H <D

— G P 03 Ή ·Η ·Η

oo X :<0 S

m 4J »o ε 3-

σι 3 G -H

ro £ >i G in cn -P <u m

* P P

u te 0) Cm

0 -n JJ -H

ΐ-, g ·η -h ε i c A! M >1 ä Λί :G to ro to G :<0 r- vo G O ε <0 ·*·

u M -P * «H

o -H to <N

O, G P O) X

[0 -H CO tO X

O > G -H co D G tO G P ».

tn -P -h ε o rH

O -P CL o

P S_| -H di G Ή I

•H G O :G

X . > O X t" G tn g x P σ.

G jG tn -rl £ o cl o

to H3 CM

G -H G ,X

G tn ε -H

co h ε

G '—I *H -H

-PO G

>1 Ή - O

• I M —«M G

GO Ph -P G ε •ro s « X G 3- rH -- 0) 0) •H rH X l£> > id W -H *

P O (N

-h · tn i <D O r~ G iH G σ> g -ρέα. tn G- σ

-H G G

G tn tn oo x p tn -h η» G G - ΓΗ το £ Ή en

G -P O

-P G G X o X :G l G ^ m m H :G P oo vo M -P -H v *>

O -h 0. O O

G :0 tn -h ·· ·· ··

P :G P I O

P H G :0 -H G

-H »—I -H ;G rH

M · -H -P M G

O G M H :G G

P to :G G .0 vo O O G EHi

• M iH O -H GO

00 O G X «

r- 0. G G tn G

σι tn M p G G

P -MC «G

CM Oi -H

<C tn O.

65631 19 c <u

G

•H

(Ο -Ρ

(O rH

Q) (O CU

M 0) :<Ö Ai (O

co X <u c <u

00 3 « M -H Ai :<CJ

in M 3 en co -h

σ, G M -h tn G -P

rn 0) C > G M -P

CO -H e (0 e e CU -H 0) CO CCS M -H O)

r ) i rH (O r—I CO >H O > S

rj Π O -P O G »0 rH -H D>

cLj .f,* rH (0 -H Φ !<C3 G -H ‘H

SS Ή 0) ·π« ·Η M -P Ai -H (CJrHCX

^ <u a: S <u o -p -p <u o

tn 4J C e -P rH

2 Tj <u to g to · a:

u e 6 Φ CU (0 rH G

o fl) &1(0ΉΕ>(0-Η

g e H J) fl 0> (OrH

m & PH ,i< <0 Ή tO > n .H rH > a O 10

m a. to (0 ro \ +J

S ^ -p > i\ co r->a) Q t0 CO CNl -P ^ |J Ai

^ -P e -H tOCQcOOJestO

H CO CD O ^ O -H -- rH G

. -H G Ai JS irH O VJ M

tn O -H G M ~ Vl A! G

J - λ: to -h to 3—.cotnto e a) g (UrHrHUioo-Hptoto a)

Jn rH -H rH f0 l0 Ai rH f0 CO C0 rH

Λ 2 O :ιβ H O -Ρ -H I Ai Ai Di G C (0

Zrt S· > ,G <U CU -H -H -H (0 G G <Ö 2 * h >t -H -ho -p <u a) cu i m m >

Z- CU .G CU CU .* Ρ Λ Λ CU

4J 3 -p to (0 3 >- 3 U -h en___ I) Ή (0 4J .H rC :t0 rH · :(0

tn Q, -P I O) rH C .H

ί S -H -rl M <0 G -P

•n a g g s i a -p

CD (0 ^ O Ή IP· G

g 2- +J - +J > (0 OH CD

s 5 (0*:GftG>rH(0E

2 S· CG -H >i (0 H HlCi · D

e [Π G 33 -PM rH -H 0) > G ·Η 3 u3 ttOMG. HJ-PtOrHttOjC^GOt

3 nO* -H CU· G w CU tU-ri'— · G CU

M oi· P>p<rH CU Ai -P E:t0

T. mrH -P (0 g rH rH -P rg M > (0 (0 X

Σ? (0 G fö tn <Ö G G (0 :(0 Oi CU 3

V, (0 (U > -H > G CU Ä-PrH Ai -H

•Fo > S & Ä COCOrH

_l D> I ΐΙιβ|Η & Ί{λ «3

Zj I -H <0 r —. (0 -H O > M G

·< (0 (0 (¾ (OtO-PPHSGftPHtn -P

^ Γ ta cu to a) en co -r > en g .2 ε Ai to saj-hh (0ΗΟοΊ<υ M co -P Meno e C\ -p OS rH Ai

(0 3 W (0 G Ai CU H' (0 w Q CO

m G M -H Λ M G G < -H IDG

. O -H -H o O "Vl M

00 * rH to rH Ai G

g; cog co h^g tnento

L (0-H G G (0 -A <0 (0 (U

Xl !(β CO rH :tG CO -P U Ä H COCOrH

™ > G > e (0 G > CC G

«£ >1 G ·Η >1 G CU 0>1-H GG (0 **· G M CU G M Ai Ai G CU MM >

CO

£ ·· G -GM G G

£ <U (U G ·· CU "CU

2 OC O G CO OC OG

2 -P -H -p -H e -P -H -P -H

Λ co> to > e co> tn>

G -M G -H G G -H (0-H

> -H ί> -H -P > -H > -H

O-P O-P O-P O-P

p ta 3(0 G <0 G <0

G -P G -P G -P G -P

tocu (0 CU (0 CU (0 CU

sen 6 tn G tn G tn

r-HCU rH (U rHCU rHCU

M > M> H> M > 20 65631

IT] I

(0 β 6 :f0 ·Η C β :(0 ρ -η tn φ α> -<π (0 X tn β β -Μ

X X β -Η H X

β β (Ο (Ο (0 β :ι0 0) Μ -Ρ -Ρ 0> >6 Ο Ή H g m :(0 CP 0) (ϋ Dl °° -ρ η β λ; μ ·η £ ρ a o β β & <υ ο) (0 (0 k] X (0 Η > (0 > (0 ™ H <0 ·Ρ X (0(0 <0 (0 -Ρ

ri Ρ O) >ϋ) (Ο -Ρ :(0 Ai -Ρ M

H :(0 Ai -H > β X -H H X -H

y. > Ή β O Φ (O X (0(00 3 «o to a: cn β g χ > g λ > Φ β Ο H Ρ β ρ β H H ro (0 (0 Φ Λ| (0-Η tn (0(0Ή X X β X Η β (Ö ^—. ι—( &ι

Ρ S > ·Η Ρ5 Φ fN. H £ [N O

Ο ο-' 0) ιηι ft oil -Ρ a γη ο ιο tn ^ .η (0 o to ο β Ρ |Η +J β Ρ Λ Φ Φ (0 tn -—. φ \j tn ω β Cn ·Η ρ β β Ο Η (0 Ο (0 Ή Ρ Ρ (0 CO Ai tn (0 β * Ο Η > (0 β (0 <Η (0 W3 ,¾ (0 Η (0 ·Η ι (0 Φ > Μ -Ρ φ »0 ιη Η ·η X :ι0 Η ω η χ a: > β β χ: > (0 φ φ ο α: >ι β ·η ·η ο >((0 ^ « χ α: ρ χ ρ φ η α: χ > <0 :(0 (θ' Ο — X (0 α: ρ ι ρ_ X (0 -Ρ (0 to tr (0 a •n (0_ h tn ^ I :i0 O !(0 (0 , O -H β ·Η I (0 +> χ ι χ tn χ -h φ

•H β Ρ X X H Ai H

Ai (0 φβ· :(0 β O Ή (0 p T-I H Φ tn φ φ P (0 (0 Φ (0 HgP P g Φ > > :<0 S p Φ tn O x tn cn β -h

tn β Ai -H :tÖ H H > (0 β X

3 (0 aa >anp:(ox e W fi H β U> β > β β ^ «o (0 — «0 (0 w a a0 Φ β φ X H X Ρ X g P ro (ö h cn tö h cn m β ρ fr

>1 Φ (0 H *3* φ Φ -H a Φ H

H HL Ai (0 O . Ai Ai O Ha

φ r(s H > X -k H Ai Hf (0 H

•r*' (0 β'Ι^φββ'Η.ΧΦιΟ

H > rs. H > to H H Ai X

h cu (Ν' Ha φ h a h tn > tn (0| < · tn x| h tn · -h

H .—. O β (0 H (0 (0 H ^ g · O

5 \H β X s (0X |S Ρ β Ai -Nam >(0 ^Φββ φ φ χ a η β β · α; γν. Ai β η η φ φ η tn 'η' tn φ ι\ ρ ββφβ mo βΜ· ;(0 Η Η (0 Ρ Ο Ρ H m β > (0<0>β »H β (0 *00 β 'χ h h to \ΐ β η n a • (0 (0 β Φ Φ (0 οο X X :(0 Η :(0 :(0 H X :(0 Η Γ-~ ΧΧ>(0 >>(0 X > (0 σι 00:(0(0 >ι >ι <0 Ο >ι (0 Η Ai A! X > X X > Ai X > <Ν ^ ·« ·· ·· ·· ·· β β β φ φ .. φ β Ο β Ο β Ο β > X ·Η X H X Η tn tn > tn > tn > (0 (0 H (0 H (0 Ή

X > H > H > -H

O X O X o x β <0 β (0 β (0

XX X X XX

(0 Φ (0 Φ (0 Φ β tri έ tn e tn r-Ι φ Η φ Η φ H > M > H > 21 65631

•H

G 4-> 0) 4-1 G G c G :tti -H O)

co t<ti (ti Ή t> (ti -H :(ti E

uc > 0) 4-1 :td 4-> 4-> 0)171

0\ «ti Λί -P 4-1 rH 4-1 M -H

ro 4-i mc P O C ,c CU

rg P 3 <D <U Λ! 0) -h <D P e Ή g > ·

O <HCtT>r-tCtn GM

rj Ή <H sd -P 0) (ti -H φ 0

Ph P 0) > CU M > CU CO -H

> ifö M :iti (ti -H i—l > -PC · 4-1 G iti tn · U Φ E A <U (ti 4-> :(d

3 E <D C P (d C O .-( <U

G P Ή -P Id · g ·Η 0) P

o (0 · <P O .C C P O r-ι M £

a A G Φ M G <ti M (d C -P

m G M G ΛΙ Dj A G > (ti >

n Λ Λ -H OI -P 0) G

/n U| »H LH · n-N, i—t (d rp 0) o) m · m r-t rd ω

o H W (d ~ td a td — rd-H

£ ^ id h φ « « h <d s>td « Id H ϋ > f-A M — 4-1

. N M tn rP

CO G G Φ

* H h M

G G G G

> to w<d co co<d oocd tn cdrdcu (dcdo) ^:^20) rt* <d tn in h tn tn -h m m <-a o « cctd c c <d -H-Htd G G <ti 3 3 3 Q)Q)(d S p p > ρ p > ,c x: > td ^ r-ι " td O p tn td --- td -— jj t7 G _______(ti •H iti Φ G Φ 0 i g 4J p ij -H -H -H td tn

hi c Iti -P O tn G

e -P C 4-1 -H (fl (ti P

m Ή I D 4-1 IH 0) I (d

3 CO :td CU G -H m -P C -P

C 0 4-1 β 11 fl tn 4-1 G 4J

c P P Iti g O G -P (Ti 4-1 3 >i 0) 0) & g P (d c ij &4 rH Λ! -H (ti · 0) — -H tn (¾ G C rH +J g Φ g -h Q) :<d td Λ Cn <u λ; p e - tn -h g O -h •n · · Q) 4-> -H 4-1 g m Oi h ii. g Id C 4J id 4-1 3 □ % p -p -p a> 4-i e ή ιχ· ►> (ti ä o C .-p o en nr ,¾ CU .C O A! C 0) g ή --id en mg o sentti pj -p

H λ -H 03 G -rl M ιΓ~ I—I

o| *ν. <—i td cu *νχΐ m · cm1 0) nj G M id i rH td i g ω •h 3 PJ Φ i tti-P i a> pui u οΰ cu ,γ·- a: i rdeo i e en :td ^ · N to > -p -h g

> Ή G O td M

o itienp O a: mc . cnidtdc 0) MG Φ ns ns aa (ti > 0) Id i-l -P -H 4-1 0) e-- tn Cg O *P i—I O JC i-Η CTi 3 C 3 E φ Old (-4 3 3 P 3 -H A -Ά -H^td cg P > -P 0) 0) φ > ^ -e »e -e G φ Φ Φ

> O G O G O G

tn 4J -H 4-1 -H 4-1 !( 3 en > tn > tn >

M Iti -rA Iti -rA iti -H

> Ή > -H > -P

0 4-1 0 4-> O 4-1 G Iti G Iti G Iti A 4J A 4-1 JC 4-1 (ti Φ Iti Q) to O) g en E en g en Ή 0) fH O) «H Q) H > H > M > 22 65631

fi mO

mO <D

> P

»O C Λ P (1) Η Ή P fi P > 0) H P fi H (0 fi :(0 I—I -P 0) > 0) H g :(0

00 X 0) Cn -P

m x h p <T\ · CU Q)

ro H g (OH

ίΜ p II P · g fi 0) H »0

:(0 II (0 fi P 0) X d> -H

U> II X5 3 (0 fi ΗΛ-p u a jd η (Ο β p

Eh Λ| Ο > (Ο β < u| · M a> a) m h m1 β xj h g in m H h «o tp

β '—N (0 (H r—t 3t (0 H

u « > ,h — > Λ 0 \i (0 a ai ro

w x β N, P

o to <u cm1 0)

<U 3 β tn H

« p h cm ο

Ο β (0 H X

ρ αία) miniä πχΐβ

3 HH (0(00) (OH

• > 00 0) in H P:(0H

win β β (0 x: >

(0 H H 3 3 <0 P O >i H

x αία) p p > <0 λ: x: a)

Di —- (0 5 1

OP -H

X (0 β

p Cn H

(0 (0 H

•d I D> w Ui U to

O (0 P

P 3 D) (0 H H (0 ci X H __ _ Ui._ P β (0 0) β H | g H “ H β

Ui - fi Ui 0) 3 λ: o o β

β 0) 0) OH

e Λ P X to

3 (0 0) 3 P

P N MOg «OH H MÖ

>1 U H W HO 0) H

H p P M P

0) (OP P (0 · P

d (00)β C 0) g C

H 0) Λ5 0) 1) ^ S tl H H g g H (0 g > H H (0 D> D> (0 X! D>

P (0 > H »"s, H > H

mo > & i 10' cu a > Ui I XI Λ CM* (00)(0 I ro (0 ^ffl(0 — x; p h p s cm p 5 MO 0) \i O) '-'HO)

v—' H H H H

O 0 0 x xx VO 003 00)3 3

• X X H x (0 H H

00 X X r-i X 10 H :(0:(0 H

Γ~~ H H H β > >

σ« 0) 0) H 0) 3 H >1>1H

H XXJOJ X3 P 0) X5 XS 0)

CM

·· ·· ·« ·· · ·· > β β β

Ui a) 0) 0) <0 O fi O fi O fl

« PH PH PH

Ui > Ui > 0) >

(OH (OH (OH

> H > H > H

OP OP OP

3 (0 3 (0 3 (0 x: p x: p x3 p (0 0) (0 0) (0 0) E tr g D> g D> HO) HO) HO) H > H > H > g 65631 23 α

• (O

β β Π β 0) -H td (β Ai β -p g td tn m Ή -P H >3 f? td c td * p £ -PO) 23 rH c x? rl e c rl :β

Zl β D ' β β > ™ a; -h to Ai :td -p

,. -Ρ β Ck -H · -P -P

Hp td td E p -p H:td ωβ td-p:td ρ β fi 3 > β rl β J| H Ή β rl β ^ tutdfi a; β -p 23 n g

AittJ-H rl Ai -P β D

tn rH > o β β β 231 Ai ·ρ 3 β Ai > id ω o| Οι

P > |\ 3 <Ug in K

O ro' ·Ρ ΛΙ h θ' r-~’ β a äi o h r. β -p ^ pi a» tn -—o ^ ui a Ph <n β O !2 1 rH td —' 3> — «rH -rl

<u ·—' CU (d \| O

CO Ai β -p Ai o tn tu tn 3

p 3 β -H -H

P -H O rH

• β 3 Ai w ei m li rH 3 tntntd 3 idtdtu «j -Η tdtdtu > m tn h HJttdn cntOAi tn ββΐΰ 23 > β β tn r. td 3 3 Λ O >ι Ή P 3 3 3

td K P P > AI 23 β <d Ρ Ρ P

O Dl

Ai β

-P I

td O

•ΓΗ P .β ^ td 3

Dl 3 P td -n H I td A! -H p P β 3 β -p - - β------ g -P td Ai tn tn a> i 3 > Ai <d β td β rt tn β 3 tu β Di 3 td 23 Λ Ai 3 ip td td · tn P -P β g -P rl p

rl td P ·Ρ 3 P

ri Otd-POtd-Ptd-p

β P g-P-P 23 -Ρ ^ · -P

-n tU Ρ-Ρβ c β · g -P

rl to β β -P tUMdfdrlPC

•p >i 23 β > tn-P6rHtdtu > n β E β -P-POtUÄg

O «DOS td -P Eh Ai β D

g -P +j β w · to -p g öt rl Q) g g a, 3 tu g P f •P -Ρβ A! & β 3 fi P I <U I β ·Ρ 23 -p tu :<ti I IN. β l td Q< fi > I CN1 -P 10) 231 rs. -p rl O rl β o| oi» o VO rl a; β 4-1 in h ^ • |0O 3 β tn r. 213

00 ^NJ -P > -P 0H ,00 -P

P- rl o ^ SJ P

D o Ai rl ΟΟΙβ <U Ai 3 tn β β <N AittJtU rHAi-P ββο) < Ai M A! O-Prl CO CO Ai •p β m tu β β m Φ 3 3 -P23-P 333 3 23 P P β <U ppp ^ ·· ·· ·· tn ·· β β β β β ·· β ·. β « Ο β Ο β Ο β Ρ -ρ -Ρ -ρ -Ρ ·ρ μ > tn > tn > β ·Ρ β ·Ρ β ·Ρ > ·Ρ > ·Ρ > -Ρ Ο ·Ρ Ο -Ρ Ο -Ρ 3 β 3 β 3 β 23 -Ρ 23 -Ρ 23 -Ρ β β β β β β

g D ED ED

rl β rl β rl β H > M > H > 24 65631

Hiilen hyväksikäyttö

Substraatti A21978.6 S. rQaeosporus ATOC 23958 L-arabinoosi + + D-fruktoosi + D-galaktoosi + + D-glukoosi + + i-inositoli D-mannitoli + D-raffinoosi L-ramnoosi + +

Salisiini + +

Sakkaroosi D-ksyloosi + + + = käyttää hyväksi = ei käytä hyväksi 25 65631 00 in σ> m cg

U

U “ en >i

* S U

rn O O c#> g M rH in £ I II I I H- Ό + rH + so

o >1 I I

α Λ m in O ·£ <1> >

M <U

0 P ^

CO

•H

(O

>1 >1 Γ“Η

O

M

Ό >1 CO O df>

• O

oo > rH o o

Γ" | Il I I + 0) + rl | H

σ -h i i •H i—i m in

esi CM

<

G

Φ I «0 aj ε S 4J rH β 3 3 -S -rl o

(0 3 M O

> (0 03 Γ- -P 03 •H > tri -H -r-i -rl -rl (O "IL 05 03 x -h i C ε p I xl -h :os

•rl I C Oi — β rH

G -H -H CO 03 03 >i O C rs -rl H -H 03 -H tn

•H-POiötn—c id E in 5hC

P O. -P -P O -H >iO>i -P 3 -P Sh Q, 3 P · -H 4-1 -P >i tn> PCPtuflSHxsmtu^i-PrH -h co iji*J0(Si+)OOO(1)iiio <u pk; o3 * e -- ε p -p > p 3 -h ^ p en >1 i tn en Ό rH o)

Oj-HrHlO Γ- Γ" -P -rl 0) 0J >4 Q Q< ·ν

«Λ G G P Λ I O

w -H -H -H en 3 e -P

2 ^ -HCtn>4 H H Jl S -H ip Hs % Ήν tn -H 3 rH Φ -h -P -rl

Co Ο-Η-ΡΦ3·Ρ03«

3 G pj Oi 11! Oi P -P 3 <H :0 03 I

Moscow ωω >ιο3,*Λ:ο3α1ρ>Η

rH H H HH E* *-H -rl p | S 4-> U

Φ Φ 03 :o3 K :¾ -H 3 S O > M Oj P1 Z 2 26 65631 00 m σ» ro

<N

U

U

< 10 3

M

O

a en o + + i i i + + + <u (0 o m • w

KO

00 r-~ σι + + l i + + + + f—t

CM

<U < 0

X -H

10 Ό -rl

>1 -H C -H

>1 -h m -h Ό Λ X E O ·Η ·Η :nj

X Ή δ Ή Μ Η +) +J

Μ Ό <β Ό ·Ρ >ι Οι +J

0) ·Ρ Ρ ·Ρ C Ή ιΗ >ι 0) m X id ri^ncJOtJitoQ* m

1 OflOtD-POrtJO

•Η λ; ΡγΡ,*>ιΡ3Ρ.* Λ Ρ Ο .* | >, Η α ·ρ Ρ >ι :ο Ρ 3 (d~vrHO<US<UiH >, O tl >

Ο ~ O

•H (U -H

θ -¾ -P

‘Ί >ι ·ρ 1 λ θ C :0 ·Ρ

< >, A

O > C

X O Ή

X -P

<D · · -P -H

•h tn tn ·ηο) X CnO'CT'^ASlT'CntTi Λ w

\ 3^3-3->i >i 3-3-3» -H

m j3 -h

3 inoiNOOooo C-P

3 h n o o >H ro ro -Ρ P tn rH ro —- C

•H <D

O :<Ö -P

P X (0 •H X ·Η A< p tn a> ω

Xl P

Il II

+ i m -h

•h e -P

C ·Η ·Η ·Η C ·Η

H ·Η ·Ρ C C ·Η ·Ρ C

•Ρ -H C ·Η ·Η ·Η Μ -Ρ ·Ρ Ρ U) ·Ρ -Ρ C ·Ρ >ι -Ρ ·Ρ Ο >ι -Ρ (0 ·Ρ 0) g ^ 0) O gP>,-PAJO>i>i Ρ OOgPSoPtng

-Q PrHOfdgOinJO

•Ρ PUiiPSlIPJi ρ >ipctn»pppc C PO)-P>iOP<l)<d < WK4ZH-Wh> 27 6 5 6 31 A-21978:aa tuottavan S. roseosporus NRRL 11379-kannan tietyt tunnusmerkit eroavat kirjallisuudessa kuvatun S. roseo-sporuskannan tunnusmerkeistä. A21978.6-viljelmällä on erilainen itiöiden koko, kasvu- porkkana- ja perunatapeilla, NaCl-sieto ja nitraatin pelkistys kuten tunnetulla kannalla.

A-21978-antibioottien tuottamisessa käytettävä Strepto-myces roseosporus-viljelmä on talletettu laitokseen the Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 ,josta se on yleisön saatavana numerolla NRRL 11379.

Streptomyces roseosporus NRRL 11379:n viljelyyn voidaan käyttää monia erilaisia viljelyväliaineita. Niistä on kuitenkin taloudellisuuden ja tuotteen optimisaannon, eristä-mishelppouden vuoksi edullisia tietyt viljelyväliaineet. Suu-rimittakaavaisessa fermentoinnissa on edullinen hiilen lähde esimerkiksi tapickadekstriiniä, vaikka myös glukoosia, fruktoosia, galaktoosia, maltoosia, mannoosia, puuvillasiemenöljyä, metyylioleaattia, glyserolia ja puhdistettua soijaöljyä voidaan käyttää. Edullinen typen lähde on entsyymihydrolysoitu kaseiini, vaikkakin liukoista lihapeptonia, soijajauhoa, soija-hydrolysaattia, soijarouhetta, hiivaa, aminohappoja, kuten L-asparagiinia ja DL-leusiinia voidaan myös käyttää. Vilje-lyväliaineeseen sisällytettävät epäorgaaniset suolat ovat liukoisia suoloja, joista saadaan väliaineeseen kalium-, ammonium-, sulfaatti- ja nitraatti-ioneja. Erityisen edullinen antibioottien tuottamisessa näistä on . Sopivia käytettä viksi ovat myös melassituhka, tuhkadialysaatti ja synteettiset mineraaliseokset.

A-21978-antibioottien tuottamisessa käytetään viljely-väliaineessa edullisesti tislattua tai deionoitua vettä.

Jotkut vesijohtoveden sisältämät mineraalit, kuten kalsium ja karbonaatti näyttävät haittaavan antibioottituotantoa.

Organismin kasvun ja kehittymisen kannalta välttämättömiä hivenaineita tulisi myös sisältyä viljelyväliaineeseen. Tällaisia hivenaineita on usein epäpuhtauksina muissa vilje-lyväliaineen aineosissa riittävästi organismin kasvun kannalta .

28 65631

Suuressa mittakaavassa suoritetussa fermentoinnissa saattaa olla tarpeen lisätä pieniä määriä (esim. 0,2 ml/litra) vaahdonestoainetta, kuten polypropyleeniglykolia.

Olennaisia määriä A-21978-antibiootteja tuotettaessa fermentointi suoritetaan edullisesti aerobisesti submersisti tankeissa.

Pieniä määriä A-21978-antibiootteja voidaan tuottaa ra-vistuspulloviljelminä. Antibioottituotannon nopeuttamiseksi suurissa tankkiviljelmissä ei yleensä käytetä ymppäystä itiöillä, vaan edullisemmin organismin vegetatiivisella muodolla. Vege-tatiivinen ymppi valmistetaan ymppäämällä pieni määrä viljely-väliainetta organismin itiöillä tai huovastolla, jolloin saadaan tuore, aktiivisesti kasvava organismin viljelmä. Vegetatiivinen ymppi siirretään sitten suurempaan tankkiin.

A-21978:aa tuottavaa organismia voidaan kasvattaa lämpö-tilavälillä 20-37°C. Optimilämpötila näyttää olevan noin 30-32°C.

Kuten yleensä aerobisessa subraerssiviljelyssä viljelyväli-aineen lävitse puhalletaan pieninä kuplina steriiliä ilmaa. A-21978-antibioottien tehokkaan tuottamisen kannalta tankkivilje-lyssä ilman kyllästysasteen tulisi olla yli 20 %, edullisesti yli 30 % (30°C:ssa 1 atm paineessa).

Tankkifermentoinnissa fermentointiväliaineen pH on noin 6,5-7,0. pH voidaan säätää sopivaksi lisäämällä esim. natrium-hydroksidia (aikaisissa vaiheissa) ja kloorivetyhappoa (myöhemmissä vaiheissa).

A-21978-antibioottien tuottoa voidaan seurata fermentoin-nin aikana määrittämällä viljelyliemestä tai huovaston kiinteiden aineiden uutteesta otetuista näytteistä antibioottiaktiivi-suus antibioottiherkän organismin avulla. Sopiva koeorganismi näiden antibioottien määrittämiseen on esimerkiksi Micrococcus luteus. Biokoe suoritetaan edullisesti agarlevyillä paperikiekoil-la.

Submerseissa aerobisissa fermentointiolosuhteissa suoritetun A-21978-antibioottien tuottamisen jälkeen antibiootit voidaan ottaa talteen fermentointiväliaineesta alalla tunnetuin menetelmin. Vil- 29 65631 viljeltäessä A-21978-antibiottia tuottavaa organismia antibiootti-aktiviteetti saadaan tavallisesti viljelyliemeen. A-21978-anti-bioottituotteista saadaan siten suuri osa talteen suodattamalla aluksi pois huovastomassa. Suodatettu viljelyliemi voidaan puhdistaa monin eri tavoin A-21978-seoksen saamiseksi. Edullinen menetelmä käsittää uuton ja A-21978-seoksen saostamisen.

Lisäpuhdistamiseksi ja A-21978C-seoksen ja eri A-21978C-tekijöiden erottamiseksi suoritetaan lisäadsorptio- ja uuttotoimenpiteitä. Sopivia adsorptiomateriaaleja A-21978C-seoksen ja sen eri tekijöiden puhdistamiseen ovat esimerkiksi: 1} anioninvaihtajahartsit - a) vahvasti emäksiset; polystyreeni, BioRad AG 1 ja 2, Bio-Rex, Dowex 1 ja 2, Amberlite IRA 400, 401, 410; b) kohtalaisen emäksiset; epoksipolyamiini Bio-Rex 5 ja Duolite A30B; c) heikosti emäksiset; polystyreeni tai fenolinen polyamiini Bio-Rad AG3, Duolite A-6, A-7, Amberlite IRA 68, IR-45, IR-4B; 2) silikageeli; 3) florisil; 4) polymeeriadsorbentit (XAD-2 ja 4); 5) erittäin huokoiset polymeerit (Diaion HP-20); 6) Sephadex G-10, G-25 ja G-50; Bio-Gel P-2 ja P-10; 7) käänteisfaasihartsit, silikageeli/C^g ja silikageeli/Cg; 8) hiili; 9) DEAE-selluloosa, DEAE Sephadex; 10) polyamidit; 11) aluminiumoksidi ja 12) mikroselluloosa. Tuottajat: Bio-Rad ja Bio-Gel-hartsit - Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia; Amberlite ja XAD hartsit - Rohm and Haas Co., Philadelphia; Duolite-hartsit- Diamond Shamrock Chemical Co., Redwood City, Kalifornia; Sephadex-hartsit - Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Ruotsi; Dowex-hartsit - Dow Chemical Co., Midland, Michigan; Diaion -Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japani; XAD-hartsit, silikageeli/C-^g ja silikageeli/Cg - E. Merck, Darmstadt, Saksa.

Vaihtoehtoisesti viljelmän kiinteitä aineita, mikä käsittää viljelyväliaineen ainekset ja huovaston, voidaan käyttää A-21978-antibioottien lähteenä uuttamatta tai erottamatta, kuitenkin edullisesti veden poistamisen jälkeen. A-21978-antibiotin tuottamisen jälkeen viljelyväliaine voidaan esimerkiksi kuivata lyofilisoimalla ja sekoittaa suoraan rehuesiseokseen.

Seuraavissa kokeissa käytetty A-21978C-seos ja sen eri A-21978C-tekijät olivat natriumsuoloina.

A-21978- ja A-21978C-seokset ja A-21978C:n eri tekijät Cq, C^, C3' C4 ia C5 ehkäisevät tiettyjen patogeenisten organismien, 65631 30 varsinkin gram-positiivisten bakteerien kasvua. Standardi-agarlai-mennuskokeilla määritetyt minimiestoväkevyydet (MIC-arvot), joilla A-21978C-tekijät ja A-21978C-seos estää joidenkin bakteerien kasvua, on esitetty seuraavassa taulukossa XI.

31 65631 ro ro vo VO ro

iH rH O O rH

ml »-»** B Ui O O Ο O O Z

m ro rs o h m o *n*| ·» - > ·* «. Eh

U | O rH O O rH Z

vo ro m ro o h rs H m o ro I - » - - - .

ui 0 0 0 0 0-0* ro m ro m i—( rs i—i rs o o — ui O O O O rH «a*

rH

e

CT

d.. ro ro ^ m o rH >H m o I—| | -k *k *k -k k. *

UU| O H O O O VO

H rH

S

m o o rs m o -k OI -k k. kk v £-|

ui rH rs O O rH Z

H

X

o

M

M

a rH m ro m ro ro a O h rs rH rH m o Φ »· S ». K k ».

E-i CO O O O O O 00

H

s*

M I

M vo ro ro ro γ~ m o (li o m rs rs m h

o oo U di m rH

ro rs (O rH

tn -H tn — tn tn o a a <d c a a c o o to tu Q) υ φ s u a) c p o tr a o o •h a o o ω υ .a a λ a υ >i a o p -p

O O CU CU -P P rH

P tn -P a O -H

ru a a m m φ c a) a υ a> a a p o ,* CJ P υ υ -P Cn| o o -p o υ en x h υ tn o o ro 6 O υ υ tn -h -h W rHQOOCP tu h >i -p -p ro υ a ,e a a a T3 tn n ro a 3 Φ O) -H tn

rOOPPP-H E-I

p ·Ρ P -P -P -H d) z o cnucntn>z * 65631 32

Standardi-viljelyliemilaijnennuskokeilla määritetyt minimi-estoväkevyydet, joilla A-21978C-seos ja sen tärkeimmät tekijät ehkäisevät joidenkin valittujen bakteerien kasvua, on esitetty seuraavassa taulukossa XII: 33 65 631 ro ro ro

H H H 1/1 O

ro I ** k * *. ^

UI O O O O CS

ro m m o es o o —* es I «··»»··>·* HUI O H O H l£> £5 i—i tp 3.

O O LO o o U r-t I - HUI H rs o es rs S ro to m in ro O rs rs h in o

CD

CO O O O O CO

H

H

X

H

O

λ: x a; μ 3 ro (ö ro rH in o O-l 'S' 3 m es es ep

(C O 00 U CD <P

ro rs pj co -h tn ^ CO t/1 <D G 3

C 3 3 C 0 O

<D CD O CD g O

C U υ tP 3 O

•h 3 o o cd υ X) Π3 U >1 e 0

O O ft ft -P

μ tn -p ft tu 3 ft tn tn cd <0 υ tu 3 3 μ ~ u u υ o +1

O -P Ό O CO

ή υ co o o g o υ o tn

tn h q o o G

•H >1 -P -P (U

G J3 ft ft ft Ό (0 ft 3 CD CD ·Η

CP (0 O M M M

M -P μ -P -P ·Η O CO O CO co > 65631 34 A-21978C-antibioottien eräs tärkeä ominaisuus on niiden kyky estää muille antibiooteille resistenttien organismien kasvua. Taulukkoon XIII on koottu ICS-agar-laimennuskokeella saadut A-21978C-tekijoiden CQ, C^, C2> C3, C4 ja C5 MIC-arvot tällaisten kantojen suhteen.

65631 35

<D

3

I—I

«τί

m » I

- - «N U

O *3· H

—· - “· s) Tj a o .—. .—- - -

η σι m « ui -H

—· -- —* oo - ·— 3 m m n o Tr h -4-1

CM CN CN rH U0 - ' «—I

U - - * · — in — u oo o o o o in * co h

r- I I I I ~ O <N S U

<Ti CN CO Ιβ ΙΠ CN rH H

H I—I I—ι o cn >—i λ :3 S

CN I g c ooooo :3 :3

P g :(0 C -P

X o x c 3 «ο o •H — Ή Ä H — VO rH 3

H g CTi rH 00 - :3 -r| i-H

0\ — ‘ <D * ,-H MOtH

P tj> rH — in 00 r-H — rH :3 TO 3 β 3. U o CN * Λ r~ — :3 β «0 —'00 H - r. » ^ oo 00 g - β X r- « o in r> h ' m 3 :3 3 tn σ» in ι — oo i m rH ,¾ P A! C >ι rH ·> n cm - n - A 3 :3 -rl > CN OrHrHCNrHOl rH :3 :3

•rl > < «··»*» ID g r-H

tn 0) O O rH O rH β 3 rH

H -r| ^ 0) X CU

H C TO -Γ0 3 T3 H -H > O rH 43 X -H O P >i

r-H P CN C C

O X « co rtj CU β

M CU Λ X -n-H

X β -rl ' N «Γ O <TJ

3 -H g m m ' β p > rH 43 -H CO Λ —« 0) β 3 ·Η β O -— ·—· - - Γ- -nttJfi

3 >< -H O O CN - ·— — — 3 X -H

H PS 00 rH rH U0 00 O CN * P -rH

P Γ- -- — — -K rH β β <u en o n m «f h ^ * -h <u P rH -IIIIIEH CU Ό - •H CN rH r—l LO CN CO .-H JS AJ-rlCTj

P < CN rH O -rl O

0) - x e u

— O O CU

tn cn il ti g 3 rH — 3 p — — — co— — o o e 3 O ' CN r-H p p

X H «I - m dl H CUCUCU

rl ’ -rH ' «TJ ' ' g g rH

3 g m HM 330 > tn p <u tn β 3 <u β β 3 3 0) β 3 0 O 3 -rl-p

β X CU Ό CU O g O CU 3 3 <U rH

CU P -H tr O 3 O O >> -H

T3 -H 30cOOCUO43 CU CU 3 CU

-H g 3 CU] >ι O β O P H H 10 X

:θ V) djoqJpm ootno n -h tn tn p a o -h x •rl β 3 3 en a U) CU β 333

X 3 O O 3 CU 3 P O III »H H

<u σ o o o p o p σ<1 n tn 3 <u -P M 0 O O P O W -H -rl en

I O O O O W O 3 33 II

U CU OOO 03 -H rH r-H β

oo O rHrHOQOCP 333EH

t" « >ι >i P P 3 CU W W Ai S

en 4S Λ OH »Ö Λ Ό M

rH a a <u g CU -rl tn CN 3 3 P ,9 P P -H ne I ΡΡΡίτ,Ρ-ΗΟ) * * <$ tn co tn « en > 2 * * * 36 ϊ 65631 3 rl <0 (n υ

n H

a O ^ .— (N — ·Η H N H 00 ‘N 3

w ^ ^ ^ Λ w 4J

ld '—* tr in in

in n m ' in w on U

U - * Λ «. vo ~ E-t H

oo ootnoooZ s

t" i i — i »I

tn ιχ> ro o m o m :to rH O rH O »H rH £ cm ·* * * % * :3

Coooo O 4-1 U

H

G S

O

:3

cn on 3 H

—. ro ro rl :3 O —> - » fS r-t 4->

rl ON V£> —* - -H

G ^ rl CO r. 0 G

•H «*ιηθ-^-Γ"<Ν·Κ ·η o A u - ·—-O — ^ -x •rl 00 O rl Lf0 · in N * -3 0 Γ' il^ri».|E-i :3 :3 ri +J tn minniOrilz M >-i ri G ri m m h in :3 :3 3

tö tN “ * * *· :3 :3 G

X «Coooo S eg - -S * -S -S-5 3 'rl K rl rl tld O W rl rl X -Hr. - CO G G Ή 4-1 G rl -r -T ^ Oltua) 3 -rl E O ι—I ·— - ·(—I TO Ό

•n -H \ rl rl IX) r. r~ r. o O A

w rl on ^ ^-00 'r -r tn 4J 4-1 >1

M a onninm^inni'- GG H U rl (N tN LJO (N "r 00 3 3 G

H G 00 · ' ' · ' in N X X -rA

h -r-itn r-- ooooo - ri to X .G >1 O I I I I I O A c G >

•rl>ir|IX)V£)tOfN«J | <U<U

O >i> tN OOOrlO rf -m -m G

Λ* -P Φ <' - G 3 -H

X 4-> .X OOOOO -P -P -H

3 0) itä rl rl c

H 4-> > Ή -H

3 tn o tu Φ - 3 v-14-1 X X (0 E-t n tn 0 0 0 0) <u χ x u •rl -r 0) tn E (N — Il II g 3 -H rl 00 3

P G — r- _ ---- O O G

3 -rl O r~ — N H P P

x s «η ta — <n tu ri tutua»

•rl — -h ^ td —" E E H

3 K gin -h tn 330 > tn ρ φ tn g 3 Φ c G 3 •rl 3Q)G30U<d -H 4-) G H Φ Ό Φ O E O Φ 3 3 0) rl

(U tnp-rltn0300 >> -H

'd -rl 3 0< O O Φ O ,G Q)tU3<U

•rl G 3 Φ| >i O G O P rl rl tn λ;

••O 3 Oi O 04 4J P OOtOO

n tn tn tn +> a O ·η ,χ •rl l-l 3 3 M O 01 Φ G 333

M O O O 3 0) 3 M O tninri-H

tu Φ υ υ υ p o 4-> tnl tn tn 3 Φ •P 0 OOO-POCO -Harien

1 X U O O V) O 3 33 II

U OOO O W -H rlric CO ririOQOGP 3 3 3 Eh r·» >, > U 4-) 3 Φ m Ui χ & tn ,C -G O :3 O Ό tn •h a a φ g φ -h tn

tN 3 3 P Jc Ρ Ρ ·<-| 4C

I 44 4-1 4-1 >1 +J Ή φ * « < U) tfl ID u: tl) > 2 * * * 37 65631 A-21978C-antibiootit estävät myös tiettyjen aerobisten bakteerien kasvua. Taulukkoon XIV on koottu standardi-agarlaimen-nuskokeella määritetty A-21978C-seoksen ja A-21978C-tekijoiden C^, C2 ja aktiivisuus erilaisia aerobisia bakteereja vastaan.

38 65631

CO

0 o o o m o o co oo oo

0) * * »*«·*· <N CM CM

CO rH00r-|00r-HOrHr-l(NrHrH^ V ΑΛΑ m m m inminininmcMcMcNoo in mi «.

UlOOOOOOOOOr-ICNO

A

in o o o o cm o in co I « cm CJ I i—I iH rH (N iH <N Or—iOrH^ *3*

<“» A

r4 e

\ o o oinomooovocN

tr dl *» * * *· ~ *> * (N r4 d

υυΐΉΟΟι—Irrr—lOiHOrHf—I £ V V A

υ

H

S o o o o o co oo «r

041 - »· »· - ~ CM CM lO

U I H 00 ri 00 CM H H I—4 ΓΊ rl H

Λ A

oo oo CM (M l£> iHliriO'triD'-a'njcN^roOrHr-i

U I I—I i—I AA

> h in

X CM CO

" CM

O OlCMCM^^T'T'M'OCMiHH'TCM

x u I a * 3

I—I

3 3

fH

CO

co 3 CD 3 -r) 3 ·Η Ό U Λ O) rj 0 g j| co co>i a)a)co Im

G G Ή rö+JQ) COO

0) 0)0 ccc OÄ •H 01 S Ή >4 (0 -H o CO -H ft

•H c 3 O ti -H (0 -H Λ O

rH -rl OHJXJ-PCOCO HEH

0)l4-H+JOO33E-H>iO C0m-P00>0030i(0|a) M^ftiHojooo-Hco g wvvwtauoouu •HOj(0n3itiO4OO0)M-<E6 •H 0 O 3 3

S CflE^SUCO-P-POCO-H-H

to a)33333ftftnja)HH

•h o -h -h -h ο o a) α; λ Ό a) ti)

G ^OOMOOJ-iM-H-rC-P+J

(0 E-H-HQ)00+>-PCOOO

01 OMM-POOCOCOOi-IOjcO

>4 3·Ρ-ΡΟΟΟΟΟ-·ΗΟ)ΛΛ O ·ΗΙΟΙΟ(04->-Ρ·<->·Ρα<4->00 0) 4JOO^3ftftftftOOC0C0 O O-Hr43(U<l>a>O Ht033 39 65631 A-21978C-tekijöillä on osoittautunut olevan in vivo anti-mikrobista aktiivisuutta kokeellisesti aiheutetuissa bakteeri-infektioissa. Kun koeinfektiossa hiirille annettiin kaksi annosta koeyhdistettä, saatiin havaitusta aktiviteetista ED^Q-arvot /vaikuttava annos (mg/kg), joka suojaa 50 % koe-eläimistä. Katso: Warren Wick et ai., J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)_7· A-21978C-seoksen ja sen tekijöiden C2> C2, CQ, C4 ja C5 ED5Q-arvot on esitetty taulukossa XV.

40 6 5 6 31 αι (0

•H

G «N

0 o τΐ> σι co vd r·* S mroHocoror-ii-lro

P Q

<y w ooooooor-· c ft 01 n ro ro vo ro 3 u ΗΗΟίηιηοπιη UH - > ' * * * - - U S oooooooo o o o

-P

ft 0

P

•P

01 d I—I ro

•H O

(0 1/1 P oi Q ro σι vo P 01 W σι in vo

0) G

> dl tr> m rt (n <n ro ro GO ovomrovoom^rn'

Φ >1 LOOOOi—IrHOOVO

•H ft Q

01 W OOOOOOOO

X 10 d d d υ oi u •HO rorovoinrovomro

> U OI HHOCNHOOrH

> -HÖH - 01 X -H-PSI OOOOOOOO 3

-P ft AG

0X0) G

X <0H 01 x -p ε

d O UI -H

H > (0

d H H

(ti > P

H (d c tn •H 01 (0 d nj 01 —

•ro P H

d rsi g O (Ö O (N VO 00 CO \ P mcNHo h m en •P ui o «. » *. ' ^ •h d M o o o o o ^ > o O 01 CO >1 HU >1 o > r—I H ro vo ro ro ai

>i U in h O H H X

.G m * * » «. :rd ft S o o o o o > fd o o id

-P +) +J -P

ui oi G -P

w oi cd d h 0 ·ρ id -p o) ε G x -P 0) -H -H 01

O G G G G

O I ·Η ·Η ·Η G

-h h ro o ^ m -h ε <d d Λ U moUUUUoi hoi •H 00 00 CO CO 00 00 00 0 ll(d

-P r^n-r^r^n-n-r-· p CO

G σισισισισισισι-Ρ UO-P <c HrHrHHfHHrH^l M ,G G mmmcsinirMiMP 2 -h id <<<<<<*ί[£)Ηη)οο 41 65631 A-21978C-tekijöiden ja A-21978C-seoksen eräs tärkeä ominaisuus on niiden vaikutus munuaistulehduksen käsittelyssä. Kokeellisesti rotilla aikaansaadussa munuaistulehduksessa A-21978C-tekijöillä saatu suojavaikutus oli parempi kuin esimerkiksi vankomysiinillä saatu. Tässä kokeessa käytettiin Streptococcus faecalis (Guze) bakteeriviljelmää. Viljelmää kasvatettiin tryptikaasi-soija-agarilla (BBL), viljelmä suspendoitiin aivo-sydän-infuusioliemeen (BBL), jaettiin 0,2 ml:n annoksiksi, jotka jäähdytettiin nestemäisessä typessä. Rottien tartuttamiseen valmistettiin bakteerisuspensioita päivittäin ymppäämällä 50 ml:n tryptikaasi-soijalientä (BBL) sisältävään pulloon jäädytetty ampulli, inkuboimalla viljelmää yön yli ravistus-laitteessa 37°C:ssa. S. faecalis viljelmä laimennettiin 5 x 10® kasvukykyistä yksikköä ml:ssa sisältäväksi. Koeyhdisteitä injektoitiin ihonalaisesti kerran päivässä 7 päivän ajan. Kaikki yhdisteet oli suspendoitu 0,125-%:iseen karboksimetyyliselluloosaan.

Rottien koeinfektointi suoritettiin seuraavasti: Naaraspuoliset eri rottaperheisiin kuuluvat albinorotat (Cox-Wistar), jotka painoivat 190-210 g, nukutettiin injektoimalla intraperitoneaalisti 12 mg natriummetoheksitaalilla, jota tarvittaessa käytettiin lisämäärä. Kokeellisesti aikaansaatu munuaistulehdus perustui Guze’n ja Beeson'in tutkimuksiin, joissa vasen virtsajohdin tukittiin 20 minuutiksi ja tämän jälkeen koeorganismia injektoitiin 0,5 ml reisilaskimoon. Mikrobien vastainen terapia aloitettiin 4-5 tunnin kuluttua infektoimisesta. 4 tuntia viimeisen käsittelyn jälkeen rotat tapettiin, vasen munuainen poistettiin ja homogenoitiin Duall-myllyssä fysiologisen suolaliuoksen (9 ml) kanssa. Näin saatiin 10 1 laimennus munuaiskudoksesta. Kudoshomogenaatista valmistettiin edelleen käsiteltyjen solujen suhteen 10-kertaisia laimennuksia suolaliuokseen. Lopuksi useista näistä laimennuksista tehtiin agar-valuja kaksoiskokeena ja agarlevyjä inkuboitiin 37°C:ssa. Terapeuttinen vaikutus ilmaistiin kahdella tavalla: (i) sellaisten rottien 2 %-määränä, joiden munuaiskudoksesta saatu lukema oli alle 10 munuaiskudoksen grammaa kohti; näitä nimitettiin "parantuneiksi", ja (ii) sellaisten rottien %-määränä, joiden bakteeritiitteri oli alentunut vähintään 4-log^g verrattuna infektoitujen kontrollimunuaisten bakteeritiitteriin. Kontrollirottia käsiteltiin pelkästään 0,125-%:isella karboksimetyyliselluloosalla. Kontrollirottien munu- 8 8 aiskudoksen elävien solujen luku oli 1,2 x 10 - 4,6 x 10 homogenoi dun kudoksen grammaa kohti.

Näiden kokeiden tulokset on koottu taulukkoon XVI.

65631 42 «5 en en <o

CJ -P

eu -h

M ei) dP

o e λ: ro - en -M »a 2 «S S S e * c6 a> m o

rH Λ P

2 e

2 e S

(0 <U -H

ro 12 §

C -H <U

3 O e e -r-i eu

rH

C - Ό <1)

•H # C CT

+) '— -HO

+j P PI in o o e» σι o (OeDliri in o Γ' e» M ·Η+{Ί· r-l P -p

C -P Ή -P

(D O ·Η H

e «-PO

•H

Φ e ex ® ® s X! ej> ti ero ,x -3 > \ 3

Cn * m > s ε o, °. ° ° °. ° 3 * ’C' “ J* IN h-I rH r-l -H 3 o «-e e ^ ^ e ,Χ O e ? s

M en < = -X

3 1

g M N

!o J e

9h < O

U

a -* en < r-ι .H m ro m -h a CJ E O O n) Ή (N r-l M\» - - - - iti en 2 tr h i—i o o o υ D 3. <1> CJ ^ ® u ^ 0 o 9 u * ^ o “ 3

pH

o] -h en <d

a en >ι X

a rX ;ro £ eu .x :ro en i ή m · 2 Ϊ | S g

g 2 S. “ S

en a m ro P ‘C

9 >i CJ CJ CJ CJ ro -P -H E CO 00 00 00 Ijm

ή -P Or-' Γ' r~ e~~ *p JS

ϋ ^ α\ σ\ en σ\ >ο 9 2c Ή rH r-l rH C (-.

.X O >0 CN CN <N (N " 'P

o^> < < < < _,H

43 65631

Suurimpien A-21978C-tekijöiden ja A-21978C-seoksen myrkyl-lisyysarvot on koottu taulukkoon XVII.

Taulukko XVII A-21978C:n myrkyllisyys LD50 (mg/kg)

Hiiri Rotta

A-21978C IV SC IV

Tekijä 250 365 479+32

Tekijä C2 150-250 175 204-17

Tekijä 50 70-75 160

Seos 150 175-190 169-10

Kun A-21978C-seosta tai A-21978C-tekijöitä käytetään bak-teerienvastäisinä aineina, niin niitä voidaan antaa oraalisesti tai parenteraalisti. A-21978C-seosta tai sen eri tekijöitä annetaan lääkkeeksi tavallisesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen tai laimennusaineen kanssa. A-21978C-seoksen tai sen tekijöiden annostus riippuu useista tekijöistä, kuten hoidettavan infektion laadusta ja vakavuudesta. Alan asiantuntija voi helposti määrätä sopivat annostusrajat ja/tai annosyksikkömäärät edellä esitetyistä MIC- ja ED^0-arvoista sekä myrkyllisyysarvoista ottaen samalla huomioon potilaan tai isäntäeläimen kunnon sekä infektoivan mikro-organismin.

A-21978-antibiootit ovat käyttökelpoisia eläinten kasvua edistäviä aineita. Kananpojille annettaessa A-21978C-seos paransi painonkasvua ja ruokinnan tehokkuutta. Taulukkoon XVIII on koottu tulokset kahdesta tätä aktiviteettia osoittavasta kokeesta. Näissä kokeissa A-21978C-seosta annettiin eläimille 25 g rehu-kg:a kohti. Antibioottia annettiin neljälle kahdeksan linnun muodostamalle kaksoiskoeryhmälle, joille kullekin suoritettiin toistokokeet suurryhminä (kaikkiaan kahdeksan linnun kahdeksan toistokoetta, so.

64 lintua). Koeaika oli 21 vrk, ja se suoritettiin lintujen ollessa 7-28 vuorokauden ikäisiä. Vaikutusta kasvuun (painonlisäys, ravinnon-kulutus ja ravinnon teho) verrattiin samanaikaisesti kontrollikäsit-telyä saavaan 40 rinnakkaiskokeeseen.

44 65631 iff 3 S O <Γι

(0 <#> i 00 J

Vj I - I -

(0 -h ^T

Λ c o c •H n r— in γμ (0 d oo

(¾ r- r> o LO

\ * - * "

•0 W Ή H H

P >1 P :<0 :0 (0 >1 Ή W rH

:(0

P

:m :(0.—. o τ m S cr· co m o co ;0 ^ r- io P P :0 >1 tn (0 2 ° nj 5 Ή I Ή

H irt HD I ·> I

H 2 I Ί· (N

> Λ » ° c

£ C tn S

2 (0 •h'-' ^ ^ ’ CL» i—I dp

o II

•H —.

P P o <0 3 o

Ό C rH

P O

P P X

C \ I in i in

O) tj> | (N | (N

(Λ — O

S >0 5 H >

Xi (OP

H (0

Λ -H

to λ: <ΰ m

> -h .. -h .. ^ S

--1 P ^ p ΰ ~ * (D P S P S m 4J o Γ" O ^ tl) c 4J p <n p <r> -PO) •h p p -p p f? ΐϋ! :t0 O < O < ^ 7ί

X « * 5 S

•H P

tn C

:(0 O

« λ; I! - ~ > 45 65631 A-21978-antibiootit ovat tyypillisiä siipikarjan kasvun edistäjiä annettaessa niitä eläinten rehuun sekoitettuna 1-100 g rehu-tonnia kohti.

Keksinnön mukaisen menetelmän valaisemiseksi esitetään seu-raavat esimerkit.

Esimerkki 1 A. Fermentointi A-21978C:n valmistamiseksi ravistuspullossa Lyofilisoitu Streptomyces roseosporus NRRL 11379 pallonen liuotettiin 1-2 ml:aan steriloitua vettä. Tätä liuosta käytettiin agarvinoviljelmän ymppinä. Agarilla oli seuraava koostumus:

Aineosa Määrä (%)

Glukoosi 0,5

Hiivauute 0,2

CaC03 0,3

Agar 2,0

Vihannesmehu x 20,0

Deionoitu vesi Säätämätön pH = 6,1; autoklavoinnin jälkeen pH = 5,9. x V/8 Juice, Campbell Soup Co.

Ympättyä vinoviljelmää inkuboitiin 30°C:ssa noin 7-10 vrk. Viljelyn jälkeen vinoviljelmä peitettiin steriilillä tislatulla vedellä (10 ml) ja siitä ravittiin steriilillä pipetillä irti itiöt. Saadun itiösuspension osaa (1 ml) käytettiin ymppäämään 50 ml kasvuväliainetta, jolla oli seuraava koostumus:

Aineosa Määrä (%)

Trypticase soijaliemi 56 3,0

Dekstriini 2,5

Vesi (deionoitu) x Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md.

Ympättyä kasvualustaa inkuboitiin 250 ml:n erlenmeyer-pullos-sa 30°C:ssa noin 48 tuntia ravistimessa, joka toimi 250 r/min kierros-nopeudella (5 cm:n läpimittainen kehä).

Tällä inkuboidulla kasvuväliaineella (0,5 ml) ympättiin 50 ml:n määrä tuotantoväliainetta, jolla oli seuraava koostumus: 46 6 5 6 31

Aineosa Määrä (g/1)

Glukoosi 7,5

Tapioka-dekstriini x 30,0

Entsymaattisesti hydrolysoitu kaseiinihydrolysaatti xx 5,0

Entsyymihydrolysoitu kaseiini xxx 5,0 K2S04 17,4 L-asparagiini, vedetön 1,32

Deionoitu vesi 1 litraksi x Stadex 11, A.E. Staley, Co., Devatur, Illinois xx NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y. xxx Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise.

Ympättyä tuotantovällainetta inkuboitiin 250 ml:n erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa 6-7 vrk ravistimessa kiertonopeudella (5 cm:n rata) 250 r/min.

B. Tankkifermentointi A-21978C;n valmistamiseksi Suuremman ymppimäärän saamiseksi 10 ml edellä valmistettua inkuboitua vegetatiivista kasvuväliainetta käytettiin ymppäämään 400 ml saman koostumuksen omaavaa toisen vaiheen vegetatiivista viljelyväliainetta. Tätä toisen vaiheen vegetatiivista viljelyväli-ainetta inkuboitiin 2 litran pullossa 48 tuntia 30°C:ssa ravistimessa (5 cm läpimittainen rata, 250 r/min).

Näin valmistettua inkuboitua toisen vaiheen vegetatiivista kasvuväliainetta (800 ml) käytettiin ymppäämään 100 litraa steriiliä tuotantoväliainetta, jolla oli sama koostumus kuin osassa A. Ympättyä tuotantoväliainetta fermentoitiin 165 litran fermentointitankissa 6-8 vrk 30°C:ssa. Fermentointiväliainetta ilmastettiin steriilillä ilmalla 1 atm paineessa siten, että ilmalla kyllästys oli yli 30 % ja sekoitettiin tavanomaisella sekoituslaitteella kierrosnopeu-della 200-300 r/min.

Esimerkki 2 A-21978C-antibioottiseoksen erottaminen

Esimerkissä 1 saatu koko viljelyliemi (6050 1) suodatettiin suodatuspuristimella käyttäen 3 % suodatusapuainetta (Celite 545, Johns-Manville Products Corp.). Suodatuskakku pestiin vedellä, jolloin saatiin kaikkiaan 4100 litraa suodosta, joka kokeen mukaan sisälsi 230 yks./ml. Suodoksen pH säädettiin HCl:llä arvoon 3,5, ja 47 65631 hapan suodos sai seistä huoneen lämpötilassa 16 tuntia, jolloin aktiiviset tekijät saostuivat. Suspensioon lisättiin suodatus-apuainetta (0,75 % Celite 545:ä), ja sakka suodatettiin eroon. Suodatuskakku uutettiin kaksi kertaa 410 litralla metanolia, jolloin ennen suodatusta sekoitettiin aina tunnin ajan. Yhdistettyihin metanoliliuuutteisiin (720 1) lisättiin 0,1 tilavuusosaa vettä (72 litraa). Liuoksen pH säädettiin NaOHslla arvoon 6,5-7,0. Liuos väkevöitiin tyhjössä noin 1/20-tilavuuteen (30 1) metanolin poistamiseksi? tarvittaessa väkevöinnin aikana lisättiin vettä. Sitten lisättiin sekoittaen n-butanolia (3/4 tilavuutta eli 22 litraa). Saadun liuoksen pH säädettiin HClsllä 3,0:ksi. Faasit erotettiin, ja aktiivisen aineen sisältävä n-butanolifaasi väkevöitiin tyhjössä. Saatu jäännös liuotettiin mahdollisimman vähäiseen määrään metanolia, metanoliliuos lisättiin 30 tilavuuteen asetonia, jolloin pääosa A-21978C-seoksesta saostui. Sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 247 g epäpuhdasta A-21978C-seosta (780 yks./mg).

Metanoli-asetoni-suodos, joka sisälsi loppuosan A-21978-seok-sesta (tekijät A ja B) väkevöitiin. Jäännös liuotettiin tert.-buta-noli: H20-seokseen (5:1), ja tämä liuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 169 g A-21978-seosta.

Esimerkki 3 A. A-21978C-seoksen puhdistus

Esimerkissä 2 valmistettu epäpuhdas A-21978C-seos (734 g) suspendoitiin veteen (25 1), ja suspension pH säädettiin 5-n NaOH:lla arvoon 5 materiaalin täydelliseksi liuottamiseksi. Saatu liuos vietiin kolonniin, joka sisälsi 27 1 ioninvaihtohartsia (asetaatti-muoto) (IRA 68, Rohm & Haas Co.). Kolonni pestiin 4 x kolonnin tilavuudella vettä (108 1) ja sitten 5 x kolonnin tilavuudella (135 1) 0,1-n etikkahappoa. Aktiivinen aine eluoltiin 0,5-n etikka-hapolla, jolloin koottiin noin 120 litran fraktioita, joista kustakin määritettiin biologinen aktiviteetti.

Vahvasti aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 278 g ruskeata A-21978C-seosta (1100 yks./mg); fraktiot, joiden aktiivisuus oli alhainen yhdistettiin, jolloin saatiin 238 g ruskeata A-21978C-seosta (880 yks./mg).

B. A-21978C-seoksen lisäpuhdistus

Osa IRA-68-kolonnista saadusta aktiivisemmasta A-21978C-seok-sesta (150 g) suspendoitiin veteen (600 ml) ja suspension pH säädet- 65631 48 tiin materiaalin liuottamiseksi arvoon 6,5; suspensioon lisättiin sellainen määrä kuivaa silikageeliä (Grace, Grade 62), joka pystyi absorboimaan vesiliuoksen. Kostea silikageeli vietiin 30 litran asetonitriilin kanssa pakattuun silikageelikolonniin (Grace 62) (10 x 375 cm), (silikageeli oli etukäteen pesty vedellä hienojen hiukkasten poistamiseksi; kolonniin pakattiin sitten veteen suspen-doitu silikageeli ja silikageeli-kolonni pestiin 30 litralla asetonitriiliä). Lastattu kolonni pestiin asetonitriilillä (15 1) ja eluoitiin asetonitriili:vesi-seoksella (4:1), jolloin koottiin 4 litran fraktioita. Eluointia seurattiin biokokeella ja silikageeli-ohutkerroskromatografia-bioautogrammilla /CH^CNsI^O (3:1)^/. Fraktiot, jotka sisälsivät pelkästään A-21978C-seosta (fraktiot 43-60) yhdistettiin, väkevöitiin tyhjössä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 86,2 g kellertävänruskeata puhdistettua A-21978C-kompleksia (1160 yks./mg). Fraktiot 21-29, jotka sisälsivät tekijöitä D ja C, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 13 g keltaista jauhetta, jonka biologinen aktiviteetti oli alhainen.

Saadulle puhdistetulle A-21978C-seokselle (30 g) tehtiin edelleen värinpoistokäsittely suspendoimalla 30 g sitä mahdollisimman vähäiseen vesimäärään ja sekoittamalla suspensiota pienen määrän kanssa silikageeliä (tyyppi LP-1, 10-20 pm, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N.J. 07006), johon liuos absorboitui. Kostea silikageeliseos suspendoitiin asetonitriili: metanoli-seokseen (4:1) ja vietiin 4 x 30 cm (ulkoläpimitta) lasilyijykolonniin, joka oli liitetty 6,5 x 82 cm (ulkoläpimitta) lasikolonniin, joka sisälsi 2,8 1 silikageeliä (Quantum LP-1) asetonitriili:metanoli-seoksessa (4:1) /silikageeli oli* etukäteen pesty vedellä ja sitten asetonitriili :metanoli-seoksella (4:1), ja kolonni oli pakattu silikageelillä asetonitriili:metanoli-seoksessa (4:1) kPa:n paineella/. Lyijykolonni ja tavallinen kolonni pestiin 3 litralla asetonitriili:metanoli: seosta (4:1) 345-414 kPa:n paineessa. Aktiivinen aine eluoitiin asetonitriili:metanoli:vesi-seoksella (55:20:25), jolloin koottiin 300 ml:n fraktioita. Eluointia seurattiin biokokeella (Micrococcus luteus). Fraktioilla 14-25 oli korkein aktiviteetti, ne yhdistettiin, väkevöitiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 24 g vaaleankeltaista, puhdasta A-21978C-seosta Na-suolana (1250 yks./mg). Fraktiot 26-32 olivat vähemmän aktiivisia, ne yhdistettiin, väkevöitiin ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 1,6 g epäpuhtaampaa A-21978C-seosta (780 yks./mg).

49 65631

Esimerkki 4 A-21978C-tekijoiden erottaminen

Esimerkissä 3 saatua puhdistettua A-21978C-seosta (2 g) liuotettiin veteen (40 ml), liuos painettiin pumpulla (FMI LAB Pump, Fluid Metering Inc. 48 Summit St., Oyster Bay, N.Y. 11771) 345 kPa:n paineella 4,1 x 60 cm kolonniin, joka sisälsi käänteis-faasisilikageeliä (Quantum LP-1 silikageeli/C^g) vesi:metanoli:ase-tonitriili-seoksessa (100:15:85), joka sisälsi 0,15 % etikkahappoa ja 0,15 % pyridiiniä. Kolonni kehitettiin 448 kPa:n paineessa samalla liuotinseoksella, jolloin koottiin 25 ml:n fraktioita. Fraktioiden eluoitumista seurattiin UV-säteilyllä aaltopituudella 280 nm ja biokokeella. Yksittäisten fraktioiden puhtaus kokeiltiin analyyttisellä kolonnilla. Tyypillisiä erotuksia olivat: fraktiot 33-37 sisälsivät tekijää CQ; fraktiot 45-53 sisälsivät tekijää C^; fraktiot 75-92 sisälsivät tekijää C2; fraktiot 112-134 sisälsivät tekijää C3; fraktiot 54-74 sisälsivät tekijöitä C^, C2 ja C4; ja fraktiot 93-111 sisälsivät tekijöitä C^> ja C,-. Useita tekijöitä sisältävät fraktiot ajettiin uudelleen kolonnilla, jolloin saatiin lisämääriä tekijöitä C^, C2 ja sekä myös tekijöitä C4 ja C,.. Fraktiot, jotka sisälsivät yhtä ainoata tekijää, yhdistettiin, väkevöi-tiin tyhjössä ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kutakin tekijää erikseen vaaleankeltaisena jauheena (Na-suoloina). 60 g:sta seosta saatiin tekijää = 5,55 g; tekijää C2 = 10 g; tekijää = 6,61 g. Useita tekijöitä sisältävät fraktiot kierrätettiin uudelleen kään-teisfaasihartsikolonnin lävitse, jolloin saatiin tekijää CQ = 550 mg; tekijää = 1,29 g; tekijää C2 = 1,99 g; tekijää = 443 mg; tekijää C4 = 512 mg ja tekijää - 384 mg.

Esimerkki 5 A-21978C-tekijoiden erotus ja puhdistus suuressa mittakaavassa

Suuressa mittakaavassa tekijät erotettiin käänteisfaasikolon-nikromatografiällä. Esimerkissä 3 saatua puhdasta A-21978C-seosta (6 g) liuotettiin veteen (80 ml). Liuoksen pH säädettiin etikka-hapolla arvoon 4,4 ja liuokseen lisättiin tetrahydrofuraania (20 ml). Liuos pumpattiin alhaisessa paineessa (Lapp-pumppu) teräskolonniin (4,8 x 100 cm), joka sisälsi 1,77 1 silikageeli/C^g /Quantum LP-1, 10-20 um, silyloitu oktadekyylitrikloorisilaanilla7 pakattuna vesi: tetrahydrofuraaniin (THF) (4:1). Kolonni pestiin paineessa (noin 65631 50 690 kPa) 150 ml:lla I^OtTHF-seosta (4:1). Kolonni kehitettiin noin 690 kPasn paineessa virtausnopeudella 35 ml/min vesi:metanolitase-töni triili-seoksella (47,5:15:37,5), joka sisälsi 0,2 % pyridiiniä ja 0,2 % etikkahappoa, jolloin koottiin 175 ml:n fraktioita. Elu-ointia seurattiin jatkuvasti piirturilla ja UV-detektorilla (280 nm). Yksittäisiä tekijöitä sisältävät fraktiot, joita osoittivat piirroksessa olevat piikit, käsiteltiin edelleen analyyttisellä käänteisfaasikolonnilla. Yhtä ainoata tekijää sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. Seuraavassa kuvataan tyypillistä ajoa: fraktiot 12-16 sisälsivät tekijää Cq? fraktiot 20-26 sisälsivät tekijää C^; fraktiot 38-50 sisälsivät tekijää C£? fraktiot 63-78 sisälsivät tekijää Cg. Fraktiot 27-37 (jotka sisälsivät tekijöitä ja C4) ja fraktiot 51-62 (jotka sisälsivät tekijöitä C2 ja Cg) kierrätettiin uudelleen kolonnin kautta, jolloin saatiin puhtaita tekijöitä C4 ja Cg. Kolonniin viety määrä oli 6-12 g. A-21978C-seoksen 84 gsn kokonaismäärästä saatiin 1,9 g CQ:aa, 3,27 g C^:tä, 4,97 g C£:ta ja 1,94 g C^ra. Yksittäisten tekijöiden suurempia saantoja saatiin kierrättämällä uudelleen sekatekijäfraktiot käyttäen sopivaa HPLC-liuotinsysteemiä. Systeemi vaihteli riippuen aina ajetusta seoksesta ja käänteisfaasikolonnin hartsista ja kolonnista.

Seuraavat liuotinsysteemit ovat käyttökelpoisia A-21978C-tekijoiden erottamiseen: A. Analyyttiset systeemit

Vesi:metanoli:asetonitriili (50:15:35), joka sisältää 0,2 % etikka-happoa (HOAc) ja jonka pH on säädetty pyridiinillä arvoon 5,5

Vesi:metanoli:asetonitriili (50:15:35), joka sisältää 0,2 % HOAc ja 0,2 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:asetonitriili (50:15:35), joka sisältää 0,75 % ammonium-formiaattia

Vesi:metanoli:asetonitriili (95:30:75), joka sisältää 0,2 % HOAc ja 0,2 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:asetonitriili (105:15:80), joka sisältää 0,2 % HOAc ja 0,2 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:THF (59:15:25), joka sisältää 0,5 % HOAc ja 0,5 % pyridiiniä

Vesi:metano1i:THF (60:15:25), joka sisältää 0,5 % aramoniumformiaattia.

51 65631 B. Preparatilviset systeemit

Vesi:metanoli:asetonitriili (95:20:85), joka sisälsi 0,15 % HOAc ja 0,15 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:asetonitriili (100:15:85), joka sisältää 0,15 % HOAc ja 0,15 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:asetonitriili (50:10:40), joka sisältää 0,1 % HOAc ja 0,1 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:asetonitriili (50:15:35), joka sisältää 0,75 % ammo-niumformiaattia

Vesi:metanoli:asetonitriili (55:10:35), joka sisältää 0,2 % HOAc ja 0,8 % pyridiiniä

Vesi:metanoli:THF (52,5:15:32,5), joka sisältää 0,6 % ammoniumformi-aattia

Vesi:metanoli:THF (50:15:35), joka sisältää 0,6 % ammoniumformiaat- tia.

Etuna etikkahappo-pyridiini-seoksella on ammoniumformiaattiin nähden se, että se voidaan poistaa kylmäkuivauksen aikana, kun ammoniumformiaatin poistamiseen on käytettävä kolonnikromatografiaa (Sephadex G-25).

Esimerkki 6

Vaihtoehtoinen menetelmä A-21978C-seoksen eristämiseksi Esimerkistä 1 saatu fermentointiliemi (97 1) suodatettiin käyttäen suodatusapuainetta (4 % Hyflo Super-Cel), saatua suodosta (80 1) sekoitettiin 2 litran kanssa ionoitumatonta makrohuokoista divinyylibentseenillä verkoutettua styreenikopolymeeria (Diaion HP-20 hartsi, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japani) 3 tuntia. Päällä oleva neste dekantoitiin, hartsi pestiin vedellä (81), vesi dekantoitiin. Sitten hartsia sekoitettiin 15 minuuttia asetonitriili:vesiseoksen (15:85) (8 1) kanssa, liuotin poistettiin suodattamalla. A-21978C-seos eluoitiin hartsista sekoittamalla sitä asetonitriili:vesi-seoksen (2:3) (81) kanssa tunnin ajan ja suodattamalla. Menettely toistettiin kaiken A-21978C-seoksen poistamiseksi. Molemmat suodokset yhdistettiin ja väkevöitiin tyhjössä öljyksi, öljy liuotettiin mahdollisimman vähäiseen vesimäärään, liuokseen lisättiin lämmittäen kaksi tilavuutta metanolia ja sitten 52 65631 30 tilavuutta asetonia, jolloin A-21978C-seos saostui. Sakka suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 13,6 g epäpuhdasta A-21978C-seosta (570 yks./mg).

Epäpuhdas A-21978C-seos puhdistettiin silikageelikolonnissa kromatografoimalla. Seos (1 g) liuotettiin mahdollisimman vähäiseen vesimäärään, liuokseen lisättiin veden absorboimiseksi silikageeliä (Grace 62) absorbentti lietettiin asetonitriiliin. Saatu liete vietiin 1,5 x 40 cm silikageelikolonniin (Grace, Grade 62), joka oli pakattu asetonitriilin kanssa. Kolonni pestiin asetonitriilillä. Aktiivinen aine eluoitiin asetonitriiliivesiiseoksella (4:1), jolloin koottiin 25 ml:n fraktioita. Fraktioita tutkittiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Fraktiot 21-46, jotka sisälsivät eniten A-21978C-seosta, yhdistettiin, väkevöitiin pieneen tilavuuteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 605 mg puhdistettua A-21978C-seosta (Na-suola) (900 yks./mg).

Esimerkki 7 A-21978C-seoksen happomuodon valmistus

Esimerkissä 6 saatua Na-suolana olevaa A-21978C-seosta (7 g) liuotettiin veteen (150 ml), ja liuokseen lisättiin 150 ml n-butanolia. Liuoksen pH säädettiin 2-n HCl:llä arvoon 3,4 samalla sekoittaen tunnin ajan. n-butanoli-faasi erotettiin ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännös liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 6 g A-21978C-seosta happomuodossa. Yksittäiset A-21978C-tekijät muutetaan suolamuodosta happomuotoon vastaavalla tavalla.

Esimerkki 8 A-21978C-seoksen natriumsuolan valmistus A-21978C-seoksen happomuodosta

Esimerkissä 7 valmistettua A-21978C-seoksen happomuotoa (50 mg) liuotettiin lämpimään absoluuttiseen etanoliin (5 ml), ja liuokseen lisättiin tipoittain 1-n NaOHtta, kunnes liuoksen pH oli 9,4j liuos sai seistä huoneen lämpötilassa yön yli. Muodostunut sakka suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 32 mg A-21978C-seosta Na-suolana. Atomiabsorptiolla määritettynä suola sisälsi 8 % natriumia.

Esimerkki 9

Esimerkin 8 mukaisella menetelmällä valmistettiin A-21978C-seoksen kalsiumsuola lisäämällä A-21978C-seoksen happomuodon etano-liliuokseen CaC^in etanoliliuosta.

53 65631

Esimerkki 10 A-21978 mikrobiologinen määritys fermentointilieminäytteistä ja eristetyistä näytteistä A-21978:n aktiviteetin määrittämiseen fermentointiliemestä ja eristetyistä näytteistä käytettiin paperikiekko-agar-diffuusio-menetelmää, jolloin mikro-organismina oli Micrococcus luteus.

Valmistettiin agar-diffuusiolevyjä ymppäämällä ravintoagar-väliaineeseen sopivan vahvuista koeviljelmää, ja valamalla kuhunkin muoviseen petrimaljaan (20 x 100 mm) 8 ml agaria.

Kokeessa käytetty vertailustandardi valmistettiin A-21978C-seoksesta siten, että vertailut sisälsivät erilaisia yksikkömääriä. Erittäin puhdas A-21978C-seos sisältää noin 1250 yks./mg. Standardi-käyrä valmistettiin näytteistä, jotka sisälsivät 150-75-40-20-10 yks./ml. Laimentimena standardinäytteissä oli 0,1-m fosfaattipuskuri pH 6,0.

Näyte ja standardiliuokset pipetoitiin automaattipipetillä 12,7 mm:n paperikiekoille. Inkuboitiin 30°C:ssa 16-18 tuntia. Vyöhykkeiden lukemiseen käytettiin modifioitua Fisher-Lilly antibiootti-vyöhyke lukijaa.

Claims (1)

1. 65631 54 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten A-21978-anti-bioottien seoksen valmistamiseksi/ joka seos käsittää tekijät Cq, C^, C2# ja C^, joilla on kaava y? L-Asp ^ D-Ala Gly f \ L-Asp D-Ser + Or L-Orn 3MG (ily L-K^n \ ^ ^L-Thr ^ * L-Asp L-Asp % L-Trp NH R jossa 3MG merkitsee L-treo-3-metyyliglutamiinihappoa ja R:llä on seuraavat merkitykset: A-21978C-tekijä R 8-metyylidekanoyyli C2 10-metyyliundekanoyyli 10-metyylidodekanoyyli CQ C1Q-alkanoyyli C4 C^2-alkanoyyli C,- C^2~alkanoyyli, tunnettu siitä, että a) viljellään Streptomyces roseosporus NRRL 11379 kantaa assimiloituvia hiilihydraatti- ja typpilähteitä sekä epäorgaanisia suoloja sisältävässä viljelyväliaineessa aerobisissa submerssiviljelyolo-suhteissa, kunnes on muodostunut olennainen määrä antibiootti-aktiivisuutta, minkä jälkeen 55 65631 b) mahdollisesti erotetaan A-21978-seos tai sen suola, joka sisältää ainoastaan tekijät CQ, C^, C2, CC4 ja Cg, vaiheessa (a) saadusta seoksesta, c) mahdollisesti eristetään tekijä Cg tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta, d) mahdollisesti eristetään tekijä tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta, e) mahdollisesti eristetään tekijä C2 tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta, f) mahdollisesti eristetään tekijä C3 tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta, g) mahdollisesti eristetään tekijä tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta ja h) mahdollisesti eristetään tekijä Cg tai sen suola vaiheessa (b) saadusta seoksesta. 56 6 5 6 31 Förfarande för framställning av en blandning av terapeutiskt användbara A-21978-antibiotika, vilken blandning omfattar fakto-rerna CQ, C^, C2, C^r och , vilka har formeln L-Aspv^ D-Ala Gly L-Asp D-Ser * * L-Orn 3MG * Ψ Gly L-Kyn K N L-Thr ^ * L-Asp * L-Asp * L-Trp NH R väri 3MG betecknar L-treo-3-metylglutaminsyra och R har följande betydelser: A-21978C-faktor R 8-metyldekanoyl C2 10-metylundekanoyl C3 10-metyldodekanoyl Cq C1Q-alkanoyl C4 C12-alkan°yl C^2~alkanoyl, kännetecknat därav, att a) stammen Streptomyces roseosporus NRRL 11379 odlas i ett odlings-medium som innehäller assimilerbara kolhydrat- och kvävekällor och oorganiska salter, under aerobiska submersodlingsförhällanden tills en väsentlig mängd av antibiotisk aktivitet alstrats, varefter